一种猪塞内卡病毒疫苗及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及一种猪塞内卡病毒疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。


背景技术：

[0002]
塞内卡病毒(seneca valley virus，svv)属于小rna病毒科，塞内卡病毒属。临床症状以鼻部、蹄部出现水泡及溃烂为主，与fmdv、vsv和svd感染症状相似；感染仔猪有一定的死亡率(30％～70％)。
[0003]
2002年首次于美国发现，随后世界范围内几乎同时暴发该病，证明其有进一步扩大暴发范围的可能性，尤其作为新发病，没有相应的疫苗和适当的治疗措施，一旦发生流行，造成的后果难以估计。因此，该病的疫苗研究迫在眉睫，应用市场广泛。
[0004]
2015年，广东猪场大面积出现水泡样症状，排除fmdv和svd感染后pcr检测svv阳性，并成功分离到svv病毒。2016-2018年，国内其他省份也陆续有发病报道(湖北、福建、河南、山东、黑龙江、浙江等地)。猪塞内卡病毒病目前在我国多个省份集中暴发，并且这种暴发也出现在世界不同国家和地区，预示该病十分有可能造成全球范围内的大规模发病或流行。该病与口蹄疫等水泡性疾病从临床症状上难以区分，既能够造成直接的经济损失，也为口蹄疫的防控带来重大干扰。因此，若大规模发病，对养猪业造成的危害是难以估量的。猪塞内卡病毒感染仔猪可导致较高的死亡率(最高可达70％)，病情恢复之后也会因为临床病变导致增重迟缓。因此研发高效的塞内卡病毒灭活疫苗能够有效预防和降低塞内卡病毒对我国养猪业的危害，同时还能够为口蹄疫的防控甚至净化起到重大辅助作用。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于利用本发明人自行分离、保存的一株塞内卡病毒，经bhk-21细胞悬浮培养，获得高抗原含量的病毒液，经纯化、灭活后配以适当佐剂配制灭活疫苗，用于预防猪的塞内卡病。此外，经研究发现，本发明的塞内卡病毒株开放阅读框(orf)的氨基酸序列具有特殊性，并决定了该毒株的免疫原性，该特征包括：
[0006]
1.svv-sd-2018株塞内卡病毒orf片段与现公开的svv毒株比较存在特征性氨基酸位点排列；
[0007]
2.svv-sd-2018株塞内卡病毒orf片段与国内svv参考株相比，核苷酸序列同源性为95.9％～99.6％，编码的氨基酸序列同源性为98.5％～99.5％；
[0008]
3.svv-sd-2018株塞内卡病毒orf片段与国外svv参考株相比，核苷酸序列同源性为93.4％～98.5％，编码的氨基酸序列同源性为97.7％～99.4％。
[0009]
本发明的技术方案
[0010]
1.一种猪塞内卡病毒疫苗，其特征在于该疫苗含有svv-sd-2018株塞内卡病毒；该株病毒已于2020年10月30日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmcc no.20715；
[0011]
所述svv-sd-2018株病毒的orf片段存在特征性氨基酸位点排列，导致病毒编码区
域蛋白空间构象改变，大大增强了病毒对悬浮细胞株bhk-2014s的感染力并提高了产毒效率。
[0012]
2.本发明所述的一种猪塞内卡病毒疫苗，其特征在于所述svv-sd-2018株病毒的orf片段与国内、国外参考毒株相比：分别有在其第165、495、575、770、1119、1476、1609、1854、2065、2104、2109位和第165、495、575、770、1119、1469、1476、1609、1854、2065、2104、2109位发生了突变；其核苷酸同源性分别为95.9％～99.6％、93.4％～98.5％；氨基酸同源性分别为98.5％～99.5％、97.7％～99.4％。
[0013]
3.本发明所述的一种猪塞内卡灭活疫苗，其特征在于该疫苗制备步骤包括：
[0014]
(1)细胞培养：将bhk-21细胞采用全悬浮培养的方式进行传代和培养；
[0015]
(2)毒种繁殖：将svv-sd-2018株病毒接种bhk-21细胞，通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；
[0016]
(3)抗原纯化：将制备的病毒液进行纯化；
[0017]
(4)抗原灭活：将纯化的病毒液使用灭活剂进行灭活；
[0018]
(5)配苗：加入水包油佐剂进行配苗。
[0019]
本发明有益效果
[0020]
