一种预防和治疗奶畜隐性乳房炎的复合添加剂及其应用的制作方法

本发明属于畜牧工程领域，具体涉及一种治疗和预防奶畜隐形乳房炎的复合添加剂、制备方法及其应用。

背景技术：

乳房炎是奶牛常见的一种多发性疾病。其发病原因主要是由于病原菌的侵入，以及造成感染的各种诱因，如外伤、挤奶技术不佳。环境卫生不良、饲养管理失宜，激素失调、乳房缺陷和其他疾病也可诱发乳房炎。乳房炎的病原微生物比较复杂，包括细菌、真菌、霉形体、酵母菌、病毒等可达80多种。在一般情况下，葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌在临床型乳房炎中占70％以上，其次是化脓性棒状杆菌、绿脓杆菌、坏死杆菌、诺卡氏菌、克雷伯氏菌等。无症状的隐性乳房炎高于临床型乳房炎，其发病率约占整个牛群的50％。隐性乳房炎约90％是由链球菌和葡萄球茵引起的。

隐形乳房炎病因的复杂性决定了治疗的困难性，但总的治疗原则是消除病因和病原，增强机体抵抗力。在消除病原中：国内外多用抗生素、磺胺类和呋喃类制剂。但有很多病例治疗并不理想或久治不愈。其原因：一是没有根据病性(急性、慢性、隐性)、症状(有无全身症状)、发病时期(泌乳期、干乳期)选择有效治疗方案；二是延误诊疗，乳腺组织已发生不可逆病变；三是未完全消除诱因和病原。特别是近年来外部对无抗饲料使用的压力，养殖场乳房炎发病率不断提高，乳房炎已经成为制约奶业发展的重要疾病。

cn111840361a请求保护了一种治疗母猪乳房炎的中药制剂，该中药制剂是香薰提取液，直接添加于饲料或直接涂抹于患处，该专利在实验中只验证了香薰提取液的体外抑菌活性，并未验证制备成饲料制剂后的抑菌活性。

cn111418709a请求保护了一种预防奶牛乳房炎的饲料，由以下重量份数的原料发酵得到：玉米50～70份、麸皮5～15份、苜蓿20～30份、豆粕5～15份、小苏打0.2～0.4份、食盐0.5～1份、产阮假丝酵母3～8份、植物乳杆菌1～3份、嗜酸乳杆菌2～6份、双歧杆菌4～7份和谷氨酸棒状杆菌3～5份。该饲料采用常规的日料加上乳酸菌发酵制备得到，但是在实验中也仅验证了奶牛喂养上述饲料后的体细胞数目，难以证明对治疗乳房炎有显著效果。

目前针对于预防和治疗奶畜发生乳房炎的功能性饲料制剂种类仍较少，微生物制剂的来源较少、选择面窄、使用效果也不够理想，尤其是调理奶畜身体机能，固本培元的专门化的饲料制品急需开发。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提到的技术问题，本发明提供一种预防和治疗奶畜乳房炎的复合型添加剂。

为实现上述目的，本发明的具体方案为：

一方面，本发明提供了一种预防或治疗奶畜隐性乳房炎的抑菌剂，其特征在于，有效成分为甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9发酵液。

所述有效成分为甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9发酵液的液体制剂、甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9发酵液的冻干粉制剂或甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9发酵液与载体混合后制备的固体粉末制剂。

所述载体为淀粉、蛋白粉、滑石粉、粘土、玉米芯粉、植物秸秆粉、麦麸、米糠中的一种或多种混合物。

所述抑菌剂为甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉混匀，进行喷雾干燥后得到的固体粉末制剂。

另一方面，本发明提供一种预防或治疗奶畜隐性乳房炎的复合添加剂，其特征在于，所述复合添加剂包含抑菌剂和三叶清粉。

本发明所述的预防或治疗奶畜隐性乳房炎的复合添加剂，其按重量百分比计包含：蛋白粉10-60份，芽孢杆菌gbacillus-9抑菌剂1-10份，淀粉20-120份,三叶青叶粉1-10份。

作为优选的技术方案，本发明所述的预防或治疗奶畜隐性乳房炎的复合添加剂，其按重量百分比计包含：蛋白粉10-30份，甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9抑菌剂1-5份，淀粉30-50份,三叶青叶粉1-5份。

