[0001]
本发明涉及止血技术领域，具体涉及一种止血封闭剂及其制备方法。
背景技术：
[0002]
纤维蛋白原是动物及人类血浆中都具有的一种活性蛋白质成分，20世纪70年代以前，在美国、奥地利和德国等国外一些发达国家已大规模的生产人纤维蛋白原，其疗效得到了肯定，且需求量也在逐年上升，但是由于当时人纤维蛋白原在制备过程中缺乏有效的病毒灭活步骤，反而成了病毒传播的污染源，后来各个国家逐渐禁止生产、销售。70年代以后，随着s/d病毒灭活方法的成熟，凝血因子产品如纤维蛋白原、凝血
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因子、凝血酶原复合物等产品又恢复了生产。猪血浆来源的纤维蛋白原具有来源广泛价格低廉及病毒安全性高的优点。
[0003]
凝血酶(thrombin)是特效的外用止血生物制品，能直接作用于血中的纤维蛋白原。目前国内主要从动物血浆中及人血浆中制备凝血酶原,再经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原子血纤维肽a和b的断裂,转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶有加速血液凝固,促进止血的作用。
[0004]
然而，纤维蛋白原和凝血酶在离开机体后容易失火，保存时间较短，稳定性较差。
技术实现要素：
[0005]
本发明的目的在于提供一种止血封闭剂，该封闭剂包括纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，具有优异的止血功效；此外，通过将纤维蛋白原和凝血酶置于特定溶液中进行储存，能够提高纤维蛋白原和凝血酶的稳定性，且保存时间长久。
[0006]
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007]
本发明第一方面提供一种止血封闭剂，所述止血封闭剂包括纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液；
[0008]
每千克所述纤维蛋白溶液包括如下组分：
[0009]
纤维蛋白原2～8g、氯化钠6～9g、枸橼酸钠6～10g、蔗糖5～8g、tris 1～3g和盐酸赖氨酸5～8g；
[0010]
每千克所述凝血酶溶液包括如下组分：
[0011]
凝血酶2～8g、氯化钠5～10g、tris 3～6g、三水醋酸钠4～8g和冰醋酸0.2～0.6ml。
[0012]
本发明封闭剂由纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液组成，该封闭剂具有优异的止血功效；此外，通过将纤维蛋白原和凝血酶分别采用特定溶液进行储存，能够提高纤维蛋白原和凝血酶的储存稳定性，且储存时间长久并保持优异的生物活性。本发明止血封闭剂在使用过程中，直接将纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液的按照质量比为1∶0.8～1∶1.2进行混合，在3分钟内使用于伤口创面，即可起到止血及粘合伤口的作用。
[0013]
优选地，所述第一悬浮缓冲液的ph值为7.1～7.3。
[0014]
优选地，所述第二悬浮缓冲液的ph值为4.9～5.9。
[0015]
通过控制第一悬浮缓冲液和第二悬浮缓冲液的ph，能够更好的提高纤维蛋白原和凝血酶的的稳定性和储存时间。
[0016]
本发明第二方面提供一种上述止血封闭剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0017]
(a)采用含有0.1m氯化钠、ph5.8的0.05m醋酸-醋酸钠缓冲液对猪血浆进行稀释并降温，加入稀释后溶液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置6～10h、离心收集上清液；
[0018]
(b)将步骤(a)中得到的上清液进行预冷，并调节ph值值7.4～7.8，再加入预冷上清液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置6～10h，离心得到纤维蛋白原粗品和上清液；
[0019]
(c)将纤维蛋白原粗品置于第一悬浮缓冲液中进行溶解、离心收集上清液，对上清液进行病毒灭活处理，随后，将病毒灭活处理后的上清液进行降温并加入低温乙醇、离心收集沉淀，得到粗沉淀物；
[0020]
(d)将粗沉淀物置于第一悬浮缓冲液中进行溶解、过滤去除沉淀，将滤液进行降温并加入低温乙醇、离心得到纤维蛋白原，再将纤维蛋白原悬浮于第一缓冲液中得到纤维蛋白原溶液；
[0021]
(e)将步骤(b)中得到的上清液进行降温，随后，加入低温乙醇、离心收集沉淀物，得到凝血酶原粗品；
[0022]
(f)将凝血酶原粗品置于第二悬浮缓冲液中进行溶解、压滤收集沉淀物，再将沉淀物置于第二悬浮缓冲液中，然后向第二悬浮缓冲液中添加氯化钙溶液、稀释，再添加聚乙二醇、压滤收集上清液；
