一种东北刺人参绿原酸类提取物及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药学领域，具体涉及一种东北刺人参绿原酸类提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

东北刺人参(oplopanaxelatusnakai)，五加科刺人参属植物，是我国长白山特有植物资源之一，为国家二级野生保护植物，其药用价值极高，含有多种有效成分，如皂苷、多糖、挥发油等，也称为长白山区的“木本人参”。目前有关东北刺人参的文献报道大部分为药效成分和药理研究，临床应用相对很少，所以，进一步对其资源的有效开发利用具有重要意义。且由于东北刺人参野生资源较少，人工栽培目前也不稳定，更是为东北刺人参的资源开发带来了难度。因此，为了解决这一问题，寻求一种快速有效的方法迫在眉睫。

利用生物反应器进行植物组织培养的方式具有安全、快速、稳定的优点，由于原始植物根具有强大的生物合成能力，可以大量生产植物组织，解决野生资源少的问题，尤其是对于名贵植物药材，例如人参、高山红景天、连翘等，既能够大量快速的获得其材料，又保护了其野生资源不被破坏，安全稳定可靠。

东北刺人参利用生物反应器培养其不定根材料，可促进其资源开发利用，目前已经有相关报道发现其不定根提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎的药理作用，但目前还未有保肝药理作用的相关报道，且其成分目前还未完全明确。

近年来，药物性肝损伤在临床上发病率日愈增加，尤其是在欧美国家比重较高，其中对乙酰氨基酚的过量使用和滥用是诱发药物性肝损伤的最主要原因。病人发病后，血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量会升高，肝细胞坏死进而引发肝硬化。对乙酰氨基酚造成急性肝损伤是因为对乙酰氨基酚在肝脏代谢后产生乙酰苯醌亚胺，耗尽肝脏中的谷胱甘肽，多余的乙酰苯醌亚胺对线粒体造成氧化应激，最后造成肝细胞坏死和损伤。目前针对对乙酰氨基酚过量所致的急性肝损伤的治疗方法主要是n-乙酰半胱氨酸，由于对乙酰氨基酚造成的肝损伤机制较为复杂，且n-乙酰半胱氨酸的最佳使用时间较为严苛，一般为8小时以内使用疗效较好，对乙酰氨基酚中毒时间越长，治疗效果越差。并且，n-乙酰半胱氨酸的使用剂量也较为严格，一旦过量使用会引起咳呛、支气管痉挛、恶心、呕吐、胃炎等不良反应。所以为了解决这一问题，寻找一种安全高效的天然保肝产物极其重要。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种东北刺人参的绿原酸类提取物及其制备方法与应用。

本发明中的东北刺人参不定根是一种具有抗炎、抗菌、抗氧化的中药，且安全无毒副作用，富含多种有效活性物质。目前还未发现有关东北刺人参不定根在肝脏保护的相关研究，在对乙酰氨基酚导致的急性药物性肝损伤研究中更是未见相关报道。n-乙酰半胱氨酸作为临床上治疗对乙酰氨基酚药物性肝损伤的药物，治疗时间较为严苛，超过最佳使用时间后，其效果也会大大降低；并且，n-乙酰半胱氨酸的使用剂量也较为严格，一旦过量使用会引起咳呛、支气管痉挛、恶心、呕吐、胃炎等不良反应。所以，本发明的目的是进一步阐述东北刺人参不定根中具有保肝作用的成分，并进行有效成分的提取分离，对珍稀东北刺人参资源的进一步开发具有重大意义。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种东北刺人参的绿原酸类提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将东北刺人参的不定根接种于液体培养基中，然后通入空气进行暗培养，得到培养后的不定根材料；

(2)将步骤(1)所述培养后的不定根浸泡在乙醇溶液中，升温进行回流反应，得到反应产物，将反应产物过滤，得到一次滤渣和一次滤液，将所述一次滤渣重新浸泡在乙醇溶液中，然后重复回流反应，得到重复回流的滤渣和重复回流的滤液，将重复回流的滤液和一次滤液合并，干燥，得到不定根乙醇提取物；

