一种pkd抑制剂与抗癌药物的组合物及其用途
技术领域
[0001]
本发明属于口腔鳞癌治疗技术领域，涉及一种pkd小分子抑制剂在阻断口腔鳞癌细胞耐药性中的应用。
背景技术：[0002]
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,oscc)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占比约达90％以上，每年约有500000新增的oscc病例，近年来其发病率有逐年增高的趋势。在过去30年中，晚期oscc的5年生存率仅有40％-50％。
[0003]
紫杉醇(paclitaxel,ptx)是一种能稳定微管蛋白的细胞毒试剂，被广泛应用于治疗各种肿瘤。ptx与传统抗肿瘤药物不一样，它是通过干扰微管蛋白的稳定性，抑制肿瘤细胞的分裂和增殖，起到抗肿瘤的作用。
[0004]
肿瘤多药耐药(multi-drug resistance，mdr)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时,对结构和作用机制完全不同的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药性的现象，是阻碍肿瘤治疗成功的主要原因之一，也是导致肿瘤治疗复发的重要因素。
[0005]
癌症的治疗一直以来是世界性难题，抗肿瘤药物也在不停的进展之中。细胞毒性药物目前仍是肿瘤治疗药物的主题，但存在对实体瘤疗效差，不良反应大，易产生耐药性等问题。
技术实现要素：[0006]
有90％以上的癌症死亡中都存在着耐药现象，针对肿瘤耐药这一临床上肿瘤治疗大难题，本发明提供了一种对抗耐药肿瘤的解决方案。
[0007]
近年来，小分子抑制剂靶向癌症作为一种新的治疗手段正在成为肿瘤治疗药物研发与研究的。新近开发了几种新的靶向蛋白激酶d(pkd)的小分子抑制剂，包括crt0066101，crt5，cid755673和kb-nb142-70(evans im,bagherzadeh a,charles m,raynham t,ireson c,boakes a et al.characterization of the biological effects of a novel protein kinase d inhibitor in endothelial cells[j].biochem j,2010；429:565-572.george km,frantz mc,bravo-altamirano k,lavalle cr,tandon m,leimgruber s et al.design,synthesis,and biological evaluation of pkd inhibitors[j].pharmaceutics,2011；3:186-228.)。这些化合物在体外细胞实验中显示出抑制pkd活性的作用。目前尚无pkd小分子抑制剂在抑制口腔鳞癌耐药细胞中的应用报道。
[0008]
本发明提供了一种组合物，它包括蛋白激酶d抑制剂和抗癌药物。
[0009]
其中，蛋白激酶d抑制剂和抗癌药物的配伍用量，可以通过具体的使用环境进行适当调整，例如可以在质量配比为20-60:1，进一步可以选自35-45:1，具体如40：1、41:1、42:1、43:1等等，不限于上述范围。
[0010]
本发明还提供了上述组合物在制备治疗鳞癌产品中的用途。
[0011]
其中，所述鳞癌为耐药鳞癌。
[0012]
所述鳞癌为对自紫杉醇或多西紫杉醇，或紫杉醇或多西紫杉醇的结构类似物或药学上可接受的盐。
[0013]
其中，所述鳞癌选自口腔鳞癌。
[0014]
进一步可以选自舌鳞癌。
[0015]
本发明还提供了上述组合物在制备抗耐药癌细胞产品中的用途。
[0016]
进一步地，所述耐药癌细胞选自对自紫杉醇或多西紫杉醇，或紫杉醇或多西紫杉醇的结构类似物或药学上可接受的盐耐药的癌细胞。
[0017]
其中，所述癌细胞选自鳞癌。
[0018]
本发明还提供了蛋白激酶d抑制剂和抗癌药物在制备治疗鳞癌或抗鳞癌细胞的联合用药中的用途。
[0019]
本发明还提供了蛋白激酶d抑制剂在治疗口腔鳞癌产品中的用途。
