本发明涉及骨多肽制品
技术领域：
，具体涉及一种用于促进骨生长、维持骨健康的骨多肽组合物和口服液。
背景技术：
：骨多肽是从动物骨中提取得到的一种多肽组合物，其通过促进成骨细胞增殖和破骨细胞凋亡且对骨代谢和血液相关指标具有积极作用，可用于促进骨折愈合、治疗骨质疏松症和消炎镇痛等，临床应用广泛。研究表明，对胫骨骨折患者，给予骨多肽治疗，有着良好的疗效，能够有效促进患者的足踝功能恢复，改善骨性生长因子，有利于促进患者骨折愈合；对四肢骨折患者给予复方骨多肽注射液治疗，可有效缩短愈合时间，促进患者骨折愈合，具有非常高的临床应用价值。骨多肽制剂多为注射剂，使用较为不便，基于骨多肽的保健功效，目前有报道开始研究骨多肽的口服剂型。动物骨中富含丰富的营养物质，因此在提取骨多肽的过程中容易被细菌等污染，所以为了长期保存，需要进行灭菌处理。作为灭菌处理方法，由于成本低且简便，加热灭菌是最常采用的处理方法。但是，提取液中一般含有芽胞菌等耐热性高的微生物，例如嗜热芽胞杆菌属等，提取液被这些微生物污染的可能性很高，为了防止这种现象，灭菌处理时需要长时间的消毒处理，但提取液中存在多肽、氨基酸、还原糖、脂质、芳香族化合物等风味前体物质，并且这此物质之间会发生反应（如美德反应），在长时间灭菌过程中，会生成新的风味物质和加热气味，如呋喃、噻唑、吡咯、吡啶、苦味氨基酸、甜味氨基酸、咸味氨基酸、苦味肽、甜味肽、鲜味肽等，从而改变了骨多肽组合物的风味。在加热杀菌处理中，为了避免产生新的风味物质和加热气味而缩短加热时间的情况下，杀菌不足，很有可能受到芽胞菌的污染。特别是芽胞菌中，如果芽胞的耐热性高，加热处理不充分，则孢子残留的可能性很高。液体制剂中，为了有效地杀菌，除了加热的方法，还采用添加防腐剂、加压等方法。添加剂如溶菌酶、苯甲酸及其钠盐、ε-聚赖氨酸盐酸盐、山梨酸及其钾盐等，虽然可以起到一定的抑菌作用，但仍需要进行一定程度的加热处理，添加剂和骨多肽组合物相互作用会产生新的风味物质和加热气味，导致骨多肽产品本身的风味降低。如果采用加热加压的方法，骨多肽组合物中的有效成分会聚合或分解，骨多肽组合物的功效也会降低。技术实现要素：针对以上技术现状，本发明提供一种用于促进骨生长、维持骨健康的骨多肽组合物及其应用，并提供由该骨多肽组合物制成的口服液。为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：一种用于促进骨生长、维持骨健康的骨多肽组合物，采用以下方法制备得到：取哺乳动物四肢骨，粉碎后加水性介质提取，分离脂肪后得提取液，所述提取液中加入蛋白酶进行水解，水解完毕后过滤得水解液，水解液经灭菌得所述骨多肽组合物溶液；所述灭菌的条件为124-126℃下灭菌20-50s，或129-131℃下灭菌10-15s。作为本发明的一种实施方案，所述水性介质为水、无机盐水溶液、亲水性有机溶剂或水与亲水性有机溶剂的混合液；所述无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙或碳酸钠，其水溶液的浓度为0.8-1.0%；所述亲水性有机溶剂为乙醇，混合液中水的体积含量为10-90%；所述水性介质的用量为所述哺乳动物四肢骨质量的2-15倍。作为本发明的一种实施方案，所述水性介质的ph为6-10，所述提取的温度为120-140℃，提取时间3-20h。作为本发明的一种实施方案，所述分离脂肪的温度为40-90℃，在该温度下脂肪融解成液体，利于脂肪与提取液不互溶的特点，可在该温度下从上部取走脂肪或从设备下部放出提取液从而实现二者的分离。作为本发明的一种实施方案，所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或风味蛋白酶，其用量为所述提取液质量的0.01-10%，酶解温度20-80℃，酶解时间0.5-40h。