(3)将步骤(2)所述不定根乙醇提取物进行纯化处理，得到所述东北刺人参的绿原酸类提取物。

进一步地，步骤(1)所述液体培养基为ms培养基、吲哚-3-丁酸及蔗糖的混合物；所述吲哚-3-丁酸的浓度为3～6mg·l^-1，所述蔗糖的浓度为50～60g·l^-1，所述液体培养基的ph值为5.8～6.8。

优选地，步骤(1)所述液体培养基为ms培养基、吲哚-3-丁酸及蔗糖的混合物；所述吲哚-3-丁酸的浓度为3mg·l^-1，所述蔗糖的浓度为50g·l^-1，所述液体培养基的ph值为5.8。

进一步地，步骤(1)所述东北刺人参的不定根接种量20～40g；所述培养的空气通气量为100～125ml·min^-1，所述培养的温度为25～30℃，培养的时间为30～40d。

优选地，步骤(1)所述东北刺人参的不定根的接种量为20g；所述培养的空气通气量为100ml·min^-1，所述培养的温度为25℃，培养的时间为30d。

进一步地，步骤(2)所述乙醇溶液的体积百分比为75-95％；所述培养后的不定根与乙醇溶液的料液比为1:10～1:20g/ml。

优选地，步骤(2)所述乙醇溶液的体积百分比浓度为75％；所述培养后的不定根与乙醇溶液的料液比为1:10。

进一步地，步骤(2)所述重复回流反应的次数为1-2次。

优选地，步骤(2)所述重复回流反应的次数为2次。

进一步地，步骤(2)所述干燥的温度为45-55℃。

优选地，步骤(2)所述干燥的温度为45℃。

进一步地，步骤(3)所述纯化处理包括：将不定根乙醇提取物溶解在水中，得到提取物溶液，然后过大孔吸附树脂柱，用洗脱剂进行洗脱，得到所述东北刺人参的绿原酸类提取物。

进一步地，所述大孔吸附树脂柱为hpd-722型树脂；所述提取物的质量与树脂体积的比例为1:10-1:20g/ml；所述洗脱使用的洗脱剂为乙醇溶液，乙醇溶液的体积百分比为0-95％、洗脱体积2bv-3bv。

优选地，所述大孔吸附树脂柱为hpd-722型树脂；所述提取物的质量与树脂体积的比例为1:10g/ml；所述洗脱使用的洗脱剂为乙醇溶液，乙醇溶液的体积百分比浓度为50％，洗脱体积3bv。

本发明提供一种由上述的制备方法制得的东北刺人参的绿原酸类提取物。

本发明提供的东北刺人参的绿原酸类提取物能够应用在保肝药物与保健品中。

东北刺人参是一种具有开发前景的植物。由于野生资源宝贵，所以一直致力于寻找替代植物资源进行开发利用，生物反应器是植物组织培养的一种高效的可控的新型培养技术，本发明通过大量试验探明出最佳的生物反应器培养的东北刺人参不定根条件，并已经初步发现其提取物具有较好的抗菌、抗炎、抗氧化活性，且发现其提取物具有保护肝脏的作用。

本发明通过建立对乙酰氨基酚肝损伤模型，首次探讨了东北刺人参不定根绿原酸类的肝保护作用及可能的分子机制，证明其发挥肝保护作用通过抑制氧化应激和影响中性粒细胞而实现的，为肝脏保护产品提供一种更好的选择。

东北刺人参具有较高的药理活性，本发明深入探讨了东北刺人参绿原酸类提取物抑制对乙酰氨基酚诱导的线粒体氧化应激反应以及对免疫细胞活化的影响，为东北刺人参材料的进一步开发和利用提供科学依据。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)近年来，越来越多的天然产物或提取物被发现可以改善药物性肝损伤，显著减少不良反应；本发明中东北刺人参具有一种具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化的作用，其提取物中富含多糖、皂苷、挥发油等物质；且目前对东北刺人参中绿原酸类成分的研究较少，尤其是在保护和治疗对乙酰氨基酚所致的肝损伤研究更未见相关文献报道。

(2)本发明中东北刺人参绿原酸类提取物可以显著保护对乙酰氨基酚造成的肝损伤，肝脏坏死程度明显减少，显著降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平。

