基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法与流程

本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法。

背景技术：

对清醒和自由活动的动物的脑细胞成像是神经科学领域研究动物行为与大脑神经元之间联系的重要手段。在动物进行相应的行为过程中，观测其脑区特定区域神经元的动作电位变化，这样可以研究动物行为与神经元、环路和更高层次的神经元信息处理之间的联系。因此神经元活动信号的检测是神经科学研究的基础，电生理记录等常规手段存在技术难度大、通量低、不具特异性和缺少空间分辨率等诸多问题。光学神经探针的发展是对现代神经科学研究检测技术的重要补充，光学信号可以提供高的空间和时间分辨率，同时比传统的微电极方法侵入性更小，能够在体研究更多自然行为中神经元的功能。

配合相应的光学荧光探针，采用各种荧光显微技术可以进行单色或多色神经元活动成像，还可通过增加光遗传刺激光源，同时进行原位光遗传刺激。为了可以记录在清醒、不受约束和可移动条件下动物在自然行为中的神经功能，业内已经发展出了一种利用微型光学器件、微型成像元件和微型镜体结构实现的微型化荧光显微镜，该微型荧光显微镜体积小，镜体可固定于小鼠头部，其重量不会影响到小鼠的自由活动，目前已经开始应用于国内外的神经科学研究中。现有的微型荧光显微镜一般采用发光二极管作为光源，并需使用配套的准直透镜和窄带滤光片(如中国发明专利，申请号201510220640.8，201680077967.7和201910621446.9)，这种设计体积小、重量轻，能够实现基本的活体成像的需求。但其观察范围小，成像分辨率低，调焦十分不便。最限制其使用的缺陷是扩展性能差，难以根据实际研究需要更换/增加光波长。特别是，若想增加光波长进行多色成像或者增加光遗传功能，每增加一个光波长，就需要增加一套由发光二极管、窄带滤光片组成的光源，且需要额外增加引导光源的二向色镜，导致镜体体积增大，重量增加，装配更复杂，反而不适合戴在动物头上持续实验。针对此技术缺点，本研究小组已经提出了一种通过混杂排列的多光纤耦合光束，将成像系统的光源外置从而简化照明光路，并拓展光源发光能力的技术方案(中国发明专利，申请号201911299007.7)。由于该技术方案仍采用宽场荧光成像技术，故而该技术方案存在宽场荧光显微镜固有的图像对比度低的问题。为了解决这个问题，可以采用其它对比度更高的成像方式，例如中国发明专利201710183353.3和中国发明专利201811494384.1提出了微型双光子显微镜的技术方案以提高成像的分辨率和对比度，然而这种设计必须使用飞秒脉冲激光器及扫描控制装置，硬件成本非常高，结构复杂，且由于采用点扫描的方式，成像速度慢。

动态散斑照明显微成像是用随机散斑模式照明荧光物体采集一系列的图像，通过计算图像随时间波动的对比度来得到光学层析图。散斑是颗粒状光强分布图案，具有高对比度的特点；通过散斑图案照明得到的荧光图像因此也具有对比度，通过图片对比度可以得到样品在焦面部分的信息：在焦面处高频信息占主导，同时在离焦位置低频占主导。观察到的散斑对比度相当于荧光图片中焦面与离焦信息的比值。mertz研究小组改进了动态散斑照明显微成像，提出一种混合散斑和均匀照明的方法(称为hilo，hi代表高频，lo代表低频)，只需两次成像，经过算法计算可以得到光学层析的图像：计算散斑图像和均匀照明图像的局部对比度，得到宽场均匀照明信息中焦面低频信息，结合均匀照明中的高频信息，融合得到全分辨率的光学层析图像。

文献(基于光纤的混合照明光学层析荧光显微成像研究，doi：2.1016.779685)公开了一种利用多模光纤导光及振动光纤消散斑方法实现了一种基于光纤的混合照明光学层析荧光显微成像系统，提高了宽场荧光显微成像的层析能力。

但其并没有阐述散斑照明与图像之间的关系、散斑颗粒怎样影响最终图像的质量以及怎样控制散斑的大小以达到预期的效果。目前尚没有头戴式微型荧光显微镜运用hilo方法以提高图像对比度的有关报道，将该方法应用于对清醒和自由活动的动物的脑细胞成像装置时，由于成像装置的体积更小、照明光路更为复杂，散斑的性能对于成像影响非常大：如果散斑颗粒太大，经hilo算法处理后的图像对比度的提升不明显，达不到改善的目的；如果散斑颗粒太小，处理后的图像会产生伪影，使图像失真。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法，其目的在于，通过对散斑照明时，采样窗口内散斑颗粒的质量和数量的控制，提高层析成像的对比度的同时避免伪影，从而获得更高质量的层析图，由此解决现有技术在微型的、可穿戴式的荧光显微成像装置中图像对比度不高的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于散斑原理的荧光成像照明装置，其包括耦合光纤束、以及一个或多个混合激发光发生单元；

所述耦合光纤束包括多个子束；

所述混合激发光发生单元，用于产生相同波长的相干荧光激发光和非相干荧光激发光；所述相干荧光激发光和非相干荧光激发光，通过耦合光纤束的相同或不同子束耦合到荧光成像系统的照明光路，所述非相干荧光激发光形成匀场照明，所述相干荧光激发光形成散斑照明。

优选地，所述散斑照明的散斑颗粒满足以下关系：单个采样窗口中散斑颗粒的个数为2-81，即，

δ/δs∈[1.4，9]

