奥替普拉在制备皮肤紫外线防护、抗光损伤药物中的用途的制作方法

本发明属生物医药技术领域，涉及奥替普拉新的药用用途，具体涉及奥替普拉在用于制备皮肤紫外线防护、抗光损伤药物中的用途。

背景技术：

现有技术公开了皮肤裸露于体表，是人体最大的器官，也是抵御外部环境的第一道防线。与机体的其他器官相比，皮肤的病变过程除了遗传背景(内源性老化)等不可抗力外，还受到紫外线辐射、空气污染物(如no、no2等)、烟雾、化学物质挥发等环境中有害物质的影响，其中，紫外线辐射是在遗传背景的基础上加剧皮肤自然老化的罪魁祸首，相比于躯干等非暴露部位，头颈及四肢等暴露部位极易受到紫外线的损害而出现皮肤粗糙、松弛等改变；本领域技术人员已关注到，逆转并控制紫外线导致的皮肤光损伤成为人类逆转皮肤的重要靶点。研究显示，成纤维细胞是皮肤真皮最主要的细胞，在紫外线损伤后可以导致细胞外基质合成的减少，其产生的异常弹性纤维和胶原纤维不能被及时降解，是导致皮肤光损伤的重要原因；在体外，紫外线作用于成纤维细胞，可以导致成纤维细胞出现活性下降、细胞周期阻滞、细胞外外基质如胶原纤维和弹性纤维的合成减少以及相关分泌表型如基质金属蛋白酶如mmp1，mmp3等合成增加、细胞外基质降解增多等表现，研究认为，这种光损伤的成纤维细胞是导致皮肤紫外线光损伤的基础和原因，也是皮肤光损伤的重要表型；因而体外利用紫外线照射成纤维细胞诱导其发生紫外线光损伤是研究皮肤光损伤和紫外线防护的良好模型。

目前已有利用小分子化合物干预小鼠模型或体外紫外线处理成纤维细胞光损伤模型的报道，包括维生素c、维生素e、雷帕霉素、藏红花素等，然而这些药物对皮肤光损伤的治疗、紫外线防护的临床效果不。

奥替普拉(oltipraz，opz)，商品名为吡噻硫酮，原用于治疗埃及血吸虫和曼氏血吸虫病，已经被fda批准应用于治疗脂肪肝和肝纤维化的三期临床试验，基础实验表明奥替普拉能够逆转儿童早衰症(hutchinson-gilfordprogeriasyndrome，hgps)充质干细胞加速的表型，并能延缓其在体内的耗竭速度。目前尚无任何将奥替普拉用于皮肤光损伤的治疗、紫外线防护的相关研究的报道。

基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供奥替普拉新的药用用途，具体涉及奥替普拉在用于制备皮肤紫外线防护、抗光损伤药物中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供奥替普拉新的药用用途，具体涉及奥替普拉在用于制备皮肤紫外线防护、抗光损伤药物中的用途。本发明能为皮肤紫外线防护、抗光损伤提供一种新手段。

本发明通过细胞模型实验，结果证实，奥替普拉能提高成纤维细胞的存活能力，降低紫外线导致的的皮肤成纤维细胞dna的损伤，降低β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的比例，并上调细胞外基质包括胶原纤维和弹性纤维的合成，下调细胞分泌表型中基质金属蛋白酶(mmp1，mmp3)的表达，降低紫外线导致的人类皮肤皮肤成纤维细胞中ros水升高，上调成纤维细胞中nrf-2及其下游抗氧化蛋白nqo-1的表达即奥体普拉能够改善紫外线导致的皮肤成纤维细胞的表型，对延缓或逆转人类皮肤光损伤表型、提供紫外线防护具有重要作用。