另一方面，本发明进一步提供一种饲料组合物，其含有上述的预防或治疗奶畜隐性乳房炎的抑菌剂或上述预防或治疗奶畜隐性乳房炎的复合添加剂。

另一方面，本发明提供上述抑菌剂或复合添加剂在制备治疗或预防奶畜隐性乳房炎饲料中的应用。

本发明中，载体仅作为芽孢杆菌发酵液的稳定载体，并不发挥抗菌作用，所以本领域常用的载体均可达到本发明的预期技术效果，本发明可选择饲料中常用的载体，如淀粉，蛋白粉、滑石粉，粘土，玉米芯粉、植物秸秆粉、麦麸、米糠等；优选的是淀粉类。

本发明中，所述淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、α-淀粉或其混合物，更优选玉米淀粉。

所述蛋白粉为膨化大豆粉、玉米蛋白粉、乳清粉、奶粉或其混合物，优选膨化大豆粉、玉米蛋白粉和奶粉。

本发明菌种来源于自主分离培养，从广东海域条纹斑竹鲨肠道中分离并培养获得，具体参考cn106957805a公开的分离方法，甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9的保藏号为cgmccno.13337。

本发明还提供所述复合添加剂的制造方法，包括以下步骤：将各组分原料加入混合机中，搅拌、研磨混合均匀，出料。

本发明提供所述复合添加剂的中益生菌的制备工艺。具体地，优选的，配制培养基步骤具体包括：(1)种子培养基制备，种子培养基包括蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l和氯化钠10g/l；(2)基础发酵培养基制备包括磷酸氢二钠8.5g/l、磷酸二氢钾3g/l、氯化铵1g/l、氯化钠0.5g/l、红糖50g/l和七水合硫酸镁0.492g/l，其中ph值为6.8～7.0。

所述的复合添加剂的制备方法，甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵液制备步骤包括：经过菌种保存，菌种活化，摇瓶培养和发酵罐发酵后获得甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵液。优选的，甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵液制备步骤具体包括：(1)菌种保存：将lb培养基中od600达到1.5时的菌液与50％的无菌甘油以1:1的比例在1.5mlep管中混合均匀，封口膜封口；短期保存放置于-20℃保存，长期保存放置于-80℃低温保存；(2)菌种活化：将保存的菌种以1:100的比列接种于5mllb培养基中，37℃220rpm培养10h；(3)摇瓶培养：取1ml种子液接种于盛有100mllb培养基的250ml锥形瓶中(接种量为1％)，培养条件与菌种活化步骤相同；(4)发酵罐培养：将摇瓶中的发酵种子液接种到含有基础发酵培养基的200l发酵罐中进行发酵罐培养，获得甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵液。

所述的复合添加剂的制备方法，优选的，所述的发酵罐发酵步骤的发酵条件为：初始ph值保持为6.8-7.2，进一步优选为7.0；甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株的生长温度为28-40℃，进一步优选为37℃；发酵罐的装液量为发酵罐体积的60％-65％，接种量为1％-2％，进一步优选为1％。

所述的复合添加剂的制备方法，优选的，甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵过程中可根据发酵液装液量，在培养基中加入消泡剂；发酵时间为7～10h，进一步优选为8h；发酵罐转速达为150rpm-300rpm，200rpm为最佳。

所述的复合添加剂的制备方法，优选的，生物制剂产品制备步骤包括取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵液直接作为生物制剂的液态产品；或者或者进一步将取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉混匀，进行喷雾干燥后，获得固体粉末状生物制剂产品。具体优选，将取自发酵罐的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)gbacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉以1l：100g的比例混匀，用搅拌器匀速搅拌，进行喷雾干燥，进口温度为180℃，出口温度为90℃，收集固体粉末生物制剂产品。

本发明还提供所述复合添加剂在预防或治疗隐形乳房炎的奶畜饲料中的应用。具体地，可将本发明所述的复合添加剂与精料混合直接饲喂或将本发明所述的添加剂在全混合日粮(tmr)中直接饲喂。