[0020]
其中，所述蛋白激酶d抑制剂选自crt006610、crt5、cid755673、kb-nb142-70中的一种或两种以上的组合。
[0021]
其中，所述抗癌药物选自自紫杉醇或多西紫杉醇，或紫杉醇或多西紫杉醇的结构类似物或药学上可接受的盐。
[0022]
本发明组合物或产品中，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
[0023]
本发明中所述的“辅料”，是药物制剂中除主药以外的一切附加材料的总称，辅料应当具备如下性质：(1)对人体无毒害作用，几无副作用；(2)化学性质稳定，不易受温度、ph、保存时间等的影响；(3)与主药无配伍禁忌，不影响主药的疗效和质量检查；(4)不与包装材料相互发生作用。
[0024]
所述“辅助性成分”，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。例如牛磺酸。
[0025]
药学上可以接受的辅料，如纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0026]
本发明中发现，pkd小分子抑制剂crt0066101可抑制蛋白激酶d2(pkd2)的磷酸化水平，增强口腔鳞癌耐药细胞对化疗药物的敏感性，并诱导细胞凋亡，从而有效抑制口腔鳞癌耐药细胞的产生，本发明填补了小分子抑制剂在口腔鳞癌耐药领域的空白，可用于制备抑制口腔鳞癌耐药细胞增殖的小分子药物，解决口腔鳞癌细胞对靶向化疗药物耐药而导致治疗失效、病情复发的问题。在此基础上，联合治疗模式可以提高oscc治疗的敏感性和特异性，为临床治疗提供全新的视角和发挥更重要的作用，因此具有广泛的应用价值。
[0027]
小分子抑制剂crt0066101在动物异种移植模型中没有显示出任何痛苦迹象(说明没有毒副作用)，且没有发现在正常组织结构功能上的副作用(即对导管功能的影响)。
附图说明
[0028]
图1是本发明实施例提供的小分子抑制剂crt0066101在阻断口腔鳞癌细胞耐药性中的应用方法流程图。
[0029]
图2是本发明实施例提供的人口腔鳞癌耐药细胞株cal-27/ptx建立方法流程图。
[0030]
图3是本发明实施提供的不同浓度化疗药物紫杉醇(ptx)对cal-27/ptx细胞抑制率曲线图。
[0031]
图4是本发明实施例提供的cal-27/ptx细胞pkd表达情况示意图。
[0032]
图5是本发明不同浓度的小分子抑制剂crt0066101对pkd2磷酸化活性的影响图。
[0033]
图6本发明实施例提供的是小分子抑制剂crt0066101增强cal-27/ptx细胞对ptx敏感性结果图。
[0034]
其中，图2表明，本发明采用药物持续接触、浓度递增诱导法，经ptx诱导cal-27细胞10个月，成功建立人口腔鳞癌cal-27/ptx耐药细胞株。
[0035]
图3表明，cal-27/ptx的ic50由亲本细胞的2.999ng/ml上升到了57.77ng/ml，表明cal-27/ptx细胞对ptx产生了耐药，ri为19.26属于中度耐药(ri>20为高度耐药，5>ri>15为中度耐药，ri<5为低度耐药)。
[0036]
图4表明，蛋白激酶pkd1、pkd2、pkd3在cal-27/ptx耐药细胞和亲本细胞cal-27中表达有差异，其中pkd1和pkd3在耐药细胞和亲本细胞中表达无明显差异，而pkd2在耐药细胞中表达明显升高(p****<0.0001)，表明pkd2在口腔鳞癌细胞耐药细胞中具有重要作用。
[0037]
图5表明，不同浓度的crt0066101处理cal-27/ptx耐药细胞24小时后，pkd2磷酸化活化程度均显著下降，而pkd2表达基本无差异，其中经过3μm浓度crt0066101处理24小时的cal-27/ptx耐药细胞的pi明显降低(p****<0.0001)。说明小分子抑制剂crt0066101能够抑制pkd2激酶的磷酸化水平，3μm浓度的crt0066101可以作为后续实验的最适浓度。
[0038]
图6表明经过3μm浓度crt和30ng/ml紫杉醇共同作用24小时的耐药细胞凋亡明显增加，说明pkd小分子抑制剂抑制处理后，耐药细胞pkd2激酶的磷酸化水平显著被抑制，耐药细胞对化疗药物ptx的敏感性明显增加。
