一种抗心肌缺血再灌注损伤的药物的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种心宝丸的药物新用途，具体涉及一种抗心肌缺血再灌注损伤的药物。

背景技术：

急性心肌梗塞(acutemyocardialinfarction,ami)为高风险，高死亡率疾病，再灌注是临床上常用的方法。再灌注在迅速恢复供血后，可有效挽救尚存活的心肌细胞、减少梗死区面积，维持左心室的收缩功能、阻断心衰的发生，但很多情况下，复灌往往会导致心功能、代谢和结构异常，从而加剧了心脏组织损伤，即缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury，iri)。因此，防止心肌缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury，iri)，是治疗ami不可忽视的临床事件。为了减少心肌缺血再灌注损伤，学术界针对iri现有机制，发现了一些治疗方法和药物，例如缺血预适应(ipc)、远程缺血性适应、阿托伐他汀等。这些手术治疗方法虽然有明显效果，但操作均比较复杂；而上述提到的药物使用简便，且在动物实验中表现出不错的药效作用，但在临床试验验证中结果却并不确切。因此，研究开发使用简便、疗效肯定的减少心肌缺血再灌注损伤药物，仍然十分必要。

心宝丸是一种成熟市售的中药复方制剂，由洋金花、鹿茸、人参、附子、肉桂、三七、人工麝香、蟾酥、冰片九味中药组成，为黑色的小丸，每丸重60mg，除去包衣显棕褐色，气香，味甘、微苦、有麻舌感。心宝丸具有温补心肾，益气助阳，活血通脉的功能，可用于治疗心肾阳虚，心脉瘀阻引起的慢性心功能不全，窦房结功能不全引起的心动过缓、病窦综合症及缺血性心脏病引起的心绞痛及心电图缺血性改变。临床研究表明，口服心宝丸改善病窦综合征患者心肌缺血及心功能，减少异位早搏；心宝丸可以延长左心室射血时间及缩短pep/lvet比值，减少ptfv1负值，提高心功能改善心衰症状，调整心功能不全引起的心率过速，是有效的强心制剂。目前尚未有现有技术中记载心宝丸具有抗心肌缺血再灌注损伤作用的报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种心宝丸的药物新用途。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗心肌缺血再灌注损伤的药物，所述药物包括心宝丸。

在本发明中，所述药物抑制缺氧复氧诱导的h9c2心肌细胞活力下降。

在本发明中，所述药物抑制冠状动脉左前降支结扎诱导的心肌缺血再灌注损伤。

在本发明中，所述药物降低凋亡相关蛋白caspase3的水平。

在本发明中，所述药物提高凋亡相关蛋白bcl2与bax的水平比例。

在本发明中，所述药物抑制自噬相关蛋白beclin-1的表达。

在本发明中，所述药物抑制自噬相关蛋白lc3ii的表达。

本发明所涉及的心宝丸是一种成熟的可通过市售购买的中药复方制剂，由洋金花、鹿茸、人参、附子、肉桂、三七、人工麝香、蟾酥、冰片九味中药组成，为黑色的小丸，每丸重60mg。其可按照《部颁药品标准中药成方制剂第十八册》心宝丸标准(ws3-b-3379-98)所记载的制备方法制成：鹿茸及部分三七分别干燥并粉碎成细粉，蟾酥、冰片分别粉碎成细粉；肉桂用水蒸气蒸馏法提取和收集挥发油，药渣继续煎煮2次，滤过，合并滤液，浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉；人参用乙醇加热回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉；洋金花用乙醇加热回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉；部分三七用乙醇加热回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇并浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉；附子加水煎煮2次，合并煎液，滤过，浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉。将人工麝香先与蟾酥细粉、冰片细粉及部分三七细粉混匀，然后与肉桂干膏细粉、三七干膏细粉、洋金花干膏细粉混匀，再与人参干膏细粉、附子干膏细粉、鹿茸细粉和剩余的三七细粉混合均匀，加入肉桂挥发油和水，搅拌制软材，制丸，干燥，用适量药用炭、滑石粉包衣，干燥，打光，分装，即得。

本发明创造性地发现心宝丸可以作为抗心肌缺血再灌注损伤的药物进行使用，其在体外对缺氧复氧的h9c2心肌细胞有很强的保护作用，可抑制缺氧复氧导致的h9c2细胞损伤；在体内能够显著减少冠状动脉左前降支结扎诱导心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏梗死面积和ck-mb的含量，抑制心肌细胞凋亡；同时还能抑制心脏组织凋亡相关蛋白表达，提升抗凋亡蛋白比例，抑制细胞自噬相关蛋白beclin-1和lc3ii表达。

