一种丝蛋白神经导管及其制备方法与流程

[0001]
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种丝蛋白神经导管及其制备方法。


背景技术：

[0002]
周围神经损伤是临床上常见的的病症，自体移植常用于周围神经缺损的桥接，然而有限的可用性和供体部位的发病率仍然存在，因此为了克服这一限制，研究人员通过开发生物材料为基础的神经导管来辅助周围神经再生。人工导管已被证明有能力填补神经间隙，合成的神经导管有望替代自体移植物，生物材料的改进在促进神经再生和功能恢复方面具有很大的潜力。因此，所研制的神经导管不仅具有良好的生物学性能，还应该为神经组织的再生提供更好的微环境。
[0003]
目前已经有多种不同材料制备的神经导管，并在动物实验和临床研究中取得相对良好的效果，然而同自体的神经导管相比，其性能仍然存在较大差距。如何根据仿生理念，将不同诱导信号引入神经导管的设计，是进一步优化神经导管功能，改善外周神经损伤修复的有效途径。
[0004]
丝蛋白由于其优异的生物相容性，可降解性以及低的炎症反应，被广泛应用于不同组织的修复和再生，在神经修复领域也获得良好的前期结果，然而，如何以丝蛋白为基质，实现不同诱导信号的主动引入仍然存在较大技术障碍。目前研究者主要通过电纺丝技术以及定向冷冻技术实现取向信号的引入，其同神经导管的有效结合以及技术的稳定性方面存在较大问题，需要考虑新的制备方法来获得具有更好取向诱导信号的丝蛋白导管。
[0005]
在我们团队的研究中，通过将丝蛋白编织技术和丝蛋白成膜技术的结合，成功获得力学性能良好的复合导管，并将其应用于小血管的替代，然而由于丝蛋白溶液的不稳定性，如何稳定获得不溶于水的丝蛋白纤维-薄膜复合导管仍需要在理解丝蛋白机制的基础上进行技术的改进和突破；另外我们通过电场诱导丝蛋白纳米纤维定向迁移，成功获得具有取向结构的丝蛋白凝胶或海绵，并将其成功应用于创面修复，以及神经细胞的诱导迁移，但上述凝胶或者海绵力学性能差，难以满足临床应用要求，因此本发明基于团队对丝蛋白的深刻理解，希望通过不同技术的结合和优化，制备外部为力学性能优异、满足应用要求，内部为取向丝蛋白海绵，提供取向诱导信号的复合神经导管，以获得更好的修复效果。本发明的关键不仅要解决丝蛋白编织管和丝蛋白薄膜在水相环境中不溶性的稳定获得问题，同时要解决取向海绵高效引入导管的技术问题。


技术实现要素：

[0006]
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有取向诱导信号的丝蛋白神经导管及其制备方法。
[0007]
本发明提供了一种丝蛋白神经导管，包括：导管部分与填充在导管部分内的填充海绵；所述导管部分包括导管基体与复合在导管基体表面的丝蛋白薄膜；所述导管基体由
丝蛋白纤维编织形成；所述填充海绵由具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶形成。
[0008]
本发明还提供了一种丝蛋白神经导管的制备方法，包括：
[0009]
s1)将丝蛋白纤维进行编织得到导管基体；
[0010]
s2)将所述导管基体浸泡在丝蛋白溶液中，得到导管部分；
[0011]
s3)将具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶与导管部分结合，冷冻干燥后，得到丝蛋白神经导管。
[0012]
优选的，所述丝蛋白纤维为80～100旦脱胶蚕丝；所述编织的编织角为45
°
～60
°
；编织速度为30～60r/min；所述导管基体的内径为0.5～15mm。
[0013]
优选的，所述丝蛋白溶液中丝蛋白的浓度为2～10wt％；所述丝蛋白包括丝蛋白纳米纤维；所述丝蛋白纳米纤维的质量为丝蛋白质量的0％～40％。
[0014]
