用于增强细胞免疫疗法的方法与流程

用于增强细胞免疫疗法的方法
相关申请的交叉引用
1.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求以下临时专利申请的优先权的权益：2019年4月5日提交的美国临时专利申请号62/830,212；2019年6月14日提交的美国临时专利申请号62/861,858；2019年9月10日提交的美国临时专利申请号62/898,473，和2019年12月6日提交的美国临时专利申请号62/944,955，其披露内容各自通过引用并入本文。
技术领域
2.本技术涉及(尤其)免疫疗法领域，并且涉及通过向患有病症(如癌症)的个体施用嵌合抗原受体(car)修饰的t细胞和白介素
‑
15受体激动剂来治疗该个体。


背景技术：

3.正在不断开发新疗法以获得改善的癌症治疗。癌症治疗最有前景的领域之一是免疫肿瘤学(即，癌症免疫疗法)。癌症免疫疗法是指被设计来调节免疫应答以诱导患者自身免疫系统来对抗癌症的一系列不同治疗策略。在目前的免疫治疗方法中，过继性细胞转移疗法(也称为act)在治疗患有某些类型癌症的患者方面显示出前景。过继性细胞疗法涉及肿瘤特异性淋巴细胞的分离和离体扩增，以产生比通过简单疫苗接种可达到的更多数量的肿瘤反应性效应t细胞。将肿瘤特异性t细胞输注到患有癌症的患者中以引发患者的免疫系统来杀伤肿瘤细胞。过继性细胞转移已经显示出有效的临床结果，特别是在转移性黑色素瘤中(dudley,m.e.,j.r.wunderlich等人,j clin oncol[临床肿瘤学杂志]23(10):2346
‑
2357(2005)；dudley,m.e.,j.c.yang等人,j clin oncol[临床肿瘤学杂志]26(32):5233
‑
5239(2008))。过继性细胞转移可以是自体的，如在过继性t细胞疗法中典型的，或者可以是同种异体的。
[0004]
过继性t细胞疗法的一种形式是car t细胞疗法(嵌合抗原受体修饰的t细胞疗法)。car是一类可以重新编程淋巴细胞特异性和功能的合成受体(sadelain,m.等人,nature[自然],545,2017年5月25日,第423
‑
431页)。car t细胞疗法使用离体基因工程改造的t细胞，其经过转导以表达人工受体，该人工受体重定向t细胞对在肿瘤细胞表面表达的靶肿瘤相关抗原(taa)的特异性(june,c.h.等人,sci transl med[科学转化医学]2015；7(280):280ps7)。与天然存在的t细胞和t细胞受体工程改造的t细胞不同(这两种t细胞在特定主要组织相容性复合体(mhc)的情况下识别其同源抗原)，car t细胞的抗原识别与mhc无关，从而扩大了此基于细胞的免疫治疗模式的应用性。第一代car t细胞包含单克隆抗体的单链可变区(scfv)、t细胞受体跨膜结构域、和cd3ζ链的胞内信号传导结构域。之后的迭代还使用一个或多个共刺激结构域，和/或可控的通断开关。随着时间的推移，car t细胞疗法已经发展到提供具有改进特异性和安全性的基因工程改造t细胞。
[0005]
虽然基于car t细胞的疗法已经在美国被批准用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤，但并非所有患者均对car t细胞产生应答，并且应答的持久性仍然存在局限。car t细胞疗法的另一个挑战是转移细胞的存活率差。在复发性或难治性大b细胞淋巴瘤中，近60％的患者
出现复发或不能进展，并且失败后的预后是严峻的(nair,j.等人,best practice&research clinical haematology[临床血液学的最佳实践和研究]31(2018)293
‑
298)。成功的car t细胞疗法结果(即6个月后具有完全缓解率的良好持久反应)至少部分依赖于car t细胞的长期持久性。虽然car t细胞疗法治疗淋巴瘤患者的ii期试验的临床结果已经报告了显著的功效，但对于许多最初对治疗产生应答的患者来说，应答的持久性仍然存在局限(shah,n.等人,frontiers in oncology[肿瘤学前沿],9(2019年3月)文章146)。此外，据报道car t细胞疗法后出现的急性毒性包括细胞因子释放综合征(crs)和被称为car相关脑病综合征的神经毒性(neelapu,s.s.等人,nat rev clin oncol[自然综述：临床肿瘤学]2018；15(10:47
‑
62))。其他较不常观察到不良副作用包括噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hlh)/巨噬细胞活化综合征(mas)、过敏反应、和肿瘤溶解综合征。
[0006]
尽管迄今为止在开发有效的基于car t细胞的疗法方面已经做出了大量努力，但仍然需要提供新的且更有效的免疫治疗性car t细胞策略和相关的治疗方案，以解决当前疗法的一个或多个缺点。
[0007]
因此，本披露寻求通过提供一种新的且有效的基于car t细胞的免疫疗法来解决这些缺点和其他需求，该免疫疗法例如将car t细胞群体引向具有更强持久性和改善功效等优势(将在下文中更详细地解释)的肿瘤杀伤表型。


技术实现要素：

[0008]
在第一方面，本文提供了包括向患有癌症的受试者进行过继性细胞转移与施用长效il
‑
15受体激动剂组合的方法，该方法将在本文中进行更详细地描述。本披露至少部分源于以下认识：如本文所述的包括以任何次序依序施用或基本上同时施用一个或多个周期的过继性细胞疗法(例如，通过输注car t细胞)和施用长效il
‑
15受体激动剂的组合治疗方案，可以特别有效地治疗一些受试者的癌症和/或可以增加、提高或延长转移细胞的活性和/或数量，或导致对癌细胞产生可测量的有益应答(在适用时，例如稳定、消退、缩小、坏死等)，其程度相对于单独的单一免疫治疗方法得以提高，优选地显著提高。
[0009]
在第二方面，本文提供了用于治疗患有癌症的受试者的组合免疫疗法，该组合免疫疗法包括向该受试者施用包含t细胞的过继性细胞免疫疗法组合物，该t细胞已经过修饰以表达嵌合抗原受体(car t细胞)；以及向该受试者施用长效il
‑
15受体激动剂。
[0010]
在第三方面，提供了改善用于治疗患有癌症的受试者的过继性细胞疗法(例如像car t细胞疗法)的治疗有效性的方法，该方法包括向患有癌症的受试者提供包含t细胞的过继性细胞免疫疗法组合物，该t细胞已经过修饰以表达嵌合抗原受体；以及向该受试者施用长效il
‑
15受体激动剂，其中施用长效il
‑
15受体激动剂有效改善该受试者对该过继性细胞疗法的应答。
[0011]
除非另外指示，否则以下实施例旨在同等地应用于上述每个方面，并且在适用时以单独和组合两种形式进行考虑。
[0012]
在一些实施例中，该过继性细胞转移包括施用包含t细胞的过继性细胞免疫疗法组合物，该t细胞已经过修饰以表达cd19定向的嵌合抗原受体。
[0013]
在一个或多个其他实施例中，该长效il
‑
15受体激动剂有效优先刺激和扩增天然杀伤(nk)细胞。在又一个或多个另外的实施例中，该长效il
‑
15受体激动剂支持cd8+ t细胞
的存活和记忆形成，例如，基本上没有诱导抑制性调节性t细胞(t reg)。在又一些其他实施例中，该长效il
‑
15受体激动剂对il
‑
15受体α具有特异性。在一些其他实施例中，该长效il
‑
15受体激动剂具有一个或多个前述特征，即(i)有效优先刺激和扩增nk细胞，(ii)支持cd8+ t细胞的存活和记忆形成，例如，基本上没有诱导抑制性调节性t细胞(t reg)，以及(iii)对il
‑
15受体α具有特异性。
[0014]
在一些其他实施例中，该长效il
‑
15受体激动剂具有以下结构：其中il
‑
15为白介素
‑
15部分，(n)为从约150至约3,000的整数并且～nh～表示所述il
‑
15部分的氨基基团。
[0015]
在一个或多个与具有式(i)的长效il
‑
15受体激动剂相关的实施例中，(n)在约795至约1068的范围内。在一些另外的实施例中，(n)为从约840至约1023的整数。在一个或多个特定实施例中，(n)的值平均为约907或约909。
[0016]
为了清楚起见，关于施用顺序，其中术语“施用”在这种情况下用于指递送过继性细胞免疫疗法组合物或长效il
‑
15受体激动剂，过继性细胞和长效il
‑
15受体激动剂可以同时或依序且以任何次序施用。此外，组合中任一组分的治疗可以包括单个治疗周期或者可以包括多个治疗周期。也就是说，在包括施用包含t细胞(其已经过修饰以表达嵌合抗原受体，例如像cd19定向的car t细胞)的过继性细胞免疫疗法组合物和施用长效il
‑
15受体激动剂的初始疗法周期之后，另外轮次的疗法可以包括过继性细胞转移(例如施用car t细胞和长效il
‑
15受体激动剂的组合)，或过继性细胞疗法(例如，car t细胞疗法)而不伴随施用长效il
‑
15受体激动剂，或施用长效il
‑
15受体激动剂而不伴随过继性细胞转移(例如，施用car t细胞，如cd19 car t细胞)。
[0017]
在一个或多个实施例中，该受试者是人类受试者。
[0018]
在一个或多个非限制性实施例中，该癌症是液体癌症(如血癌)，例如复发性或难治性恶性肿瘤。
[0019]
在一个或多个相关的非限制性实施例中，该癌症是淋巴瘤或白血病。在一个或多个相关的实施例中，该癌症选自霍奇金(hodgkin)淋巴瘤和非霍奇金(non
‑
hodgkin)淋巴瘤。
[0020]
在一些另外的非限制性实施例中，该癌症是b细胞恶性肿瘤。在一些其他实施例中，该癌症是b细胞淋巴瘤。
[0021]
在又一些其他实施例中，该癌症是多发性骨髓瘤。
[0022]
在一个或多个可替代实施例中，该癌症是实体癌。
[0023]
在本文提供的方法的一些其他实施例中，该方法导致了有益的治疗应答，该有益的治疗应答相对于根据单独施用过继性细胞免疫疗法组合物或长效il
‑
15受体激动剂来进行施用时观察到的治疗应答有所提高。
[0024]
在一些与前述相关的实施例中，有益的治疗应答是基于合适的动物模型，例如像体内异种b细胞淋巴瘤模型。
[0025]
另外的方面和实施例在以下说明书和权利要求书中进行阐述。
附图说明
[0026]
图1提供了来自大肠杆菌的示例性重组人il
‑
15的氨基酸序列(seq id no:1)；示例性重组人il
‑
15的氨基酸序列(seq id no:2)，该氨基酸序列包括在大肠杆菌中启动翻译的序列开始处的甲硫氨酸，是一条含有115个氨基酸的非糖基化多肽链，分子量为12.9kda；和示例性前体形式的il
‑
15的氨基酸序列(seq id no:3)。
[0027]
图2是如实例中所述用以转导分离自健康供体的cd4和cd8 t细胞的合适cd19 car慢病毒构建体的图解。
[0028]
图3a和图3b展示了如流式细胞术所测量和如实例2中进一步所述的人cd19 car t细胞的il
‑
15rα表达。图3a中示出了cd8 car t细胞的表达(实线)；图3b中示出了cd4 car t细胞的il
‑
15rα表达(实线)。两个附图均还包括fmo对照(灰色填充)和同型对照(虚线)。
[0029]
图3c和图3d是示出了如流式细胞术所测量和如实例2中进一步所述的用不同浓度的mpba
‑
il15(
●
)或il
‑
15(
■
)刺激20分钟后，cd8 car t细胞(图3c)或cd4 car t细胞(图3d)的stat5磷酸化百分比相对于浓度对数(ng/ml)的图。
[0030]
图3e和图3f是示出了如流式细胞术所测量和如实例2中进一步所述的用cfse标记并且与不同浓度的mpba
‑
il15(
●
)或il
‑
15(
■
)一起孵育20分钟，cd8 car t细胞(图3e)或cd4 car t细胞(图3f)的增殖(％分裂)的图。
[0031]
图4a是如实例3所述的如在荷瘤小鼠的体内异种b细胞淋巴瘤模型中所评估平均肿瘤辐射(p/s/cm2/sr)随时间(car t细胞输注后天数)的图，这些荷瘤小鼠用单独的car t细胞治疗(
■
)，和用其与不同剂量的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)(0.030mg/kg(绿色
◆
)、0.10mg/kg(紫色
◆
)和0.30mg/kg(
▼
))组合治疗。pbs对照示作圆点(
●
)。
[0032]
图4b示出了如实例3(研究a)所述的用于评估临床前鼠淋巴瘤模型中cd19 car t细胞组合免疫疗法的功效的说明性治疗方案。
[0033]
图5a和图5b是示出了携带淋巴瘤细胞的小鼠的血液中cd8 car t细胞(图5a)或cd4 car t细胞(图5b)的数量的图，该携带淋巴瘤细胞的小鼠输注了car t细胞(d0)，随后施用mpba
‑
il15(0.3mg/kg)(开始于第
‑
1天、第7天或第14天，然后每周施用)。每周给小鼠放血，并且通过流式细胞术鉴定cd8和cd4car t细胞。图提供了细胞数/μl血液相对于car t细胞施用后天数。研究组包括：如实例3所述的在car t细胞输注之后仅输注了mpba
‑
il15的荷瘤小鼠(
●
)、仅输注了car t细胞的荷瘤小鼠(
■
)、和用car t细胞与mpba
‑
il15的组合(开始于第
‑
1天(
▲
)、第7天(
▼
)或第14天(
◆
))治疗的荷瘤小鼠，持续多达28天。
[0034]
图6是通过提供如实例3所述的如在进行以下治疗后的荷瘤小鼠的体内异种b细胞淋巴瘤模型中所评估的随时间(car t细胞输注后天数)的平均肿瘤辐射(p/s/cm2/sr)来评估肿瘤负荷的图，这些荷瘤小鼠仅输注了mpba
‑
il15(
●
)、仅输注了car t细胞(
■
)、或用car t细胞与mpba
‑
il15的组合(开始于第
‑
1天(
▲
)、第7天(
▼
)或第14天(
◆
)，然后每周进行)进行治疗。
[0035]
图7a是示出了如实例3所述的如体内异种b细胞淋巴瘤模型中所评估的荷瘤小鼠的存活百分比的图，这些荷瘤小鼠在输注car t细胞(第0天)之后仅用car t细胞治疗(蓝色线)、仅用mpba
‑
il15治疗(黑色线)、或用car t细胞与mpba
‑
il15(0.3mg/kg)的组合(开始于第
‑
1天(紫色线)、第7天(红色线)或第14天(绿色线))治疗。
[0036]
图7b示出了如实例3(研究b)所述的用于评估临床前鼠淋巴瘤模型中cd19 car t细胞组合免疫疗法的功效的说明性治疗方案。
[0037]
图8a至图8c分别是如实例3所述的cd8 car t细胞的car t细胞总数、ki67表达水平、以及pd1和tim3的表达的图，这些cd8 car t细胞来自携带raji
‑
淋巴瘤细胞的nsg小鼠的骨髓，这些nsg小鼠在d0输注了car t细胞(car t细胞单一疗法)或已经接受了除输注car t细胞外，从d7开始进行每周注射mpba
‑
il15。图8a是示出了仅输注了car t细胞(
●
)后的荷瘤小鼠和接受了car t细胞疗法与mpba
‑
il15的组合(
■
)的荷瘤小鼠的骨髓中cd8 car t细胞的总数的图。图8b是示出了来自car t细胞单一疗法(
●
)后的荷瘤小鼠和来自接受了car t细胞与mpba
‑
il15的组合(
■
)的荷瘤小鼠的骨髓的cd8 car t细胞中ki67的表达(％ki67+)的图。图8c是示出了来自仅输注了car t细胞(
●
)(单一疗法)后的荷瘤小鼠和来自接受了car t细胞疗法与mpba
‑
il15的组合(
■
)的荷瘤小鼠的骨髓的cd8 car t细胞中pd1和tim3的表达(％pd1+tim3+)的图。
[0038]
图9a至图9c分别是如实例3所述的cd4 car t细胞的car t细胞总数、ki67表达水平、以及pd1和tm3的表达的图，这些cd4 car t细胞来自携带raji
‑
淋巴瘤细胞的nsg小鼠的骨髓，这些nsg小鼠在d0输注了car t细胞(car t细胞单一疗法)或从d7开始每周还另外接受了mpba
‑
il15注射。图9a是示出了仅输注了car t细胞(
●
)后的荷瘤小鼠和接受了car t细胞疗法与mpba
‑
il15的组合(
■
)的荷瘤小鼠的骨髓中cd4 car t细胞的总数的图。图9b是示出了来自car t细胞单一疗法(
●
)后的荷瘤小鼠和来自接受了car t细胞疗法与mpba
‑
il15的组合(
■
)的荷瘤小鼠的骨髓的cd4 car t细胞中ki67的表达(％ki67+)的图。图9c是示出了来自仅输注了car t细胞(
●
)(单一疗法)后的荷瘤小鼠和来自接受了car t细胞疗法与mpba
‑
il15的组合(
■
)的荷瘤小鼠的骨髓的cd4 car t细胞中pd1和tm3的表达(％pd1+tim3+)的图。
[0039]
图10提供了无肿瘤小鼠在代表性时间点的生物发光图像，这些无肿瘤小鼠先前用mpba
‑
il
‑