具体实施方式
[0039]
本发明具体实施方式中，pkd小分子抑制剂为crt0066101；口腔鳞癌耐药细胞为对靶向药物耐药的口腔鳞癌细胞；靶向药物选自紫杉醇；口腔鳞癌耐药细胞包括耐紫杉醇细胞cal-27/ptx。本发明的口腔鳞癌细胞cal-27为实验室冻存，常规培养于rpmi-1640完全培养液内[含小牛血清10％(体积分数)、青霉素105u/l、链霉素100mg/l]。
[0040]
实施例1
[0041]
本发明提供的pkd小分子抑制剂在阻断口腔鳞癌细胞耐药性中的应用方法，包括(如图1所示，)：
[0042]
s101，人口腔鳞癌耐药细胞株cal-27/ptx建立；
[0043]
s102，cck8检测不同浓度ptx对cal-27/ptx的细胞抑制率
[0044]
s103，western blot检测cal-27/ptx细胞pkd表达情况；
[0045]
s104，western blot检测不同浓度pkd小分子抑制剂crt0066101作用cal-27/ptx细胞pkd2磷酸化活化表达情况；
[0046]
s105，流式细胞术检测crt0066101和紫杉醇(ptx)共同作用cal-27/ptx细胞的凋亡率。
[0047]
人口腔鳞癌耐药细胞株cal-27/ptx建立的方法，包括：
[0048]
取对数生长期cal-27细胞培养至贴壁70-80％时，以20ng/ml的紫杉醇为初始浓度，持续诱导24小时，后撤去含药培养基，更换无药培养基并每天换液去除死细胞，至细胞恢复生长，继续传代至细胞状态良好，重复上述操作三次，再逐渐增加紫杉醇浓度，如此反复，直至最终紫杉醇诱导浓度为400ng/ml，共历时10个月。最终得到耐药细胞株cal-27/ptx。
[0049]
cck8检测不同浓度ptx对cal-27/ptx的细胞抑制率的方法，包括：
[0050]
步骤一，种板：取对数生长期的细胞cal-27和cal-27/ptx，胰酶消化离心收集，用培养基重悬细胞计数，制成3
×
104个/ml细胞悬液，按每孔100μl接种于96孔板中。
[0051]
步骤二，配制不同浓度的ptx：将ptx储存液用培养基分别稀释至10个浓度梯度:5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，400ng/ml，500ng/ml，且每个浓度梯度设置5个复孔。
[0052]
步骤三，药物处理：将贴壁的cal-27和cal-27/ptx细胞培养基吸掉，每孔分别加入200μl培养基，其中加药组分别加入不同浓度的含ptx的培养基，空白对照组和阴性对照组加无药培养基。
[0053]
步骤四，cck8检测：药物和细胞共培养72小时后，吸去孔里培养基，再分别加入含有100μl新鲜培养基(含有10μlcck8溶液)，继续培养4小时，用酶标仪测定450nm处的吸光度值(即od值)，并绘制曲线，用graphpad prism软件计算细胞对ptx的ic
50
，并计算耐药指数ri。
[0054]
ri＝耐药细胞ic
50
/亲本细胞ic
50
[0055]
western blot检测口腔鳞癌耐药细胞pkd表达情况的方法包括：
[0056]
步骤一，蛋白样本的制备：将cal-27，cal-27/ptx细胞按1
×
106密度种在6孔板里，培养细胞至90％密度后，用胰酶消化并收集细胞。用预冷的磷酸盐缓冲液pbs洗细胞两次后，加入100μl lysis buffer(50mm tris
–
hcl,ph 8.0；5mm edta；150mm nacl；0.5％nonidet p-40；0.5mm pmsf；and 0.5mm dtt)4℃裂解细胞30分钟，将裂解液转移至新的ep管中，4℃，12500g离心20分钟，收集上清移至另一新ep管中。取少量上清用bca蛋白含量测定试剂盒测定蛋白含量。取50μg加入5
×
nodding buffer混匀后，100℃水浴锅里煮沸5分钟(使蛋白变性)储存在-20℃备用。
[0057]
步骤二，sds-page电泳：本发明所用的分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，80v恒压30分钟，110v恒压1小时-2小时。