优选的，所述丝蛋白纳米纤维的直径为10～20nm；长度为1～2μm。
[0015]
优选的，所述s2)具体为：
[0016]
将所述导管基体浸泡在丝蛋白溶液中，在10℃～90℃蒸发，得到导管部分。
[0017]
优选的，所述丝蛋白纳米纤维凝胶按照以下步骤进行制备：
[0018]
将丝蛋白纳米纤维水溶液40℃～60℃浓缩至浓度为6～12wt％的第一丝蛋白纳米纤维水溶液；
[0019]
将第一丝蛋白纳米纤维水溶液在20℃～35℃浓缩至浓度为18～24wt％的第二丝蛋白纳米纤维水溶液；
[0020]
将所述第二丝蛋白纳米纤维水溶液加水稀释至浓度为0.2～4wt％的第三丝蛋白纳米纤维水溶液，然后在50℃～70℃密封孵育，得到丝蛋白纳米纤维凝胶。
[0021]
优选的，所述步骤s3)具体为：
[0022]
将丝蛋白纳米纤维凝胶利用电场诱导，得到具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶；
[0023]
然后将导管部分沿着取向方向插进具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶中，使其充满导管部分，取出后，冷冻干燥，得到丝蛋白神经导管；
[0024]
或者：将导管部分沿着平行于电极的方向浸入丝蛋白纳米纤维凝胶中，然后进行电场处理，取出后，冷冻干燥，得到丝蛋白神经导管。
[0025]
优选的，所述电场诱导与电场处理的电场强度各自独立地为10～120v；时间各自独立地为5～60min。
[0026]
优选的，所述冷冻干燥具体为：先在-20℃～-50℃冷冻1～12h后，然后在-2℃～-90℃冷冻干燥24～72h。
[0027]
本发明提供了一种丝蛋白神经导管，包括：导管部分与填充在导管部分内的填充海绵；所述导管部分包括导管基体与复合在导管基体表面的丝蛋白薄膜；所述导管基体由丝蛋白纤维编织形成；所述填充海绵由具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶形成。与现有技术相比，本发明通过导管内部设置有具有取向结构的丝蛋白纳米纤维海绵，具有与神经轴突方向一致的取向结构，能够提供取向诱导信号，促进神经细胞的迁移增值，也能指导神经纤维的再生和延伸，显著提高神经导管的功能；因此本发明通过丝蛋白管和丝蛋白取向海绵的结合，解决力学性能和取向诱导的问题。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例1步骤(1)中得到的编织的导管的扫描电镜图；
[0029]
图2为本发明实施例1步骤(2)中得到的丝蛋白纤维-丝蛋白膜复合导管的扫描电镜图；
[0030]
图3为本发明实施例2中得到的丝蛋白神经导管的扫描电镜图；
[0031]
图4为本发明实施例3中得到的丝蛋白神经导管内部取向丝蛋白海绵的扫描电镜图；
[0032]
图5为本发明实施例3中得到的丝蛋白神经导管移植移植大鼠坐骨神经缺损后再生神经与自体移植的电生理波形图。
具体实施方式
[0033]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034]
本发明提供了一种丝蛋白神经导管，包括：导管部分与填充在导管部分内的填充海绵；所述导管部分包括导管基体与复合在导管基体表面的丝蛋白薄膜；所述导管基体由丝蛋白纤维编织形成；所述填充海绵由具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶形成。
[0035]
本发明通过在丝蛋白纤维编织形成的导管基体表面复合丝蛋白薄膜，提高了导管的力学性能；导管内部设置有具有取向结构的丝蛋白纳米纤维海绵，具有与神经轴突方向一致的取向结构，能够提供取向诱导信号，促进神经细胞的迁移增值，也能指导神经纤维的再生和延伸，显著提高神经导管的功能；因此本发明通过丝蛋白管和丝蛋白取向海绵的结合，解决力学性能和取向诱导的问题。