15和car t细胞治疗并且在d38用raji肿瘤细胞再激发，之后每周进行成像以评估肿瘤负荷。此图说明了当在小鼠淋巴瘤模型中进行评估时先前用示例性长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il
‑
15)和car t细胞治疗的小鼠能够排斥raji肿瘤再激发。
[0040]
图11示出了如实例4所述的用于评估ror1 car t细胞与示例性长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il15)的组合免疫疗法在临床前鼠淋巴瘤模型中的功效的说明性治疗方案。
[0041]
图12a是如实例4所述的鼠淋巴瘤模型中各个治疗组的小鼠的肿瘤体积的变化百分比的图：对照t细胞(长方形)、对照t细胞和mpba
‑
il15(
▲
)、ror1 car t细胞(
▼
)、以及ror1 car t细胞和mpba
‑
il15(
◆
)；图12b是用ror1 car t细胞单一疗法(组消退率为18.5％)治疗的个体小鼠的肿瘤体积变化百分比相对于感染后周数的图；图12c是用ror1 car t细胞和mpba
‑
il
‑
15双联组合疗法(组消退率为44.4％)治疗的个体小鼠的肿瘤体积变化百分比相对于感染后周数的图。
[0042]
图13a是如实例4所述的治疗组中cd8 car t细胞频率(其表示为活细胞分别在脾脏和肿瘤中的百分比)的图：对照t细胞(黑色)、ror1 car t细胞(红色)、以及ror1 car t细胞和mpba
‑
il15(蓝色)；图13b是如实例4所述的各个治疗组中cd8细胞总频率(其表示为活细胞分别在脾脏和肿瘤中的百分比)的图。
[0043]
图14a、图14b、图14c、和图14d是来自ror1肺模型中各个治疗组的小鼠的肺组织
图，这说明了mpba
‑
il
‑
15(一种说明性长效il
‑
15激动剂)增强了ror1 car t细胞在肺中的运输和持久性。
[0044]
图15a和图15b展示了如实例5所述用mpba
‑
il15体外治疗之后cd8 car t细胞中的蛋白质表达水平。图15a提供了cd8car t细胞中ifnγ的表达(以pg/ml计)，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。图15b提供了cd8 car t细胞中tnfα的表达(以pg/ml计)，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0045]
图16a展示了如实例5所述的cd8 car t细胞的car t细胞扩增(呈倍数扩增)，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0046]
图16b和图16c分别提供了如实例5所述的cd8 car t细胞中bcl
‑
2(以bcl
‑
2mfi计)和活化的半胱天冬酶3(示作％半胱天冬酶3+)的表达，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0047]
图17a和图17b展示了如实例6所述的bcl
‑
2在car
‑
t细胞中的表达，这些car
‑
t细胞来自用单独的car t细胞处理或用其与mpba
‑
il15的组合处理的携带淋巴瘤的小鼠。如在输注后d8所确定的，对于cd8 car t细胞(图17a)和cd4 car t细胞(图17b)，直方图中示出了bcl
‑
2在car t细胞中的表达(灰色＝仅用car t细胞治疗的小鼠；红色和蓝色＝施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠)。
[0048]
图18a和图18b还展示了如实例6所述的bcl
‑
2在car
‑
t细胞中的表达，这些car
‑
t细胞来自用单独的car t细胞治疗或用其与mpba
‑
il15的组合治疗的携带淋巴瘤的小鼠。如在输注后d8所确定的，对于cd8 car t细胞(图18a)和cd4 car t细胞(图18b)，条形图中示出了bcl
‑
2在car t细胞中的表达(黑色＝仅用car t细胞治疗的小鼠；红色＝施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠)。
[0049]
图19a至图19d展示了如实例6所述的记忆标志物cd45ra和ccr7在car t细胞中的表达。图19a展示了蛋白质在仅施用car t细胞的小鼠的cd8 car t细胞中的表达；图19b展示了蛋白质在施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠的cd8 car t细胞中的表达；图19c展示了蛋白质在仅施用car t细胞的小鼠的cd4 car t细胞中的表达；以及图19d展示了蛋白质在施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠的cd4 car t细胞中的表达，其中提供了cd5ra
‑
ccr7
‑
(橙色)、cd5ra+ccr7
‑
(绿色)、和cd5ra
‑
ccr7+(红色)的表达数据。这些图示出了平均值
±
sem。
具体实施方式
[0050]
如本说明书所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。
[0051]
在描述和要求本披露的某些特征时，除非另外指明，否则将依据以下所述定义使用以下术语。
[0052]
如本文所使用的“peg”或“聚乙二醇”意指包括任何水溶性的聚(环氧乙烷)。除非
另外指明，否则“peg聚合物”或聚乙二醇是如下物质，其中基本上所有(优选所有)单体亚单元是环氧乙烷亚单元，但是，该聚合物可以含有不同的封端部分或官能团，例如用于缀合的封端部分或官能团。用于在本披露中使用的peg聚合物将包括两种以下结构之一：
“‑
(ch2ch2o)
n
‑”
或
“‑
(ch2ch2o)
n
‑1ch2ch2‑”
，这取决于末端的一个或多个氧是否被置换(例如在合成转化期间)。对于这些peg聚合物，该变量(n)的范围典型地为从约3至4000，并且整个peg的末端基团和架构可以变化。然而，示例性或优选的包含peg的分子可以包含一种或多种特定的peg架构和/或接头、和/或分子量范围。
[0053]
在水溶性聚合物(诸如peg)的情况下，分子量可以表示为数(标称)均分子量或重均分子量。除非另外指明，否则所有对分子量的提及本文均指重均分子量。两种分子量测定(数均与重均分子量)均可以使用凝胶渗透色谱法或其他液相色谱技术(例如，凝胶过滤色谱法)来测量。最常采用的是凝胶渗透色谱法和凝胶过滤色谱法。用于确定分子量的其他方法包括末端基团分析或依数性(例如冰点降低、沸点升高或渗透压)的测量以确定数均分子量；或使用光散射技术、超速离心法、maldi tof或粘度测定法以确定重均分子量。peg聚合物典型地是多分散的(即这些聚合物的数均分子量和重均分子量是不相等的)。如本文所述，用于共价附接至靶分子(如il
‑
15)的peg聚合物通常具有优选小于约1.2，更优选小于约1.15，仍更优选小于约1.10，例如小于约1.05、或小于约1.03的低多分散性值。
[0054]“生理学上可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键是典型地与水在生理条件下和在任何合适的水解方法下进行反应(即，被水解)的相对不稳定的键。键在水中水解的趋势可能不仅取决于在给定分子内连接两个原子的键联的一般类型，还取决于附接到这些原子上的取代基和分子的整体结构。水解不稳定的或弱的键联典型地可以包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽、寡核苷酸、硫酯以及碳酸酯。
[0055]“酶可降解的键联”意指经受一种或多种酶降解的键联。
[0056]“稳定的”键联或键是指在水中基本上稳定，也就是说在生理条件下经延长的时间段没有经受任何明显程度水解的化学键。水解稳定的键联的实例通常包括但不限于以下：碳
‑
碳键(例如，在脂族链中)、醚、酰胺、胺等。一般而言，稳定的键联是在生理条件下展现出小于约1％
‑
2％的每日水解速率的键联。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科书中找到。
[0057]
如本文所使用，术语“il
‑
15部分”是指具有人il
‑
15活性的肽或蛋白质部分。此外，术语“il
‑
15部分”涵盖与peg部分缀合前的il
‑
15部分，以及与反应性peg部分(例如像mpeg
‑
琥珀酰亚胺基丁酸酯)缀合(即，共价附接)(例如与该反应性peg部分反应)后的il
‑
15部分。如下文中将进一步详细解释，本领域的普通技术人员可以确定给定部分是否具有il
‑
15活性。包含与seq id no:1至3中任一项对应的氨基酸序列的蛋白质是示例性il
‑
15部分，与其基本上同源的任何蛋白质或多肽也是示例性il
‑
15部分。如本文所使用，术语“il
‑
15部分”包括例如通过位点定向诱变而有意修饰或通过突变而偶然修饰的此类肽和蛋白质。因此包括具有从1至6个额外糖基化位点的il
‑
15序列、在肽或蛋白质的羧基末端处具有至少一个额外氨基酸(其中该一个或多个额外氨基酸包含至少一个糖基化位点)的序列以及具有包含至少一个糖基化位点的氨基酸序列的序列。该术语意指包括天然地、重组地和合成地产生的il
‑
15部分。提及长效il
‑
15受体激动剂旨在涵盖其药学上可接受的盐形式。
[0058]
术语“基本上同源”或“基本上相同”意指特定主题序列(例如突变序列)因一个或
多个取代、缺失或添加而不同于参考序列，其净效应不导致该参考序列与该主题序列之间不利的官能差异。出于本文的目的，与给定序列(在严格条件下)具有大于95％的同源性(同一性)、等效的生物活性(但并非必须是等效强度的生物活性)、以及等效的表达特征的序列被认为是基本上同源的(相同的)。出于确定同源性的目的，应当忽略成熟序列的截短。本文所用的示例性il
‑
15多肽包括与seq id no:1基本上同源的那些序列。seq id no:2与seq id no:1几乎相同，不同之处在于seq id no:2在序列开端具有甲硫氨酸，该甲硫氨酸是大肠杆菌中起始翻译所需的。
[0059]
术语“片段”意指具有蛋白质或多肽(例如il
‑
15部分)的一部分或片段的氨基酸序列、并且具有蛋白质或多肽(例如il
‑
15)的生物活性或基本具有其生物活性的任何蛋白质或多肽。片段包括由蛋白水解降解所产生的蛋白质或多肽以及通过本领域中的常规方法通过化学合成产生的蛋白质或多肽。
[0060]
如本文所使用，术语“治疗癌症”并非旨在是绝对术语，并且可以包括例如减小肿瘤的尺寸或减少癌细胞的数量，使癌症缓解或阻止癌细胞的尺寸或数量增长等。在一些情况下，根据本披露的治疗产生改善的预后。
[0061]
如本文在用于治疗患有癌症的受试者的方法中所使用，短语“需要治疗的受试者”是指已被诊断患有癌症的个体或受试者。
[0062]
如本文所使用，术语“增强(enhancing)”(例如在增强的应答的上下文中)是指当与给定的基线或参考疗法比较时，受试者或肿瘤细胞对治疗(例如，如本文所披露的)的改善的应答能力。例如，基于对治疗的应答性的任何一个或多个指标，提高的应答可以包括应答性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。如本文所使用，“提高”还可以指提高有利地对治疗反应的受试者的数量，例如，当与这种比较的给定基线比较时。
[0063]
如本文所使用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如像癌症。难治性癌症可能在治疗前或治疗开始时对治疗具有抗性，或者难治性癌症可能在治疗期间变的具有抗性。难治性癌症还被称作抗性癌症。
[0064]
如本文所使用的“复发性(relapsed)”或“复发(relapse)”是指疾病(例如癌症)或疾病(如癌症)的体征和症状经过一段时间的改善或应答后(例如在某疗法(如癌症疗法)的先前治疗后)再次出现。
[0065]
如本文所使用，术语“cd19”是指分化簇19蛋白，其为可在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸序列和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如像genbank、uniprot和swiss
‑
prot。如本文所用，“cd19”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型cd19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。cd19在大多数b谱系癌症(包括例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤)上表达。
[0066]
短语“治疗上有效的”、“治疗有效量”、“有效量”或“以有效的量”是指促进所希望生理应答的足够量或剂量，如在施用长效il
‑
15受体激动剂的情况下，是指足够促进对包含例如car t细胞的过继性细胞免疫疗法组合物的施用产生增强的应答的量。精确量将取决于许多因素，例如像所治疗的特定病症、患者群体、个体患者的考虑因素、待施用的治疗组合物和特定组合的组分和物理特性、待施用的特定过继性细胞转移疗法(例如，car t细胞组合物中包含的细胞的特定组分，和/或car t细胞表达的一种或多种嵌合抗原受体)等，并
且可以由本领域一般技术人员确定。
[0067]“基本上”或“实质上”意指几乎全部地或完全地，例如给定量的95％或更大。
[0068]
类似地，如本文所使用的“约”或“大约”意指在给定量的加或减5％内。
[0069]“任选的”或“任选地”意指随后描述的情形可以但是并非必然发生，这样该说明包括其中该情形发生的情况以及该情形不发生的情况。
[0070]“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包括在本文描述的组合物中并且不会对受试者引起显著不良毒理学作用的组分。
[0071]
如本文所使用，术语“患者”或“受试者”是指患有或易于患有通过施用如本文提供的化合物或组合物或组合来预防或治疗的病症(诸如癌症)的活生物体，并且包括人和动物。受试者包括但不限于哺乳动物(例如，鼠类、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科等)，并且优选是人(包括小儿和成人受试者)。概述
[0072]
虽然在用car t细胞进行过继性细胞疗法后，在例如血液恶性肿瘤中诱导有效的抗肿瘤应答是一种有前景的疗法，但患者在对治疗的最初有利应答后经常复发。为了解决与当前car t细胞策略相关的至少一些缺点，例如像通过提高持久性、延长应答持续期、克服或解决抗性、提高安全性、和/或改善患者结果(功效)，本文提供了一种方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用包含t细胞的过继性细胞免疫疗法组合物(该t细胞已经过修饰以表达嵌合抗原受体，如cd19定向的car t细胞)和具有如本文所述特征的长效il
‑
15受体激动剂。鉴于这些与当前car t细胞免疫疗法相关的缺点，需要进一步的增强以提供对治疗持久且有效的应答。因此，本披露(至少部分)基于发现了特别有利的治疗性免疫肿瘤学组合，该治疗性免疫肿瘤学组合包含car t细胞疗法和施用长效il
‑
15激动剂(并且更特别地是一种优选地保留与il
‑
15受体α结合的受体的长效il
‑
15激动剂，如示例性体内模型所展示的)，如从本披露和支持实例中将变得显而易见。过继性嵌合抗原受体细胞转移疗法和组合物
[0073]
本文提供的治疗方法包括施用离体扩增的、基因工程改造的t细胞，这些t细胞经过转导以表达人工靶肿瘤相关抗原(taa)结合结构域，即用于刺激癌症特异性免疫应答。本文提供的组合物和方法(尤其)可用于临床应用和研究应用两者中。不受理论束缚，据信可以经由il
‑
15路径(即，经由与过继性细胞转移一起施用长效il
‑
15受体激动剂)模拟由过继性细胞转移例如car t细胞转移的免疫活化和本文提供的长效il
‑
15受体激动剂的互补机制产生的所希望的t细胞应答来达到提高的抗肿瘤结果。
[0074]
任何合适的嵌合抗原受体t细胞(car t细胞)疗法都可以用于本文提供的方法中，并且本披露在这个方面不受限制。参见例如，rosenberg,s.等人,adoptive cell transfer:a clinical path to effective cancer immunotherapy.[过继性细胞转移：有效的癌症免疫疗法的临床途径]nat rev cancer.[自然癌症综述]2008年4月；8(4):299