其中，所述采样窗口为采用混合散斑均匀照明光学层析算法计算图像的局部对比度时所取的最小计算区域，δ为采样窗口的大小(边长)，δs为散斑颗粒的大小(直径)。

优选地，所述光纤束的数值孔径≥0.5。

优选地，所述荧光成像照明装置，其所述耦合光纤束由多根多模光纤组成，优选为塑料光纤。

优选地，所述混合激发光发生单元，还包括用于筛选光在光纤束中传输模式的模式筛选器，所述模式筛选器滤除低阶模式保留高阶模式。

优选地，所述荧光成像照明装置，其所述混合激发光发生单元，包括相干荧光激发光源和非相干荧光激发光源，所述相干荧光激发光源优选为激光器，非相干荧光激发光源优选为大功率led-窄带滤光片组合，所述相干荧光激发光源和非相干荧光激发光源通过耦合光纤束的不同子束耦合到照明光路或者经合束装置合束后通过同一子束耦合到照明光路中；所述合束装置优选为光纤合束器或空间光合束器件。

优选地，所述荧光成像照明装置，其所述混合激发光发生单元，包括相干荧光激发光源和散斑衰减装置，所述相干荧光激发光源和所述散斑衰减装置串联，通过子束耦合到照明光路中，即在光出射处、传导光纤处、光纤出射端后设置散斑衰减装置；当所述散斑衰减装置启动时抑制散斑效应，形成均匀光照明光斑；当所述散斑衰减装置关闭时，形成散斑照明。

按照本发明的另一方面，提供了一种基于散斑原理的光学层析图像获取系统，其包括本发明提供的基于散斑原理的荧光成像照明装置、镜体、成像装置、以及采集控制装置；

所述荧光成像照明装置，产生照明光通过镜体投射在目标区域，激发的荧光通过镜体被所述成像装置收集并成像；

所述采集控制装置，用于控制所述荧光成像照明装置交替产生形成散斑照明和形成均匀光照明，并用于控制所述成像装置进行散斑照明成像和均匀光照明成像。

优选地，所述基于散斑原理的光学层析图像获取系统，其所述镜体包括二向色镜、物镜、荧光滤光片、成像透镜；照明光路上依次设置二向色镜、物镜；成像光路上依次设置物镜、二向色镜、荧光滤光片、成像透镜；所述镜体是微型荧光显微镜，工作时穿戴在实验动物身体上，固定在需要成像的部位；

所述照明装置产生的照明光由耦合光纤束传导至镜体中的二向色镜，反射后经由物镜投射到目标区域；目标区域发射的荧光经同一物镜收集并透射通过二向色镜，由成像透镜成像到图像采集装置形成荧光图像信息。

优选地，所述光纤出光端至物镜后端面的光路在物镜2倍焦距处。

按照本发明的另一个方面，提供了一种应用本发明提供的基于散斑原理的光学层析图像获取系统的成像方法，其包括以下步骤：

(1)控制所述系统的荧光成像照明装置交替产生形成散斑照明的荧光激发光和形成均匀光照明的荧光激发光，并控制所述成像装置进行散斑照明成像和均匀光照明成像，获得相同大小的散斑照明成像的图像序列ls和均匀光照明成像lu的图像序列；

(2)按照成像相差时刻不超过预设阈值的最接近的原则，将步骤(1)获得的相同大小的散斑照明成像的图像序列的每一幅is和均匀光照明成像的图像序列的每一幅iu进行关联，获得散斑照明成像与均匀光照明成像关联图像对序列；

(3)对步骤(2)中获得的散斑照明成像与均匀光照明成像关联图像对序列中的每一图像序列对(is，iu)，采用hilo光学层析算法，获得光学层析图。

优选地，所述成像方法，其步骤(1)为重复以下步骤a1、a2；或复以下步骤b1、b2；

a1.所述采集控制装置发出触发信号给混合激发光发生单元中的相干光源，使之发生相干荧光激发光，同时或等待延迟后发出触发信号给镜体中的图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于相干荧光激发光持续时间与图像采集装置采集时间之差；相干荧光激发光通过耦合光纤束传输至镜体，并在物镜的焦面处形成散斑照明，此时图像采集装置采集一幅散斑照明的图像is；采集完毕后采集控制装置发出触发信号关闭相干光源；

a2.所述采集控制装置发出触发信号给混合激发光发生单元中的非相干光源，使之发生非相干荧光激发光源，同时或等待延迟后发出触发信号给图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于非相干荧光激发光持续时间与图像采集装置采集时间之差；非相干荧光激发光通过耦合光纤束传输至镜体，并在物镜的焦面处形成均匀光照明，此时图像采集装置采集一幅均匀光照明的图像iu；采集完毕后采集控制装置发出触发信号关闭非相干光源；

b1.所述采集控制装置发出触发信号给混合激发光发生单元中的相干光源，使之发生相干荧光激发光源，同时或等待延迟后发出触发信号给镜体中的图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于相干荧光激发光持续时间与图像采集装置采集时间之差；光源发出的光通过耦合光纤束传输至镜体，并在物镜的焦面处形成散斑光照明，此时图像采集装置采集一幅散斑照明的图像is；

b2.所述采集控制装置发出触发信号给散斑衰减装置，使散斑衰减装置开始运行，同时或等待延迟后发出触发信号给图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于散斑衰减装置运行时间与图像采集装置采集时间之差；此时光通过耦合光纤束传输至镜体，并被散斑衰减装置匀化，在物镜的焦面处形成均匀光照明，此时图像采集装置采集一幅均匀光照明的图像iu。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于提供了一种基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法，能够取得下列有益效果。

(1)本发明选择具有可拓展光源的穿戴式荧光显微系统，配合混合相干光源和非相干光源等多类型光源，经过算法处理得到目标样品的光学层析图像，可大大提高成像的对比度和分辨率，扩展宽场荧光显微系统的应用范围。

(2)本发明优选方案充分利用光纤的固有的特性：相干光通过多模光纤后产生散斑效应，控制散斑的直径大小、数量进行控制，从而实现提高图像对比度的目的，因而结构简单、改造成本低,不会增加额外的散斑控制装置。