[0036]
本发明还提供了一种上述丝蛋白神经导管的制备方法，包括：s1)将丝蛋白纤维进行编织得到导管基体；s2)将所述导管基体浸泡在丝蛋白溶液中，得到导管部分；s3)将具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶与导管部分结合，冷冻干燥后，得到丝蛋白神经导管。
[0037]
本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
[0038]
将丝蛋白纤维进行编织得到导管基体；所述丝蛋白纤维优选为蚕丝，更优选为脱胶蚕丝，再优选为80～100旦脱胶蚕丝；所述编织的编织角优选为45
°
～60
°
；所述编织的速度优选为30～60r/min，更优选为40～50r/min，再优选为45r/min；所述编织时的齿轮比优选为(60～100)：(20～60)，更优选为(70～90)：(30～50)，再优选为80：40；所述编织的骨架结构优选为针织结构或编织结构；所述编织优选在光滑金属模具上进行；所述光滑金属模具的直径优选为0.5～15mm，使得得到的导管基体的内径优选为0.5～15mm。
[0039]
将所述导管基体浸泡在丝蛋白溶液中，优选将带有模具的导管基体浸泡在丝蛋白溶液中；所述丝蛋白溶液中丝蛋白的浓度优选为2～10wt％；在本发明提供的一些实施例中，所述丝蛋白溶液的浓度优选为2wt％；在本发明提供的一些实施例中，所述丝蛋白溶液的浓度优选为5wt％；在本发明提供的另一些实施例中，所述丝蛋白溶液的浓度优选为10wt％；所述丝蛋白溶液中的丝蛋白包括丝蛋白纳米纤维；所述丝蛋白纳米纤维的质量优选为丝蛋白总质量的0％～40％，更优选为丝蛋白总质量的0.5％～30％，再优选为丝蛋白
总质量的0.5％～10％，最优选为丝蛋白总质量的0.8％～4％；利用丝蛋白纳米纤维诱导普通丝蛋白构象转变速率；所述丝蛋白纳米纤维的直径优选为10～20nm；所述丝蛋白纳米纤维的长度优选为1～2μm；所述导管基体与丝蛋白溶液的体积比优选为1：(1.5～3)，更优选为1：(2～2.5)，再优选为1：2；将导管基体浸泡在丝蛋白溶液中，优选在10℃～90℃蒸发，随着丝蛋白溶液中水分的缓慢蒸发，会在导管基体上形成一层不溶性丝蛋白膜，通过纳米纤维诱导和温度诱导的协同作用调控丝蛋白的构象转百年速率，最终使得薄膜稳定获得在水中的稳定性，制备出力学性能良好、在水中稳定存在的神经导管的导管部分。
[0040]
将具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶与导管部分结合；在本发明中，可按照以下方法进行结合：将丝蛋白纳米纤维凝胶利用电场诱导，得到具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶；然后将导管部分沿着取向方向插进具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶中，使其充满导管部分；其中，所述丝蛋白纳米纤维凝胶优选按照以下步骤进行：将丝蛋白纳米纤维水溶液40℃～60℃浓缩至浓度为6～12wt％的第一丝蛋白纳米纤维水溶液；将第一丝蛋白纳米纤维水溶液在20℃～35℃浓缩至浓度为18～24wt％的第二丝蛋白纳米纤维水溶液；将所述第二丝蛋白纳米纤维水溶液加水稀释至浓度为0.2～4wt％的第三丝蛋白纳米纤维水溶液，然后在50℃～70℃密封孵育，得到丝蛋白纳米纤维凝胶；所述丝蛋白纳米纤维同上所述，在此不再赘述；所述电场诱导的电场强度优选为10～120v，更优选为10～100v；所述电场诱导的时间优选为5～60min；然后利用导管部分和凝胶力学性能的差异，将导管部分沿着凝胶取向方向插入具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶中，使得凝胶充满导管。