‑
308和sadelain,m.等人,current opinion in immunology[免疫学新见],卷21(2),215
‑
223(2009)；还参见kalos,m.等人,sci transl med[科学转化医学]2011；3:95ra73；和grupp sa等人,n engl j med[新英格兰医学杂志]2013；368:1509
‑
1518。应当理解，本领域已知的任何合适car t细胞均可以用于如本文所述的方法和疗法中。本文所使用的合适car t细胞和疗法的非限制性实例包括例如在美国专利公开号2017/0209492和2019/091308，以
及在美国专利号8,911,993；8,975,071；9,328,156；9,987,308和10,253,086中描述的那些。
[0075]
在一个或多个实施例中，car t细胞包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域。在又一些其他实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：cd19、cd20、cd22、和ror1以及前述各项的组合。在又一些其他实施例中，car t细胞是包含与cd19结合的抗原结合结构域的cd19靶向t细胞。参见例如，turtle,c.j.等人,clinical pharmacology&therapeutics[临床药理学与治疗学],2016年5月12日(在线)。除前述段落所提供的示例性出版物外，另外的说明性cd19 car t细胞，例如所定义的cd4+:cd8+组合物的cd19 car t细胞描述于，例如turtle,c.j.,j.clin invest.[临床研究杂志]2016；126(6):2133
‑
2138中。适合用于本文所描述的方法和疗法中的其他car t细胞包括，例如cd19定向的替沙仑赛(tisagenlecleucel)和cd19定向的阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)二者均被美国fda批准用于治疗b细胞恶性肿瘤。在又一些其他实施例中，car t细胞表达受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)，其是一种肿瘤相关分子，在例如流行性b
‑
淋巴样癌和上皮癌以及在非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌的亚群中表达，但不在正常b细胞中表达。可用于本文所描述的方法和疗法中的ror1特异性car t细胞描述于，例如hudecek,m.,clinical cancer research[临床癌症研究],2013年6月,19(12),3153
‑
3164；hudecek,m.等人,blood[血液]2010,116:4532
‑
4541；和sprecht,j.m.等人,cancer research[癌症研究],78(增刊13):ct131,2018年7月中。在一些实施例中，细胞构建体靶向ror1的胞外结构域的ig/fz部分，并且含有4
‑
1bb/cd3ζ胞内信号传导结构域。在一些实施例中，ror1 car t的制造过程使用了自体外周血淋巴细胞(分离成cd4和cd8亚群)，将这些自体外周血淋巴细胞与抗cd3/抗cd28珠粒和il
‑
2独立培养，然后用编码ror1 car的慢病毒载体转导。在又一些其他实施例中，car t细胞产物被配制为比率为1:1的cd4
+
和cd8
+ car t细胞。
[0076]
car t细胞疗法通常包括施用car t细胞以治疗患有癌症(特别是其肿瘤细胞表达受试者肿瘤抗原的癌症)的患者。在一些实施例中，car t细胞是通过如本文所述或本领域已知的方法制备的。例如在分离后，将宿主t细胞转导(以表达靶肿瘤相关的抗原识别结构域)、扩增、并且重输注至受试者体内。在输注之前，还可以进行患者预调节，例如，使用淋巴细胞耗减性非清髓性化疗(nmc)来遏制内源性调节性t细胞并为输注的car t细胞提供优化的环境；可替代地，可以使用环磷酰胺或任何其他合适的调节剂。这种预调节可用于消除或基本上减少treg(调节性t细胞)和淋巴细胞的数量，这些细胞与转移细胞竞争稳态细胞因子。宿主细胞可以从多种来源(例如淋巴结，如腹股沟、肠系膜、浅表远端附件等；骨髓；脾；或外周血)以及肿瘤(例如肿瘤浸润性淋巴细胞)分离。这些细胞可以是同种异体的，或者优选是自体的。为了进行离体刺激，无菌地取出宿主细胞，并将其悬浮在本领域已知的任何合适的培养基中。转导后，使用多种方案中的任一种(特别是使用抗cd3、b7、抗cd28等的组合)刺激并扩增这些细胞。用于离体扩增宿主t细胞的合适方案描述于“focus on adoptive t cell transfer trials in melanoma[关注黑素瘤过继性t细胞转移试验]”,clinical and developmental immunology[临床和发育免疫学],卷2010,文章id 260267中。
[0077]
例如，car t细胞的过继性细胞转移可通过以下步骤进行：(i)从哺乳动物受试者
如人获得自体淋巴细胞，(ii)对自体淋巴细胞进行基因工程改造以表达靶肿瘤相关的抗原(taa)识别结构域或结合结构域，(iii)培养经基因工程改造的淋巴细胞以产生扩增的car t细胞，以及(iv)向受试者(即患者)施用扩增的car t细胞。自体过继性细胞疗法还可以通过以下步骤进行：(i)对自体淋巴细胞进行基因工程改造以表达taa结合结构域；(ii)培养经基因工程改造的淋巴细胞以产生扩增的car t细胞；(iii)向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗减性化疗(nmc)；以及(iv)施用nmc后，施用扩增的car t细胞。自体细胞可以来源于血液，或使用自体抗原呈递细胞和来源于肿瘤的肽进行克隆。
[0078]
car t细胞可以通过如本文所述或本领域已知的任何方法制备。用于生产car和/或car t细胞的方法描述于本文，并且还描述于美国专利号6,319,494；6,410,319；7,446,179；7,446,191；7,514,537；7,741,465；和9,987,308中；描述于美国公开的申请号2016/0185861、2017/0137783和2019/0091308中，以及pct公开的申请号wo 2010/065818、wo 2010/025177、和wo 2007/059298中，将其方法通过引用并入本文。berger c.等人,j.clinical investigation,[临床研究杂志]118:1 294
‑
308(2008)和wang等人(molecular therapy
‑
oncolytics[分子疗法
‑
溶瘤细胞药物](2016)3,16015)(将其通过引用特此并入)描述了用于产生car t细胞的其他方法。
[0079]
car t细胞能够基于car的结合特异性重定向抗原识别。car可以提供对任何taa的靶向，使得当car t细胞在肿瘤细胞表面与其同源抗原结合时，影响肿瘤细胞从而减少、减弱或消除患者的肿瘤负荷。可以使用如本文所述或本领域已知的任何方法对t细胞进行工程改造以表达一个或多个嵌合抗原受体(car)。在一个实施例中，通过用编码car构建体的表达载体转染t细胞来对分离的t细胞进行基因工程改造以表达car构建体。用于转导表达所选car构建体的t细胞群体的方法是本领域已知的，并且描述于sambrook等人,“molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册]”,第4版,cold spring harbor laboratory press[冷泉港实验室出版社](2012)，将其通过引用并入本文。
[0080]
通常，car包括结合肿瘤细胞上的taa的细胞外识别或结合区/结构域或外结构域(例如，抗体的单链片段可变区(scfv))、跨膜结构域、以及任选的可为t细胞活化提供信号以攻击肿瘤细胞的细胞内结构域。
[0081]
通常，如本文所述的car针对在癌症或肿瘤细胞的细胞表面上表达的分子(例如，蛋白质)。本领域已知多种taa，其非限制性实例包括磷蛋白、跨膜蛋白、糖蛋白、糖脂和生长因子。用于确定给定化合物是否适合用于用作针对如本文所述的任一抗原或靶标的car识别区的测定可以由本领域普通技术人员通过常规实验确定。如本文所述或本领域已知的任何car均可用于如本文所使用的方法和细胞和过继性细胞免疫疗法组合物中。示例性car包括描述于美国专利号7,446,190；7,741,465；9,499,629；9,987,308；和10,253,086中的那些。
[0082]
在一些实施例中，car识别结构域靶向在b细胞的细胞表面上表达的抗原。在一些实施例中，car包括抗cd19识别或结合结构域。说明性cd19
‑
car构建体包括以下各项：(i)cd19定向的嵌合抗原受体(ctl019)慢病毒载体(衍生出car抗原识别部分的scfv：fmc63；共刺激结构域：4
‑
1bb)，maude,sl.等人n engl j med[新英格兰医学期刊]2014；371(16):1507
‑
1517)；(ii)cd19定向的嵌合抗原受体(其中并入抗cd
‑
19单一可变片段加tcrζ和cd28
信号传导结构域)，γ
‑
逆转录病毒载体(衍生出car抗原识别部分的scfv：fmc63；共刺激结构域：cd28)，lee,dw.等人,lancet[柳叶刀]2015；385(9967)517
‑
528；基于鼠类步骤细胞病毒的剪接
‑
gag载体；(iii)如kochenderfer jn等人,j immunother[免疫疗法杂志]2009；32(7)689
‑
702中所述的编码抗cd19 car的msgv
‑
fmc63
‑
28z；(iv)cd
‑
19特异性cd28/cd3ζ双信号传导car，19
‑
28z(除park,jh等人,blood[血液],2016年6月30日,127(26),第3312
‑
3320页,表1中所描述的那些外，还描述于brentjens,rj.等人,sci trans med[科学转化医学],2013年3月20日:5(177):177中)。
[0083]
人cd19抗原是属于免疫球蛋白超家族的95kda的糖蛋白。将cd19用作正常和赘生性b细胞以及滤泡树突细胞的生物标志物。cd19从前b细胞发育的早期阶段通过末端分化表达，从而调节b淋巴细胞的发育和功能。cd19的表达在大多数b细胞肿瘤(包括b细胞淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤)中高度保守。cd19也可以在大多数类型的白血病中表达，包括b细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)。大多数b细胞恶性肿瘤(淋巴瘤和白血病)以正常至较高水平表达cd19。在一些实施例中，car包括抗cd19结合部分。在又其他实施例中，长效il
‑
15受体激动剂和cd19定向的car t细胞的组合用于治疗b细胞恶性肿瘤，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)。在一些优选实施例中，cd19car t细胞疗法包含cd
‑
19定向的基因修饰的自体t细胞。
[0084]
对cd19 car t细胞疗法的应答持久性的阻碍已经被鉴定为来自肿瘤细胞表面的靶抗原cd19的下调(shah等人,frontiers in oncology[肿瘤学前沿](2019)第9卷,文章146)。在一些实施例中，car t细胞疗法是多靶点car t细胞疗法，包括靶向cd19和一个或多个另外的taa。在一些实施例中，car t细胞疗法包含表达cd19识别或结合结构域以及一个或多个另外的taa的细胞群体的至少一部分。在一些实施例中，car t细胞疗法包括靶向选自cd20、cd22、cd38、cd123、cd70、或cd30的taa。在一些实施例中，car t细胞疗法包含两个或更多个细胞群体，其中每个群体表达不同的car。细胞群体可以作为混合物施用或依序共同施用。优选地，多靶点car t细胞疗法包括施用抗cd19 car t细胞和指向一个或多个另外的taa(选自cd20、cd22、cd38、cd123、cd70、或cd30)的car t细胞。在一些其他实施例中，car t细胞疗法包括靶向taa，该taa为ror1。
[0085]
在一些实施例中，car包括一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域。示例性共刺激结构域包括但不限于cd28、cd123、或具有cd3ζ的4
‑
1bb。
[0086]
可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来完成淋巴细胞(如t细胞)的扩增。例如，可以在饲养淋巴细胞和白介素
‑
2(il
‑
2)、il
‑
7、il
‑
15、il
‑
21或其组合存在下，使用非特异性t细胞受体刺激扩增t细胞。非特异性t细胞受体刺激可以包括例如刺激量的小鼠单克隆抗cd3抗体(可从例如华盛顿州西雅图ls生物公司(ls bio)获得)。可替代地，可以通过在t细胞生长因子如白介素
‑
2或白介素
‑
15(优选白介素
‑
2)存在下，用一种或多种抗原(包括其抗原部分，如表位)体外刺激外周血单核细胞(pbmc)来快速扩增t细胞，这些抗原可任选地由载体表达，如人白细胞抗原a2(hla
‑
a2)结合肽。体外诱导的t细胞通过用脉冲到表达hla
‑
a2的抗原呈递细胞上的一种或多种相同的癌症抗原再刺激来快速扩增。可替代地，可以用经照射的自体淋巴细胞或用经照射的hla
‑
a2+同种异体淋巴细胞和白介素
‑
2再刺激t细胞。
[0087]
扩增的t细胞的特异性肿瘤反应性可以通过本领域已知的任何方法测试，例如，通过在与肿瘤细胞共培养后测量细胞因子释放(例如，干扰素
‑
γ)。例如，过继性细胞转移可以包括在细胞快速扩增之前针对cd8+ t细胞富集培养的t细胞。在含有白介素
‑
2的培养基中培养t细胞后，t细胞中cd4+细胞耗减并且cd8+细胞富集，使用例如cd8微珠分离。在一些实施例中，将促进自体t细胞的生长和活化的t细胞生长因子与自体t细胞同时或在自体t细胞之后向受试者施用。t细胞生长因子可以是促进自体t细胞生长和活化的任何合适生长因子。合适的t细胞生长因子的实例包括白介素(il)
‑
2、il
‑
7、il
‑
15、il
‑
12和il
‑
21，这些t细胞生长因子可以单独使用或以各种组合使用，如il
‑
2和il
‑
7，il
‑
2和il
‑
15，il
‑
7和il
‑
15，il
‑
2、il
‑
7和il
‑
15，il
‑
12和il
‑
7，il
‑
12和il
‑
15，或il
‑
12和il2。
[0088]
通过荧光活化细胞分选分析和体外识别hla
‑
a2
+ 526黑素瘤系而不是hla
‑
a2
‑
888黑素瘤系，在未转导(untd)和转导(td)的细胞中比较嵌合抗原受体在car t细胞中的表达(rosenberg,s.等人,nat rev.cancer[自然癌症综述],2008年4月；84(4):299
‑
308)。也可以使用通用型t细胞，如由qasim,w.等人,sci.transl.med.[科学转化医学]9,eaaj2013(2017)所述。例如，可以使用talen介导的细胞工程改造与慢病毒转导的组合产生通用car19 t细胞，并用于过继性细胞疗法。通过非人白细胞抗原匹配的供体细胞的慢病毒转导和同时转录活化因子样效应核酸酶(talen)介导的t细胞受体α链和cd52基因座的基因编辑产生细胞。
[0089]
施用car t细胞前，可以用化疗(例如，如例如美国专利号9,855,298中所述的环磷酰胺和氟达拉滨)对患者进行预调节以促进该疗法的功效。不受理论的限制，用化疗进行预调节可以通过消耗正常淋巴细胞为car t细胞的增殖创造空间，可以消除细胞因子的下沉以增加促进car t细胞增殖的稳态细胞因子的可用性，和/或可以减少免疫抑制性细胞(如调节性t细胞(treg)和骨髓源性抑制细胞)的数量(nair等人)。应当理解，本领域已知的任何合适化疗方法均可使用。
[0090]
然后通过输注(例如静脉内或动脉内输注)或其他合适的递送形式向宿主施用扩增的细胞，该施用典型地持续约30分钟至约60分钟，但可能使用更短或更长的持续时间。其他施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。在合适的培养基中提供扩增的细胞，该培养基可任选地包括多种药学上可接受的添加剂、粘合剂、填充剂、载体、防腐剂、稳定剂，乳化剂、缓冲剂等中的任一种。稀释剂和赋形剂包括水、盐水和葡萄糖。代表性培养基包括但不限于，例如复方电解质注射液，1型，usp，标称ph范围为约5.5至8.0；含有人血清或胎牛血清的组织培养基；或无异种和无血清的培养基，例如像prime