本发明涉及一种猪塞内卡病毒疫苗及其制备方法。本发明所述利用猪塞内卡病毒svv-sd-2018分离毒株用于猪塞内卡灭活疫苗的制备，该毒株的orf具有独特的氨基酸位点排列，大大增强了对悬浮细胞株bhk的感染力，产毒效率高且具备良好的免疫原性。将svv-sd-2018株经悬浮细胞bhk进行增殖、并经纯化的抗原、加入佐剂制备成猪塞内卡病毒灭活疫苗。疫苗安全、效力试验结果显示：使用本发明的灭活疫苗免疫猪后无不良反应，且均能产生良好的保护力。结果说明利用本发明的毒株制备的疫苗安全有效，可用于预防猪塞内卡病的发生。
[0021]
本发明涉及的生物材料资源信息
[0022]
本发明的毒株：塞内卡病毒(seneca valley virus，svv)svv-sd-2018株为本发明人由我国山东分离获得，该病毒已于2020年10月30日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmcc no.20715。
[0023]
本发明具体实施方式
[0024]
1.svv-sd-2018株orf片段pcr扩增与基因特征性序列
[0025]
(1)pcr扩增
[0026]
设计5对引物用于扩增svv-sd-2018株的orf片段(对应全基因组669～7214bp)，引物序列如下：
[0027]
表1引物序列
[0028][0029]
(2)基因特征性序列
[0030]
1)将svv-sd-2018株orf片段与11株国内流行毒株进行氨基酸序列比对，其存在多个氨基酸位点的变异，具体结果见表2。
[0031]
表2 svv-sd-2018株与国内11个参考株orf片段氨基酸序列的比较
[0032][0033]
2)将svv-sd-2018株orf片段国外流行毒株进行氨基酸序列比对，同样存在多个氨基酸位点的变异，具体结果见表3。
[0034]
表3 svv-sd-2018株与国外6个参考株orf片段氨基酸序列的比较
[0035]
[0036]
2.全悬浮培养bhk-21细胞株的驯化
[0037]
(1)bhk-21细胞贴壁培养阶段的驯化(降低血清)
[0038]
从液氮罐中取bhk-21贴壁细胞种子(bhk-21细胞，cvcc no.cl6，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，在t75培养瓶中加入10％新生牛血清的细胞生长液，进行bhk-21细胞复苏，并贴壁培养，使用逐步降低血清的贴壁培养基进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％。
[0039]
(2)bhk-21细胞(低血清培养基)的悬浮驯化
[0040]
将已适应低血清状态的bhk-21贴壁细胞继续使用三角培养瓶进行培养，当bhk-21细胞连续5代在细胞形态、增殖速率等方面一致时完成细胞的悬浮驯化，收获部分驯化成功的bhk-21细胞f42并冻存，此时细胞的增殖效率已稳定到1.4
×
106个细胞/ml左右，细胞活力达到96％以上。驯化成功后的悬浮细胞标记为bhk-2014s株。
[0041]
本发明使用的生物反应器为applikon公司30l～2000l细胞生物反应器。进一步对生物反应器全悬浮培养工艺进行优化，确定了培养参数：溶氧40％、ph7.0
±
0.1、转速110～120r/min，实现了bhk-21细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养。
[0042]
3.bhk-21全悬浮细胞的制备
[0043]
(1)细胞摇瓶培养：细胞复苏后以8.0
×
105个细胞/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，以120r/min转速于37℃、5％co2培养箱中培养。待细胞生长至4.0
×
106个细胞/ml时，进行传代，按照比例补加新鲜培养基，使细胞初始密度为8.0
×
105个细胞/ml。
[0044]
(2)细胞接种及放大培养：将细胞培养罐清洗干净，121℃灭菌30min，灭菌结束后，完成空罐溶氧电极的100％点校正。选择生长旺盛的bhk-21细胞，接种细胞培养罐，接种密度为8.0
×
105～1.3
×
106个细胞/ml，37℃培养，待细胞密度高于4.0
×
106个细胞/ml时，补加培养基，继续培养至细胞密度达到4.0
×
106个细胞/ml时，将细胞培养罐内细胞悬液转移至新细胞培养罐培养，接种密度为8.0
×
105～1.3
×
106个细胞/ml。
[0045]
4.制苗用毒液(生产种毒)的制备
[0046]
(1)接毒：待bhk-2014s株全悬浮培养至密度约4.0
×
106个细胞/ml，补加含0.5％～1％新生牛血清的bhk-21培养基(约占培养基体积的1/3)，将细胞密度稀释至2.0