本发明采用特定方法制备得到的骨多肽组合物溶液，有害微生物可被完全杀灭，并且能够保持骨多肽本身的风味，没有异味，骨多肽组合物中分子量10kda以下的小分子肽含量95%以上，该骨多肽组合物用于制备促进骨生长及维持骨健康的食品、保健食品或药品，具有显著的功效。本发明还提供一种骨多肽口服液，包括上述骨多肽组合物以及牛奶碱性蛋白，且二者的质量比为1:0.04-1。所述的骨多肽组合物的质量以氮含量计，下同。将上述骨多肽组合物制成口服液，服用方便，满足人们日常作为食品、保健品或药品服用的需求。骨多肽组合物中含有大量的小分子肽，这些小分子肽在保存过程中容易聚合成大分子，从而使其功效降低。本发明通过在骨多肽口服液中加入牛奶碱性蛋白，可以显著抑制小分子肽的聚合，从而延长口服液的保质期。骨多肽组合物口服后在消化液的作用下容易降低活性，这也是目前骨多肽制剂多为注射剂的原因，而本发明发现，加入牛奶碱性蛋白在保持口服液稳定性的同时还能改善骨多肽组合物的口服效果，提高生物利用度。此外，牛奶碱性蛋白本身也具有促进骨骼生长、预防骨质疏松的作用，在日本等国家已被广泛加入保健食品等中广泛应用，将其加入本发明骨多肽组合物中，没有任何副作用，并且还能够提高口服液促进骨生长、维持骨健康的功效。作为本发明的一种实施方案，所述骨多肽口服液中骨多肽组合物的质量浓度为5-200g/l。在此浓度下，骨多肽口服液具有更优的贮存稳定性和功效。作为本发明的一种实施方案，所述骨多肽口服液中还包括食品工业和/或药品制剂中允许的辅料，如营养强化剂、抗氧化剂、增稠剂、酸度调节剂、甜味剂、防腐剂、香精等。具体工艺中，可将牛奶碱性蛋白和辅料加入四肢骨的蛋白酶水解液中，然后再经灭菌制得。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1（1）取刚解冻的猪四肢骨100kg，其外观色泽鲜明，无臭味或异味，取骨上残留肉检测挥发性盐基氮0.06g/kg，将所述猪四肢骨用水洗净，剔肉。（2）将上述猪四肢骨粉碎成粒径2mm以下的颗粒，投入加压釜，加入400kg水，加热到140℃提取3小时。（3）等提取液温度降至80℃，从加压釜底部排出提取液，进行脂肪分离，得到四肢骨提取液390kg。（4）四肢骨提取液加入其质量1%的胰蛋白酶，40℃水解1小时。（5）板框过滤得水解液360kg，125℃下灭菌20s，即得骨多肽组合物溶液。实施例2（1）取新鲜的牛四肢骨100kg，其外观色泽鲜明，无臭味或异味，取骨上残留肉检测挥发性盐基氮0.08g/kg，将所述牛四肢骨用水洗净，剔肉。（2）将上述牛四肢骨粉碎成粒径2mm以下的颗粒，投入加压釜，加入200kg10%（v/v）乙醇水溶液，加热到120℃提取10小时。（3）等提取液温度降至40℃，从加压釜底部排出提取液，进行脂肪分离，得到四肢骨提取液230kg。（4）四肢骨提取液加入其质量5%的胃蛋白酶，30℃水解2小时。（5）板框过滤得水解液210kg，130℃下灭菌10s，即得骨多肽组合物溶液。实施例3（1）取新鲜的猪四肢骨100kg，其外观色泽鲜明，无臭味或异味，取骨上残留肉检测挥发性盐基氮0.05g/kg，将所述猪四肢骨用水洗净，剔肉。（2）将上述猪四肢骨粉碎成粒径2mm以下的颗粒，投入加压釜，加入1000kg氯化钠水溶液（质量浓度为0.9%），加热到130℃提取5小时。（3）等提取液温度降至90℃，从加压釜底部排出提取液，进行脂肪分离，得到四肢骨提取液850kg。（4）四肢骨提取液加入其质量0.2%的胃蛋白酶，30℃水解10小时。（5）板框过滤得水解液790kg，125℃下灭菌50s，即得骨多肽组合物溶液。对比例1实施例1获得的水解液在125℃下灭菌10s，得骨多肽组合物溶液。对比例2实施例1获得的水解液在130℃下灭菌20s，得骨多肽组合物溶液。对比例3实施例1获得的水解液在135℃下灭菌10s，得骨多肽组合物溶液。