(3)本发明不改变镜体部分的任何结构和尺寸，通过对光纤束的改进，实现耐用且不会影响小动物的穿戴的可穿戴显微镜，十分方便易于实现。

附图说明

图1为本发明提供的混合照明微型荧光成像系统的结构示意图；

图2为镜体3的截面示意图；

图3为实施例1中混合光发生单元1及耦合光纤束2的结构连接示意图；

图4为实施例2中混合光发生单元1及耦合光纤束2的结构连接示意图；

图5为实施例3中采集控制单元4发出的时序信号示意图；

图6为实施例4中混合光发生单元1及耦合光纤束2的结构连接示意图；

图7为实施例4采集控制单元4发出的时序信号示意图。

图8为实施例5中混合光发生单元1及耦合光纤束2的结构连接示意图。

图9为实施例6中散斑衰减装置及耦合光纤束2的结构连接示意图；

图10为实施例6中采集控制单元4发出的时序信号示意图；

图11为实施例7中散斑衰减装置及耦合光纤束2的结构连接示意图；

图12为实施例8中散斑衰减装置及耦合光纤束2的结构连接示意图。

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：

1为混合激发光发生单元，s1为光遗传刺激光发生单元，2为耦合光纤束，3为镜体，4为采集控制单元，5为二向色镜，6为物镜，7为荧光滤光片，8为成像透镜8，9为图像采集装置，10为激光器，101为激光器10的驱动模块，11为大功率led-窄带滤光片组合，111为11的驱动模块，12为光遗传刺激激光器及，121为12的驱动模块，13为光纤合束器，14为fc连接器，18为刚性套管，202、203、204为耦合光纤束2的子束，201为耦合光纤束2的出光端，20为光阑，01为第一混合激发光发生单元，02为第二混合激发光发生单元，50为470nm激光器，501为50的驱动模块，51为470nm大功率led-窄带滤光片组合，511为51的驱动模块511，52为560nm激光器，521为52的驱动模块；53为560nm大功率led-窄带滤光片组合，531为53的驱动模块。912为散斑衰减装置，913为透镜，921为磨砂玻璃片，922为步进电机，923为压电转换器。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的基于散斑原理的荧光成像照明装置，包括耦合光纤束、以及一个或多个混合激发光发生单元，优选还包括光遗传刺激光发生单元；

所述耦合光纤束包括多个子束；所述耦合光纤束，优选由多根塑料光纤组成，优选为pmma塑料光纤。由于本发明的光源产生均匀光照明的过程可能会伴随振动或缠绕，普通玻璃光纤会产生机械疲劳，容易断裂受损；塑料光纤质轻、柔软，更耐破坏(振动和弯曲)，有着优异的拉伸强度、耐用性的特点，因此所述耦合光纤束中的每根光纤都采用pmma制成的塑料光纤，以适应本发明的特殊应用。

当所述耦合光纤束由多根多模光纤组成时，由于散斑的大小与多模光纤的参数及光在多模光纤中传输的模式有关，因此所述混合激发光发生单元，还包括用于筛选光在光纤束中传输模式的模式筛选器，所述模式筛选器滤除低阶模式保留高阶模式，形成更小的散斑颗粒，提升散斑照明的效果。

所述混合激发光发生单元，用于产生相同波长的相干荧光激发光和非相干荧光激发光；所述相干荧光激发光和非相干荧光激发光，通过耦合光纤束的相同或不同子束耦合到荧光成像系统的照明光路，所述非相干荧光激发光形成匀场照明，所述相干荧光激发光形成散斑照明。

作为一种优选方案，所述散斑照明的散斑颗粒满足以下关系：单个采样窗口中散斑颗粒的个数为2-81；且满足：

δ/δs∈[1.4，9]

其中，所述采样窗口为采用混合散斑均匀照明光学层析算法计算图像的局部对比度时所取的最小计算区域，δ为采样窗口的边长，δs为散斑颗粒的直径。

所述光纤束的数值孔径≥0.5。

作为一种优选方案，所述混合激发光发生单元，包括相干荧光激发光源和非相干荧光激发光源，所述相干荧光激发光源优选为激光器，非相干荧光激发光源优选为大功率led-窄带滤光片组合，所述相干荧光激发光源和非相干荧光激发光源通过耦合光纤束的不同子束耦合到照明光路或者经合束装置合束后通过同一子束耦合到照明光路中；所述合束装置优选为光纤合束器或空间光合束器件。

作为一种优选方案，所述混合激发光发生单元，包括相干荧光激发光源和散斑衰减装置，所述相干荧光激发光源和所述散斑衰减装置串联，通过子束耦合到照明光路中，即在光出射处、传导光纤处、光纤出射端后设置散斑衰减装置；当所述散斑衰减装置启动时抑制散斑效应，形成均匀光照明光斑；当所述散斑衰减装置关闭时，形成散斑照明。

所述光遗传刺激光发生单元，发生光遗传刺激光，通过耦合光纤束的子束耦合到照明光路中。

在hilo算法中，局部散斑对比度决定了最终图像的特征，而局部散斑对比度又是由δ/δs决定，其代表的是每个采样窗口中散斑颗粒的个数的平方根。也就是说，每个采样窗口中散斑颗粒的个数的平方根决定了最终图像的对比度等特征。经过多次实验，我们发现当在1.4-9之间时，最终的图像具有较好的图像对比度，同时也不会有明显的伪影。

本发明提供的一种基于散斑原理的光学层析图像获取系统，包括本发明提供的基于散斑原理的荧光成像照明装置、镜体、成像装置、以及采集控制装置；

所述荧光成像照明装置，产生照明光通过镜体投射在目标区域，激发的荧光通过镜体被所述成像装置收集并成像；

所述镜体包括二向色镜、物镜、荧光滤光片、成像透镜；照明光路上依次设置二向色镜、物镜；成像光路上依次设置物镜、二向色镜、荧光滤光片、成像透镜；所述镜体是微型荧光显微镜，工作时穿戴在实验动物身体上，固定在需要成像的部位。

