碳环衍生物及其缀合衍生物以及其在疫苗中的用途的制作方法

1.本发明属于疫苗领域并且其涉及通过将多个碳环重复单元连接在一起而获得的具有选定聚合度的寡聚物及其缀合衍生物。本发明的寡聚物及其缀合衍生物还具有选定的乙酰化程度。本发明的衍生物可用于制备免疫原性组合物，例如，以疫苗形式。


背景技术：

2.脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)是全世界细菌性脑膜炎和败血症的主要原因，能够引起侵袭性疾病的爆发和流行。侵袭性脑膜炎球菌病在世界范围内发生。尽管世界不同地区的发病率有所不同，但婴儿、儿童和青少年最容易患上侵袭性疾病。这种疾病的症状进展迅速，且通常会导致毁灭性的结果。基于其荚膜多糖的抗原性差异，已鉴定出12种脑膜炎奈瑟氏菌(n.meningitidis)血清群。几乎所有与疾病相关的分离株都带荚膜，其中血清群a、b、c、w、x和y造成全世界90％以上的侵袭性脑膜炎球菌感染。这些血清群的分布在地域和时间上各不相同。
3.一般而言，脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖(cps)是非t细胞依赖性的抗原，这意味着其可以在没有t细胞参与的情况下产生免疫应答。这种应答缺乏t细胞依赖性免疫应答特有的几个重要特性，如免疫记忆、从igm到igg的类别转换以及亲和力成熟。然而，如果多糖部分与载体蛋白相连，其会触发产生记忆效应的细胞免疫应答，并且还为幼儿提供保护。这种与载体蛋白相连的多糖通常被称为糖缀合物，且作为疫苗特别有价值。在这方面，特别有效的疫苗(糖缀合物疫苗)可以通过将糖经由接头部分(或间隔基)连接到载体蛋白或者甚至通过糖与所选载体蛋白的直接偶联来制备。在任何情况下，糖缀合物可以诱导具有记忆的t细胞依赖性免疫应答且也在幼儿中有效，而非缀合的cps通常无法在成人中提供记忆效应或在婴儿中提供任何实质性的免疫原性效应。
4.在脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖中，已知脑膜炎奈瑟氏菌血清群a荚膜多糖(mena cps)在水中具有固有的化学不稳定性(参见例如，frasch等，adv.biotechnol.processes,1990,12,123-145)。mena cps由(1
→
6)-连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-吡喃甘露糖磷酸酯重复单元组成，并且mena多糖的水解不稳定性主要是由于环氧和n-乙酰胺促进的磷酸二酯键上的水解。事实上已经观察到环中的氧和n-乙酰基都使磷酸二酯糖苷键失稳定，且nhac的轴向位置也有助于这种机制，如下面报告的路线a所示(berti等，vaccine,2012,30,6409-6415)：
[0005][0006]
抗水解的mena多糖模拟物的可用性对于开发更稳定的缀合物疫苗非常有吸引力。cps的稳定化可以通过不同方式实现，现有技术中已经报道了环氧被亚甲基替代的mena cps类似物。特别是在这方面，当环中的氧被碳替代时，路线a中描述的去稳定化被阻止，如路线b中所提供的：
[0007][0008]
toma等，org.biomol.chem.,2009,7,3734-3740描述了单体o-(2-乙酰氨基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基)磷酸酯的制备，其中亚甲基替代了mena cps的重复单元的吡喃糖氧。该出版物仅涉及单体本身的化学合成制备。
[0009]
gao等(org.biomol.chem.2012,10(33),6673和acs chem.biol.2013,8(11),2561)和ramella d.等(eur j.org.chem,2014,5915-5924)描述了通过使用碳环糖稳定糖基1-o-磷酸酯，其中亚甲基替代吡喃糖氧原子。其还报道了合成的carba三聚体与蛋白载体的缀合，但没有进一步研究具有更高聚合度的carba类似物的性能。也没有提及具有特定乙酰化水平和/或特定乙酰化模式的carba类似物。更进一步，所考虑的三聚体在抑制抗mena cps抗体的结合方面表现出较差的潜力，表明所描述的衍生物是相对较差的合成抗原。
[0010]
因此，需要找到具有良好稳定性并且还表现出良好免疫原性特征的carba类似物多糖衍生物，其可通过可靠且方便的合成途径获得，并且适于制备针对脑膜炎的疫苗，优选以液体形式配制。