试验例1将实施例1-3以及对比例1-3得到的骨多肽组合物溶液在37℃和55℃的环境下进行一周的孵化。孵化后，从各个骨多肽组合物溶液中无菌抽取1ml样品，将各个样品倒入培养皿中，再注入琼脂培养基20～30ml。将含有骨多肽组合物的琼脂培养基分别在37℃和55℃下进行孵化24小时。孵化后，观察各个培养基上有没有出现菌斑。另将实施例1-3以及对比例1-3得到的骨多肽组合物溶液由16人进行口味的官能试验。评价是以完全没有变味的情况为1分，以有变味的的情况为7分的7等级评价法进行评价，取16人评分的平均值，平均值1以上不满2的情况下，设为“无”；平均值2以上不满3的情况下，设为“小”；平均值3以上不满4的情况下，设为“有点”；平均值4以上不满6的情况下，设为“有”；平均值在6以上不满7的情况下，设为“大”。试验结果如表1所示。表1微生物检测及感官评价结果样品微生物检测（37℃）嗜热菌检测（55℃）口味实施例1--小实施例2--无实施例3--小对比例1-+无对比例2--有对比例3--有注：“+”代表有菌斑，“-”代表无菌斑。可见，实施例1-3的骨多肽组合物溶液中微生物均被完全杀灭，且口味无变化或变化很小，而对比例1-3或不能杀灭耐热微生物，或口味发生明显改变，产品质量不尽理想。试验例2将实施例1-3的骨多肽组合物溶液用于成骨细胞增殖试验，具体过程如下：取出生24h以内的健康wistar大鼠颅盖骨，用pbs清洗，去除结缔组织，剪碎至1mm3大小，加入0.25%的胰蛋白酶消化10min，弃酶液，加入0.1%的ⅱ型胶原酶和0.25的胰蛋白酶消化4-5次，每次15min，合并消化液，加入含胎牛血清的dmem培养基终止消化。500r/min离心10min，沉淀即为成骨细胞，将其加入含15%fbs的dmem培养基中重悬，以每毫升105个细胞接种于培养瓶中，于37℃、饱和湿度、co2分压5%的细胞培养箱中进行培养。待细胞长满培养瓶底后，吸出培养基，用0.25%的胰蛋白酶消化，进行传代培养。将传至第3代的细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔培养液中，每孔加入含15%fbs的培养基200μl，在37℃、5%co2及饱和湿度条件下培养。24h细胞完全贴壁吸去培养基，用实施例1-3的骨多肽组合物溶液进行培养，三蒸水作为空白对照，于第3天用mtt法分析培养液的吸光值，从而计算成骨戏班的增值率，结果如表2所示。表2成骨细胞增殖试验结果组别od值空白对照0.122±0.015实施例10.376±0.021实施例20.407±0.028实施例30.393±0.017可见，本发明的骨多肽组合物对成骨细胞增殖有显著的促进作用，口服该骨多肽组合物具有促进骨骼生长的功效。实施例4在实施例1的猪四肢骨水解液中加水稀释至骨多肽组合物含量为10g/l，加入牛奶碱性蛋白，使其含量为0.4g/l，再加入常规量的三氯蔗糖，按照实施例1的灭菌条件进行灭菌，得骨多肽口服液。实施例5在实施例2的牛四肢骨水解液中加水稀释至骨多肽组合物含量为5g/l，加入牛奶碱性蛋白，使其含量为5g/l，再加入常规量的三氯蔗糖，按照实施例2的灭菌条件进行灭菌，得骨多肽口服液。实施例6将实施例3的猪四肢骨水解液浓缩至骨多肽组合物含量为200g/l，加入牛奶碱性蛋白，使其含量为10g/l，再加入常规量的三氯蔗糖，按照实施例3的灭菌条件进行灭菌，得骨多肽口服液。试验例3取出生4周的断乳大鼠，常规饲养的同时每日按0.5ml/kg体重灌胃实施例1-3的骨多肽组合物溶液和实施例4-6的骨多肽口服液，实验3周后解剖大鼠，剥离左侧股骨，测量大鼠股骨中点骨密度以及骨钙含量。等量纯净水灌胃作为空白对照。试验结果如表3所示。表3骨密度及骨钙含量试验结果可见，实施例1-3的骨多肽组合物溶液能显著提高骨密度和骨钙含量，对于维持骨骼健康具有积极的效果。