‑
xv t cell expansion xsfm(欧文科技公司(irvine scientific))。可商购培养基包括，例如rpmi 1640(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、aim v细胞培养基(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和x
‑
vivo 15(隆萨公司(lonza)，巴塞尔，瑞士)。il
‑
15受体激动剂
[0091]
在一个或多个实施例中，本文所描述的方法包括施用长效il
‑
15受体激动剂。只要在施用于受试者之后化合物展现出体内il
‑
15激动性，并且其持续时间量比在施用相同的呈未修饰形式的白介素
‑
15受体激动剂部分的情况下的持续时间更长，则该激动剂就视为根据本披露的长效il
‑
15受体激动剂。可以使用常规方法，诸如涉及放射性标记化合物、将该化合物施用于体内、并测定其清除率的那些方法，可用于评估化合物是否为长效il
‑
15受
体激动剂(即，具有的清除率是否长于在相同体内系统中施用的未修饰的il
‑
15的清除率)。例如，il
‑
15受体激动剂的长效性质可以使用流式细胞术来测定以测量在向小鼠施用激动剂之后的不同时间点的淋巴细胞中的stat5磷酸化。作为参考，如本文所述在il
‑
15的情况下信号丢失约24小时，但是持续时间段大于长效il
‑
15激动剂的时间段。
[0092]
长效il
‑
15受体激动剂可以呈药学上可接受的盐形式，并且提及长效il
‑
15受体激动剂旨在涵盖其药学上可接受的盐。典型地，此类盐通过与药学上可接受的酸或酸等效物反应而形成。术语“药学上可接受的盐”在此方面通常将是指相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过将如本文所述的长效白介素
‑
15受体激动剂与适合的有机酸或无机酸分别反应并分离因此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、草酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐、和月桂基磺酸盐等。(参见，例如berge等人(1977)“pharmaceutical salts[药用盐]”,j.pharmsci.[药物科学杂志]66:1
‑
19)。因此，如所描述的盐可以衍生自无机酸，这些无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；或由有机酸制备，这些有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2
‑
乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、衣康酸等。
[0093]
以下结构涵盖示例性长效il
‑
15受体激动剂：其中il
‑
15为白介素
‑
15部分，(n)为从约150至约3,000的整数并且～nh～表示所述il
‑
15部分的氨基基团。以上il
‑
15受体激动剂在本文称为单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(即，mpba
‑
il15)。实例1中提供了单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的说明性制备。
[0094]
在一个或多个与具有式(i)的长效il
‑
15受体激动剂相关的实施例中，(n)在约795至约1068的范围内。在一些另外的实施例中，(n)为从约840至约1023的整数。在一个或多个特定实施例中，(n)的值平均为约907或约909，这使得聚乙二醇链的平均分子量为约40,000道尔顿。
[0095]
典型地将单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)制备为主要是单聚乙二醇化的il
‑
15(即，含有共价附接至il
‑
15的氨基基团(即il
‑
15的赖氨酸或n
‑
末端α胺处)的单甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺部分)的分布，其具有少量的二聚乙二醇化和更高聚乙二醇化的il
‑
15种类。单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的另外的特征描述于，例如国际专利公开号wo 2018/213341中。
[0096]
mpba
‑
il15的说明性组合物主要包含单聚乙二醇化的种类，其具有少于约10摩尔％的peg二聚体(即，具有2个附接至il
‑
15的甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺部分)，并且包含甚至更低量的更高聚乙二醇化的种类(即，具有3个或更多个附接至il
‑
15的甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺部分)。单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的组合物将通常具有至少约80摩尔％的单聚乙
二醇化的il
‑
15种类(基于组合物中的所有白介素
‑
15种类，包括未经修饰的il
‑
15(如果存在)和其他含有il
‑
15的种类，例如二聚乙二醇化的il
‑
15和更高聚乙二醇化的il
‑
15)。mpba
‑
il15的组合物可以优选地具有至少约90摩尔％的单聚乙二醇化的il
‑
15种类，其具有少于约10摩尔％的其他含有il
‑
15的种类。在一些实施例中，mpba
‑
il15组合物包含少于约5摩尔％的peg二聚体(二聚乙二醇化的il
‑
15，其具有2个共价附接至il
‑
15的甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺部分)，和少于约5摩尔％的所有其他更高聚乙二醇化的种类。在一个或多个实施例中，mpba
‑
il15组合物包含至少约85mol％、90mol％、95mol％、98mol％或99mol％的具有式(i)的单聚乙二醇化的种类。
[0097]
例如，在一些优选实施例中，长效il
‑
15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约20摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效il
‑
15受体激动剂(该组合物中含il
‑
15的分子)：其中所有实施例中的n的值如前所述，或包含在共同考虑时不超过约15摩尔百分比(mol％)的根据式(ii)的长效il
‑
15受体激动剂(该组合物中含有il
‑
15的分子)，或含有在共同考虑时不超过约10摩尔％的根据式(ii)的长效il
‑
15受体激动剂(该组合物中含有il
‑
15的分子)。
[0098]
在一些实施例中，mpba
‑
il15组合物包含从约0.1
‑
15、0.1
‑
10、0.1
‑
5、0.1
‑
1、1
‑
20、1
‑
15、1
‑
10、1
‑
5、5
‑
20、5
‑
15、5
‑
10、10
‑
20、10
‑
15、或从约15
‑
20mol％的具有式(ii)的化合物。
[0099]
在一些另外的实施例中，长效il
‑
15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约1
‑
5mol％的游离il
‑
15蛋白质(该组合物中含il
‑
15的分子)。
[0100]
关于以上所述的式，“n”对应于(och2ch2)单体亚单元的平均数。可以例如使用适当活化的mpeg
‑
丁酸酯试剂(其具有从约6600道尔顿至约132,000道尔顿的平均分子量)制备mpba
‑
il15。例如，可以使用适当活化的mpeg
‑
丁酸酯试剂(其具有的平均分子量选自：例如10kd、15kd、20kd、25kd、30kd、45kd、50kd或60kd)制备mpba
‑
il15。经活化的聚合物试剂在与il
‑
15的氨基基团(例如，赖氨酸或n末端)反应时有效形成il
‑
15部分与一个或多个聚乙二醇部分之间的稳定的酰胺键联。
[0101]
在一个或多个实施例中，n是具有对应于具有选自下组的重均分子量的聚乙二醇部分的值的整数，该组由以下组成：约10,000道尔顿(其中n是约227)、或约15,000道尔顿(其中n是约340)、或约20,000道尔顿(其中n是约454)、或约25,000道尔顿(其中n是约568)、或约30,000道尔顿(其中n是约681)、或约40,000道尔顿(其中n是约909)、或约50,000道尔顿(其中n是约1136)或甚至约60,000道尔顿(其中n是约1364)。
[0102]
用以制备mpba
‑
il15的说明性peg试剂将典型地具有约小于约1.1(例如为约1.05)的多分散性值。因此，在peg试剂(如mpeg
‑
琥珀酰亚胺基丁酸酯)具有约40,000道尔顿的标称平均重量的情况下，peg试剂(和所得的il
‑
15缀合物)将具有从约35千道尔顿至约47千道
尔顿，或从约37千道尔顿至约45千道尔顿的分子量范围(41kd
±
4kda)内的共价附接的peg部分。在一些优选实施例中，mpeg丁酸活化酯试剂具有约40千道尔顿的标称平均分子量，即n平均为约907
‑
909。
[0103]
当考虑il
‑
15部分时，术语“il
‑
15部分”是指缀合之前的il
‑
15部分以及缀合之后的il
‑
15部分。然而，应了解的是，当原始il
‑
15部分附接至聚乙二醇部分时，由于存在与一种或多种聚合物的键联(如在mpba
‑
il15的制备期间形成酰胺键联的情况下)相关的一个或多个共价键而使il
‑
15部分轻微改变。
[0104]
il
‑
15部分可以源自非重组方法和重组方法，并且在此方面本披露不受限制。另外，il
‑
15部分可以源自人类来源、动物来源(包括昆虫)、真菌来源(包括酵母)、以及植物来源。
[0105]
il
‑
15部分可以根据例如grabstein等人描述的程序获得(grabstein等人(1994)science[科学]264:965
‑
968)。il
‑
15部分还可以使用重组方法，例如像英姆纳克斯公司(immunex corporation)的欧洲专利号0 772 624 b2中所述的那些重组方法制备。可替代地，il
‑
15部分可以商购自例如金斯瑞美国有限公司(genscript usa inc.)(新泽西州皮斯卡特维(piscataway nj))和派普泰克公司(peprotech)(新泽西州洛基山(rockyhill,nj))。
[0106]
更特别地，il
‑
15部分可以在细菌(例如大肠杆菌，参见例如，fischer等人(1995)biotechnol.appl.biotechnol.[生物技术与应用生物化学]21(3):295
‑
311)、哺乳动物(参见例如，kronman等人(1992)gene[基因]121:295
‑
304)、酵母(例如，毕赤酵母(pichia pastoris)，参见例如，morel等人(1997)biochem.j.[生物化学杂志]328(1):121
‑
129)、以及植物(参见例如，mor等人(2001)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]75(3):259
‑
266)表达系统中表达。表达可以经由外源性表达(当宿主细胞天然地包含所希望的遗传编码时)或经由内源性表达来进行。
[0107]
制备和/或纯化il
‑
15部分的其他方法描述于pct申请号pct/us 2018/032817中。
[0108]
根据用于表达具有il
‑
15活性的蛋白质的系统，il
‑
15部分可以是非糖基化或糖基化的并且任一种都可以使用。也就是说，il
‑
15部分可以是非糖基化的或il
‑
15部分可以是糖基化的。在一个或多个实施例中，il
‑
15部分是非糖基化的。
[0109]
可以有利地修饰il
‑
15部分以包含和/或取代一个或多个氨基酸残基，例如像赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以便使聚合物与氨基酸侧链内部的原子容易连接。il
‑
15部分的取代实例描述于美国专利号6,177,079中。另外，可以修饰il
‑
15部分以包含非天然存在的氨基酸残基。用于添加氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的技术是为本领域普通技术人员众所周知的。
[0110]
在本文中、在文献中、和在例如美国专利申请公开号us 2006/0104945，pettit等人(1997)j.biol.chem.[生物化学杂志]272(4):2312
‑
2318，wong等人(2013)oncoimmunology[肿瘤免疫学]2(11),e26442:1
‑
3，和pct公开的申请号wo 2018/213341中描述了示例性il
‑
15部分。优选的il
‑
15部分包括具有以下氨基酸序列的那些il
‑
15部分，该氨基酸序列包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:1到3，以及基本上与其同源的序列。优选的il
‑
15部分具有与seq id no:1对应的氨基酸序列。在一些实施例中，il
‑
15部分是与seq id no:1
‑
3中的任一种具有至少约85％或至少约90％同一性的功能同源物。在一
些实施例中，il
‑
15部分是与seq id no:1
‑
3中的任一种具有至少约95％、98％或99％同一性的功能同源物。
[0111]
在一些情况下，il
‑
15部分将处于“单体”形式，其中将相应肽的单一表达组织成离散单元中。在其他情况下，il
‑
15部分将处于“二聚体”形式(例如重组il
‑
15的二聚体)，其中蛋白质的两个单体形式彼此缔合。
[0112]
另外，il
‑
15的前体形式可以用作il
‑
15部分。il
‑
15的一种示例性前体形式具有序列seq id no:3。
[0113]
前述序列中任一项的截短形式、杂交变体、以及肽模拟物也可以充当il
‑
15部分。前述序列中任一项的维持至少一些程度的il
‑
15活性的生物活性片段、缺失变体、取代变体或添加变体也可以充当il
‑
15部分。
[0114]
对于任何给定的肽、蛋白质部分或缀合物，有可能确定该肽、蛋白质部分或缀合物是否具有一定程度的il
‑
15活性。本领域中描述了用于确定体外il
‑
15活性的不同方法。示例性方法是基于pstat测定。简言之，如果将il
‑
15依赖性ctll
‑
2细胞暴露于具有il
‑
15活性的测试物品，可以定量地测量包括stat5在酪氨酸残基694(tyr694)处磷酸化的信号传导级联结果的开始。测定方案和试剂盒是已知的并且包括例如msd磷酸(tyr694)/总stata,b全细胞溶解产物试剂盒(马里兰州盖瑟斯堡的meso scal diagnostics公司(meso scal diagnostics,llc,gaithersburg,md))。例如，使用这种方法，展现出至少一个5分钟或10分钟不超过约300ng/ml(更优选不超过约150ng/ml)的pstat5 ec
50
值的所提出的il
‑
15部分典型地被认为是与本披露有关的“il
‑
15部分”。优选的是，然而，所使用的il
‑
15部分是更有效力的(例如，具有在至少5分钟或10分钟之一小于150ng/ml的pstat5 ec
50
值，诸如小于约1ng/ml、并且甚至更优选至少一个5分钟或10分钟小于0.5ng/ml)。
[0115]
本领域中已知的其他方法也可以用于评估il
‑
15功能，包括量电法、分光光度法、色谱法以及辐射测量方法。对于一种这样的另外类型的测定，参见例如，ring等人(2012)nat.immunol.[自然免疫学]13(12):1187
‑
1195。
[0116]
如先前所述，il
‑
15部分上的氨基基团提供了用于与mpeg
‑
琥珀酰亚胺基丁酸酯试剂反应的附接位点以提供由式(i)涵盖的il
‑
15受体激动剂。考虑到本文提供的示例性il
‑
15氨基酸序列，显然的是存在各自具有可用于缀合的ε
‑
氨基酸的七个赖氨酸残基。此外，甲硫氨酸的n
‑