第二方面，本发明提供心宝丸在制备抗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

第三方面，本发明提供心宝丸在制备抗h9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的药物中的应用。

第四方面，本发明提供心宝丸在制备抗冠状动脉左前降支结扎诱导的心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

第五方面，本发明提供心宝丸在制备抑制凋亡相关蛋白caspase3表达的药物中的应用。

第六方面，本发明提供心宝丸在制备抑制自噬相关蛋白beclin-1表达的药物中的应用。

第七方面，本发明提供心宝丸在制备抑制自噬相关蛋白lc3ii表达的药物中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如稀释剂和赋形剂的组合、粘合剂和润湿剂的组合、乳化剂和助溶剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地发现心宝丸可以作为抗心肌缺血再灌注损伤的药物进行使用，也可以将心宝丸用于制备抗心肌缺血再灌注损伤的药物中，其在体外对缺氧复氧的h9c2心肌细胞有很强的保护作用，可抑制缺氧复氧导致的h9c2细胞凋亡；在体内能够显著减少冠状动脉左前降支结扎诱导心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏梗死面积和ck-mb的含量，抑制心肌细胞凋亡；同时还能抑制心脏组织凋亡相关蛋白表达，提升抗凋亡蛋白比例，抑制细胞自噬相关蛋白beclin-1和lc3ii表达。本发明为研究心肌缺血再灌注损伤的治疗策略提供了理论依据，为制备新的抗心肌缺血再灌注损伤的药物提供了一个嵌入点。

附图说明

图1是心宝丸对h9c2心肌细胞活力影响的结果统计图；

图2是心宝丸对缺氧复氧h9c2心肌细胞活力影响的结果统计图；

图3a是实施例3中三组大鼠心脏的横截面ttc染色结果图；

图3b是实施例3中两组大鼠梗死心肌ir占危险区心肌的面积百分比(ir/aar)的结果统计图；

图3c是实施例3中elisa检测三组ck-mb含量的结果统计图；

图3d是实施例3中三组大鼠的心脏he染色结果图；

图4a是实施例4中对caspase3,bax,bcl2,tubulin,β-actin的蛋白质印迹分析结果图；

图4b是实施例4中各组对caspase3表达水平影响统计结果图；

图4c是实施例4中各组对bax/bcl2表达水平影响统计结果图；

图5a是实施例5中对beclin-1和lc3ii的蛋白质印迹分析结果图；

图5b是实施例5中各组对beclin-1表达水平影响统计结果图；

图5c是实施例5中各组对lc3ii表达水平影响统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普通知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

下述实施例中所使用的心宝丸由广东心宝药业科技有限公司公司提供，生产批号为20170408，规格为每丸重60mg，每瓶20丸。

h9c2大鼠心肌细胞来源于上海中科院细胞库。

实验动物成年雄性sprague-dawley(sd)大鼠(wm：250–280g)购自于南方医科大学实验动物中心。

实施例1

心宝丸对h9c2心肌细胞活力影响的评价

操作方法为：取对数期生长的h9c2心肌细胞，以5000/孔接种于96孔培养板中，过夜，细胞生长状态良好后，加入含不同浓度的心宝丸(0，4，8，16，32，64，128，256，512，1024μg/ml)完全dmem培养基，培养24h后停止培养。然后加入0.5mg/ml的mtt溶液100μl，继续培养4h后，弃去培养基，加入150μldmso振荡混匀，放置于酶标仪上，并于波长490nm测定其吸光光度值。结果如图1所示：心宝丸在1024μg/ml浓度以下未对h9c2心肌细胞产生任何毒性。

实施例2

心宝丸对缺氧复氧h9c2心肌细胞的保护作用的评价

操作方法为：取对数期生长的h9c2心肌细胞，以5000/孔接种于96孔培养板中，过夜，细胞生长状态良好后，更换成含有不同浓度的心宝丸(0，10，60，240，720μg/ml)及阳性对照药二氮嗪(100μm)的无糖无血清培养基后，置于无氧装置中培养6h后，换完全正常dmem培养基，继续培养18h后停止培养。然后加入0.5mg/ml的mtt溶液100μl，继续培养4h后，弃去培养基，加入150μldmso振荡混匀，放置于酶标仪上，并于波长490nm测定其吸光光度值。结果如图2所示：心宝丸可显著抑制缺氧复氧诱导的h9c2心肌细胞活力下降。

实施例3

心宝丸对冠状动脉左前降支结扎诱导的大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用的评价，包括如下内容：