[0058]
步骤三，转膜：电泳结束后，将胶取出，放入转移缓冲液(25mm tris碱,0.2m甘氨酸,20％甲醇ph 8.5)中浸泡30分钟，同时取面积稍大于胶的pvdf膜先浸泡于甲醇中5分钟(用于活化膜)，再放入转移缓冲液中浸泡20分钟。将膜于胶夹在两层滤纸中间，压紧固定后置于半干电转移槽中，20v恒压转移1小时。
[0059]
步骤四，抗原封闭：转移结束后，将pvdf膜于37℃封闭1小时(封闭液：5％的脱脂奶粉和含0.1％的tween 20的tbs)，或4℃封闭过夜，tbst(1x tbs,0.1％tween-20)洗膜10分钟。
[0060]
步骤五，加入一抗：分别加入5％脱脂奶粉稀释至适合浓度的一抗：pkd1抗体(1：1000)，pkd2抗体(1：1000)，pkd3抗体(1：1000)，β-actin抗体(1：1000)，室温下孵育2小时或4℃过夜，tbst洗膜15分钟
×
3次。
[0061]
步骤六，加入二抗：分别加入5％脱脂奶粉稀释至适合浓度的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1:2000)，羊抗鼠二抗(1:2000)，37℃孵育1小时，tbst洗膜15分钟
×
3次。
[0062]
步骤七，化学发光：用ecl发光液试剂(easyecl western blot kit)显色，曝光，显影，chemidoc xrs(biorad)采集图像。
[0063]
western blot检测不同浓度pkd小分子抑制剂crt0066101作用cal-27/ptx细胞pkd2磷酸化活化表达情况的方法，包括：
[0064]
步骤一，蛋白样本的制备：将cal-27/ptx细胞按1
×
106密度种在6孔板里，培养细胞至70％密度后，加入不同浓度小分子抑制剂crt0066101(1μm，2μm，3μm，5μm)分别作用24小时，用胰酶消化并收集细胞。用预冷的磷酸盐缓冲液pbs洗细胞两次后，加入100μl lysis buffer(50mm tris
–
hcl,ph 8.0；5mm edta；150mm nacl；0.5％nonidet p-40；0.5mm pmsf；and 0.5mm dtt)4℃裂解细胞30分钟，将裂解液转移至新的ep管中，4℃，12500g离心20分钟，收集上清移至另一新ep管中。取少量上清用bca蛋白含量测定试剂盒测定蛋白含量。取50μg加入5
×
nodding buffer混匀后，100℃水浴锅里煮沸5分钟(使蛋白变性)储存在-20℃备用。
[0065]
步骤二，sds-page电泳：本发明所用的分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，80v恒压30分钟，110v恒压1小时-2小时。
[0066]
步骤三，转膜：电泳结束后，将胶取出，放入转移缓冲液(25mm tris碱,0.2m甘氨酸,20％甲醇ph 8.5)中浸泡30分钟，同时取面积稍大于胶的pvdf膜先浸泡于甲醇中5分钟(用于活化膜)，再放入转移缓冲液中浸泡20分钟。将膜于胶夹在两层滤纸中间，压紧固定后置于半干电转移槽中，20v恒压转移1小时。
[0067]
步骤四，抗原封闭：转移结束后，将pvdf膜于37℃封闭1小时(封闭液：5％的脱脂奶粉和含0.1％的tween 20的tbs)，或4℃封闭过夜，tbst(1x tbs,0.1％tween-20)洗膜10分钟。
[0068]
步骤五，加入一抗：分别加入5％脱脂奶粉稀释至适合浓度的一抗：pkd2抗体(1：1000)，p-pkd2抗体(1：1000)，β-actin抗体(1：1000)，室温下孵育2小时或4℃过夜，tbst洗膜15分钟
×
3次。
[0069]
步骤六，加入二抗：分别加入5％脱脂奶粉稀释至适合浓度的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1:2000)，羊抗鼠二抗(1:2000)，37℃孵育1小时，tbst洗膜15分钟
×
3次。
[0070]
步骤七，化学发光：用ecl发光液试剂(easyecl western blot kit)显色，曝光，显影，chemidoc xrs(biorad)采集图像，并计算磷酸化指数(pi)。