本发明所述的奶畜可以为奶牛、奶羊、绵羊和水牛等。

已有实验数据显示，本发明所述的来源于甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9菌株发酵液具有抑菌活性。前期的研究发炎，该菌株发酵液对反刍动物腹泻具有治疗作用，本发明以由该菌株制得的添加剂和三叶青叶为主要活性成分，经过大量实验探索，与其他成分进行合理优化复配，制成复合添加剂，填补了现有技中的空白，动物实验结果显示，本发明所述的添加剂能够显著提高反刍幼畜的免疫力，对于隐形乳房炎具有显著的预防和治疗效果，有广泛的应用前景。本发明的复合添加剂其在预防和治疗奶畜，例如奶羊乳房炎方面具有良好的效果，本发明的组合物原料易得，工艺简单，适合规模化生产。

附图说明

附图1为微生物丰度差异维恩图。

附图2为微生物shannon指数图。

附图3为微生物simpson指数图。

附图4为微生物丰度差异pcoa图。

附图5为0周和6周后乳产量比较图。

附图6为0周和6周后乳蛋白含量比较图。

附图7为0周和6周后乳脂肪含量比较图。

附图8为0周和6周后乳糖含量比较图。

附图9为0周和6周后体细胞数比较图。

具体实施方式

菌剂来源

本发明菌种来源于自主分离培养，从广东海域条纹斑竹鲨肠道中分离并培养获得。

实施例1

复合添加剂，以重量百分比计包含：蛋白粉30份，甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9抑菌剂5份，淀粉60份,三叶青叶粉5份。

将各组分原料加入混合机中，搅拌、研磨混合均匀，出料。

其中甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9抑菌制备方法为，将甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉以1l：100g的比例混匀，用搅拌器匀速搅拌，进行喷雾干燥，进口温度为150℃，出口温度为80℃，收集固体粉末生物制剂产品。

实施例2

复合添加剂，以重量百分比计包含：蛋白粉28份，甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9抑菌剂1份，淀粉70份,三叶青叶粉1份。

将各组分原料加入混合机中，搅拌、研磨混合均匀，出料。

其中甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9抑菌制备方法为，将甲基营养型芽孢杆菌gbacillus-9菌株发酵液与玉米淀粉以1l：120g的比例混匀，用搅拌器匀速搅拌，进行喷雾干燥，进口温度为130℃，出口温度为90℃，收集固体粉末生物制剂产品。

试验例1

按照响应面优化实验方法优化得到的最优培养基，我们使用摇瓶对ph、转速、温度、接种量、时间等方面对发酵条件进行优化，从而提供一个更有利于菌株分泌抗菌物质的环境条件。在取得最佳培养基配方和优化发酵条件基础上，进行20l发酵罐的小试发酵实验，检测发酵液抑菌活性，为制备菌制剂奠定基础。综合单因素实验结果，可得各因素最佳实验浓度值如表1所示

表1单因素实验确定各因素最佳浓度值

通过单因素实验，我们得到培养基分成份最佳浓度的粗略值，为了进一步优化最佳浓度值，找出个因素对gbacillus-9菌株发酵液抑菌活性的影响的主要性，我们又设计了plackett-burman实验。在实验各因素水平设计时，我们分别设计一个高水平(+1)和一个低水平(-1)，效应值为菌液上清对tg1和bs168的抑菌圈直径。利用minitab软件进行实验设计和数据分析，见表2-4。

表2pb因素水平设计

表3pb实验设计与结果

表4实验结果分析(tg1)

*p<0.05，表示因果关系显著

表5plackett-burman实验结果分析(bs168)

*p<0.05，表示因果关系显著

如表4和表5所示，经过minitab软件分析，培养基中对于菌液上清抑制tg1效果影响最大为因素为a因素(x)，其次是d因素(nh4cl)和f因素(mgso4)，其差异性均显著(p<0.05)，为显著性因素，其余因素主要性可根据p值大小排序为c因素(na2hpo4)、b因素(kh2po4)、e因素(nacl)；对于抑制bs168生长效果影响因素最大为a因素x，结果差性显著(p<0.05)，为显著性因素，其余因素主要性根据p值大小排序为d因素(nh4cl)、f因素(mgso4)、e因素(nacl)、b因素(kh2po4)、c因素(na2hpo4)。综合考虑，我们选取a因素、d因素、f因素为影响菌液上清抑菌活性的主要因素进行后续研究。