[0041]
或者按以下步骤结合：将导管部分沿着平行于电极的方向浸入丝蛋白纳米纤维凝胶中，然后进行电场处理；所述丝蛋白纳米纤维凝胶同上所述，在此不再赘述；所述电场处理的强度优选为10～120v；所述电场处理的时间优选为5～60min；通过电场处理从而使得导管内部的纳米纤维定向移动，并在导管内部靠近正极的部分形成取向凝胶，所占体积大约为1/3，优选重复上述浸入与电场处理步骤，直到具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶充满导管部分90％以上。
[0042]
具有取向结构的丝蛋白纳米纤维凝胶与导管部分结合后，冷冻干燥，得到丝蛋白神经导管；所述冷冻干燥优选具体为：先在-20℃～-50℃冷冻1～12h后，然后在-2℃～-90℃冷冻干燥24～72h。通过冷冻干燥，使得凝胶转变为具有取向结构的多孔海绵，最终获得外部为导管，内部为取向海绵的复合神经导管。
[0043]
本发明制备的丝蛋白神经导管没有加入任何有毒物质，其全部成分均为天然蛋白质，相容性好；并且通过调控丝蛋白的构象转变速率，在水溶液中直接稳定获得不溶于水的丝蛋白纤维-薄膜复合的导管部分，提高了导管的力学性能，使其满足临床应用需求，导管内部为取向丝蛋白纳米纤维海绵，具有与神经轴突方向一致的取向结构，能够提供取向诱导信号，促进神经细胞的迁移增值，也能指导神经纤维的再生和延伸，显著提高神经导管的功能；通过丝蛋白管和丝蛋白取向海绵的结合，解决力学性能和取向诱导的问题；再者，本发明整个技术均基于基础的物理处理过程，不存在化学反应和苛刻制备条件，有利于技术的产业转化和功能丰富，尽管是温和的物理调控，但其相关参数和工艺融合的关键步骤，均基于对丝蛋白本质的深入理解，特别是丝蛋白组装机制的深入理解，不同参数的整合共同决定导管最终性能，而非简单的物理方法的罗列，因此技术存在显著的创新性。
[0044]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种丝蛋白神经导管及
其制备方法进行详细描述。
[0045]
以下实施例中所用的试剂均为市售。
[0046]
实施例中所用丝蛋白纳米纤维的直径为10nm，长度为1μm；
[0047]
实施例中丝蛋白纳米纤维凝胶的制备方法为：将丝蛋白纳米纤维(直径10～20nm，长度为1～2μm)为水溶液40℃～60℃浓缩至浓度为6～12wt％的第一丝蛋白纳米纤维水溶液；将第一丝蛋白纳米纤维水溶液在20℃～35℃浓缩至浓度为18～24wt％的第二丝蛋白纳米纤维水溶液；将所述第二丝蛋白纳米纤维水溶液加水稀释至浓度为0.2～4wt％的第三丝蛋白纳米纤维水溶液，然后在50℃～70℃密封孵育，得到丝蛋白纳米纤维凝胶；
[0048]
所述实施例中的丝蛋白可根据reversible hydrogel-solution system of silkwith high beta-sheet content(biomacromolecules 2014,15,3044-3051)制备。
[0049]
实施例1
[0050]
(1)选取光滑的直径为3mm第一模具，用熟丝线100旦脱胶蚕丝，通过纺织机器在其上面织出骨架结构，编织角为45
°
，速度为45r/min，齿轮比为80：40；编织的骨架结构为编织结构。
[0051]
(2)将编织好的导管完全浸没于2％丝蛋白水溶液(丝蛋白纳米纤维的含量为丝蛋白总质量的0.8％)中，导管与丝蛋白水溶液的体积比为1：2，在10℃的条件下，随着丝蛋白溶液中水分的缓慢蒸发，会在骨架上形成一层不溶性的丝素蛋白膜，获得丝蛋白纤维-丝蛋白膜复合导管。
[0052]