(1)动物分组：成年雄性sprague-dawley(sd)大鼠(wm：250–280g)用于体内实验。每个笼子饲养4只大鼠，并在spf动物房中以22±2℃和湿度进行12:12h的明暗循环。允许动物自由获得标准啮齿动物食物和蒸馏水。将24只大鼠随机分成3组，每组8只：第1组为sham组(假手术组)，生理盐水(i.p.)；第2组为mi/r组(心肌缺血再灌注损伤组)，生理盐水(i.p.)；第3组为mi/r+心宝丸组(mi/r+xbw)(给药180mg/kg，i.p.)。雄性sd大鼠进行冠状动脉左前降支结扎手术，将心宝丸溶于生理盐水中，于结扎前1h灌胃。再灌注24h后，检测心脏超声，对大鼠进行心电图测试，接着将大鼠安乐死并收集样品。

(2)心肌缺血再灌注模型的构建方法：腹腔注射2％戊巴比妥钠(100μl/100g)使大鼠麻醉，并用呼吸机保持呼吸。将大鼠仰卧，剪开其左胸的皮肤和胸肌。接着，剪开大鼠胸部左侧第三和第四肋之间的肋间隙。打开心包后暴露大鼠心脏，并使用8-0缝合线结扎冠状动脉左前降支(lad)，在结扎完全之前放置一个pe10管。左心室(lv)前壁变白证实结扎成功。同时快速关闭胸腔，用4-0缝合线关闭胸腔。缺血30min后，再次打开胸腔，将pe10管取出后关闭胸部，缝合胸肌和皮肤。手术结束。

(3)梗死面积分析方法：在mi/r后24h，通过超声心动图对左心室功能进行评估。将大鼠安乐死后进行静脉血液采集，打开胸腔，再次结扎冠状动脉左前降支，然后将1％的evans蓝色染料注入，取出心脏并用pbs冲洗后，将心脏放入-80度中冷冻10min，并将其横截面切成六块。将心脏切片置于ttc中并于暗室中37℃孵育15min，然后用4％多聚甲醛于4℃固定过夜。经上述处理，蓝色为正常心肌，粉红色为缺血心肌，灰白色是坏死心肌，如图3a所示。通过imagej软件计算梗死心肌ir占危险区心肌的面积百分比(ir/aar)，结果如图3b所示：心宝丸给药组(mi/r+xbw)可显著减少大鼠心肌缺血再灌注损伤造成的心脏梗死面积。

(4)elisa检测ck-mb含量：取大鼠血浆，按照南京草本源公司大鼠ck-mbelisa试剂盒说明书进行检测。结果如图3c所示：心宝丸给药组(mi/r+xbw)可显著降低ck-mb水平。

(5)苏木精-伊红染色：在对动物实施安乐死后，收集心脏并将其固定在多聚甲醛中。石蜡包埋后加工成切片(5μm)，经脱蜡，复水后，用苏木精-伊红(h&e)染色，然后在光学显微镜下进行拍照。结果如图3d所示：心宝丸给药组(mi/r+xbw)可减少粒细胞浸润，心肌细胞核浓缩等病变，减少心肌损伤。

实施例4

心宝丸对凋亡相关蛋白表达影响的评价

操作方法为：取大鼠左心室约250mg于离心管中，并加入1×ripa缓冲液500μl，用研磨器研磨。12000rpm离心15min，得到的上清为提取的蛋白质。样品制成后，将样品在100v恒定电压中用10％或15％sds-page进行不同蛋白分子量的分离，并置于transferbuffer(25mmtris，192mm甘氨酸，10％异丙醇)中以300ma恒定电流将蛋白电转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。膜用pbs–tween20(0.1％)(pbst)稀释的5％bsa封闭1h后，膜在特异性抗体(caspase3,bax,bcl2,tubulin,β-actin)(1/1000，在2％bsa中)中4℃孵育过夜。用pbs清洗膜三次，用山羊抗兔或山羊抗小鼠igg的二抗(1/3000在2％bsa中)孵育1h，并用化学发光液检测。结果如图4a、4b和4c所示：心宝丸给药组(mi/r+xbw)可显著降低凋亡相关蛋白caspase3水平，提高bcl2/bax比例，从而抗心肌凋亡，减少再灌注损伤。

实施例5

心宝丸对自噬相关蛋白beclin-1和lc3ii表达影响的评价

操作方法为：与实施例4中方法一致，从动物组织中提取蛋白，并进行蛋白质印迹分析自噬相关蛋白beclin-1和lc3ii的表达。结果如图5a、5b和5c所示：缺血再灌注可增加自噬相关蛋白beclin-1表达，而心宝丸给药组可显著降低beclin-1和lc3ii的表达。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种抗心肌缺血再灌注损伤的药物，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。