末端胺也可以充当与peg部分的连接点。应当理解，聚乙二醇部分可以在赖氨酸或n
‑
末端胺位置中的任何一个或多个处附接。在一些实施例中，聚乙二醇部分连接位点位于lys
10
和lys
11
(使用如例如seq id no:2中所示的编号或使用seq id no:1的lys
11
和lys
12
)中的一个或多个处。在一些实施例中，聚乙二醇部分在n
‑
末端胺处附接。应当理解，赖氨酸位点中的任何一个都可以适合作为peg部分的连接位点(例如seq id no:1的lys
37
或lys
42
)。在一些实施例中，mpba
‑
il15包含位置异构体的混合物，其中聚乙二醇部分的共价附接主要位于n
‑
末端(也就是说，在位置异构体的集合中，与其他位置异构体相比时，具有在n
‑
末端附接的peg部分的异构体以最高量存在)。
[0117]
mpba
‑
il15是免疫治疗剂，其通过与所有il
‑
15受体亚单元(il
‑
15α、β和γ亚单元)结合提供了持续的il
‑
15生物活性，而无需每日给药。更特别地，mpba
‑
il15与il
‑
15受体α和白介素
‑
2(il
‑
2)/il
‑
15βγ亚单元结合，并且维持il
‑
15生物学的全谱(包括对nk细胞和cd8+记忆t细胞的药效动力学(pd)作用)，同时聚乙二醇部分增加了分子的流体力学体积，相对
于未修饰的rhil
‑
15这有助于延长有效半衰期。
[0118]
在啮齿动物和非人类灵长类动物的临床前研究中，已经显示mpba
‑
il15在与car t细胞疗法组合时具有被诸位发明人认为是特别有利的特征。例如，已经显示mpba
‑
il
‑
15会(i)刺激和扩增nk细胞增殖；(ii)支持cd8 t细胞存活和记忆形成而基本上没有诱导抑制性调节性t细胞；(iii)增强长期免疫记忆的形成；以及另外地，保留与il
‑
r结合的受体，但是其亲和力比未修饰的il
‑
15要小。
[0119]
还适合用于本文所提供的方法的另外的il
‑
15受体激动剂包括例如以下分子，如n
‑
803(原名alt
‑
803，其为突变型il
‑
15/il
‑
15rα融合蛋白，参见例如han,k.等人,cytokine[细胞因子],2011；56(3):804
‑
810；zhu,x.等人,j immunol.[免疫学杂志]2009；183(6):3598
‑
3607，和xu,w.等人,cancer res.[癌症研究]2013；73(10):3075
‑
3086)、niz985(异源二聚体il
‑
15，其为il
‑
15/可溶性il
‑
15rα二聚体，参见例如，aacr；cancer res[癌症研究]2019；79(增刊13))、am0015(聚乙二醇修饰的il
‑
15，参见例如，wo 2017/112528)、和oxs
‑
3550(单链三特异性scfv重组融合蛋白缀合物，其由抗cd16和抗cd33抗体的重链和轻链的可变区以及修饰形式的il
‑
15组成，cas注册号2094086
‑
30
‑
1，uni：e5ge91q5fx)。方法
[0120]
基于长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il15)的至少一个或多个特征，在一方面，本文提供了在施用mpba
‑
il15前有效诱导癌症患者的免疫应答的方法，即通过施用包含自体或同种异体的(优选自体)抗肿瘤t细胞的过继性细胞免疫疗法组合物(该抗肿瘤细胞已经过基因转化以表达靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体(例如，如前所述的并且具有抗肿瘤活性的cd19 car t细胞))，同时/随后施用长效il
‑
15受体激动剂(即mpba
‑
il15)，从而实现增强的治疗效果。在优选实施例中，t细胞免疫疗法包含cd19定向的基因修饰的自体t细胞。说明性过继性细胞免疫疗法组合物包含经修饰以表达嵌合抗原受体的肿瘤反应性t细胞，该嵌合抗原受体包含指向与癌症相关的抗原(例如，cd19)的抗体的细胞外可变结构域、铰链结构域和跨膜结构域、以及t细胞或其他受体的细胞内信号传导结构域(如共刺激结构域)。例如，肿瘤反应性t细胞可用指向cd19分子的源自单链抗体的嵌合抗原受体进行修饰。在一些实施例中，细胞组合物包含car修饰的细胞毒性肿瘤细胞(例如，cd19 car修饰的cd8+ t淋巴细胞)，并且此外可以包含其他类型的t淋巴细胞(例如，辅助性t淋巴细胞)，例如，cd4+或已经过基因修饰以具有指向癌症相关抗原(例如，cd19)的嵌合抗原受体的其他t细胞；并且本披露就此而言不受限制(即，不被限制于含有car t细胞(例如，cd19定向的car t细胞)的过继性细胞免疫疗法组合物的特定组成)。前述部分中描述了适合用于本文所提供的方法的代表性car t细胞组合物。
[0121]
在一些实施例中，过继性细胞免疫疗法组合物中所包含的细胞是通过以下步骤来配制的：首先从其培养基中将其收获，之后在适合以治疗有效量进行施用的培养基和容器系统中将这些细胞清洗并且浓缩。合适的浸液培养基可以是任何等渗培养基配制品，例如像生理盐水、rpmi 1640(赛默飞世尔公司(thermofisher))、aim v serum free medium(赛默飞世尔公司)、和x
‑
vivo
tm
培养基(龙沙沃克斯维尔公司(lonza walkersville))、5％右旋糖水溶液、或林格氏乳酸(ringer’s lactate)等。
[0122]
含有car t细胞(例如，cd19 car t细胞)的过继性细胞免疫疗法组合物典型地以治疗有效量(即以能有效赋予受试者免疫性的量)施用。免疫性意指与淋巴细胞应答所指向
的肿瘤或癌症相关的一个或多个身体症状的减轻。过继性细胞免疫疗法组合物典型地通过输注施用，每次输注包含从至少两个细胞/kg至至少106至10
10
个细胞/kg，优选地在至少107至约109个细胞/kg的范围内，或优选地在至少106至约108个细胞/kg的范围内。在一些特定但非限制性实施例中，每次输注包含至少约0.2x106个细胞/kg至约6.0x108个细胞/kg、至少约2.0x106个细胞/kg至约2.0x108个细胞/kg、至少约0.2x106个细胞/kg至约5.0x106个细胞/kg、至少约0.1x108个细胞/kg至约2.5x108个细胞/kg、或至少约0.6x108个细胞/kg至约6.0x108个细胞/kg。细胞可通过单次输注或通过多次输注施用。在一些特定实施例中，细胞作为单剂量输注施用。由于不同个体的应答是不同的，所以输注细胞的数量以及输注的次数和施用多次输注经历的时间范围可由医疗保健专业人员如通过常规检查确定。在一些实施例中，施用t细胞免疫疗法之前是施用淋巴细胞耗减性化疗方案，例如像施用环磷酰胺(典型地经静脉内)和氟达拉滨(典型地静脉内)。
[0123]
根据本文所述的方法，长效il
‑
15受体激动剂以能有效增强car t细胞免疫疗法的结果的量施用。为了确认，关于长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il15)，活化的量和程度可以广泛变化，并且当与施用过继性细胞免疫疗法组合物结合时仍然有效。也就是说，在足够延长的时间段内仅表现出最小il
‑
15受体激动剂活性的一定量的mpba
‑
il15仍然可以是长效il
‑
15受体激动剂，只要与car t细胞疗法组合施用时，本文描述的方法能够产生临床上有意义的应答。在一些情况下，由于(例如)协同相互作用和协同应答，当伴有car t细胞疗法(例如，cd19 car t细胞疗法)时可能仅需要最小il
‑
15受体激动剂活性，并且应当理解所施用的长效il
‑
15受体激动剂和car t细胞数量中任一种或两种的治疗量可能比单独施用时任一组分的治疗有效量要低。
[0124]
如本文所述，本披露的一个方面提供了一种方法，该方法可用于(尤其)治疗患有对用过继性细胞免疫疗法组合物和长效il
‑
15受体激动剂中任一种或两种的治疗有应答的病症(如癌症)的患者。例如，患者可以对单独以及组合的单个药剂有应答，但是对组合的应答更强。作为进一步举例，患者可能对单个免疫治疗剂中的一种无应答，但是对组合有应答。作为仍然进一步举例，患者可能对单独的单个药剂中的任一种无应答，但是对组合有应答。
[0125]
长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il15)可以通过本领域已知的任何合适的方式施用。在一些实施例中，长效il
‑
15受体激动剂通过肠胃外施用。如本文所使用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、瘤内、淋巴管内、腹膜内、心脏内、鞘内和肌肉内注射，以及通过输注。
[0126]
mpba
‑
il15可以与一个或多个合适赋形剂或稀释剂组合以形成适合用于施用或其他用途的组合物。长效il
‑
15受体激动剂可以包含于单剂量组合物中，任选地伴随一种或多种药学上可接受的赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂包括例如在handbook of pharmaceutical excipients[药物赋形剂手册],第7版,rowe,r.c.编辑,pharmaceutical press[医药出版社],2012中描述的那些。一种这样的示例性配制品包含溶液中的mpga
‑
il15，该溶液包含磷酸盐缓冲剂和海藻糖，ph 6.8。例如，示例性配制品包含配制于溶液中的mpba
‑
il15，该溶液包含磷酸钾缓冲剂、海藻糖、和聚山梨醇酯20，ph约为6。
[0127]
适合用于肠胃外施用的配制品类型包括注射即用型溶液、在使用之前与溶剂组合的干散剂、注射即用型混悬剂、在使用之前与媒介物组合的干燥不溶性组合物以及在施用
之前稀释的乳剂和液体浓缩剂等。在一些特定实施例中，长效il
‑
15受体激动剂提供在适合于静脉内施用的配制品中，并且以静脉内方式施用。在一些其他实施例中，长效il
‑
15受体激动剂提供在适合于皮下施用的配制品中，并且以皮下方式施用。在一些另外的实施例中，长效il
‑
15受体激动剂通过瘤内施用。还涵盖其他施用方式，如经肺、经鼻、经颊、经直肠、舌下和经皮施用。
[0128]
通常，长效il
‑
15受体激动剂的治疗有效量将在从约5mcg(μg)至约10mg的范围内，基于所施用的蛋白质剂量(il
‑
15当量)。可以定期施用给定剂量直到例如临床医生确定实现了适当的终点(例如，治愈、消退、部分消退等)。
[0129]
在一些实施例中，长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il15)的治疗有效剂量的范围为从约0.10
‑
70mcg/kg(微克/千克，μg/kg il
‑
15当量)。在其他实施例中，治疗有效剂量的范围为每天从约0.10mcg/kg至约50mcg/kg、或从约0.30至约45mcg/kg、或从约0.25mcg/kg至约0.1mg/kg、从约0.01mg/kg至约0.1mg/kg或每天约0.03mg/kg至约0.1mg/kg。在其他实施例中，治疗有效剂量的范围为从约1
‑
10mcg/kg、从约0.03mg/kg至约0.1mg/kg。在一些特定但非限制性实施例中，治疗有效剂量是约0.25mcg/kg、0.3mcg/kg、0.5mcg/kg、1mcg/kg、2mcg/kg、3mcg/kg、5mcg/kg、6mcg/kg、7mcg/kg、10mcg/kg、15mcg/kg、20mcg/kg、25mcg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、或0.1mg/kg。
[0130]
在又一些其他实施例中，长效il
‑
15r激动剂的治疗有效剂量的范围为约0.25
‑
25μg/kg。在其他实施例中，治疗有效剂量(例如每天)的范围为每天约0.25μg/kg至约0.1mg/kg、约1.0μg/kg至约20μg/kg、约1.0μg/kg至约15μg/kg、约1.0μg/kg至约10μg/kg、约1.0μg/kg至约5.0μg/kg、约1μg/kg至约1.5μg/kg、约1.5μg/kg至约20μg/kg、约1.5μg/kg至约15μg/kg、约1.5μg/kg至约10μg/kg、约1.5μg/kg至约5.0μg/kg、约5.0μg/kg至约20μg/kg、约5.0μg/kg至约15μg/kg、约5.0μg/kg至约10μg/kg、约10约1.5μg/kg至约20μg/kg、约10μg/kg至约20μg/kg、约10μg/kg至约15μg/kg、约15μg/kg至约20μg/kg、约0.01mg/kg至约0.1mg/kg或每天约0.03mg/kg至约0.1mg/kg。在其他实施例中，治疗有效剂量的范围为约1
‑
10μcg/kg、约0.03mg/kg至约0.1mg/kg。在一些特定但非限制性实施例中，治疗有效剂量是每天约0.25μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、或0.1mg/kg。
[0131]
如在施用过继性细胞免疫疗法组合物的情况下，长效il
‑
15受体激动剂的剂量将例如根据受试者的年龄、体重和一般状况以及所治疗的病症的严重程度、特定的过继性细胞免疫疗法组合物、以及医疗保健专业人员的判断而变化。
[0132]
在一个或多个实施例中，在施用长效il
‑
15受体激动剂之前进行过继性细胞转移。例如，基于过继性细胞转移的car t细胞的细胞输注可以在施用mpba
‑
il15之前瞬间、最多1小时、最多2小时、最多3小时、最多4小时、最多5小时、最多6小时、最多7小时、最多到8小时、最多9小时、最多10小时、最多11小时、最多12小时、最多1天、最多2天、最多3天、最多4天、最多5天、最多6天、最多7天、最多8天、最多9天、最多10天、最多11天、最多12天、最多13天、最多14天、最多15天、最多16天、最多17天、最多18天、最多19天、最多20天、最多21天、最多22天、最多23天、最多24天、最多25天、最多26天、最多27天、最多28天、最多29天、最多1个月、最多3个月、最多6个月或其任何组合施用。
[0133]
可替代地，在一些实施例中，在施用长效il
‑
15受体激动剂之后进行过继性细胞转
移。例如，基于过继性细胞转移的car t细胞的细胞输注可以在施用mpba
‑
il15之后瞬间、最多1小时、最多2小时、最多3小时、最多4小时、最多5小时、最多6小时、最多7小时、最多到8小时、最多9小时、最多10小时、最多11小时、最多12小时、最多1天、最多2天、最多3天、最多4天、最多5天、最多6天、最多7天、最多8天、最多9天、最多10天、最多11天、最多12天、最多13天、最多14天、最多15天、最多16天、最多17天、最多18天、最多19天、最多20天、最多21天、最多22天、最多23天、最多24天、最多25天、最多26天、最多27天、最多28天、最多29天、最多1个月、最多3个月、最多6个月或其任何组合施用。
[0134]
如本文关于治疗患有癌症的受试者所使用的，术语“治疗(treatment/treat/treating)”意指包括对受试者所罹患癌症的全谱干预，诸如施用组合以缓解、减缓、终止、或逆转癌症的一个或多个症状或即使未实际上消除也延迟癌症的进展。治疗可以包括例如减小症状的严重程度、症状的数目、或复发的频率，例如，抑制肿瘤生长、遏制肿瘤生长、或使已经存在的肿瘤消退。
[0135]
例如，癌症或癌症相关疾病的改善可表征为完全或部分应答。“完全应答”是指不存在临床上可检测到的疾病，其中任何先前异常的x射线照像研究、骨髓、和脑脊液(csf)或异常的单克隆蛋白测量都正常化。“部分应答”是指在不存在新的病灶下，所有可测量的肿瘤负荷(即，受试者中存在的恶性肿瘤细胞的数目、或测量的肿瘤块的体积或异常单克隆蛋白的数量)减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。术语“治疗”涵盖完全应答和部分应答二者。
[0136]
关于输注过继性细胞免疫疗法组合物和施用长效il
‑
15受体激动剂的频率和时间表，本领域普通技术人员将能够确定适当的频率。例如，在一个治疗周期中，临床医生可以进行car t细胞的过继性细胞转移与施用长效il
‑
15受体激动剂的组合，施用长效il
‑
15受体激动剂是与过继性细胞转移同时进行，或优选地在过继性细胞转移后进行。例如，在一些治疗方式中，长效il
‑
15受体激动剂在car t细胞的过继性细胞转移的约7天内施用(例如，在第1、2、3、4、5、6或7天中的任一天)。在一些情况下，长效il
‑
15受体激动剂(即mpba
‑
il15)在过继性细胞转移的4天内施用，例如在第1、2、3或4天中的任一天。基于mpba
‑
il15的长效性质，il