在本发明中，所述紫外线导致的皮肤成纤维细胞的光损伤模型按如下步骤制备获得，

(1)人正常原代成纤维细胞的分离培养：利用酶消化法获得人类包皮中的成纤维细胞，接种于培养瓶中，通过两次传代，得到较纯的成纤维细胞；

(2)紫外线光干预：使用中波紫外线(uvb)光(311nm，1.9mw/cm²)照射3s，每24小时给予一次照射，连续照射3天；

在本发明中，药物干预方式为：初次照射前24小时，奥替普拉开始干预细胞，每次紫外线照射后仍加入奥替普拉干预，并在最后一次照射后24小时收取细胞；

本发明所用细胞为人类包皮真皮中的成纤维细胞，所述药物奥替普拉的使用浓度为20μm以内。

实验证实，所述的奥体普拉能改善紫外线导致的皮肤成纤维细胞的表型，对延缓或逆转人类皮肤光损伤表型、提供紫外线防护具有重要作用；进一步，所述的奥替普拉可用于制备延缓或逆转紫外线导致的人类皮肤皮肤紫外线防护、抗光损伤表型的产品；用于延缓或逆转紫外线导致的人类皮肤皮肤紫外线防护、抗光损伤表型疾患。

更具体的，

所述的奥替普拉可用于制备提高紫外线所下调人类皮肤成纤维细胞活性和增殖能力，或用于制备提高紫外线所下调的人类皮肤成纤维细胞活性的产品和增值能力的产品；

所述的奥替普拉能降低紫外线所提高的人类皮肤成纤维细胞dna的损伤，可用于制备降低紫外线所提高人类皮肤成纤维细胞的dna的损伤的药物；

所述的奥替普拉能降低紫外线所上调的人类皮肤成纤维细胞中β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞比例，可制备用于降低紫外线所上调的人类皮肤成纤维细胞中β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞比例的药物；

所述的奥替普拉能提高紫外线所下降的人类皮肤成纤维细胞中细胞外基质包括胶原纤维和弹性纤维的合成量，可制备用于提高紫外线所下调的人类皮肤成纤维细胞中细胞外基质包括胶原纤维和弹性纤维的合成量的药物；

所述的奥替普拉能降低紫外线所上调的人类皮肤成纤维细胞中相关分泌表型如基质金属蛋白酶1(mmp1)、基质金属蛋白酶3(mmp3)的表达量，可制备用于降低紫外线所上调的人类皮肤成纤维细胞中相关分泌表型如基质金属蛋白酶1(mmp1)、基质金属蛋白酶3(mmp3)的表达量的药物；

所述的奥替普拉能降低紫外线所上调的人类皮肤皮肤成纤维细胞中ros水平，可制备用于降低紫外线所上调的人类皮肤皮肤成纤维细胞中ros水平的药物；

所述的奥替普拉能能提高人类皮肤皮肤成纤维细胞中nrf-2及其下游抗氧化蛋白nqo-1的表达量，可制备用于提高人类皮肤成纤维细胞中nrf-2及其下游抗氧化蛋白nqo-1的表达量的药物。

本发明所制备的皮肤紫外线防护、抗光损伤的药物优选为外用药物制剂。

附图说明

图1：光学显微镜下观察不同处理条件下人原代成纤维细胞的数量和形态学特征。

图2：cck8检测不同处理条件下人原代成纤维细胞的活性。

图3：流式细胞技术检测ki-67阳性细胞比例。

图4：免疫荧光技术检测细胞dna的损伤。

图5：光学显微镜下观察不同处理条件下人原代成纤维细胞的β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的比例。

图6：不同处理条件下人原代成纤维细胞细胞外基质和基质金属蛋白酶的表达。

图7：不同处理条件下ros的表达水平。

图8：不同条件下nrf-2及其下游抗氧化蛋白nqo-1的表达。

具体实施方式

本发明结合实施例和相应附图做进一步阐释说明，以下实施例仅用于说明目的，不用于限制本发明范围。

实施例1、本发明的细胞模型实验

一)正常人原代成纤维细胞的分离与培养

正常人原代成纤维细胞单细胞悬液制备：正常人皮肤组织于75％乙醇溶液中浸泡30秒，然后用pbs清洗3-5遍至无血。无菌条件下去除皮下组织、血管，用剪刀修成2mm×4mm的细条，移至0.5％dispase4℃消化过夜，约16小时；血清终止消化，用小镊子小心分离表皮和真皮，去除表皮；将得到的真皮置于0.25％胰酶-0.02％edta37℃孵育90min，200μm钢丝滤网上研磨过滤，1500r/min离心10min。弃上清，加入5ml含10％fbs的dmem高糖培养基，按5×105/瓶的密度接种于100cm2培养皿中，37℃、5％co2培养，3天换液1次；