[0023]
(g)将步骤(f)中收集的上清液进行病毒灭活处理，随后，采用吸附树脂对上清液进行吸附，再采用第二悬浮液进行洗脱、超滤得到凝血酶溶液。
[0024]
本发明上述制备方法能够充分提取猪血浆中的纤维蛋白原和凝血酶，并具有较高的得率并保障提取的纤维蛋白原和凝血酶的活性；此外，通过病毒灭活处理，能够最大限度的保障产品的安全性。
[0025]
优选地，所述病毒灭活处理方式为s/d病毒灭活法。
[0026]
优选地，所述低温乙醇温度为-5～-25℃；
[0027]
所述步骤(c)、(d)或(e)中低温乙醇加入后终浓度分别为7％～9％。通过对低温乙醇温度以及添加量的限定，能够更好的提高提取纤维素蛋白原和凝血酶的得率。
[0028]
优选地，所述步骤(f)中，氯化钙溶液添加至氯化钙终浓度为0.01～0.03mol/l。通过氯化钙溶液的添加能够激活凝血酶原得到凝血酶，使得制备得到凝血酶具有优异的生物活性。
[0029]
优选地，所述聚乙二醇的添加后的终浓度为10％～15％。通过聚乙二醇的添加能够更好的将杂质蛋白进行沉淀以便进行去除，提高制备凝血酶的纯度。
[0030]
优选地，所述超滤所述超滤用于截留分子量为100kda的大分子蛋白。
[0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
[0032]
本发明封闭剂由纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液组成，该封闭剂具有优异的止血功效；此外，通过将纤维蛋白原和凝血酶分别采用特定溶液进行储存，能够提高纤维蛋白原和凝血酶的储存稳定性，且储存时间长久并保持优异的生物活性。
[0033]
本发明上述制备方法能够充分提取猪血浆中的纤维蛋白原和凝血酶，并具有较高的得率并保障提取的纤维蛋白原和凝血酶的活性；此外，通过病毒灭活处理，能够最大限度的保障产品的安全性。
具体实施方式
[0034]
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0035]
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
[0036]
实施例1
[0037]
一、止血封闭剂
[0038]
上述止血封闭剂包括纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液；
[0039]
每千克纤维蛋白溶液包括如下组分：
[0040]
纤维蛋白原2g、氯化钠6g、枸橼酸钠10g、蔗糖5g、tris 3g和盐酸赖氨酸5g；
[0041]
每千克凝血酶溶液包括如下组分：
[0042]
凝血酶6.1g、氯化钠5g、tris 6g、三水醋酸钠4g和冰醋酸0.6ml；
[0043]
第一悬浮缓冲液的ph值为7.1；第二悬浮缓冲液的ph值为5.9。
[0044]
二、制备方法
[0045]
上述止血封闭剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0046]
(a)采用含有0.1m氯化钠、ph5.8的0.05m醋酸-醋酸钠缓冲液对猪血浆进行等倍(即等体积)稀释并降温，加入稀释后溶液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置8h、离心收集上清液；
[0047]
(b)将步骤(a)中得到的上清液进行预冷，并调节ph值值7.5，再加入预冷上清液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置8h，离心得到纤维蛋白原粗品和上清液；
[0048]
(c)将纤维蛋白原粗品置于第一悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、离心收集上清液，向上清液中添加tween-80和磷酸三丁酯，并使得tween-80终浓度为1％，磷酸三丁酯终浓度为0.3％，然后在25℃下病毒灭活处理6h，随后，将上清液进行降温至4℃并加入-20℃低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心收集沉淀，得到粗沉淀物；
[0049]
(d)将粗沉淀物置于第一悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、过滤去除沉淀，将滤液进行降温至4℃并加入-20℃低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心得到纤维蛋白原；再将纤维蛋白原悬浮于第一缓冲液中得到纤维蛋白原溶液；
[0050]
(e)将步骤(b)中得到的上清液降温至4℃，随后加入-20℃的低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心收集沉淀物，得到凝血酶原粗品；