‑
15受体激动剂通常相对不频繁地施用(例如，每三周一次、每两周一次、每8
‑
10天一次、每周一次等)。
[0137]
与治疗过程相关的示例性时间长度包括约一周；约两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年以及约五年。典型地，向患者提供单轮例如cd19 car t细胞的过继性细胞转移，随后提供一个或多个剂量的长效il
‑
15受体激动剂(mpba
‑
il15)，然而，在一些情况下，可以进行一个或多个额外周期的过继性细胞转移。
[0138]
本文描述的治疗方法典型地持续长达监督患者护理的临床医生认为该治疗方法有效(即该患者对治疗有应答)的时间。指示该治疗方法有效的非限制性参数可以包括以下中的一个或多个：肿瘤缩小(就重量和/或体积和/或视觉外观而言)；个体肿瘤集落的数量
减少；癌症细胞的数量减少；肿瘤消除；无进展存活；通过合适的肿瘤标志物(如果适用)的适当应答、nk(自然杀伤)细胞的数量增加、t细胞的数量增加、记忆t细胞的数量增加、中心记忆t细胞的数量增加、调节性t细胞(如cd4+ treg、cd25+ treg和foxp3+ treg)的数量减少等。
[0139]
如前所述，过继性细胞组合物(例如，包含car t细胞)和长效il
‑
15受体激动剂可以分开施用。可替代地，如果希望在初始给药时或在整个治疗过程中或在给药方案的各个阶段同时提供过继性细胞转移和施用长效il
‑
15受体激动剂，并且car t细胞和长效il
‑
15受体激动剂在一起和在给定配制品中是相容的，则可以通过输注单一剂型/配制品(例如，静脉内施用含有两种免疫组分的静脉内配制品)来达到同时施用。
[0140]
本文描述的方法和组合物可以用于治疗患有可以通过本文提供的方法治疗或预防的任何病症(如癌症)的患者。例如，这些方法可用于治疗，例如实体瘤、血液系统恶性肿瘤(液体瘤)、或黑色素瘤等病症。示例性病症是癌症，例如像黑素瘤、肾癌、非小细胞肺癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、膀胱癌、头颈癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、脑癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、以及白血病。
[0141]
在一些特定实施例中，癌症是实体癌。
[0142]
在又一些其他实施例中，癌症选自例如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、子宫颈癌、上颌窦癌、膀胱癌、食管癌和肾上腺皮质癌。
[0143]
在又一个或多个其他实施例中，该癌症选自黑素瘤、肾癌、非小细胞肺癌、乳癌、膀胱癌、头颈癌和结肠癌。
[0144]
在一个或多个特定实施例中，该乳腺癌是三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌是高度侵袭性的肿瘤，这些肿瘤缺乏雌激素受体、孕酮受体和erbb2(her2)基因扩增。
[0145]
在一些其他实施例中，癌症是淋巴瘤或白血病。
[0146]
在一些其他实施例中，癌症是选自但不局限于非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)的b细胞恶性肿瘤，其中患者群体涵盖小儿和成人患者。
[0147]
本发明的方法可用于提高car t细胞(例如cd19 car t细胞)的过继性细胞转移的治疗效果，例如，通过施用长效il
‑
15受体激动剂mpba
‑
il15来改善受试者的应答。可以在治疗期间、单轮治疗之后、2
‑
3个治疗周期之后等的任何合适的时间点并且通过多种合适方法中的任一种来评估增强的应答，包括例如肿瘤的缩小(部分应答)(即肿瘤大小或体积的评估)、肿瘤的消失、癌症细胞数量的减少、疾病进展的减少(癌症未进展)以及在适当时一种或多种肿瘤测试标志物的分析。该比较可以在人患者中进行，或在合适的动物模型如合适的鼠癌症模型中进行。
[0148]
在又一些其他实施例中，本文提供的方法、试剂盒、组合物和组合可有效刺激受试者的t细胞和/或nk细胞活性和/或增殖。在一些实施例中，例如，当在相应癌症的小鼠模型中评价时，该方法可有效增加受试者的cd8+ t细胞的数量。在又一些其他实施例中，例如，当在相应癌症的癌症小鼠模型中评价时，该方法有效增加了受试者的nk细胞的数量。
[0149]
治疗前和治疗期间均可从受试者收集血液样品以表征和监测car
‑
t细胞并且评估疗法对于免疫细胞群体(包括但不限于nk细胞、cd8+t细胞、和cd8+记忆细胞)的数量和活化的作用。在治疗前和治疗期间，可通过定量聚合酶链式反应(qpcr)在外周血中进行对基因修饰的cd19定向的car
‑
t细胞的表征和持久性的监测，并且car
‑
t细胞表型还可通过流式细胞术评估。还可在治疗前和治疗期间收集血液样品以确定细胞因子水平的变化并且分析应答于疗法的基因表达的变化。此外，可以收集全血样品或pbmc，并且将其用于评估其他免疫功能。
[0150]
在可行的情况下，可在治疗前、治疗期间和治疗后收集新鲜肿瘤骨髓活检用于表征肿瘤细胞和免疫系统的活化。评价可能包括对肿瘤微环境中的肿瘤特异性蛋白标志物和免疫细胞群体的变化的评估。在施用长效il
‑
15受体激动剂(例如，mpba
‑
il15)治疗前或治疗后，可通过定量聚合酶链式反应(qpcr)来进行对骨髓中基因修饰的cd19 car
‑
t细胞的表征和监测。
[0151]
还可进行肿瘤活检收集。活检应优选在还未暴露于既往辐射的病灶处进行。活检可获取自非靶标病灶，除非已经没有其他适合用于活检的病灶。如果可行的话，治疗前和治疗后的肿瘤组织活检应优选取自同一病灶。此外，活检可以取自远端的非注射病变处以作为对照活检。可以使用一组标志物(包括但不限于cd3、cd4、cd8、和cd56)通过免疫组织化学(ihc)和/或流式细胞术将肿瘤组织活检用于表征浸润性免疫细胞群体。
[0152]
在一些实施例中，与许多基于act的疗法相比，本文描述的组合免疫疗法可有效增加外源递送的car t细胞在肿瘤位点或血液中的程度和持久性(即保留性)，从而提供增加的抗肿瘤功效。
[0153]
本文引用的所有文章、书籍、专利、专利公开和其他的出版物均通过引用以其全文并入。倘若本说明书的传授内容和通过引用并入的本领域之间不一致，则以本说明书中的传授内容和定义的含义为准(特别是关于在本文所附的权利要求中使用的术语)。例如，如果本技术和通过引用并入的出版物以不同方式定义了同一术语，则将该术语的定义保留在该定义所处文件的传授内容内。实例
[0154]
应理解，前述描述以及随后的实例旨在说明而不是限制本披露的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对本披露所属领域的技术人员而言将是显而易见的。材料与方法
[0155]
car t细胞：如前所述，表达cd19/4
‑
1bb/cd3ζcar的人cd19 car t细胞产生自健康供体。参见例如，turtle,c.j.等人j.clin invest.[临床研究杂志]2016；126(6):2123
‑
2138和美国专利号9,987,308。简言之，将cd4和cd8 t细胞分离并且用cd19 car慢病毒载体(图2)分别转导，分选出转导细胞，然后用lcl(类淋巴母细胞b细胞系)细胞进行扩增，持续14
‑
16天；在第15天对细胞进行测定。
[0156]
在以下实例中使用利用常规技术制备的重组il
‑
15(“ril
‑
15”)seq id no:1(如图
1中所提供)，但可以类似地采用任何适合的il
‑
15部分。seq id no:1(其为表达并且纯化自大肠杆菌内含体的非糖基化重组人il
‑
15)含有115个氨基酸并且具有两个二硫桥，分子量为约12.9kda。ril
‑
15序列包括添加的不存在于天然分泌的人il
‑
15上的n
‑
末端甲硫氨酸。
[0157]
反应性线性聚合物试剂(mpeg
‑
琥珀酰亚胺基丁酸酯(40kda)(“mpeg
‑
sba”)，cas号187848
‑
51
‑
7)具有以下结构，其中n对应于提供标称平均分子量为约40千道尔顿的聚合物的单体亚单元的平均数目，即，其中n平均为约907
‑
909。peg试剂具有小于约1.1(例如为约1.05)的多分散性值，使得其标称平均分子量的范围为从约37千道尔顿至约45千道尔顿(41kd
±
4kda)。mpegsba典型地呈白色到灰白色粉末的形式。适合使用的另外的mpeg
‑
琥珀酰亚胺基丁酸酯试剂包括重均分子量为例如约10kd、15kd、20kd、25kd、30kd、45kd、50kd或60kd的那些。此经活化的聚合物试剂在与il
‑
15的氨基基团(例如，赖氨酸或n末端)反应时有效形成il
‑
15部分与聚乙二醇部分之间的稳定的酰胺键联。
[0158]
单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15可以例如如以下实例1中所述制备。单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(其在本文可以称作mpba
‑
il15)主要是单聚乙二醇化il
‑
15的分布，具有共价附接至il
‑
15的赖氨酸或n
‑
末端α胺的单一mpeg
‑
n
‑
丁酰胺部分，具有少量的二聚乙二醇化和更高聚乙二醇化的il
‑
15种类(cas注册号2361317
‑
09
‑
9)。单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的另外的特征描述于，例如国际专利公开号wo 2018/213341(将其内容通过引用并入本文)中。
[0159]
效力生物测定：使用pstat5/总stat5多重测定法(meso scale discovery公司，马里兰州)通过ctll
‑
2细胞(其为表达il
‑
15α亚单元的鼠t淋巴细胞系)中stat5的磷酸化来确定mpba
‑
il15的效力。在受体结合至ctll
‑
2细胞之后，下游细胞信号传导通过磷酸化将stat5活化以促进基因表达从而诱导细胞增殖。对于效力测定，对配体结合后受体下游stat5信号传导分子的磷酸化进行评估以测量短时间段内的生物应答。
[0160]
使用测定培养基将参考材料、测定对照、和测试样品连续稀释至10倍最终浓度，然后应用于固定数量的细胞，在37℃/5％co2下孵育10分钟。使用磷酸
‑
stat5/总stat5多重测定法(meso scale discovery公司，马里兰州)测量磷酸
‑
stat5和总stat5。使用4参数模型通过非线性回归分析生成剂量依赖性％磷蛋白应答曲线。使用平行线分析(pla)软件以评估回归的平行性和显著性，并且以计算样品相比于同一板中的参考材料的相对效力。
[0161]
通过反相hplc使用halo蛋白c4分析(柱温为25℃，流速为1.0ml/min，并且线性梯度为水/乙腈/三氟乙酸(tfa))，并且在214nm处使用紫外线(uv)检测，使用反相hplc以评估mpba
‑
il15的纯度。
[0162]
使用shodex protein kw
‑
803柱(在25℃下以流速为0.5ml/min运行)，使用尺寸排阻hplc以评估mpba
‑
il15的相对纯度。使用15mm磷酸钠(ph 7.2)在乙腈中进行色谱洗脱，其中在214nm处进行uv检测。
[0163]
通过分离酸性和碱性的电荷变体，使用agilent pl
‑
sax柱(在40℃下以流速为
1.0ml/分钟运行)，还使用了离子交换hplc以评估mpba
‑
il15的相对纯度。使用线性梯度的bistris丙烷(ph6.8):异丙醇和bistris丙烷(ph 6.8，含有nacl溶液):异丙醇进行洗脱，并且在214nm处进行uv检测。实例1制备长效il
‑
15受体激动剂，单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)
40kd
白介素
‑
15
[0164]
制备1：将2.7ml ril
‑
15溶液(1.23mg/ml，在pbs缓冲液中，ph 7.4)转移到小反应瓶中。添加300μl 0.6m硼酸盐缓冲液(ph 8)以调节ph至ph 8。将在
‑
20℃在氮气下储存的40kda(标称平均分子量)的mpeg
‑
sba升温至环境温度。将十倍过量(相对于il
‑
15的摩尔量)的mpeg
‑
sba
‑
40k溶解在2mm hcl中以形成10％peg试剂溶液。将10％peg试剂溶液迅速添加到il
‑
15溶液中并充分混合。在添加mpeg
‑
sba
‑
40k后，使用常规技术测定反应混合物的ph并调节至ph 8。为了使将mpeg
‑
sba
‑
40k偶联到il
‑
15上(即，经由形成稳定的酰胺键联)，将反应溶液在室温下放置在慢速实验室旋转器上持续1.5小时以促进缀合。通过添加甘氨酸溶液迅速淬灭反应。
[0165]
该反应产生40％的单缀合物(即，具有单个附接至il
‑
15的peg部分)、24％的二缀合物(具有两个附接至il
‑
15的peg)和6％的三缀合物(具有三个附接至il
‑
15的peg)种类。反应混合物中保留大约30％未反应的il
‑
15，但没有优化反应条件。
[0166]
通过阴离子交换色谱法、使用q sepharose高效柱并使用磷酸钠缓冲液作为洗脱相来分离单缀合物。将经纯化的单mpeg
‑
sba40k
‑
il
‑
15缀合物(在本文中也称为单mpeg
‑
丁酰胺
‑
40k
‑
il
‑
15或单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)
40kd
白介素
‑
15、或单mpeg
40k
‑
c4
‑
酰胺
‑
il
‑
15)通过hplc和sds
‑
page来表征。对于剩余实例，经纯化的单mpeg
‑
sba40k
‑
il
‑
15称为缀合物1。
[0167]
如sds凝胶所指示，确定了纯化的缀合物具有高水平纯度并且不存在可检测出的量的未反应il
‑
15。基于hplc图，纯化的单mpeg
‑
sba
‑
40k
‑
il
‑
15组合物包含少于约10％(摩尔量)的二或更高级的缀合物。
[0168]
使用此合成方法，缀合物(如单mpeg
‑
sba
‑
10k
‑
il
‑
15、单mpeg
‑
sba
‑
15k
‑
il
‑
15、单mpeg
‑
sba
‑
20k
‑
il
‑
15、单mpeg
‑
sba
‑
25k
‑
il
‑
15、单mpeg
‑
sba
‑
30k
‑
il
‑
15；单mpeg
‑
sba
‑
45k
‑
il
‑
15；单mpeg
‑
sba
‑
50k
‑
il
‑
15；和mpeg
‑
sba
‑
60k
‑
il
‑
15)是使用具有不同标称平均分子量(例如，分别具有约10千道尔顿、15千道尔顿、20千道尔顿、25千道尔顿、30千道尔顿、45千道尔顿、50千道尔顿、60千道尔顿等标称平均分子量)的mpeg
‑
sba制备的。
[0169]
制备2：将大约2mg/ml ril
‑
15于缓冲液(50mm磷酸钠、100mm氯化钠、10％蔗糖，ph 7.4)中的溶液转移到两个不同反应容器中的每一个中(在本文中称为组合物1和组合物2)。为将ph调节至8.0，添加在ph 8下的硼酸盐缓冲液(0.4m或0.6m)。将十倍过量(相对于il
‑
15的摩尔量)的稀释于2mm hcl中的mpeg
‑
sba
‑
40k(mpeg
‑
sba，40kda)添加到每种il
‑
15溶液中并充分混合。在添加mpeg
‑
sba
‑
40k后，将反应混合物的ph确定为ph 8，或在必要时通过使用额外的硼酸盐缓冲液调节。反应中ril
‑
15的终浓度的目标为1g/l，在必要时使用额外的稀释剂(将含有50mm磷酸钠、100mm氯化钠、10％蔗糖，ph 7.4的缓冲液用于组合物1并且将水用于组合物2)。为了使mpeg
‑
sba
‑
40k与il
‑
15偶联(即，经由形成显著稳定的酰胺键联)，对
于组合物1或组合物2分别将反应溶液在室温下混合45或60分钟以促进缀合。通过添加71倍过量的甘氨酸(相对于最初在ph 8.0下添加至反应物中持续30分钟的peg的摩尔量将反应淬灭。对于组合物1，通过使用0.2m磷酸滴定至ph 7.0来调节ph。
[0170]
将所得组合物通过反相hplc(rp
‑
hplc)、sds
‑
page、和离子交换hplc(iex
‑
hplc)来表征。rp
‑
hplc分析的结果提供于下表1a中。表1a.rrt是相对保留时间。sec
‑
hplc分析的结果提供于下表1b中。表1b.hmw＝具有3个或更多个共价附接至白介素
‑
15的peg的高分子量mpeg
‑
il
‑
15缀合物。iex
‑
hplc分析的结果提供于下表1b中。表1c.