[0071]
pi＝density of phospho-pkd2 band/density of total pkd2 band
[0072]
流式细胞术检测crt0066101和紫杉醇(ptx)共同作用cal-27/ptx细胞的凋亡率的方法，包括：
[0073]
步骤一，细胞样本的制备：将cal-27/ptx细胞按1
×
106密度种在6孔板里，培养细胞至70％密度后，加入3μm的crt0066101和30ng/ml紫杉醇分别/共同作用24小时，用不含edta胰酶消化并收集细胞。
[0074]
步骤二，将收集的细胞用pbsf(pbs+5％fbs)洗两次，加入凯基凋亡试剂盒中的binding buffer 500μl重悬细胞，再加入annexin v-fitc 5μl，pi 5μl，室温避光孵育15分钟后用流式细胞仪fc500检测。
[0075]
实验结果：
[0076]
不同浓度ptx对cal-27/ptx的细胞抑制率
[0077]
参阅图3，将cal-27，cal-27/ptx细胞按3
×
103密度种在96孔板里，培养过夜后，加入不同浓度ptx(:5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，400ng/ml，500ng/ml)分别作用72小时，采用cck8法检测cal-27和cal-27/ptx细胞的ic
50
和耐药指数ri。具体的，cal-27/ptx的ic50由亲本细胞的2.999ng/ml上升到了57.77ng/ml，最终耐药指数ri为19.26(ri>20为高度耐药，5>ri>15为中度耐药，ri<5为低度耐药)，所以该株cal-27/ptx细胞对ptx属于中度耐药。
[0078]
耐药细胞cal-27/ptx中pkd表达情况
[0079]
参阅图4，将cal-27，cal-27/ptx细胞按1
×
106密度种在6孔板里，培养细胞至90％密度后，用胰酶消化并收集细胞。western blot检测两组细胞中pkd1、pkd2、pkd3表达。发明方法的cal-27/ptx细胞的pkd2表达明显高于亲本细胞cal-27(p****<0.0001)。
[0080]
不同浓度pkd小分子抑制剂crt0066101cal-27/ptx细胞pkd2磷酸化活化表达情况
[0081]
参阅图5，将cal-27/ptx细胞按1
×
106密度种在6孔板里，培养细胞至70％密度后，加入不同浓度小分子抑制剂crt0066101(1μm，2μm，3μm，5μm)分别作用24小时，用胰酶消化并收集细胞。western blot检测不同处理细胞中pkd2磷酸化活化和表达情况。具体的，3μm的crt0066101处理cal-27/ptx细胞24小时，pi指数降低最明显，并且用方差分析，其结果具有统计学意义(p****<0.0001)。
[0082]
crt0066101和紫杉醇(ptx)共同作用cal-27/ptx细胞的凋亡率
[0083]
参阅图6，将cal-27/ptx细胞按1
×
106密度种在6孔板里，培养细胞至70％密度后，加入3μm的crt0066101和30ng/ml ptx(换算后两者质量比值为：1233.9ng：30ng)分别/共同作用24小时，用不含edta胰酶消化并收集细胞。流式细胞术检测不同处理组细胞凋亡率。具体的，crt0066101+ptx共同作用细胞的凋亡率(97.27％)明显高于crt0066101(13.61％)或ptx(23.27％)作用的细胞，并且用方差分析，其结果具有统计学意义。
[0084]
实施例2
[0085]
取crt0066101和ptx，适当的填充剂，混合后，制备胶囊剂。
[0086]
实施例3
[0087]
取crt0066101和ptx，适当的填充剂、粘合剂、润滑剂，制备颗粒剂。
[0088]
实施例4
[0089]
取crt0066101，适当填充剂、粘合剂、润滑剂，制备成片剂a；取ptx，适当填充剂、粘合剂、润滑剂，制备成片剂b；将片剂a和片剂b联合包装或联合使用。
[0090]
实施例5
[0091]
取crt0066101和ptx，适当的溶剂、助溶剂等，制备注射剂。