所述照明装置产生的照明光由耦合光纤束传导至镜体中的二向色镜，反射后经由物镜投射到目标区域；目标区域发射的荧光经同一物镜收集并透射通过二向色镜，由成像透镜成像到图像采集装置形成荧光图像信息。其中，根据光纤传输和光干涉原理，相干荧光激发光在多模光纤中传输时，由于不同模式之间发生了干涉，会在光纤出射端形成散斑效应，而非相干荧光激发光不会发生干涉，所以在通过多模光纤传输后，在出射端会形成均匀的照明光斑。

所述光纤出光端至物镜后端面的光路在物镜2倍焦距处。考虑具有更小的装置体积，所述耦合光纤束的出光端到物镜后端面的距离应在2.5倍焦距以内；但是当该距离大于2倍焦距时，光纤出射的光斑在样品处会被缩小，超过2.5倍焦距时，导致照明范围缩小，不能满足视野需求当该距离小于2倍焦距时，光纤出射的光斑在样品处会被放大，这会导致散斑颗粒在样品处被放大，从而影响hilo算法的效果。

所述采集控制装置，用于控制所述荧光成像照明装置交替产生形成散斑照明和形成均匀光照明，并用于控制所述成像装置进行散斑照明成像和均匀光照明成像。

应用本发明提供的光学层析图像获取系统的成像方法，包括以下步骤：

(1)控制所述系统的荧光成像照明装置交替产生形成散斑照明的荧光激发光和形成均匀光照明的荧光激发光，并控制所述成像装置进行散斑照明成像和均匀光照明成像，获得相同大小的散斑照明成像的图像序列ls和均匀光照明成像lu的图像序列；优选为：

重复以下步骤a1、a2：

a1.所述采集控制装置发出触发信号给混合激发光发生单元中的相干光源，使之发生相干荧光激发光，同时或等待延迟后发出触发信号给镜体中的图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于相干荧光激发光持续时间与图像采集装置采集时间之差,例如数毫秒。相干荧光激发光通过耦合光纤束传输至镜体，并在物镜的焦面处形成散斑照明，此时图像采集装置采集一幅散斑照明的图像is；采集完毕后采集控制装置发出触发信号关闭相干光源。

a2.所述采集控制装置发出触发信号给混合激发光发生单元中的非相干光源，使之发生非相干荧光激发光源，同时或等待延迟后发出触发信号给图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于相干荧光激发光持续时间与图像采集装置采集时间之差,例如数毫秒。非相干荧光激发光通过耦合光纤束传输至镜体，并在物镜的焦面处形成均匀光照明，此时图像采集装置采集一幅均匀光照明的图像iu；采集完毕后采集控制装置发出触发信号关闭非相干光源。

或重复以下步骤b1、b2：

b1.所述采集控制装置发出触发信号给混合激发光发生单元中的相干光源，使之发生相干荧光激发光源，同时或等待延迟后发出触发信号给镜体中的图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于相干荧光激发光持续时间与图像采集装置采集时间之差,例如数个毫秒。光源发出的光通过耦合光纤束传输至镜体，并在物镜的焦面处形成散斑光照明，此时图像采集装置采集一幅散斑照明的图像is；

b2.所述采集控制装置发出触发信号给散斑衰减装置，使散斑衰减装置开始运行，同时或等待延迟后发出触发信号给图像采集装置，图像采集装置开始采集信号,所述延迟长度小于散斑衰减装置运行时间与图像采集装置采集时间之差。此时光通过耦合光纤束传输至镜体，并被散斑衰减装置匀化，在物镜的焦面处形成均匀光照明，此时图像采集装置采集一幅均匀光照明的图像iu；

相干荧光剂发光光源和非相干荧光激发光光源的照明持续时间一般远大于数毫秒，增加这一延迟，有利于避开光发生阶段的不稳定照明时间段，取得更好的图像采集效果。

(2)按照相差时刻不超过预设阈值的原则，将步骤(1)获得的相同大小的散斑照明成像的图像序列的每一幅is和均匀光照明成像的图像序列的每一幅iu进行关联，获得散斑照明成像与均匀光照明成像关联图像对序列；所述预设阈值，不超过成像一个成像周期。

(3)对步骤(2)中获得的散斑照明成像与均匀光照明成像关联图像对序列中的每一图像序列对(is，iu)，采用光学层析算法(hilo算法)，获得光学层析图像ihilo；可以选择实时显示或/和保存，由于计算速度非常快，可以产生几乎是实时显示的效果；也可以选择只对其中感兴趣的某段时间内采集的图像做算法处理，并实时显示或/和保存。具体地光学层析图像ihilo：

ihilo＝ihp+ηilp

其中，η为权重通过保证高低频之间的光学传递函数不发生突变计算得到，一般取值为1；ihp为焦面高频部分信息，ilp为焦面低频部分的信息；

所述焦面低频部分的信息ilp按照如下方法获取：

ilp＝f^-1{isu×lp}

其中，isu为isu的傅里叶变换，isu＝cδiu，cδ为局部空间对比度；lp为高斯低通滤波器，其截止频率为kc，kc的取值为其中δ局部空间的窗口长度。

所述局部空间对比度cδ的计算方法如下：

其中，std(id_bp)δ及μ(id_bp)δ分别表示id_bp在长度为δ的窗口中的标准差及均值，id_bp为差值图像id采用高斯带通滤波器滤波得到，差值图像id＝is-iu，高斯带通滤波器为