[0051]
(f)将凝血酶原粗品置于第二悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、压滤收集沉淀物，将沉淀物置于第二悬浮缓冲液中，然后向第二悬浮缓冲液中添加氯化钙溶液至氯化钙终浓度为0.02mol/l以进行激活、再加入等体积的第二悬浮缓冲液进行稀释，然后按照质量比为12％添加聚乙二醇以沉淀杂蛋白、压滤收集上清液；
[0052]
(g)在步骤(f)中收集的上清液中添加tween-80和磷酸三丁酯，并使得tween-80终
浓度为1％，磷酸三丁酯终浓度为0.3％，然后在25℃下病毒灭活处理6h，随后，采用sp-c50吸附树脂对上清液进行吸附，再采用第二悬浮液进行洗脱、超滤截留分子量为100kda的大分子蛋白得到凝血酶溶液。
[0053]
实施例2
[0054]
一、止血封闭剂
[0055]
上述止血封闭剂包括纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液；
[0056]
每千克纤维蛋白溶液包括如下组分：
[0057]
纤维蛋白原8g、氯化钠9g、枸橼酸钠6g、蔗糖8g、tris 1g和盐酸赖氨酸8g；
[0058]
每千克凝血酶溶液包括如下组分：
[0059]
凝血酶2.7、氯化钠10g、tris 3g、三水醋酸钠8g和冰醋酸0.2ml；
[0060]
第一悬浮缓冲液的ph值为7.3；第二悬浮缓冲液的ph值为4.9。
[0061]
二、制备方法
[0062]
上述止血封闭剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0063]
(a)采用含有0.1m氯化钠、ph5.8的0.05m醋酸-醋酸钠缓冲液对猪血浆进行等倍(即等体积)稀释并降温，加入稀释后溶液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置8h、离心收集上清液；
[0064]
(b)将步骤(a)中得到的上清液进行预冷，并调节ph值值7.5，再加入预冷上清液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置8h，离心得到纤维蛋白原粗品和上清液；
[0065]
(c)将纤维蛋白原粗品置于第一悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、离心收集上清液，向上清液中添加tween-80和磷酸三丁酯，并使得tween-80终浓度为1％，磷酸三丁酯终浓度为0.3％，然后在25℃下病毒灭活处理6h，随后，将上清液进行降温至4℃并加入-20℃低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心收集沉淀，得到粗沉淀物；
[0066]
(d)将粗沉淀物置于第一悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、过滤去除沉淀，将滤液进行降温至4℃并加入-20℃低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心得到纤维蛋白原；再将纤维蛋白原悬浮于第一缓冲液中得到纤维蛋白原溶液；
[0067]
(e)将步骤(b)中得到的上清液降温至4℃，随后加入-20℃的低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心收集沉淀物，得到凝血酶原粗品；
[0068]
(f)将凝血酶原粗品置于第二悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、压滤收集沉淀物，将沉淀物置于第二悬浮缓冲液中，然后向第二悬浮缓冲液中添加氯化钙溶液至氯化钙终浓度为0.02mol/l以进行激活、再加入等体积的第二悬浮缓冲液进行稀释，然后按照质量比为12％添加聚乙二醇以沉淀杂蛋白、压滤收集上清液；
[0069]
(g)在步骤(f)中收集的上清液中添加tween-80和磷酸三丁酯，并使得tween-80终浓度为1％，磷酸三丁酯终浓度为0.3％，然后在25℃下病毒灭活处理6h，随后，采用sp-c50吸附树脂对上清液进行吸附，再采用第二悬浮液进行洗脱、超滤截留分子量为100kda的大分子蛋白得到凝血酶溶液。
[0070]
实施例3
[0071]
一、止血封闭剂
[0072]
上述止血封闭剂包括纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液；
[0073]
每千克纤维蛋白溶液包括如下组分：
[0074]
纤维蛋白原6g、氯化钠8g、枸橼酸钠8g、蔗糖6g、tris 2g和盐酸赖氨酸7g；
[0075]
每千克凝血酶溶液包括如下组分：
[0076]
