一种田基黄提取物及其在制备抗新型冠状病毒药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一种田基黄提取物及其药物用途。


背景技术：

[0002]
2019新型冠状病毒属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与sars-cov和mers-cov有明显区别。经呼吸道飞沫和密切接触传播。感染并发病者以发热、干咳和乏力为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。自2019年底爆发疫情以来，导致全球死亡人数已超100万。但针对该病毒目前尚未有特效药物及疫苗，主要依靠自身免疫能力的提高。中医药在防治传染性疾病中具有特色优势，挖掘抗新冠病毒的中药成分，对抗击新冠疫情具有重要作用。
[0003]
田基黄又名地耳草，民间别名有小元宝草、雀舌草、七层塔等，为藤黄科金丝桃属植物hypericum japomicum thumb的干燥全草。始载于清代何克谏撰写的《生草药性备要》，广泛分布于长江流域及以南各地，原植物主产于广东、广西、四川、贵州以及江西等地。目前已从该植物中分离鉴定得到色原烯类、二肽类、双苯吡酮类、间苯三酚类衍生物以及黄酮类等多种化学成分。现代药理作用研究表明，田基黄具有抑菌、抗病毒、抗肝损伤、抗氧化以及抑制癌细胞等多种药理功效。


技术实现要素：

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本发明的目的是提供一种田基黄提取物，并公开其在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
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本发明的田基黄提取物由以下方法制备：
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田基黄药材水提取液，上大孔树脂柱，依次以水，20％乙醇和60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇后，即得。
[0007]
洗脱方法优选：上大孔树脂柱，依次以8-12倍柱体积的水和20％乙醇洗脱，再以3-7倍柱体积的60％乙醇洗脱。最优选：依次以10倍柱体积的水和20％乙醇洗脱，再以5倍柱体积的60％乙醇洗脱。
[0008]
田基黄药材水提取液的制备方法可为：田基黄药材按料液比1:10，水煎煮提取2-3次，提取0.5-1小时，过滤即得。提取次数优选3次，时间优选0.5小时。
[0009]
经试验，结果表明：该田基黄提取物在18.75-75μg/ml浓度范围，对新型冠状病毒(sars-cov-2)感染vero e6细胞致细胞病变具有明显抑制作用。有望用于防治新型冠状病毒(sars-cov-2)感染。
[0010]
本发明的田基黄提取物主要含有槲皮苷、异槲皮苷、白前苷b、槲皮素等黄酮类成分，经对单体化合物测定，白前苷b、槲皮素均具有一定的抗2019新型冠状病毒作用，槲皮苷、异槲皮苷未检测到抗该病毒作用。本提取物的作用与白前苷b、槲皮素单体化合物比较，
作用明显增强，提示其中的化合物槲皮苷、异槲皮苷虽然未检测到抗病毒作用，但与白前苷b、槲皮素在一起，各化合物之间可能具有某些协同作用，提高了后二者的活性强度。
附图说明
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图1是田基黄水提取液hplc图谱；
[0012]
图2是田基黄水提取液水洗脱部位的hplc图谱；
[0013]
图3是田基黄水提取液20％乙醇洗脱部位的hplc图谱；
[0014]
图4是田基黄水提取液60％乙醇洗脱部位的hplc图谱；
[0015]
图5是异槲皮苷hplc图谱；
[0016]
图6是槲皮苷hplc图谱；
[0017]
图7是白前苷b的hplc图谱；
[0018]
图8是槲皮素hplc图谱；
[0019]
图9是白前苷b抗新型冠状病毒药效结果曲线图；
[0020]
图10是田基黄提取物抗新型冠状病毒药效结果曲线图；
[0021]
图11是槲皮素对新型冠状病毒药效检测结果曲线图；
具体实施方式
[0022]
以下结合具体的实施例对本发明作进一步说明。
[0023]
实施例1
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取田基黄药材1千克，水煎煮提取3次，每次10倍量水，提取0.5小时，滤过，滤液放冷，上d101大孔树脂柱(含树脂1000克)，依次以10倍柱体积的水和20％乙醇洗脱，再以5倍柱体积的60％乙醇洗脱。分别收集各部分洗脱液，浓缩回收乙醇冻干，即得。
[0025]
将各洗脱部位和各对照品分别配成适当浓度的溶液(16ug/ml-60ug/ml)，0.45μm滤膜滤过，备用。
[0026]
色谱柱为十八烷基键合相硅胶柱；pda检测器；流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液，0～100min线性梯度(乙腈5％
→
27％)洗脱；流速1.0ml/min；检测波长350nm，进样量10μl。得hplc图谱如图1到图8所示。
[0027]
实施例2
[0028]
实验目的：在细胞水平评价药物抗新型冠状病毒(sars-cov-2)效果。
[0029]