所述焦面高频部分信息ihp可通过均匀光照明成像的图像iu获取，如下：

ihp＝f^-1{iu×hp}

其中，iu为过均匀光照明成像的图像iu的傅里叶变换，hp是与lp互补的高通滤波器，hp+lp＝1，f^-1{}是逆傅里叶变换。

以下为实施例：

实施例1原位光遗传-单色荧光成像系统

以下以原位光遗传-单色荧光成像应用为例，详细说明本发明提供的一种改进的微型荧光成像系统，如图1、图2所示，包括荧光成像照明装置、镜体3和采集控制单元4

镜体3固定在目标身上需要成像的部位，比如头部，镜体3是一个微型荧光显微镜，包括二向色镜5、物镜6、荧光滤光片7、成像透镜8及图像采集装置9。

其荧光成像照明装置包括：混合激发光发生单元1、光遗传刺激光发生单元s1、耦合光纤束2。

混合激发光发生单元1及耦合光纤束2详细的结构及连接方式如图3所示。混合激发光发生单元1包括：激光器10及其驱动模块101，激光器10发射450nm荧光激发光，输出功率可达50mw；大功率led-窄带滤光片组合11及其驱动模块111，其发射450nm荧光激发光；

激光器10与led-窄带滤光片组合11发出的光通过光纤合束器13合成一路光，合束器的另一端通过fc连接器14与耦合光纤束2其中一个子束202连接。如果激光器或led输出空间光，那么所有的光纤耦合方式均换成对应的空间光耦合方式，空间光耦合方式为领域内常识，在此不再赘述。混合激发光发生单元1还包括安装在激光器10出光孔处的光阑20(图中未画出)，光阑20为一直径为50-100um的圆盘或环形阻挡靶，光阑20作为模式筛选器，滤掉低阶模式，保留光纤束中的高阶模式，使散斑照明时颗粒更小。

所述光遗传刺激光发生单元s1，包括：激光器12及其驱动模块121，激光器12发射633nm刺激光，功率可达100mw。所述激光器和led皆具有标准fc接口，用于与耦合光纤束2连接。

耦合光纤束2包括19根塑料光纤，材料为pmma，每根外径为125um，数值孔径0.5，长度2米，其在出光端201紧密排列，在入光端分为两个子束202和203；子束202通过标准fc连接器14与光纤合束器13的一端连接，子束203通过标准fc接口与激光器12连接。子束202包含10根光纤，其分布见横截面b-b16，子束203包含9根光纤，其分布见横截面c-c17。子束202和子束203的光纤在出光端201中混杂排列，如横截面a-a15所示，保证来自不同子束的光在出光端201的出射光斑重合。耦合光纤束2的出光端201到物镜6后端面的距离在2.5倍焦距以内，耦合光纤束2的直径0.625毫米，其子束202和203的光纤密度分别是51和46根/平方毫米。耦合光纤束2的出光端201经由一段刚性套管18包裹，通过ab胶固定在近二向色镜5处，处于物镜6后端面的2倍焦距处。

镜体3中填充聚甲醛树脂材料，用于设置光路，镜体3中沿荧光成像光路依次设置物镜6、二向色镜5、荧光滤光片7、成像透镜8及图像采集装置9。物镜6直径1.8mm,焦距1.71mm；二相色镜5尺寸5*4*1mm，500-550nm透射，其余可见光波段45°反射；荧光滤光片7是500-550nm透射带通荧光滤光片；成像透镜8直径5mm，焦距10mm，系统光学放大倍率为5.85倍；所述光纤出光端至物镜后端面的光路在物镜2倍焦距处。

所述驱动模块均与采集控制单元4连接，采集控制单元4发出ttl信号控制10,11及12按照实验要求发出光。

图像采集装置9，包括阵列图像探测器及其外围电路，所述阵列图像探测器为cmos，通过高速接口与采集控制单元4连接，采集速率应能够达到30帧/秒以上，同时将每一帧图像的采集开始时刻以脉冲形式输出给采集控制单元4进行采集记录；采集控制单元4应能与上位机(电脑)通信，通过软件编辑固定频率和占空比的ttl脉冲并由采集控制单元4输出到混合激发光发生单元1，实现对刺激光源激光器12的调制及激光器10和led-窄带滤光片组合11的时序控制。

成像过程可以描述为：在某一时刻，混合激发光发生单元1中由激光器10或者由大功率led-窄带滤光片组合11发出的450nm荧光激发光和激光器12发出的633nm光遗传刺激光，分别耦合到相应子束202和203，并同时由耦合光纤束2传导至镜体3中的二向色镜5，反射后经由物镜6投射到目标区域；目标区域神经元活动伴随发射荧光，经同一物镜6收集并透射通过二向色镜5，由成像透镜8成像到图像采集装置9形成荧光图像信息。

实施例2原位光遗传-单色荧光成像系统

以下是原位光遗传-单色荧光成像应用的另一种实现方案，以此说明本发明提供的一种改进的微型荧光成像系统，其大部分结构与实施例1中的系统相同，相同的地方不再赘述，在此只描述与实施例1不同的地方。

系统如图1、图2所示，此部分全部与实施例1相同，区别在于：

荧光成像照明装置的混合激发光发生单元1及耦合光纤束2详细的结构及连接方式如图4所示。

混合激发光发生单元1包括：激光器10及其驱动模块101，激光器10发射450nm荧光激发光，输出功率可达50mw；大功率led-窄带滤光片组合11及其驱动模块111，其发射450nm荧光激发光；

所述激光器和led皆具有标准fc接口，用于与耦合光纤束2连接。所述驱动模块均与采集控制单元4连接，采集控制单元4发出ttl信号控制10,11及12按照实验要求发出光。混合激发光发生单元1还包括安装在激光器10出光孔处的光阑20(图中未画出)，光阑20为一直径为50-100um的圆盘或环形阻挡靶，光阑20作为模式筛选器，滤掉低阶模式，保留光纤束中的高阶模式，使散斑照明时颗粒更小。