凝血酶5.7g、氯化钠8g、tris 5g、三水醋酸钠6g和冰醋酸0.4ml；
[0077]
第一悬浮缓冲液的ph值为7.2；第二悬浮缓冲液的ph值为5.4。
[0078]
二、制备方法
[0079]
上述止血封闭剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0080]
(a)采用含有0.1m氯化钠、ph5.8的0.05m醋酸-醋酸钠缓冲液对猪血浆进行等倍(即等体积)稀释并降温，加入稀释后溶液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置8h、离心收集上清液；
[0081]
(b)将步骤(a)中得到的上清液进行预冷，并调节ph值值7.5，再加入预冷上清液0.5倍体积的乙醇并搅拌静置8h，离心得到纤维蛋白原粗品和上清液；
[0082]
(c)将纤维蛋白原粗品置于第一悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、离心收集上清液，向上清液中添加tween-80和磷酸三丁酯，并使得tween-80终浓度为1％，磷酸三丁酯终浓度为0.3％，然后在25℃下病毒灭活处理6h，随后，将上清液进行降温至4℃并加入-20℃低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心收集沉淀，得到粗沉淀物；
[0083]
(d)将粗沉淀物置于第一悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、过滤去除沉淀，将滤液进行降温至4℃并加入-20℃低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心得到纤维蛋白原；再将纤维蛋白原悬浮于第一缓冲液中得到纤维蛋白原溶液；
[0084]
(e)将步骤(b)中得到的上清液降温至4℃，随后加入-20℃的低温乙醇至乙醇终浓度为8％、离心收集沉淀物，得到凝血酶原粗品；
[0085]
(f)将凝血酶原粗品置于第二悬浮缓冲液中在25℃下进行溶解、压滤收集沉淀物，将沉淀物置于第二悬浮缓冲液中，然后向第二悬浮缓冲液中添加氯化钙溶液至氯化钙终浓度为0.02mol/l以进行激活、再加入等体积的第二悬浮缓冲液进行稀释，然后按照质量比为12％添加聚乙二醇以沉淀杂蛋白、压滤收集上清液；
[0086]
(g)在步骤(f)中收集的上清液中添加tween-80和磷酸三丁酯，并使得tween-80终浓度为1％，磷酸三丁酯终浓度为0.3％，然后在25℃下病毒灭活处理6h，随后，采用sp-c50吸附树脂对上清液进行吸附，再采用第二悬浮液进行洗脱、超滤截留分子量为100kda的大分子蛋白得到凝血酶溶液。
[0087]
对照例1
[0088]
本对照例公开了一种止血封闭剂，该止血封闭剂与实施例3中的止血封闭剂基本相同，区别仅在于将实施例3中纤维蛋白原溶液中的枸橼酸钠替换为同等分数的柠檬酸钠；
[0089]
上述止血封闭剂的制备方法同实施例3中的制备方法。
[0090]
对照例2
[0091]
本对照例公开了一种止血封闭剂，该止血封闭剂与实施例3中的止血封闭剂基本相同，区别仅在于将实施例3中纤维蛋白原溶液ph值调节至7.5；
[0092]
上述止血封闭剂的制备方法同实施例3中的制备方法。
[0093]
对照例3
[0094]
本对照例公开了一种止血封闭剂，该止血封闭剂与实施例3中的止血封闭剂相同；
[0095]
上述止血封闭剂的制备方法与实施例3中的制备方法基本相同，区别仅在于步骤
(c)和(d)中添加低温乙醇后终浓度为10％。
[0096]
实验例1
[0097]
分别选取实施例1～3以及对照例1～2中制备得到的纤维蛋白原溶液；将上述纤维蛋白原溶液至于4℃条件下进行储存，储存80天后进行观察，观察结果如表1所示：
[0098]
表1不同纤维蛋白原溶液的储存情况
[0099]
组别实施例1实施例2实施例3对照例1对照例2溶液状态微浑浊微浑浊澄清絮状沉淀絮状沉淀
[0100]
由表1可知，
[0101]
本发明实施例制备得到的纤维蛋白原溶液具有更好的稳定性，储存时间更加长久。
[0102]
实验例2
[0103]
分别按照实施例1～3以及对照例1～3中纤维素蛋白原溶液的制备方法，并称取步骤(c)中得到的纤维蛋白原的质量，计算各实施例和对照例中每升猪血浆中提取的纤维蛋白原量，计算结果如表2所示：
[0104]
表2
[0105]
组别实施例1实施例2实施例3对照例1对照例2对照例3得率2.36g/l2.24g/l2.43g/l2.37g/l2.25g/l1.97g/l
[0106]
由表2可知：
[0107]
本申请实施例要求保护技术方案具有更好的提取纤维蛋白原，并通过对低温乙醇含量的选择，更好的提取猪血浆中的纤维蛋白原。
[0108]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。