(3)制备0.2％取向的丝蛋白纳米纤维凝胶，电场诱导的基本参数为：电场强度10v，处理时间5分钟。随后将丝蛋白纤维-丝蛋白膜复合导管沿着取向方向插进凝胶基质，使得凝胶充满导管内部。放入-20℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥48h取出，获得填充有取向丝蛋白海绵的丝蛋白神经导管。
[0053]
利用扫描电子显微镜对步骤(1)中得到的编织的导管进行分析，得到其扫描电镜图，如图1所示。
[0054]
利用扫描电子显微镜对步骤(2)中得到的丝蛋白纤维-丝蛋白膜复合导管进行分析，得到其扫描电镜图，如图2所示。
[0055]
实施例2
[0056]
(1)选取光滑的直径为5mm第一模具，用熟丝线100旦脱胶蚕丝，通过纺织机器在其上面织出骨架结构，编织角为60
°
，速度为45r/min，齿轮比为80：40；编织的骨架结构为编织结构。
[0057]
(2)将编织好的导管完全浸没于10％丝蛋白溶液(丝蛋白纳米纤维的含量为丝蛋白质量的4％)中，导管与丝蛋白水溶液的体积比为1：2，在90℃的条件下，随着丝素溶液中水分的缓慢蒸发，会在骨架上形成一层不溶性的丝素蛋白膜，获得丝蛋白纤维-丝蛋白膜复合导管。
[0058]
(3)将导管沿着平行于电极的方向放置并浸入4％丝蛋白纳米纤维凝胶中，随后对凝胶进行电场处理，电场强度100v，处理时间30min，从而使得导管内部的纳米纤维定向移动，并在导管内部靠近正极的部分形成取向凝胶，所占体积大约在1/3，随后继续在导管无取向凝胶的部分浸满凝胶，重复电场处理过程，直至90％以上的空间被取向凝胶占据，将导管取出，获得复合导管。放入-20℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中-50℃冷冻干燥48h
取出将凝胶转变为取向海绵，最终获得具有取向信号的丝蛋白神经导管。
[0059]
利用扫描电子显微镜对实施例2中得到的丝蛋白神经导管进行分析，得到其扫描电镜图，如图3所示。
[0060]
实施例3
[0061]
(1)选取光滑的直径为10mm第一模具，用熟丝线100旦脱胶蚕丝，通过纺织机器在其上面织出骨架结构，编织角为60
°
，速度为45r/min，齿轮比为80：40；编织的骨架结构为编织结构。
[0062]
(2)将编织好的导管完全浸没于5％丝蛋白溶液(丝蛋白纳米纤维的含量为丝蛋白总质量的2％)中，导管与丝蛋白水溶液的体积比为1：2，在90℃的条件下，随着丝素溶液中水分的缓慢蒸发，会在骨架上形成一层不溶性的丝素蛋白膜，获得丝蛋白纤维-丝蛋白膜复合导管。
[0063]
(3)制备4％取向的丝蛋白纳米纤维凝胶，电场诱导的基本参数为：电场强度100v，处理时间60min。随后将复合丝蛋白导管沿着取向方向插进凝胶基质，使得凝胶充满导管内部。放入-20℃冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥48h取出，获得填充有取向丝蛋白海绵的丝蛋白神经导管。
[0064]
利用扫描电子显微镜对实施例3中得到的丝蛋白神经导管进行分析，得到其内部取向丝蛋白海绵的扫描电镜图，如图4所示。
[0065]
将实施例3中得到的丝蛋白神经导管移植移植大鼠坐骨神经缺损后再生神经与自体移植的电生理波形图，如图5所示。神经导管移植到大鼠缺损部位12周后检测到电信号传导。
[0066]
综上所述，本发明公开了一种取向丝素蛋白神经导管及其制备方法，从材料和仿生结构设计入手，设计了分别由蚕丝基导管和取向丝蛋白纳米纤维支架复合的神经导管。将蚕丝编织纤维增强的丝蛋白导管利用具有取向结构的丝蛋白凝胶进行填充，通过冷冻干燥技术将凝胶转变成取向海绵，获得具有取向诱导信号的神经导管。本发明所述制备过程条件温和，创新性地将不同丝蛋白制备技术有机结合，获得具有取向信号，力学性能满足应用需求的神经导管，修复性能同人自体神经相当，具有良好的临床应用价值。