光遗传刺激光发生单元s1包括：激光器12及其驱动模块121，激光器12发射633nm刺激光，功率可达100mw。

耦合光纤束2包括19根塑料光纤，材料为pmma，每根外径为125um，数值孔径0.5，长度2米，其在出光端201紧密排列，在入光端分为三个子束202、203和204；子束202通过标准fc接口与激光器10连接，子束203通过标准fc接口与大功率led-窄带滤光片组合11连接，子束204通过标准fc接口与激光器12连接。子束202包含1根光纤，其分布见横截面b-b16，子束203包含12根光纤，其分布见横截面c-c17，子束204包含6根光纤，其分布见横截面d-d19。子束202、203和204的光纤在出光端201中混杂排列，如横截面a-a15所示，保证来自不同子束的光在出光端201的出射光斑重合。耦合光纤束2的出光端201到物镜6后端面的距离在2.5倍焦距以内，耦合光纤束2的直径0.625毫米，其子束202、203和204的光纤密度分别是20、46和31根/平方毫米。耦合光纤束2的出光端201经由一段刚性套管18包裹，通过ab胶固定在近二向色镜5处，处于物镜6后端面的2倍焦距处。

其余结构与实施例1中的系统相同，不再赘述。

实施例3原位光遗传-单色荧光成像方法

以下结合实施例1、2的系统，详细说明本发明提供的一种改进的微型荧光成像方法。

采集控制单元4应能与上位机(电脑)通信，由采集控制单元4输出通过软件编辑固定频率和占空比的ttl脉冲，一种采集控制单元4发出的时序信号如图5所示。设定激光器12、激光器10和led11在上升沿时打开并在高电平保持打开状态，在下降沿时关闭并在低电平时保持关闭状态，图像采集装置9在上升沿时开始采集一幅图像。为了描述简单，假设实验时633nm刺激光一直保持打开状态，实际使用时，应根据光遗传控制需要，编辑ttl脉冲以控制刺激光的开关时间及强度。

1.实验时，采集控制单元4发出ttl信号给混合激发光发生单元1和图像采集装置9，在t1时刻，激光器10和12打开，分别发出450nm荧光激发光和633nm刺激光，led11保持关闭，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时激光器10发出的450nm荧光激发光在成像目标区域内形成散斑照明，图像采集装置9采集一幅散斑照明的图像i1。

2.在t2时刻，激光器10遇到下降沿关闭，led11遇到上升沿打开，并保持一段时间，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时led11发出的450nm荧光激发光在成像目标区域内形成均匀光照明，图像采集装置9采集一幅均匀光照明的图像i2。

3.步骤1-2为一个周期，通过ttl信号控制循环执行步骤1-2，图像采集装置9会得到一系列散斑照明和均匀光照明相间的图像i1，i2，……in，对每相邻两幅图运用混合散斑均匀光照明光学层析算法计算出一幅层析图p1，p2，……pn-1，可以选择实时显示或/和保存，由于计算速度非常快，可以产生几乎是实时显示的效果；也可以选择只对其中感兴趣的某段时间内采集的图像做算法处理，并实时显示或/和保存。

对于图像对(i1，i2)、(i3，i2)、(i3，ik)、(i5，ik)、……(in-1，in)：采用混合散斑均匀光照明光学层析算法获得层析图p1，p2，……pn-1，方法具体如下：

每一图像序列对(is，iu)，采用光学层析算法(hilo算法)，获得光学层析图像：首先获取散斑照明图像is和均匀光照明图像iu，求出差值图像id＝is-iu，再用一个高斯带通滤波器

对id滤波，得到id_bp,定义id_bp的局部空间对比度：

其中std(id_bp)δ及μ(id_bp)δ分别表示id_bp在长度为δ的窗口中的标准差及均值。用对比度作为权重值与均匀照明图像iu相乘isu＝cδiu,于是可提取出焦面低频部分的信息：

ilp＝f^-1{isu×lp}

其中，isu是isu的傅里叶变换，lp是高斯低通滤波器，其截止频率为kc，kc的取值为

hp是与lp互补的高通滤波器，lp+hp＝1，f^-1{}是逆傅里叶变换。

同时焦面高频部分信息可以通过iu直接提取出来：

ihp＝f^-1{iu×hp}

iu是iu的傅里叶变换。

最后，融合高频部分信息和低频部分信息，可以得到焦面的光学层析图像。

ihilo＝ihp+ηilp

其中，η值通过保证高低频之间的光学传递函数不发生突变计算得到，取值为1。

实施例4双色荧光成像系统及方法

一种改进的微型荧光成像系统用于双色荧光成像，其大部分结构与实施例1中的系统相同，相同的地方不再赘述，在此只描述与实施例1不同的地方。

系统如图1、图2所示，此部分全部与实施例1相同，区别在于：荧光成像照明装置如图6所示，包括：

第一混合激发光发生单元01，包括：470nm激光器50及其驱动模块501；470nm大功率led-窄带滤光片组合51及其驱动模块511；560nm激光器52及其驱动模块521；

第二混合激发光发生单元02，包括：560nm大功率led-窄带滤光片组合53及其驱动模块531。

所述驱动模块501-531用于根据外部ttl信号调制光源，配合图像采集装置9的成像帧频，两组光源分时点亮。

激光器50与led-窄带滤光片组合51发出的470nm光通过第一光纤合束器13合成一路光，合束器的另一端通过第一fc连接器14与耦合光纤束2的一个子束202连接；激光器52与led-窄带滤光片组合53发出的560nm光通过第二光纤合束器13合成一路光，合束器的另一端通过第二fc连接器14与耦合光纤束2的一个子束203连接。如果激光器或led输出空间光，那么所有的光纤耦合方式均换成对应的空间光耦合方式，空间光耦合方式为领域内常识，在此不再赘述。混合激发光发生单元1还包括安装在激光器50和激光器52出光孔处的光阑(图中未画出)，光阑为一直径为50-100um的圆盘或环形阻挡靶。