(3)由于东北刺人参绿原酸类化合物具有良好的抗氧化作用，可以减少过量对乙酰氨基酚引起肝损伤造成的线粒体氧化应激反应，明显恢复肝脏中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽活性，减轻丙二醛含量，影响对乙酰氨基酚在肝脏中的药物代谢，从而减轻中性粒细胞产生活性氧对肝脏的无菌炎性损伤，从而保护肝脏，减轻肝损伤。

(4)本发明中的东北刺人参提取物安全无毒，对机体没有毒副作用，与对照相比，对体重不会有影响，也不会造成肝损伤。

附图说明

图1为东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分hplc结果图；

图2a为东北刺人参绿原酸类提取物对谷丙转氨酶水平的影响结果图；

图2b为东北刺人参绿原酸类提取物对谷草转氨酶水平的影响结果图；

图2c为东北刺人参绿原酸类提取物对小鼠肝脏损伤程度的水平结果图；

图3a为东北刺人参绿原酸类提取物对超氧化物歧化酶活性的影响结果图；

图3b为东北刺人参绿原酸类提取物对过氧化氢酶活性的影响结果图；

图3c为东北刺人参绿原酸类提取物对谷胱甘肽含量的影响结果图；

图3d为东北刺人参绿原酸类提取物对丙二醛含量的影响结果图；

图4a为东北刺人参绿原酸类提取物对中性粒细胞比例的影响结果图；

图4b为东北刺人参绿原酸类提取物对中性粒细胞数量的影响结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1：本发明中东北刺人参不定根绿原酸类提取物的制备过程

(1)东北刺人参不定根的培养：将增殖培养的不定根切成1cm大小后，称取20g(鲜重)增殖培养的不定根接种于含有4l液体培养基的5l气球型生物反应器中，培养基为ms+iba3.0mg/l+蔗糖50g/l，ph5.8，通气量调节为100ml/min，在温度为25℃条件下进行暗培养；培养30d后收获东北刺人参不定根作为实验材料。

(2)东北刺人参不定根提取物制备：将实施例1步骤(1)中得到的东北刺人参不定根干品浸泡于体积百分比为75％乙醇中(料液比＝1:10g/ml)，60℃冷凝回流1h后，抽滤，收集滤液；残渣再次进行冷凝回流重复2次，将滤液合并，在45℃条件下减压干燥即得不定根乙醇提取物干品。

(3)东北刺人参不定根绿原酸类提取物的纯化：将实施例1步骤(2)中得到的不定根乙醇提取物干品进行进一步纯化处理，纯化使用的大孔吸附树脂为hpd-722型树脂，不定根乙醇提取物干品的质量与树脂体积的比例为1:10g/ml；所述洗脱使用的洗脱剂为乙醇溶液，洗脱剂乙醇溶液的体积百分比浓度50％、洗脱剂体积为3bv，即得到纯化的东北刺人参不定根50％乙醇组分，该组分经高效液相色谱与标准品比对，确定该组分为绿原酸类提取物(附图1)，即东北刺人参不定根绿原酸类提取物。

实施例2：本发明中东北刺人参不定根绿原酸类提取物的制备过程

(1)东北刺人参不定根的培养：将增殖培养的不定根切成1cm大小后，称取40g(鲜重)增殖培养的不定根接种于含有4l液体培养基的5l气球型生物反应器中，培养基为ms+iba6.0mg/l+蔗糖60g/l，ph6.8，通气量调节为125ml/min，在温度为30℃条件下进行暗培养，培养40d后收获东北刺人参不定根作为实验材料。

(2)东北刺人参不定根提取物制备：将实施例2步骤(1)中得到的东北刺人参不定根干品浸泡于体积百分比浓度为95％乙醇中(料液比＝1:20g/ml)，60℃冷凝回流1h后，抽滤，收集滤液，残渣再次进行冷凝回流重复3次，将滤液合并，在55℃条件下减压干燥即得不定根乙醇提取物干品。