本实验利用pb实验所确定的主要因素：a因素(x)、d因素(nh4cl)、f因素(mgso4)进行中心组合实验(ccd)设计，各实验因素各取5个水平6，分别以“-1.68、-1、0、+1、1.68”表示，其中“-1.68、-1”代表因素低水平，“0”代表因素中水平，“+1、1.68”代表因素高水平，实验设计结果见表7。利用minitab软件对实验结果进行分析，见表7，表8，表9。

表6ccd实验因素水平设计

表7ccd实验设计与结果

表8ccd试验结果分析(tg1)

表9ccd试验结果分析(bs168)

从上述数据可以研究各因素对菌株发酵液抑菌活性的影响，可以反映出两种变量因素之间的交互作用对发酵液抑菌活性的影响，可以得到在两种变量因素交互作用下发酵液最佳抑菌活性。

试验例2

试验动物：泌乳奶山羊44只，均高体细胞数(隐性乳房炎，平均体细胞数超过600万/ml)，平均分为4组。

动物饲养管理：每个试验组单栏饲养，所有试验羊均打耳号，免疫程序按羊场正规程序进行。试验前驱虫，称重，对羊舍地面、四壁等进行消毒。每日饲喂2次、自由饮水和正常挤奶。观察羊健康状况并对体细胞数血液指标和粪便进行分析。于试验正式开始第0和50天早晨饲喂前采集奶、血液和粪便。实验处理组以3％重量份添加入日精料中，对照组添同等重量加淀粉。

试验处理1:每日精料中添加实施例1中gbacillus-9菌粉(即bs组).

试验处理2：每日精料中添加实施例1中复合添加剂(即ds组)。

实验处理3：每日精料中添加三叶青粉(即rs组)。

对照组：每日精料中同等重量的淀粉(即cs组)。

试验设计：采用随机区组试验设计，其中预饲期7天，正式试验期42天，总计49天。

研究内容与样品采集

(1)添加剂对肠道微生物的影响。

试验的第0和35天，收集试验羔羊的粪便，用来提取粪便中总的细菌dna，进行菌群多样性检测。

(2)添加剂对泌乳羊血液生化指标的影响。

于试验的第0、50天采集颈静脉血液。分别于晨饲后3h使用一次性负压管血清管，采集静脉血5ml/头，室温静置30min后，4℃3000g离心15min，制备得到血浆和血清，保存于冰箱内，测定免疫球蛋白iga和igm以及免疫因子il-2、il-4和il-6的含量。

(3)添加剂对泌乳羊乳成分的影响

试验的第0，1，2天和48,49，50天分别收集奶羊，进行dhi测定，测定体细胞数。

实验结果

(1)粪便微生物多样性检测发现：试验组粪便中微生物的丰度和对照有一定的差异，ds组的细菌丰度有所提高。说明饲喂本发明的复合添加剂能够通过引起肠道微生物的丰度差异变化，提高有益菌的丰度，增强反刍动物的免疫力，进而对腹泻疾病有较为显著的治疗和预防作用。

(2)在试验进行6周后，对照组的体细胞数(scc)仍维持较高，均超过800万/ml,试验1处理组和试验2处理组的体细胞数显著下降，试验处理1组的体细胞平均数约300万/ml,试验组2体细胞数平均数降低到145万/ml，达到正常水平(注：奶山羊乳房炎体细胞数的标准为200万/ml)，说明本发明的抑菌剂和复合添加剂对于治疗隐形乳房炎均具有明显作用。另外，6周后，产奶量、山羊奶中的乳蛋白含量、乳糖含量、乳脂肪含量、如蛋白产率等参数和对照组无明显变化，说明本发明的抑菌剂和复合添加剂抑制隐形乳房炎的同时并不影响奶山羊的产奶。

(3)根据血液生理生化指标结果显示，直接饲喂本发明复合益生添加剂显著降低了奶山羊免疫球蛋白iga和igm以及免疫因子il-2、il-4和il-6的含量，其中复合添加剂组的il-2和il-6的降幅最高，说明该复合益生添加剂能够通过降低隐形乳房炎引起的体内炎症反应，进而对隐形乳房炎具有有较好的预防与治疗作用。

本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但不能用来限制本发明的保护范围，对于药物的其他范围或其他药物的具体实施方式，可参照本发明的技术原理以及实施例的操作来实施，仍在本发明的保护范围内。