[0171]
所制备的组合物主要包含mpeg
‑
sba
‑
40k单聚乙二醇化的种类，并具有少于约10摩尔％的peg二聚体(即，具有2个附接至il
‑
15的peg部分)以及甚至更低量的高级peg种类(即，具有3个或更多个附接至il
‑
15的peg部分)。另外指示，单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的组合物通常将具有至少约80摩尔％的单聚乙二醇化的il
‑
15种类(基于所得组合物中所有白介素
‑
15种类，包括未修饰的il
‑
15和其他含有il
‑
15的种类，例如二聚乙二醇化或更高聚乙二醇化的il
‑
15)，并且可以优选地具有至少约90摩尔％的单聚乙二醇化的il
‑
15种类，其中少于约10摩尔％的其他含有il
‑
15的种类。在一些实施例中，单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15组合物包含少于约5摩尔％的peg二聚体(二聚乙二醇化的il
‑
15，其具有2个共价附接至il
‑
15的甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺部分)，和少于约5摩尔％的所有其他更高聚乙二醇化的种类。
[0172]
制备并且分析了两个另外的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的合成。以下表1d中提供了分析结果的总结。
[0173]
mpba
‑
il15可以被配制用于进一步用作在10mm磷酸钾、260mm海藻糖和0.02w/v％聚山梨醇酯20中含有浓度为1mg/ml(以蛋白质计)的mpba
‑
il15的溶液(ph 6.8)。表1d.
缩写：nt＝未测试；di
‑
peg＝二聚乙二醇化种类；hmw＝更高分子量；nd＝未检测出；loq＝定量限；ntu＝比浊法浊度单位实例2单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15对于car t细胞的磷酸化和增殖的体外研究
[0174]
如下所述探索了单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15对于人cd19 car t细胞的体外作用。
[0175]
对于体外研究，用具有和不具有cd19抗原的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(0
‑
100ng/ml)孵育car t细胞。通过流式细胞术评估stat5磷酸化和cfse稀释。
[0176]
通过流式细胞术测量cd8 car t细胞的il15rα表达(如图3a(cd8，绿色实线，最右边)中所示)以及cd4 car t细胞的il15rα表达(如图3b(cd4，蓝色实线，最右边)中所示)。每张图中还示出了fmo对照(灰色填充区)和同型对照(虚线)。cd8和cd4 car t细胞表达il
‑
15rα。
[0177]
对于cd8 car t细胞和cd4 car t细胞，应答于单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的stat5的剂量依赖性磷酸化分别示出于图3c和3d中。用各个浓度的mpba
‑
il15或il
‑
15刺激car t细胞，持续20分钟。在stat
‑
5磷酸化测定中，cd8和cd4 car t细胞应答于il
‑
15或单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的ec
50
值(ng/ml)总结如下：表2.
[0178]
还通过流式细胞术评估了用cfse标记并且与各个浓度的mpba
‑
il15或il
‑
15一起孵育4天的car t细胞的增殖。结果示出于图3e(cd8 car t细胞)和图3f(cd4 car t细胞)中。ec50值总结如下。表3.
[0179]
对于图3c、图3d、图3e、和图3f，正方形对应于il
‑
15，圆形对应于mpba
‑
il15。
[0180]
如上所述，单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15在体外诱导stat5磷酸化并且以剂量依赖性方式诱导cd8和cd4 cd 19 car t细胞的抗原依赖性增殖。实例3单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15对cd19 car t细胞免疫疗法在临床前鼠淋巴瘤模型中的功效的研究
[0181]
单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(例如，以上实例1中所述)保留了对il
‑
15rα的结合亲和力，并且展示出降低的清除率，这提供了持续的药效动力学应答。如下所述在实验中探索了单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15对体内异种b细胞淋巴瘤模型中的人cd19 car t细胞的作用。
[0182]
一般方法：对于体内研究，nsg小鼠在第
‑
7天(d
‑
7)静脉内接受了5x105个经稳定转导以表达荧火虫荧光素酶的raji淋巴瘤细胞，之后在d0单独输注亚治疗剂量(0.8x106)的car t细胞(1:1cd4:cd8)，或从d
‑
1、d7、或d14开始每周施用该亚治疗剂量的car t细胞与单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的组合(0.03、0.10或0.30mg/kg静脉内输注)。在d38用raji细胞对无肿瘤小鼠进行再激发。每周通过小鼠生物发光成像对肿瘤进行评估。结果示于图10中。
[0183]
如图4a(各个治疗组的平均肿瘤辐射相对于car t细胞施用后天数)中所示，用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(以0.10mg/kg和0.30mg/kg)与car t细胞的组合的治疗相比于仅用car t细胞疗法治疗时导致了nsg小鼠中肿瘤负荷的降低和raji淋巴瘤的根除。在此研究(研究a)中，携带raji的nsg小鼠在d0接受了亚治疗剂量的car t细胞，之后从d6开始并且在其后每周(d13、d20、d27、d33等)接受0.030、0.10或0.30mg/kg的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15。图4b中展示了治疗方案。
[0184]
在进一步研究(研究b)中，携带raji的nsg小鼠在d0接受了car t细胞输注；在d
‑
1、d7、或d14并且在其后每周施用0.30mg/kg的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(5只小鼠/组)。参见图7b。每周给小鼠放血，并且通过流式细胞术鉴定cd8和cd4 car t细胞(分别参见
图5a和图5b)。通过每周的生物发光成像(如图6中所示：平均肿瘤辐射相对于car t细胞施用后天数)和存活率(图7a)对肿瘤负荷进行评估。
[0185]
此临床前研究的结果进一步指示单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15与car t细胞的组合导致了携带raji淋巴瘤的nsg小鼠的血液中car t细胞的增加、肿瘤负荷的降低、和存活的增加。
[0186]
对于研究a中0.30mg/kg单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15剂量组中的小鼠，在car t细胞输注后d8、d11、d14、d21和d28对小鼠进行安乐死。从骨髓和car t细胞制备单细胞悬浮液；通过流式细胞术分别对cd8 car t细胞和cd4 car t细胞悬浮液的总细胞数(图8a和图9a)、ki67表达水平(图8b和图9b)、pd1和tim3表达(图8c和图9c)进行评估。这些图示出了平均值
±
sem。
[0187]
如图8a和图9a中所示，用示例性组合免疫疗法治疗的小鼠骨髓中的car t细胞的绝对数量增加。car t细胞疗法与mpba
‑
il
‑
15的组合导致了携带raji的小鼠骨髓中的car t细胞的累积和增殖增加、并且pd1和tim3的延长双重表达降低(图8c和图9c)。
[0188]
在体内，从d
‑
1、d7或d14开始输注单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15增加了血液中峰值car t细胞的数量。对于在d7接受car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的小鼠，raji细胞在d14从骨髓中消除(参见特别是0.30mg/kg剂量组)，但是未从仅接受car t细胞的小鼠的骨髓中消除。与仅接受car t细胞或仅接受单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的小鼠相比，在接受car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的小鼠中观察到优异的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15剂量依赖性肿瘤控制和存活。虽然决不是限制性的，但基于这组实验，在这个临床前模型中联合治疗的益处似乎在大约d7开始施用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15时更大。用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15治疗过的小鼠中的残余car t细胞排斥了在car t细胞输注后超过5周时施用的raji肿瘤细胞的再激发。
[0189]
在此淋巴瘤模型中，发现单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的施用改善了所施用的cd19 car t细胞的抗肿瘤功效和动力学。更特别地，与仅施用car t细胞相比，car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的组合展示出优异的功效，显著减少了肿瘤负荷并且发挥了持续的肿瘤控制，并且在一些情况下，根除了nsg小鼠中的raji淋巴瘤。与之相反，在car t细胞单一疗法组中观察到了肿瘤进展。参见图4a。
[0190]
更特别地，100％的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(0.03mg/kg)/car t细胞治疗的小鼠在肿瘤注射后存活了70天，然而与之相比，接受媒介物对照的小鼠均未存活至第14天，并且仅用car t细胞治疗的小鼠均未存活至第59天。图4a(生物发光成像结果)和图7a(存活率)中示出了用剂量为0.30mg/kg的mpba
‑
il15治疗的小鼠的结果。此外，先前用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15和car t细胞治疗的小鼠能够排斥raji肿瘤的再激发，这支持了car t细胞持久性和潜在地长期记忆car t的形成；这些惊人结果示出于图10中，并且说明了长效白介素
‑
15激动剂(如mpba
‑
il
‑
15)当与car
‑
t细胞疗法组合施用时不仅能显著降低肿瘤负荷并且还能根除raji淋巴瘤的能力。实例4单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15对ror1 car t细胞免疫疗法在临床前鼠ror1肺肿瘤模型中的功效的研究
[0191]
对一个组群的kras
lsl
‑
g12d/+
p53
f/f
小鼠(n＝5至6只/组)用3x104pfu的cre
‑
ffluc
‑
hror1慢病毒进行气管内感染以诱导ror1+肺肿瘤的发展。在感染后12周和15周，用100mg/kg环磷酰胺治疗小鼠用于淋巴细胞耗减，并且在静脉内过继性转移6x106个ror1 car t细胞或对照t细胞(cd8:cd4比率为1:1)。ror1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)在多种恶性肿瘤(包括非小细胞肺癌(nsclc)和三阴性乳腺癌(tnbc)的亚群)中表达。小鼠在8天内每隔一天经腹膜内接受5x104的iu il
‑
2以支持转移t细胞的移植。从t细胞转移那天开始，每7天用0.33mg/kg mpba
‑
il15静脉内治疗小鼠亚组。图11中示出了临床前治疗方案。
[0192]
通过获取跨越整个肺的连续1mm图像并将所有图像中的肿瘤面积相加以量化肿瘤体积，从而量化肿瘤负荷。在感染后17周，对所有小鼠进行安乐死，并且通过流式细胞术和免疫组织化学对全肺进行分析。为区分循环中肺肿瘤浸润的细胞和污染的细胞，在进行安乐死前5分钟对小鼠静脉内注射pe缀合的抗cd45抗体以标记循环中的所有免疫细胞，这允许将pe细胞定义为无血管肺实质细胞。通过ihc染色分析肺部的cd8a和cd8对肿瘤的浸润；使用halo软件对染色进行量化。
[0193]
结果示出于图12a(各个治疗组中小鼠肿瘤体积的变化％：对照t细胞(长方形)、对照t细胞和mpba
‑
il15(
▲
)、ror1 car t细胞(
▼
)、以及ror1 car t细胞和mpba
‑
il15(
◆
))；图12b(用ror1 car t细胞单一疗法(组消退率为18.5％)治疗的个体小鼠的肿瘤体积变化百分比相对于感染后周数)；图12c(用ror1 car t细胞和mpba
‑
il
‑
15双联组合疗法(组消退率为44.4％)治疗的个体小鼠的肿瘤体积变化百分比相对于感染后周数)；图13a(各个治疗组中的cd8 car t细胞频率，其表示为活细胞分别在脾脏和肿瘤中的百分比)；图13b(各个治疗组中的cd8细胞频率，其表示为活细胞分别在脾脏和肿瘤中的百分比)；和图14a、图14b、图14c、和图14d(ihc染色说明了mpba
‑
il
‑
15(一种说明性长效il
‑
15激动剂)增强了此临床前ror1肺癌模型中ror1 car t细胞在肺中的运输)。
[0194]
前述实例说明了施用mpba
‑
il15显著改善了cd19 car t细胞在治疗患有癌症的受试者中的抗肿瘤功效和动力学，并且增强了ror1 car t细胞在癌性肺组织中的运输和持久性；因此，本披露提供了用于治疗患有癌症的受试者的新的、独特的有利免疫治疗方法，该免疫治疗方法是通过施用car t细胞疗法和长效il
‑
15激动剂(如mpba
‑
il15)的组合。实例5用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15体外治疗的cd8 car t细胞中的car
‑
t细胞数量和细胞内蛋白质表达
[0195]
cd8 car t细胞生成自健康供体。在第15天，car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养。细胞要么未经处理，要么用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(浓度为1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml)处理。共同培养24小时后通过luminex对ifnγ和tnfα的产生进行评估。共同培养5天后确定car t细胞数量以及bcl
‑
2和活化的半胱天冬酶3的细胞内表达。通过流式细胞术确定bcl
‑
2和活化的半胱天冬酶3的表达。结果示出于图15a、图15b和图16a至图16c中。
[0196]
图15a提供了cd8 car t细胞中ifnγ的表达(以pg/ml计)，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0197]
图15b提供了cd8 car t细胞中tnfα的表达(以pg/ml计)，这些cd8 car t细胞与经
辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0198]
图16a展示了cd8 car t细胞的car t细胞扩增(呈倍数扩增)，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0199]
图16b和图16c分别提供了cd8 car t细胞中bcl
‑
2(以bcl
‑
2 mfi计)和活化的半胱天冬酶3(示作％半胱天冬酶3+)的表达，这些cd8 car t细胞与经辐射的k562
‑
cd19+或k562
‑
cd19
‑
细胞共同培养，并且未用mpba
‑
il15处理或用1ng/ml、10ng/ml、或30ng/ml浓度的mpba
‑
il15处理。
[0200]
从这些结果可以看出car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的体外治疗增加了抗原特异性cd8 car t细胞的产生和扩增，并且提高了存活率。实例6临床前鼠淋巴瘤模型中施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15的组合之后car t细胞中的蛋白质表达
[0201]
nsg小鼠在d
‑
7接受了raji淋巴瘤细胞，在d0接受了car
‑
t细胞，并且从d7开始每周接受单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(0.3mg/kg)注射，如在以上实例3中更加详细描述的。在car t细胞输注后d8、d11、d14、d21和d28对小鼠进行安乐死。从骨髓(每只小鼠2个股骨和2个胫骨)制备单细胞悬浮液。通过流式细胞术对蛋白质(bcl