实验材料：实施例1中所得到的各洗脱部分冻干后得到的田基黄提取物，白前苷b为从田基黄水提取物中柱层析得到，纯度大于95％。浓度见表1；veroe6细胞，由广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室保存；.病毒sars-cov-2，滴度为tcid
50
＝10-6
/100μl，由广州海关技术中心bsl-3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室)-80℃保存。使用病毒滴度为100tcid
50
。
[0030]
实验方法：无菌96孔培养板,每孔加入100μl浓度为2
×
105cells/ml veroe6细胞，37℃5％co2培养24小时；培养板实验组和病毒对照组加入100tcid
50
病毒液100μl/孔，37℃，5％co2培养箱吸附2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；受试药物稀释成表1中的各个浓度，每个浓度3个复孔，100μl/孔加入上述药液；同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)、病毒对照(阴性对照)；细胞37℃,5％c02孵箱孵育3-4天；光学显微镜下观察细胞病变
(cpe),细胞出现病变程度按以下6级标准记录：
“-”
无病变出现；
“±”
为细胞病变少于10％；“+”为细胞病变约25％；“++”为细胞病变约50％；“+++”为约75％的细胞出现病变：“++++”为75％以上病变。采用reed-muench法或graphpad prism5.0计算半数有效浓度(ic
50
)。判断药效标准：具有50％的抑制病毒cpe的浓度视为有效浓度。以上实验操作均在bsl-3实验室内完成。
[0031]
表1药物名称、实验浓度和分组
[0032][0033]
实验结果：通过观察细胞病变(cpe)并记录实验结果，采用reed-muench法或graphpad prism 5.0计算半数有效浓度(ic
50
)，实验结果见表2、表3、图9和图10。
[0034]
表2白前苷b抗新型冠状病毒药效结果
[0035][0036]
实验结果表明白前苷b在最大无毒浓度60μg/ml，对新型冠状病毒(sars-cov-2)感染vero e6细胞致细胞病变具有抑制作用。
[0037]
表3田基黄提取物抗新型冠状病毒药效结果
[0038][0039]
实验结果表明田基黄提取物在18.75-75μg/ml浓度范围，对新型冠状病毒(sars-cov-2)感染vero e6细胞致细胞病变具有显著的抑制作用。
[0040]
田基黄水提取液上柱后的水洗脱液、20％乙醇洗脱液，浓缩冻干后的提取物无抗病毒效果。
[0041]
结果表明，田基黄水提取液上柱后的60％乙醇洗脱得到的田基黄提取物，对新型
冠状病毒(sars-cov-2)感染vero e6细胞致细胞病变具有显著的抑制作用，且明显优于其所含成分白前苷b。
[0042]
实施例3
[0043]
一、实验目的
[0044]
在疫情应急期间，在细胞水平评价药物抗新型冠状病毒(sars-cov-2)效果。
[0045]
二、实验材料：
[0046]
槲皮苷、异槲皮苷、槲皮素，具体稀释比例或浓度见表4。veroe6细胞，由广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室保存。病毒sars-cov-2,滴度为tcid
50
＝10-6
/100μl,由广州海关技术中心卫生检疫研究所国家生物安全检测重点实验室(p3实验室)-80℃保存；使用病毒滴度为100tcid
50
。
[0047]
三、实验方法：
[0048]
(一)受试药物
[0049]
表4药物名称、实验浓度和分组
[0050][0051]
(二)受试药物抗病毒实验
[0052]
无菌96孔培养板,每孔加入100μl浓度为2
×
105cells/ml veroe6细胞，37℃5％co2培养24小时；培养板实验组和病毒对照组加入100tcid
50
病毒液100μl/孔，37℃5％co2培养箱吸附2h；2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；受试药物稀释成表1中的各个浓度，每个浓度3个复孔，100μl/孔加入上述药液；同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)和病毒对照(阴性对照)；细胞37℃,5％c02孵箱孵育3-4天；光学显微镜下观察细胞病变(cpe),细胞出现病变程度按以下6级标准记录：
“-”
无病变出现；
“±”
为细胞病变少于10％；“+”为细胞病变约25％；“++”为细胞病变约50％；“+++”为约75％的细胞出现病变：“++++”为75％以上病变。采用reed-muench法或graphpad prism8.0计算半数有效浓度(ic
50
)。判断药效标准：具有50％的抑制病毒cpe的浓度视为有效浓度。
[0053]
(三)实验条件：以上实验操作均在bsl-3实验室内完成。
[0054]
四、实验结果
[0055]
通过观察细胞病变(cpe)并记录实验结果，采用reed-muench法或graphpad prism8.0计算半数有效浓度(ic
50
)，实验结果如表5和图11所示。
[0056]
表5槲皮素抗新型冠状病毒药效结果
[0057][0058]
结果表明，槲皮素在体外对新型冠状病毒(sars-cov-2)感染vero e6细胞致细胞病变有抑制作用，但槲皮苷、异槲皮苷对新冠病毒均无抑制作用。