而实施例4-6的骨多肽口服液中骨多肽组合物浓度低于实施例1-3，然而其效果却明显优于骨多肽组合物，可见牛奶碱性蛋白的加入显著提高了口服液的效果，推测可能是牛奶碱性蛋白能够减少消化液对骨多肽活性的影响，从而提高了其生物利用度。这为本发明的骨多肽组合物用于制备具有相应功能的食品、保健食品或口服药品提供了基础。试验例4取体重为250-300g的雄性sd大鼠，麻醉后经股外侧切口暴露股骨，线锯离断其股骨中段，1mm克氏钉固定，得到骨折模型。将模型大鼠随机分为7组，每组20只，分别每日按照1ml/kg体重灌胃实施例1-3的骨多肽组合物溶液、实施例4-6的骨多肽口服液以及纯净水，30天后通过x光片评价各组大鼠的骨折愈合情况，记录各组的x线评分。具体的x线评分标准如下：0分：骨折线清晰无变化；1分：骨折线出现模糊；2分：骨折线模糊且出现明显的连接迹象；3分：骨折线完全消失，骨痂出现；4分：骨折线消失且骨髓腔密度减低；5分：骨折线消失且骨髓腔完全再通。各组大鼠的评分结果如表4所示。表4sd大鼠骨折愈合x线评分结果组别评分对照（纯净水）1.9±0.3实施例13.3±0.3实施例23.1±0.5实施例33.5±0.7实施例44.4±0.5实施例54.5±0.5实施例64.7±0.4可见，本发明的骨多肽组合物和骨多肽口服液均对骨折愈合有促进作用，骨多肽口服液的效果骨多肽组合物组也有显著的差别。试验例5取10月龄sd大鼠，经背部切口切除双侧卵巢以制作骨质疏松模型，造模成功的大鼠分为7组，每组20只，分别每日按照1ml/kg体重灌胃实施例1-3的骨多肽组合物溶液、实施例4-6的骨多肽口服液以及纯净水，常规喂养3个月后，处死大鼠，取左侧股骨和胫骨，测定其骨密度，结果如表5所示。表5各组骨质疏松模型的骨密度对比组别股骨密度（g/cm2）胫骨密度（g/cm2）对照（纯净水）0.208±0.0090.203±0.005实施例10.223±0.0060.216±0.008实施例20.220±0.0110.215±0.006实施例30.228±0.0120.218±0.009实施例40.257±0.0080.228±0.012实施例50.255±0.0130.226±0.008实施例60.259±0.0100.231±0.011可见，本发明的骨多肽组合物和骨多肽口服液能够明显提高骨质疏松大鼠的骨密度，本发明产品可口服用于改善骨质疏松。由以上试验例可见，本发明的骨多肽组合物和骨多肽口服液口服后具有显著的促进骨生长、提高骨密度、促进骨伤愈合、改善骨质疏松等功效，且实验动物在试验期间及试验后均未出现不良反应，证明本发明产品口服安全有效，为其成为具有相应功效的食品、保健食品和药品提供了基础。对比例4在实施例4的猪四肢骨水解液中加水稀释至骨多肽组合物含量为10g/l，再加入与实施例4等量的三氯蔗糖，按照实施例4的灭菌条件进行灭菌，得骨多肽口服液。对比例5在实施例5的牛四肢骨水解液中加水稀释至骨多肽组合物含量为5g/l，再加入与实施例5等量的三氯蔗糖，按照实施例5的灭菌条件进行灭菌，得骨多肽口服液。对比例6将实施例6的猪四肢骨水解液浓缩至骨多肽组合物含量为200g/l，再加入与实施例6等量的三氯蔗糖，按照实施例6的灭菌条件进行灭菌，得骨多肽口服液。试验例6将实施例4-6及对比例4-6的骨多肽口服液在常温下自然放置24个月，检测其中相对分子质量10kda以下的多肽含量。另取实施例4-6和对比例4-6的骨多肽口服液样品于50℃下放置10天，检测其中相对分子质量10kda以下的多肽含量。以结果如表6所示。表6稳定性试验结果可见，加入牛奶碱性蛋白能够减少骨多肽口服液中小分子肽的聚合，提高口服液的稳定性。这为本发明产品的长期有效性提供了基础。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12