成纤维细胞传代与纯化培养：成纤维细胞生长近70％-80％融合时(约占瓶底面积的80％)，弃去培养瓶中的细胞培养液，经pbs液冲洗两次后，加入2ml的0.25％胰蛋白酶-edta消化液，37℃条件下孵育1-2min。在相差显微镜下观察成纤维细胞形态变化；当大多数细胞缩小、彼此分离、细胞变圆悬浮时，立即加入等量10％fbs血清终止消化。将细胞悬液移至离心管中离心(2200g，5min)后，弃去上清液，用pbs溶液冲洗两次后，加入新的细胞培养液，吹打均匀并细胞计数后移至细胞培养皿，37℃、5％co2培养，3天换液1次；一般传代2次即可得到纯的成纤维细胞；按；照实验方案的方法处理成纤维细胞，所得光镜下图片如图1所示，紫外线辐照后成纤维细胞变大变平，数量减少，而加入奥替普拉后成纤维细胞的数量和形态均得到改善。

二)cck-8细胞活性实验、ki-67细胞染色流式计数实验检测成纤维细胞的活力

1.cck-8法检测细胞活性：紫外线干预组、紫外线+奥替普拉处理组以及对照组的成纤维细胞，分别接种至96孔板，每孔1x103个，每组设3个复孔，空白孔不加细胞，只加培养基。5％co2，37℃培养箱培养48h弃去上清液，pbs洗2次；每孔加入cck-850ul，5％co2，37℃培养箱培养4h；置酶标仪于450nm波长测吸收光光度值(a值)。细胞增殖率＝(a450照射组-a450空白组)/(a450对照组-a450空白组)×100％。重复3次，结果如图2所示，紫外线辐照后成纤维细胞活性明显下降，加入奥替普拉处理后，活性明显上升。

2.ki-67细胞染色流式计数检测细胞增殖：紫外线干预组、紫外线+奥替普拉处理组以及对照组的成纤维细胞处理后收取的细胞用细胞死活15分钟，用ph7.4的不含ca2+和mg2+的pbs洗2次，破膜后，用ki-67荧光标记染色45分钟，随后用流式机器检测，统计ki-67阳性的细胞比例，重复三次，结果如图3所示，紫外线辐照后成纤维细胞增殖能力明显下降，加入奥替普拉处理后，增值能力显著上升。

三).细胞免疫荧光技术检测细胞dna的损伤

1.细胞爬片：将细胞专用爬片高温消毒后，放置在24孔板底部，接种细胞，过夜后即可进行紫外线照射及opz处理；

2.将处理后的细胞，用pbs洗涤3遍，加入4％多聚甲醛固定15分钟；

3.pbs洗涤5min*3遍，而后在含0.3％triton^tmx-100的5％bsa封闭缓冲液中封闭标本60分钟；

4.吸去封闭缓冲液，加入用封闭缓冲液稀释的γ-h2a.x一抗，4℃孵育过夜；

5.用1xpbs漂洗三次，每次5分钟。用封闭缓冲液稀释将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本1小时；

6.用1xpbs漂洗三次，每次5分钟，加入封闭缓冲液稀释的dapi，染色5分钟，1xpbs漂洗三次；

7.加入抗淬灭剂，荧光显微镜下观察结果，而后放入4度冰箱中保存；

结果如图4所示，紫外线辐照后成纤维细胞中γ-h2a.x的表达阳性的细胞明显增多，加入奥替普拉处理后，γ-h2a.x的表达阳性的细胞明显下降。

四)相关β-半乳糖苷酶染色鉴定

细胞相关β-半乳糖苷酶染色是一种基于细胞β半乳糖苷酶染色活性水平上调进行细胞检测的方法；在12孔板中处理获得的紫外线干预组、紫外线+奥替普拉处理组以及对照组的成纤维细胞，用pbs洗涤两次，加入染色固定液，室温固定20分钟后，弃掉固定液，用pbs洗涤2次，每孔中加入600μl染色液；36小时左右在显微镜下观测被染成蓝绿色的细胞即为细胞，对三组细胞中相关β半乳糖苷酶染色阳性细胞比例进行统计分析；