×
106个细胞/ml～3.0
×
106个细胞/ml，按moi＝0.01～0.5比例接种svv-sd-2018株病毒(cgmcc no.20715)。
[0047]
(2)收获病毒液：在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待细胞活率降至50％以下时，收获细胞培养毒液作为生产用毒种。
[0048]
5.病毒液的纯化
[0049]
将收获的病毒液经澄清或连续流离心除去细胞碎片等杂质，根据svv的大小，选用100kd分子截留值的超滤膜得到纯化病毒液(抗原)。
[0050]
6.病毒液(抗原)灭活
[0051]
制备的病毒液(抗原)按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯净性检验，应无细菌、霉菌、支原体，且svv-sd-2018株病毒含量≥10
9.5
tcid
50
/ml。使用bei灭活，检验合格后，进行乳化配苗。
[0052]
将检验合格的svv-sd-2018株病毒置于容器内，加入工作浓度为0.1％～0.5％的bei，30～37℃灭活24～48小时，灭活结束后，向病毒液中添加终浓度为0.2％的硫代硫酸钠
溶液，搅拌1小时终止灭活。将svv-sd-2018株灭活样品取样，按5％接种量接种bhk-21细胞，盲传3代进行灭活检测。
[0053]
7.乳化配苗
[0054]
将水包油佐剂缓缓注入到制得的svv-sd-2018株病毒灭活抗原中，按抗原:佐剂体积比9:1进行混合乳化，配制成猪塞内卡病毒灭活疫苗。
[0055]
8.疫苗成品检验
[0056]
(1)无菌检验按《中国兽药典》附录(中华人民共和国兽药典二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016年，本发明称《中国兽药典》)进行，应符合规定。
[0057]
(2)安全性试验
[0058]
1)替代动物试验：将疫苗按0.5ml/只腹腔接种balb/c小鼠，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现。
[0059]
2)本体动物试验：用14～21日龄健康易感仔猪5头，每头肌肉注射疫苗4.0ml，连续观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0060]
(3)效力试验(任择其一)
[0061]
1)血清学方法：用14～21日龄健康易感仔猪10头，其中5头各肌肉注射疫苗1.0ml，另5头不接种作为对照。免疫后21日，每头猪分别采血，分离血清，测定猪塞内卡病毒中和抗体效价，免疫猪塞内卡病毒疫苗的中和抗体效价均应不低于1:32，对照猪的塞内卡病毒中和抗体效价均应不高于1:4。
[0062]
2)免疫攻毒法：用14～21日龄健康易感仔猪10头，其中5头各肌肉注射疫苗1.0ml，另5头不接种作对照。免疫后21日，用svv-sd-2018株攻击，每头猪滴鼻2.0ml、肌肉注射3.0ml(含5.0
×
10
7.5
tcid
50
)。攻毒后观察14日，对照猪应至少4头发病，免疫猪应全保护。
实施例
[0063]
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
[0064]
实施例1——svv-sd-2018株orf片段的基因特性
[0065]
svv-sd-2018株结构蛋白为orf区域，使用5对引物对orf片段进行pcr扩增并测序，经同源性比较可知该片段的氨基酸序列与国内参考毒株/流行毒株相比，在其第165、495、575、770、1119、1476、1609、1854、2065、2104和2109位发生了突变；与国外参考毒株/流行毒株相比，在其第165、495、575、770、1119、1469、1476、1609、1854、2065、2104和2109位发生了突变。
[0066]
实施例2——生产用毒种制备
[0067]
将svv-sd-2018株毒种按moi＝0.01～0.5比例加入生长良好的bhk-21细胞悬浮培养，培养温度37℃，待细胞活率低于50％时收获，定量分装，冷冻保存，注明收获日期，毒种代数等。病毒含量稳定维持在10
9.5
tcid
50
/ml以上。
[0068]
实施例3——猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备
[0069]
1.细胞培养和接毒
[0070]
(1)摇瓶培养工艺
[0071]
1)不同感染复数对病毒含量的影响初始细胞密度为2.5
×