耦合光纤束2包括37根塑料光纤，材料为pmma，数值孔径0.5，长度2米，单根光纤的直径为0.125毫米，其在出光端201紧密排列，在入光端分为两个子束202和203。子束202包含19根光纤，其分布见横截面b-b16，子束203包含18根光纤，其分布见横截面c-c17。子束202和子束203的光纤在出光端201中混杂排列，如横截面a-a15所示，保证来自不同子束的光在出光端201的出射光斑重合。耦合光纤束2的出光端201位于物镜6后端1.8倍焦距处，所耦合光纤束2的直径0.875毫米，其子束202和203的光纤密度分别是43和41根/平方毫米。耦合光纤束的出光端201经由一段刚性套管18包裹，与所述荧光成像光路通过ab胶固定。

由于采用双波长激发荧光，因此镜体3中的荧光滤光片7是500-550nm，580-620nm双带通荧光滤光片，二相色镜5在500-550nm，580-620nm透射，其余可见光波段45°反射；图像采集装置9包括阵列图像探测器及其外围电路，所述阵列图像探测器为480*752灰度阵列图像探测器。

成像过程可以描述为：激光器50、大功率led-窄带滤光片组合51、激光器52、大功率led-窄带滤光片组合53按照时序控制依次点亮，荧光激发光由耦合光纤束2传导至镜体3中的二向色镜5，反射后经由物镜6投射到目标区域；目标区域神经元活动伴随发射荧光，经同一物镜6收集并透射通过二向色镜5，由成像透镜8成像到图像采集装置9形成荧光图像信息。

以下结合上述系统，详细说明双色荧光成像的方法。

采集控制单元4应能与上位机(电脑)通信，由采集控制单元4输出通过软件编辑固定频率和占空比的ttl脉冲，一种采集控制单元4发出的时序信号如图7所示。设定激光器50、led51、激光器52和led53在上升沿时打开并在高电平保持打开状态，在下降沿时关闭并在低电平时保持关闭状态，图像采集装置9在上升沿时开始采集一幅图像。

1.实验时，采集控制单元4发出ttl信号给混合激发光发生单元1和图像采集装置9，在t1时刻，激光器50打开，发出470nm荧光激发光，其余光源保持关闭，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时激光器50发出的470nm荧光激发光在成像目标区域内形成散斑照明，图像采集装置9采集一幅470nm散斑照明的图像i1。

2.在t2时刻，激光器50遇到下降沿关闭，led51遇到上升沿打开，并保持一段时间，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时led51发出的470nm荧光激发光在成像目标区域内形成均匀光照明，图像采集装置9采集一幅470nm均匀光照明的图像i2。

3.在t3时刻，led51遇到下降沿关闭，激光器52遇到上升沿打开，并保持一段时间，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时激光器52发出的560nm荧光激发光在成像目标区域内形成散斑照明，图像采集装置9采集一幅560nm散斑照明的图像j1。

4.在t4时刻，激光器52遇到下降沿关闭，led53遇到上升沿打开，并保持一段时间，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时led53发出的560nm荧光激发光在成像目标区域内形成均匀光照明，图像采集装置9采集一幅470nm均匀光照明的图像j2。

5.步骤1-4为一个周期，通过ttl信号控制循环执行n个周期，图像采集装置9会得到一系列470nm散斑照明和均匀光照明相间的图像i1，i2，……i2n，和一系列560nm散斑照明和均匀光照明相间的图像j1，j2，……j2n。对每两幅图im和im+1(m＝1,2,3，…，2n-1)运用混合散斑均匀光照明光学层析算法计算出一幅470nm的光学层析图p1，p2，……pn；对每两幅图jm和jm+1(m＝1,2,3，…，2n-1)运用混合散斑均匀光照明光学层析算法计算出一幅560nm的光学层析图m1，m2，……mn。可以选择实时显示或/和保存，由于计算速度非常快，可以产生几乎是实时显示的效果；也可以选择只对其中感兴趣的某段时间内采集的图像做算法处理，并实时显示或/和保存。

实施例5原位光遗传-双色荧光成像系统及方法。

一种改进的微型荧光成像系统用于原位光遗传-双色荧光成像，其大部分结构与实施例4中的系统相同，相同的地方不再赘述，在此只描述与实施例4不同的地方。

系统如图1、图2所示，此部分全部与实施例4相同，区别在于：荧光成像照明装置如图8所示，在实施例4的基础上还包括光遗传刺激光发生单元：一个633nm激光器12及其驱动模块121，用于光遗传刺激。

因此耦合光纤束2在入光端需分为三个子束202,203及204，耦合光纤束2包括37根塑料光纤，单根光纤的直径为0.125毫米。子束202包含13根光纤，其分布见横截面b-b16，子束203包含12根光纤，其分布见横截面c-c17，子束204包含12根光纤，其分布见横截面d-d19。三个子束的光纤在出光端201中混杂排列，如横截面a-a15所示，保证来自不同子束的光在出光端201的出射光斑重合。耦合光纤束2的出光端201位于物镜6后端2倍焦距处，所耦合光纤束2的直径0.875毫米，其子束202、203和2/4的光纤密度分别是46/42和42根/平方毫米。耦合光纤束的出光端201经由一段刚性套管18包裹，与所述荧光成像光路通过快干胶固定。

成像过程与实施例4完全相同，只是在实施例4的基础上增加了633nm激光器12作为光遗传刺激光源，其受到一段固定频率和占空比的ttl信号调制，ttl脉冲信号来自采集控制单元4。