‑
2、cd45ra和ccr7)表达进行评估。
[0202]
如在输注后d8所确定的，对于cd8 car t细胞(图17a)和cd4 car t细胞(图17b)，直方图中示出了bcl
‑
2在car t中的表达(灰色＝仅用car t细胞治疗的小鼠)，红色和蓝色＝施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠。
[0203]
如在输注后d8所确定的，对于cd8 car t细胞(图18a)和cd4 car t细胞(图18b)，条形图中还示出了bcl
‑
2在car t中的表达(黑色＝仅用car t细胞治疗的小鼠)，红色＝施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠。
[0204]
图19a至图19d中展示了car t细胞中记忆标志物cd45ra和ccr7的表达，其中图19a涉及仅施用car t细胞的小鼠的cd8 car t细胞中的蛋白质表达；图19b涉及施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠的cd8 car t细胞中的蛋白质表达；图19c涉及仅施用car t细胞的小鼠的cd4 car t细胞中的蛋白质表达；图19d涉及施用car t细胞和单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)的小鼠的cd4 car t细胞中的蛋白质表达，其中提供了cd5ra
‑
ccr7
‑
(橙色)、cd5ra+ccr7
‑
(绿色)、和cd5ra
‑
ccr7+(红色)的表达数据。这些图示出了平均值+sem。
[0205]
用单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)处理的car
‑
t细胞以及从用car
‑
t细胞疗法和mpba
‑
il15的组合处理的小鼠中回收的car
‑
t细胞在体外和体内均表现出了增加的增殖和存活，这可能部分是由于bcl
‑
2的表达增加。实例7临床研究在患有b细胞非霍奇金淋巴瘤的患者中进行的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15与cd19定向的car
‑
t疗法的组合的1b/2期、开放标签、多中心、剂量递增和剂量扩增研究
[0206]
这是一项在患有弥漫性淋巴细胞b细胞淋巴瘤(dlbcl)的患者中进行的单(甲氧基peg
‑
n
‑
丁酰胺)白介素
‑
15(mpba
‑
il15)与cd19+car
‑
t的组合的1b/2期、开放标签、多中心、剂量递增和剂量扩增研究。研究被分为筛查期、治疗期、治疗结束(eot)期、和长期随访期。
[0207]
剂量组1中mpba
‑
il
‑
15的起始剂量将是1.5μg/kg。患者将以21天为周期接受iv mpba
‑
il
‑
15，从第1周期第1天开始。
[0208]
mpba
‑
il
‑
15药物作为无菌、白色至灰白色冻干粉剂提供。mpba
‑
il
‑
15药品是用大约1.0mg/ml重组人il
‑
15(rhil
‑
15)在10mm磷酸钾、260mm海藻糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯20(ph 6.8)中配制的。每瓶mpba
‑
il
‑
15药品含有1.1mg rhil
‑
15当量。这包括0.1mg的过量填充，以确保在重构后标记一致撤回要求的1.0mg的量。治疗持续时间
[0209]
剂量递增(1b期)：接受2种可商购的cd19定向的嵌合抗原受体t细胞(cd19 car
‑
t，kymriah
tm
(替沙仑赛)或(阿基仑赛))疗法之一并且符合安全纳入标准的患者将接受静脉内(iv)mpba
‑
il
‑
15。在剂量递增期间，将在单剂量cd19 car
‑
t输注后大约14天或7天(取决于所分配的群组)向患者给予mpba
‑
il
‑
15。用mpba
‑
il
‑
15的治疗将最多8个周期(6个月)，每21天(即，每3周[q3w])一个周期；或直到有疾病进展证据、不可接受的毒性、患者退出、研究人员判定或主办方决定终止研究为止。根据研究人员的判断显示出临床获益的患者可以在获得医疗监督者许可后继续治疗。
[0210]
剂量扩增(2期)：在确定mpba
‑
il
‑
15与任一cd19 car
‑
t产品的推荐2期剂量(rp2d)后，将在2期期间在扩增群组中进一步研究rp2d剂量。用mpba
‑
il
‑
15的治疗将最多8个周期(6个月)，每21天(即，每3周)一个周期；或直到有疾病进展证据、不可接受的毒性、患者退出、研究人员判定或主办方决定终止研究为止。根据研究人员的判断显示出临床获益的患者可以在获得医疗监督者许可后继续治疗。主要目的：
[0211]
1b期：(i)评估cd19 car
‑
t疗法后mpba
‑
il
‑
15的安全性和耐受性(ii)限定cd19 car
‑
t施用后mpba
‑
il
‑
15的最大耐受剂量(mtd)或rp2d和最佳给药期
[0212]
2期：基于lugano分类通过评估6个月时的完全应答率(crr)来评估cd19 car
‑
t疗法后mpba
‑
il
‑
15的功效(cheson bd,fisher ri,barrington sf等人,recommendations for initial evaluation,staging,and response assessment of hodgkin and non
‑
hodgkin lymphoma:the lugano classification.[霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的初始评估、分期和反应评估的建议：lugano分类]j clin oncol.[临床肿瘤学杂志]2014；32(27):3059)。次要目的：
[0213]
1b期和2期：(i)评估mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t疗法的组合的总体应答率(orr)(ii)评估mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t疗法的组合的无进展存活(pfs)(iii)评估mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t疗法的组合的总体存活(os)(仅2期)
(iv)评估mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t疗法的组合的应答持续时间(dor)(v)表征nktr
‑
255与cd19 car
‑
t疗法的组合的药代动力学(pk)(vi)表征nktr 255与cd19 car
‑
t疗法的组合的药效动力学(pd)作用(vii)评估cd19 car
‑
t细胞的pd作用，包括过继性转移的t细胞的体内持久性的持续时间和持久t细胞的表型(viii)评估mpba
‑
il
‑
15的免疫原性
[0214]
探索目的：(i)评估mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t疗法的组合的无事件存活(efs)(ii)评估抗肿瘤活性与免疫细胞在肿瘤和血液中的关系(iii)评估过继性转移的t细胞至骨髓或其他肿瘤位点的运输，以及其体内功能(iv)表征细胞因子水平和免疫细胞群体相比基线的变化
[0215]
研究群体：18岁及以上的成年人，其接受cd19 car
‑
t细胞以在2个或更多个的全身疗法线后治疗复发性/难治性(r/r)b细胞非霍奇金淋巴瘤(b
‑
nhl)，包括弥散性淋巴细胞b细胞淋巴瘤(dlbcl)(未另说明)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbcl；仅yescarta)、高级别b细胞淋巴瘤、和源于滤泡性淋巴瘤的dlbcl。
[0216]
患者数量(计划)：1b期：将招募大约55名患者2期：将招募大约60名患者
[0217]
研究场所数量：1b期：大约5个北美场所2期：大约5个北美场所研究设计：
[0218]
此研究是一项1b/2期、开放标签、多中心研究，其由剂量递增(1b期)部分和剂量扩增(2期)部分组成。1b期(剂量递增)
[0219]
接受us fda批准的cd19 car
‑
t细胞(yescarta或kymriah)并且符合安全纳入标准的患者将从cd19 car
‑
t输注的单一治疗后大约14天或7天(取决于所分配的群组)开始接受iv mpba
‑
il
‑
15q3w。在剂量递增(1b期)期间，将在cd19 car
‑
t细胞输注后向最多5个群组(每组至少3名患者)给予递增剂量的mpba
‑
il
‑
15。下表中提供了mpba
‑
il
‑
15和cd19 car
‑
t的样品剂量递增方案。在向每个递增mpba
‑
il
‑
15剂量群组的首位患者(前哨患者)首次施用mpba
‑
il
‑
15后，将对其进行持续21天的安全性和耐受性的监测，之后才会向同一群组中另外的患者给药。表4.mpba
‑
il
‑
15的样品剂量水平(1b期)*
q3w：每3周*除了群组1剂量，随后群组的剂量水平可基于临床观察结果进行调节。剂量递增将不会超过mpba
‑
il
‑
15既往剂量的二倍。**如果在起始剂量就观察到剂量限制毒性，可对mpba
‑
il
‑
15进行递减，如剂量水平
‑
1所示。***在对安全性/pk数据进行审查并在主办方医疗监督者和主要研究者之间达成一致后，可以招募另外的一个或多个群组，或剂量水平。
[0220]
将以顺序组合对mpba
‑
il
‑
15进行测试，最初从yescarta疗法开始。研究将从mpba
‑
il
‑
15起始剂量1.5μg/kg iv开始，在yescarta输注后14天施用(群组a)。在yescarta后14天(
±
3天)施用3个剂量水平的mpba
‑
il
‑
15中建立安全性和耐受性之后，将以确认的安全剂量水平并行开始下一个群组(kymriah(car
‑
t输注后14天；群组b)和yescarta(car
‑
t输注后7天；群组c))。如果在起始剂量水平观察到7天方案具有安全性或耐受性问题，则可将测试剂量递减至之前刚刚测试过的剂量。7天方案将以14天方案中观察到的每种产品的安全性和耐受性为依据。在7天方案中，仅mpba
‑
il
‑
15的剂量递增将继续，直到建立mtd或rp2d。如果发现7天方案不被耐受，那么14日方案中的mpba
‑
il
‑
15剂量递增可能恢复。
[0221]
将在研究的递增期使用采用控制过量用药的剂量递增设计(ewoc)原则的2参数贝叶斯逻辑回归模型(blrm)(neuenschwander b,branson m,gsponer t.critical aspects of the bayesian approach to phase i cancer trials.[贝叶斯方法进行i期癌症试验的关键方面]stat med.[医学统计学]2008年6月15日；27(13):2420
‑
39)用于剂量水平选择和确定mtd。当对至少6名患者在某一剂量进行评估并且该剂量的靶向毒性的后验概率至少为70％时，将宣布mtd。将基于5.8节中总结的标准确定mtd。还可能开放另外的群组以进一步探索mtd。
[0222]
mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t的组合中的rp2d将在不超过剂量递增最终推荐的剂量下选择，并且将基于对mpba
‑
il
‑
15的安全性、pk、pd和最佳生物应答的所有可用数据的审查。可能会招募另外的患者来完善rp2d，并且需要至少6名以所选rp2d给药的患者(包括剂量递增的任何患者)来确定rp2d。
[0223]
关于1b期剂量递增的附加规则如下：
ο足够的肝功能，其定义如下：
‑
天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)≤3
×
uln
‑
胆红素≤2.0mg/dl，患有gilbert
‑
meulengracht综合征的患者除外；可以包括患有gilbert
‑
meulengracht综合征的患者，如果其总胆红素≤3.0x uln并且直接胆红素≤1.5
×
ulnο足够的骨髓储备(没有输血的情况下)，其定义如下：
‑
绝对嗜中性粒细胞计数(anc)>1000/mm3‑
绝对淋巴细胞计数(alc)≥300/mm3‑
血小板≥50,000/mm3血红蛋白>8.0g/dl初始和随后的mpba
‑
il
‑
15剂量前评估的安全合格性
[0227]
如果患者满足以下标准，则将有资格进行mpba
‑
il
‑
15输注：1.接受了cd19 car
‑
t输注2.mpba
‑
il
‑
15输注当天，无持续的≥1级的细胞因子释放综合征(crs)(温度≥38.0℃)3.mpba
‑
il
‑
15输注前96小时内无4级crs4.mpba
‑
il
‑
15输注当天，无持续的≥2级的神经毒性5.mpba
‑
il
‑
15输注前任何时间，无先前持续时间>48小时的≥3级的神经毒性6.mpba
‑
il
‑
15输注前48小时内，未用托珠单抗和/或地塞米松进行干预7.无活动性、严重和无法控制的一种或多种感染8.根据研究者的评估，无禁忌症9.mpba
‑
il
‑
15的所有剂量前，患者具有足够的器官功能：a)ast和alt水平≤3
×
uln；b)总胆红素水平≤3
×
ulnc)egfr>30ml/mind)dlco>40％e)lvef>45％测试产品、剂量和施用方式
[0228]
每21天(即，q3w)将iv施用重构的mpba
‑
il
‑
15。将用可商购的或0.9％的生理盐水溶液来进行进一步稀释重构的mpba
‑
il
‑
15用于注射。将在30
±
5分钟内输注最终稀释的溶液。
[0229]
mpba
‑
il
‑
15的起始剂量将为每21天1.5μg/kg。安全性
[0230]
安全性评估将通过对以下各项的持续审查来进行：
·
不良事件(ae)发生率，包括严重ae(sae)和免疫介导的ae(imae)
·
临床实验室测试(血液和尿液取样)
·
生命体征
·
心电图(ecg)
·
体格检查
·
伴随用药dlt
‑
仅1b期药代动力学
[0231]
将收集所有患者的血液样品用于mpba
‑
il
‑
15pk分析。将在mpba
‑
il
‑
15的每个周期后的多个预定采样时间收集连续pk样品。将使用一种或多种经验证的方法对每个pk样品的mpba
‑
il
‑
15的血浆浓度进行测量。在可能的情况下，将根据血浆浓度
‑
时间数据对药代动力学参数(如最大浓度(c
max
)、浓度
‑
时间曲线下面积(auc)、清除率(cl)、分布体积(vd)、和半衰期(t1/2))进行估计。生物标志物
[0232]
将检查mpba
‑
il
‑
15与cd19 car
‑
t的组合的全身性pd作用和基于肿瘤组织(血液和骨髓)的pd作用。
[0233]
在用nktr 255治疗前或治疗期间，将通过通过定量聚合酶链式反应(qpcr)和流式细胞术在外周血以及骨髓样品中进行基因修饰的cd19 car
‑
t细胞的表征以及监测。治疗前和治疗期间将从所有患者收集血液样品用于全身性pd分析以评估mpba
‑
il
‑
15对于免疫细胞群体(包括但不限于nk细胞、cd8+t细胞、和cd8+记忆细胞)的数量和活化的作用。还将在治疗前和治疗期间收集血液样品以确定细胞因子水平的变化并且分析应答于mpba
‑
il
‑
15的基因表达的变化。
[0234]
在可行的情况下，将在治疗前、治疗期间和治疗后(根据时间表)收集新鲜骨髓活检用于表征肿瘤细胞和免疫系统的活化。评价将包括对肿瘤微环境中的肿瘤特异性蛋白标志物和免疫细胞群体的变化的评估。将收集档案肿瘤组织样本(如果可获得)并能够以同样的方式进行分析。功效：
[0235]
将在筛查基线评估和确定可测量疾病(suv
max
)的合格性期间进行全身(从颅骨底部到大腿中部)的18f
‑
fdg
‑
正电子发射断层扫描(pet)/计算机断层扫描(ct)。用于根据lugano分类(cheson，2014，同上)进行功效评估的后续fdg
‑
pet/ct将在第4周、第3个月(紧接在第5周期之前)进行，然后每12周进行一次，直到受试者中止研究，以及在疾病进展时进行(如果可行的话)。如果可行的话，肿瘤活检将大约在基线、cd19 car
‑
t输注后的前4周、和第14周、和研究人员决定结束治疗(eot)时获得。统计方法：安全性：
[0236]
安全性评估将包括ae、临床实验室测试、生命体征、体格检查、和ecg(中心读数)。将评估每个剂量递增群组的dlt发生率。将分别按系统器官类别和优选术语对在1b期和2期研究中每个剂量群组的所有≥3级的治疗突发不良事件(teae)进行总结。将对teae按发生率、严重性、和与一种或多种研究药物的关系进行总结。将单独总结免疫介导的ae(imae)。
[0237]
将对在研究的1b期和2期中每个剂量群组的≥3级的临床实验室异常和生命体征异常进行描述性总结。功效：
[0238]
crr(6个月时)和orr的功效评估将基于精确方法与95％置信区间(ci)一起计算。kaplan
‑
meier方法将用于分析pfs、dor和os。基于独立审查委员会(irc)评估的6个月时的
crr将是主要功效终点并且将使用改良意向治疗群体对其进行总结。还将基于研究人员的评估对6个月时的crr进行评估。
[0239]
对所有功效终点的初步分析将基于来自本研究剂量扩增部分的患者以及来自本研究剂量递增部分的以rp2d进行治疗的患者。药代动力学和生物标志物：
[0240]
药代动力学参数将被制成表格，并用描述性统计进行总结。将在每个观察时间计算生物标志物的描述性总结。也将使用描述性总结对从给药前到每次观察时间的生物标志物变化进行评估。