(3)东北刺人参不定根绿原酸类提取物的纯化：将实施例2步骤(2)中得到的不定根乙醇提取物干品进行进一步纯化处理，纯化使用的大孔吸附树脂为hpd-722型树脂，提取物的质量与树脂体积的比例为1:20g/ml；所述洗脱使用的洗脱剂为乙醇溶液，洗脱剂乙醇溶液体积百分比浓度50％、洗脱剂体积为3bv，即得到纯化的东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分(所述东北刺人参不定根绿原酸类提取物)。

实施例3：东北刺人参不定根绿原酸类提取物预防对乙酰氨基酚引起的肝损伤的研究

一、实验材料

采用实例1中制备的东北刺人参绿原酸类提取物对小鼠进行预处理7d，通过对照试验，考察东北刺人参绿原酸类提取物的保肝作用。

二、实验方法

分别设定空白对照组和药物处理组(低剂量组25mg·ml^-1、中剂量组50mg·ml^-1、高剂量组100mg·ml^-1)连续灌胃7天，分别腹腔注射对乙酰氨基酚溶液(300mg/kg)，12h后牺牲小鼠，留存血清和肝脏样本。利用试剂盒检测血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶，确定东北刺人参绿原酸类提取物对对乙酰氨基酚肝损伤中转氨酶的影响；采用he染色法对肝脏的组织学观察，研究东北刺人参绿原酸类提取物是否能改善对乙酰氨基酚对肝脏的损伤程度；利用试剂盒检测谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛的水平变化，探明东北刺人参绿原酸类提取物对对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤中的氧化应激的影响；利用流式细胞术研究东北刺人参绿原酸类提取物在对乙酰氨基酚肝损伤对免疫细胞(中性粒细胞和巨噬细胞等)的影响，以及酶联免疫吸附法测定炎性细胞因子和趋化因子的变化，研究东北刺人参绿原酸类提取物是否能有效保护肝脏，预防对乙酰氨基酚肝损伤。

三、实验结果

(1)东北刺人参绿原酸类提取物可以显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平(如图2a、2b)，在病理结果中可以发现，东北刺人参绿原酸类提取物预处理组的肝损伤程度显著低于未处理组，坏死面积显著低于对乙酰氨基酚处理组(图2c)，结果说明预处理东北刺人参绿原酸类提取物可以预防对乙酰氨基酚引起的肝损伤。

(2)之后通过试剂盒检测东北刺人参绿原酸类提取物对小鼠肝脏中的氧化酶活性的影响，经对乙酰氨基酚处理后超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽活性明显降低(如图3a、图3b、图3c所示)，丙二醛含量明显升高(图3d)，预处理东北刺人参绿原酸类提取物的小鼠肝脏中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽在对乙酰氨基酚处理后不会发生变化，即预处理东北刺人参绿原酸类提取物可以保护小鼠肝脏，增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽活性，减少丙二醛含量，说明东北刺人参绿原酸类提取物可能是通过影响肝脏氧化应激反应达到预防对乙酰氨基酚肝损伤的目的。

(3)通过流式细胞术研究了预处理东北刺人参绿原酸类提取物是否对小鼠肝脏的免疫细胞数量和比例的影响。对乙酰氨基酚处理后中性粒细胞数量比例均明显升高(如图4a、图4b所示)，预处理东北刺人参绿原酸类提取物的小鼠肝脏中的中性粒细胞并没有升高，与未处理组数据相似，说明预处理东北刺人参绿原酸类提取物可以保护肝脏，降低肝脏中浸润的中性粒细胞数量，预防对乙酰氨基酚所致的肝损伤。

实施例2制备的东北刺人参不定根绿原酸类提取物可以显著保护对乙酰氨基酚造成的肝损伤，肝脏坏死程度明显减少，能够显著降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平，可以减少过量对乙酰氨基酚引起肝损伤造成的线粒体氧化应激反应，明显恢复肝脏中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽活性，减轻丙二醛含量，影响对乙酰氨基酚在肝脏中的药物代谢，从而减轻中性粒细胞产生活性氧对肝脏的无菌炎性损伤，从而保护肝脏，减轻肝损伤，可参照图2a、图2b、图2c、图3a、图3b、图3c、图3d、图4a及图4b所示。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。