原位光遗传-双色荧光成像方法与实施例4完全相同，只是在实施例4的基础上增加了激光器12的ttl信号，实际实验时，可根据光遗传控制需要，编辑ttl脉冲的频率和占空比，在此不再赘述。

实施例6激光散斑衰减器，原位光遗传-单色荧光成像系统及方法

以下以激光散斑衰减器(laserspecklereducer,lsr)作为散斑衰减装置，实现原位光遗传-单色荧光成像为例，详细说明本发明提供的混合照明微型荧光成像系统，其大部分结构与实施例1中的系统相同，相同的地方不再赘述，在此只描述与实施例1不同的地方。

散斑衰减装置及耦合光纤束2详细的结构及连接方式如图9所示。其荧光成像照明装置，包括：

混合激发光发生单元1包括：激光器10及其驱动模块101，激光器10发射450nm荧光激发光，输出功率可达50mw；所述散斑衰减装置为lsr912,激光器10发出的光经过第一透镜913汇聚后入射到lsr912上，经过lsr912调制后，再由第二透镜913准直后出射，第三透镜913用于将光束耦合至耦合光纤束中，14为fc连接器或者光纤耦合器。

所述光遗传刺激光发生单元s1，包括：激光器12及其驱动模块121，激光器12发射633nm刺激光，功率可达100mw。所述激光器均具有标准fc接口，用于与耦合光纤束2连接。

所述驱动模块与lsr均被采集控制单元4控制，采集控制单元4发出ttl信号控制10,12及912按照实验要求运行或关闭。

以下结合上述系统，详细说明成像的方法。

采集控制单元4应能与上位机(电脑)通信，由采集控制单元4输出通过软件编辑固定频率和占空比的ttl脉冲，一种采集控制单元4发出的时序信号如图10所示。设定激光器12、激光器10和lsr912在上升沿时打开并在高电平保持打开状态，在下降沿时关闭并在低电平时保持关闭状态，图像采集装置9在上升沿时开始采集一幅图像。为了描述简单，假设实验时633nm刺激光一直保持打开状态，实际使用时，应根据光遗传控制需要，编辑ttl脉冲以控制刺激光的开关时间及强度。

1.实验时，采集控制单元4发出ttl信号给发光单元1和图像采集装置9，在t1时刻，激光器10和12打开，分别发出450nm荧光激发光和633nm刺激光，lsr912保持关闭，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时由于lsr912保持关闭，激光器10发出的450nm荧光激发光直接透过lsr912，没有被调制，因此激光经过耦合光纤束2后在成像目标区域内形成散斑照明，图像采集装置9采集一幅散斑照明的图像i1。

2.在t2时刻，lsr912遇到上升沿打开，并保持一段时间，同时或等待数毫秒的延迟后图像采集装置9开始采集信号。此时由于lsr912处于工作状态，发出的450nm荧光激发光被lsr912调制后再进入耦合光纤束2，激光散斑效应被削弱，激光在成像目标区域内形成均匀光照明，图像采集装置9采集一幅均匀光照明的图像i2。

3.步骤1-2为一个周期，通过ttl信号控制循环执行步骤1-2，图像采集装置9会得到一系列散斑照明和均匀光照明相间的图像i1，i2，……in，对每相邻两幅图运用混合散斑均匀光照明光学层析算法计算出一幅层析图p1，p2，……pn-1，可以选择实时显示或/和保存，由于计算速度非常快，可以产生几乎是实时显示的效果；也可以选择只对其中感兴趣的某段时间内采集的图像做算法处理，并实时显示或/和保存。

实施例7磨砂玻璃片

振动或旋转的磨砂玻璃片(扩散片)也可以作为散斑衰减装置，以下以旋转的磨砂玻璃片作为散斑衰减装置，实现原位光遗传-单色荧光成像为例，详细说明本发明提供的一种改进的微型荧光成像系统，其大部分结构与实施例6中的系统相同，相同的地方不再赘述，在此只描述与实施例6不同的地方。

如图11所示，散斑衰减装置包括磨砂玻璃片921和步进电机922及其电源、驱动(未画出)，磨砂玻璃片921材质为bk7，粒度1500目。磨砂玻璃片921固定在步进电机922上，步进电机922可以带着磨砂玻璃片921旋转。步进电机922的驱动接收采集控制单元4发出的指令，根据需要控制步进电机922旋转或停止旋转。本实施例中，最大旋转速度为468rpm。

当采集控制单元4控制步进电机922带动磨砂玻璃片921旋转时，激光照射在转动的磨砂玻璃片921上产生部分相干光，能够抑制散斑效应，此时目标区域产生均匀光照明；当采集控制单元4控制步进电机922停止转动时，目标区域产生散斑照明，由此产生两种照明方式，具体成像方法同实施例6，不再赘述。

实施例8压电转换器

将光纤固定在振动的马达或者压电转换器(piezoelectrictransducer，pzt)上也可以作为散斑衰减装置，以下以光纤缠绕在pzt上作为散斑衰减装置，实现原位光遗传-单色荧光成像为例，详细说明本发明提供的一种改进的微型荧光成像系统，其大部分结构与实施例6中的系统相同，相同的地方不再赘述，在此只描述与实施例6不同的地方。

如图12所示，散斑衰减装置包括一个压电转换器(pzt)923及其电源、驱动(未画出)，pzt923的驱动频率为0-40khz，驱动电压为0-20v。耦合光纤束2的一个子束202缠绕在pzt923上并固定好。pzt923的驱动接收采集控制单元4发出的指令，根据需要控制pzt923振动的频率和电压。

当采集控制单元4控制pzt923振动时，会对子束202中传输的光起到扰模作用，从而抑制散斑效应，此时目标区域产生均匀光照明；当采集控制单元4控制pzt923停止振动时，目标区域产生散斑照明，由此产生两种照明方式，具体成像方法同实施例6，不再赘述。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。