结果如图5所示，紫外线辐照后成纤维细胞中β半乳糖苷酶染色阳性细胞比例显著上升，加入奥替普拉处理后，β半乳糖苷酶染色阳性细胞比例下降。

五)细胞外基质及基质金属蛋白酶的mrna水平的分析

6孔板每孔加入1mltrizol直接裂解贴壁细胞，将细胞裂解液转移至离心管中、涡旋、震荡混匀；每管加入氯仿200ul，震荡混匀，室温静置3分钟，12,500rpm离心15分钟，收集上清；向上清中加入1倍体积异丙醇，混匀得到的溶液，12,500rpm离心15分钟，弃上清，加入75％无水乙醇，混匀后7500rpm离心10分钟，弃掉上清，晾干后所得即为rna；采用cdna合成试剂盒将rna逆转录为cdna总反应体系为10μl，反应条件如下：37℃，15min；85℃，5s；4℃；采用extaqdna聚合酶，以上述cdna为模板，扩增目的基因和gapdh基因；应用7500real-time仪器进行real-time-pcr，扩增总反应体系为20μl，反应条件如下：95℃，15s；95℃，5s；60℃，34seconds，循环数40；目的基因mrna相对表达量采用δδct进行计算即：δct＝ct目的基因-ctgapdh，-δδct＝δct对照组平均值-δct目的基因，rq(相对表达量)目的基因＝2-δδct，rq对照组＝1；

图6结果表明，紫外线辐照后成纤维细胞中ecm(col1a1和elastin)合成下降，同时mmp1和mmp9基质金属蛋白酶的合成上升，并且奥替普拉的处理可以逆转这种变化。

六)流失细胞学技术检测细胞ros

用荧光探针dcfh-da进行活性氧检测；dcfh-da不带荧光，能够穿管细胞膜进入细胞，可以在细胞内的被水解生成dcfh，dcfh不能通透细胞膜而存蓄在细胞内，当细胞内活性氧水平升高时，无荧光的dcfh可以被活性氧氧化成有荧光的dcf，细胞内ros的水平即可用为dcf的荧光强度表示；

1.紫外线及奥替普拉处理细胞后装载探针：用dmem稀释dcfh-da，使终浓度为10μm，紫外线和奥替普拉处理后，收取细胞，加入稀释后的dcfh-da，将处理后的细胞在37℃细胞培养箱内孵育20-30分钟，随后用dmem洗涤细胞2-3次，洗掉未进入细胞内的dcfh-da；

2.检测：使用488nm激发波长，525nm发射波长设置流式细胞仪，检测空白、对照组和处理组的ros水平；

图7所示结果表明，紫外线辐照后成纤维细胞中ros水平相较于对照组明显上升，加入奥替普拉处理后，相对于紫外线辐照组，ros的水平明显下降。

七)nrf-2及其下游抗氧化蛋白nqo-1的统计分析

蛋白的制备：紫外线干预组、紫外线+奥替普拉处理组以及对照组的成纤维细胞在冰上用rapa裂解15分钟，并加入pmsf防止蛋白降解，获得的蛋白，利用bca比色法将蛋白浓度调至同一水平，而后加入sds-page，随后100℃变性处理5min；

电泳：制备sds-page电泳凝胶，样品中加上样缓冲液，冷却至室温后，将蛋白样品上样至凝胶进行电泳；

转膜：电泳结束后将胶条割至合适大小；预裁与胶条同样大小pvdf膜，浸入甲醇中活化15s，在转膜液中，转膜装置从下至上依次按阳极碳板、厚滤纸、薄滤纸、pvdf膜、凝胶、薄滤纸、厚滤纸、阴极碳板的顺序放好，每一步去除气泡；接通电源，恒压100v，转移1.5h。转移结束后，断开电源将膜取出；

抗体孵育：裁取待测膜条，用tbst洗膜，5min×3次，加入封闭液，平稳摇动，室温2h，弃封闭液，用tbst洗膜，5min×3次，加入兔抗人iggnrf-2及nqo-1一抗2ml(1∶1000)，4℃放置12h以上，弃一抗和5％bsa，用tbst分别洗膜，5min×4次，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，平稳摇动，室温2h。弃二抗，用tbst洗膜，5min×4次，显色：加入显色液显色；

所得western图片如图8所示，western结果表明紫外线辐照后成纤维细胞中nrf-2及nqo-1表达略有上升，奥替普拉的处理能明显上调nrf-2及nqo-1蛋白的表达。