106个细胞/ml的bhk-21细胞，按moi为0.01、0.05、0.1、0.5分别接种svv-sd-2018株，接种后24小时、36小时、48小时
取样，测定病毒含量。
[0072]
2)接毒时细胞密度对病毒含量的影响将bhk-21细胞接种摇瓶，当细胞密度为2.0
×
106个细胞/ml、2.5
×
106个细胞/ml、3.0
×
106个细胞/ml、3.5
×
106个细胞/ml、4.0
×
106个细胞/ml时，分别按moi＝0.05接种svv-sd-2018株，接种后24小时、36小时、48小时取样，测定病毒含量。
[0073]
3)不同收获时间对病毒含量的影响将bhk-21细胞接种摇瓶，当细胞密度为2.0
×
106、3.0
×
106个细胞/ml时，按moi＝0.05接种svv-sd-2018株，接种后8小时、16小时、24小时、32小时、40小时、48小时取样，测定病毒含量。
[0074]
通过摇瓶工艺摸索，确定细胞密度为2.0
×
106～3.0
×
106个细胞/ml时，按感染复数moi＝0.01～0.5接种病毒，培养24～48小时收获的细胞培养物病毒含量最高。
[0075]
(2)细胞罐接毒工艺
[0076]
将摇瓶培养的健康bhk-21细胞接种于30l细胞培养罐，并最终放大至2000l细胞培养罐。bhk-21细胞在2000l细胞培养罐培养至密度为2.5
×
106个细胞/ml时，按感染复数moi＝0.05接种svv-sd-2018株后继续培养。接毒后24小时、36小时、48小时取样测病毒含量。
[0077]
表4 2000l细胞培养罐接毒试验病毒含量测定结果
[0078][0079]
试验结果表明svv-sd-2018株病毒在细胞培养罐病毒增殖能力稳定，病毒含量均不低于10
9.5
tcid
50
/ml。从而说明利用细胞培养罐进行svv-sd-2018株大规模培养是可行的。
[0080]
2.观察与收获
[0081]
接毒后每12h取样观察细胞状态，当细胞活力低于50％时，收获毒液，置于-20℃。按《中国兽药典》附录作无菌检验，并抽样1份测定病毒含量，病毒含量不低于10
9.5
tcid
50
/ml。
[0082]
3.抗原纯化
[0083]
将收获的细胞悬液经澄清或连续流离心除去细胞碎片等杂质，根据svv的大小，选用100kd分子截留值的超滤膜进行纯化，将纯化的病毒液贮存于2～8℃。
[0084]
4.抗原灭活
[0085]
取svv-sd-2018株病毒液，分装12瓶，每瓶100ml。然后分成3组，每组4份，其中第1组每瓶分别加入bei使其终浓度为0.01％、第2组终浓度为0.1％、第3组终浓度为0.5％，置37℃恒温摇床中灭活。于灭活后16h、20h、24h和28h每组各取1瓶，分别加入终浓度为2％硫代硫酸钠溶液终止灭活。取样进行灭活检验。本实验重复进行一次。
[0086]
取灭活后的病毒液，按5％的比例接种已长成单层的bhk-21细胞，吸附1小时后，换成含2％新生牛血清的细胞维持液，置37℃、含5％co2培养箱培养观察5日。冻融收获细胞培养物，在bhk-21细胞上盲传3代。
[0087]
通过比较0.01％、0.1％和0.5％三个浓度的灭活效果，发现0.01％效果稍差，28h不能灭活；0.1％和0.5％浓度24小时即可灭活完全。
[0088]
5.乳化配苗
[0089]
将水包油佐剂按佐剂：抗原为1:9的比例缓缓注入到制得的svv-sd-2018株病毒灭
活抗原中，常温低速(400r/min)搅拌15min，配制成猪塞内卡病毒灭活疫苗。
[0090]
实施例4——猪塞内卡病毒灭活疫苗安全性试验
[0091]
1.替代动物试验
[0092]
按0.5ml/只腹腔接种balb/c小鼠，结果显示，接种疫苗后balb/c小鼠均未出现局部或全身不良反应，精神、饮食、粪便均正常，剖解结果均正常。
[0093]
2.本体动物试验
[0094]
按4.0ml/头肌肉注射照14～21日龄健康易感仔猪，结果显示，接种后猪的体温正常，没有异常升高(表5)，未出现局部或全身不良反应，精神、饮食、粪便均正常，剖解结果均正常。
[0095]
表5安全性试验体温观察记录表
[0096][0097]
安全性试验结果说明疫苗的安全性良好。
[0098]
实施例5——猪塞内卡病毒灭活疫苗效力试验
[0099]
用14～21日龄健康易感仔猪10头，其中5头各肌肉注射疫苗1.0ml，另5头不接种作对照。免疫后21日，用svv-sd-2018株攻击，每头猪滴鼻2.0ml、肌肉注射3.0ml(含5.0
×
10
7.5
tcid
50
)。攻毒后观察14日，对照猪5/5发病，免疫猪5/5保护(表6)。
[0100]
表6效力试验攻毒保护结果
[0101]