一种柱上低pH病毒灭活的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白药物下游生产工艺中一种柱上低ph病毒灭活的方法。

背景技术：

近年来蛋白类药物越来越受到人们的关注。随着哺乳动物细胞培养技术的发展，大量的抗体类蛋白或融合蛋白都采用哺乳动物进行表达生产。目前，中国仓鼠卵巢细胞(cho，chinesehamsterovarycells)是应用最为广泛的表达体系之一。采用动物细胞表达生产的产品，有引入病毒的风险。为了保证最终产品的安全性，需要下游生产工艺有效去除或者灭活潜在的病毒。

低ph病毒灭活是一种常用的病毒灭活方式，能有效降低病毒水平，但在传统的实际应用和操作过程中仍存在一些不足之处。低ph病毒灭活通常需要在较低的ph下进行，在进行酸调节时容易发生局部过酸，导致部分产品聚体含量增加。其次，大规模生产中，ph的调节操作比较繁琐，调节过程时间长，调节ph的一致性不容易控制。另外，在容器中进行低ph调节，容易存在死角或是残液挂壁的现象，有可能导致病毒灭活不彻底。

本发明针对蛋白药物，采用柱上低ph病毒灭活，充分利用阳离子层析柱高吸附容量、操作方便和易于控制的优势，提高低ph病毒灭活的工艺稳健性，保证产品的病毒安全性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种柱上低ph病毒灭活的方法。

一种柱上低ph病毒灭活的方法包括如下步骤：

1)采用50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积；

2)将待处理的蛋白样品调节至ph4.0-6.0，得到蛋白上样液；

3)将蛋白上样液上样到阳离子层析柱上，上样量为20-120g/l填料；

4)采用50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3-8个柱体积；

5)采用50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱3-8个柱体积，并暂停30-120min；

6)采用50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品。

进一步的，所述的50mm柠檬酸平衡缓冲液，ph值为4.0-6.0；

进一步的，所述的待处理的蛋白样品，为单抗、双特异性抗体或融合蛋白；

进一步的，所述的阳离子层析柱，为装填captosimpact或porosxs的层析柱；

进一步的，所述的50mm柠檬酸灭活缓冲液，ph值为3.0-3.8；

进一步的，所述的50mm柠檬酸洗脱缓冲液，ph值为5.0-6.0，氯化钠浓度为100-300mm。

本发明采用柱上低ph病毒灭活，充分利用阳离子层析柱高吸附容量、操作方便和易于控制的优势，提高低ph病毒灭活的工艺稳健性。本发明的优点在于：1)高吸附容量；2)操作方便；3)易于放大；4)病毒灭活效果好；5)利于稳定蛋白产品；6)回收的蛋白产品纯度高。

附图说明

附图是本发明阳离子层析柱上对单抗料液进行低ph病毒灭活的电泳谱图，第1泳道为标准蛋白，第2泳道为待处理的单抗料液，第3、4泳道为低ph病毒灭活后的单抗产品。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

取柱体积为10ml的captosimpact阳离子层析柱，用ph4.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3个柱体积。取含有0.2g单抗的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至4.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为20g/l填料。用ph4.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3个柱体积。用ph3.0的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱3个柱体积，并暂停30min。采用ph5.0含100mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的单抗产品，电泳分析纯度为97.8％。

实施例2

取柱体积为35ml的captosimpact阳离子层析柱，用ph6.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱8个柱体积。取含有4.2g双特异性抗体的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至6.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为120g/l填料。用ph6.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱8个柱体积。用ph3.8的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱8个柱体积，并暂停120min。采用ph6.0含300mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的双特异性抗体产品，电泳分析纯度为98.5％。

实施例3

取柱体积为20ml的porosxs阳离子层析柱，用ph5.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱4个柱体积。取含有2.0g单抗的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至5.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为100g/l填料。用ph5.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱8个柱体积。用ph3.5的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱4个柱体积，并暂停90min。采用ph5.0含200mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的单抗产品，电泳分析纯度为98.0％。

实施例4

取柱体积为25ml的porosxs阳离子层析柱，用ph5.5的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱5个柱体积。取含有2.0g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至5.5，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为80g/l填料。用ph5.5的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱5个柱体积。用ph3.6的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱5个柱体积，并暂停60min。采用ph5.5含150mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为97.5％。

实施例5

取柱体积为15ml的captosimpact阳离子层析柱，用ph4.5的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3个柱体积。取含有0.9g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至4.5，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为60g/l填料。用ph4.5的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3个柱体积。用ph3.3的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱5个柱体积，并暂停40min。采用ph5.4含180mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为99.1％。

实施例6

取柱体积为50ml的porosxs阳离子层析柱，用ph4.8的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱7个柱体积。取含有2.5g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至4.8，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为50g/l填料。用ph4.8的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱4个柱体积。用ph3.5的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱4个柱体积，并暂停70min。采用ph5.5含150mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为98.4％。

实施例7

取柱体积为20ml的porosxs阳离子层析柱，用ph4.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3个柱体积。取含有0.4g单抗的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至4.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为20g/l填料。用ph4.0的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱3个柱体积。用ph3.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱3个柱体积，并暂停30min。采用ph5.0含100mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的单抗产品，电泳分析纯度为97.6％。

实施例8

取柱体积为200ml的porosxs阳离子层析柱，用ph6.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱8个柱体积。取含有24g双特异性抗体的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至6.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为120g/l填料。用ph6.0的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱8个柱体积。用ph3.8的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱8个柱体积，并暂停120min。采用ph6.0含300mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的双特异性抗体产品，电泳分析纯度为98.8％。

实施例9

取柱体积为50ml的captosimpact阳离子层析柱，用ph4.8的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱7个柱体积。取含有2.5g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节ph至4.8，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到层析柱，上样量为50g/l填料。用ph4.8的50mm柠檬酸平衡缓冲液冲洗层析柱4个柱体积。用ph3.5的50mm柠檬酸灭活缓冲液冲洗层析柱4个柱体积，并暂停70min。采用ph5.5含150mmnacl的50mm柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低ph病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为98.3％。