技术实现要素：

[0011]
在第一个方面中，本发明涉及一种式(ia)或(ib)的寡聚物：
[0012][0013]
其中
[0014]
n是≥6；
[0015]
r是h或-p(o)(or")2，其中r"是h或药学上可接受的磷酸根抗衡离子；
[0016]
r'是h或药学上可接受的磷酸根抗衡离子；
[0017]rx
是h或-c(o)ch3，并且在每个重复单元中可以相同或不同；
[0018]ry
是h或-c(o)ch3，并且在每个重复单元中可以相同或不同；
[0019]
其中在至少一个重复单元中至少一个r
x
或ry是-c(o)ch3；以及其中合起来，在所述寡聚物中约50至90％的r
x
和ry是-c(o)ch3；
[0020]
az是选自以下的氮杂取代基：-nh(co)r1、-n(r1)2和-n3，其中r1独立地选自以下：h、直链或支链c
1-c
6-烷基和直链或支链c
1-c
6-卤代烷基；
[0021]
z是(i)保护基团，
[0022]
(ii)用于与蛋白质缀合的功能性接头，
[0023]
或(iii)直链或支链c
1-c6烷基、任选取代的苯基、-c(o)y或直链或支链c
1-c
6-烷基-x，
[0024]
其中y是h、直链或支链c
1-c
6-烷基或保护基团，和
[0025]
其中x是-nh2、-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-sh或-s-c≡n。
[0026]
在第二个方面中，本发明涉及一种式(iia)或(iib)的寡聚物缀合物抗原：
[0027][0028]
其中n、r、r'、r
x
和ry如以上结合第一个方面所定义的；
[0029]
z是接头或键；和
[0030]
p是蛋白质。
[0031]
在第三个方面中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含(a)如上述根据本发明的第二个方面描述的缀合物；和(b)至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0032]
在第四个方面中，本发明涉及一种疫苗，其包含如上述根据本发明的第二个方面所述的缀合物，或者如上述根据本发明的第三个方面所述的免疫原性组合物。
[0033]
在第五个方面中，本发明涉及一种用于在受试者中治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的根据本发明第二个方面的缀合物，或者根据本发明第三个方面的免疫原性组合物，或者根据本发明第四个方面的疫苗。
[0034]
在第六个方面中，本发明涉及一种在受试者中针对脑膜炎a、c、w135或y进行免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据本发明第三个方面的免疫原性组合物，或者根据本发明第四个方面的疫苗。
[0035]
在第七个方面中，本发明涉及一种在受试者中诱导针对脑膜炎a、c、w135或y的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据本发明第三个方面的免疫原性组合物，或者根据本发明第四个方面的疫苗。
[0036]
在第八个方面中，本发明涉及根据本发明第三个方面的免疫原性组合物或者根据本发明第四个方面的疫苗在制备用于治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y的药物中的用途。
[0037]
在第九个方面中，本发明涉及一种根据本发明第三个方面的免疫原性组合物或者根据本发明第四个方面的疫苗，其用于治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y。
[0038]
在第十个方面中，本发明涉及一种根据本发明第三个方面的免疫原性组合物或者根据本发明第四个方面的疫苗，其用于诱导针对脑膜炎a、c、w135或y的免疫应答。
附图说明
[0039]
图1是carba-类似物dp8(即，式(ia)，其中n＝8)的随机o-乙酰化的三个反应步骤的1h-nmr谱监测。
[0040]
图2是最终随机o-乙酰化的carba类似物dp8(即，式(ia)，其中n＝8)的1h-nmr谱，其具有针对乙酰化％测定的积分。
[0041]
图3是最终随机o-乙酰化的carba类似物dp8(式ia)的
31
p nmr谱。该谱表明在位置c3+c4处出现44％程度的同时乙酰化，以及在任一c3或c4处28％程度的乙酰化。27％的分子是非乙酰化的。
[0042]
图4描述了根据本发明的寡聚物与crm
197
的缀合路线，以及粗反应的sds-page表征。
[0043]
图5a和5b是2和3剂疫苗后的elisa滴度。p值指基准mena-crm
197
天然和其他疫苗接种组之间的比较。
[0044]
图6显示了3剂疫苗后测量的elisa滴度：已使用随机o-乙酰化carbamena类似物dp8的crm
197
缀合物与选择性3-o-乙酰化carbamena dp8的crm
197
缀合物和与天然mena-crm
197
疫苗作为基准(即，阳性对照)比较评价了抗mena多糖igg抗体。
[0045]
图7显示了使用兔(rsba)和人补体(hsba)获得的根据本发明疫苗2和3剂后的sba滴度。
[0046]
图8显示了3剂疫苗后的sba滴度：在使用随机o-乙酰化carbamena类似物dp8的
crm
197
缀合物与选择性3-o-乙酰化carbamena dp8的crm
197
缀合物和与天然mena-crm
197
疫苗作为基准(即，阳性对照)比较诱发的血清上测量人补体介导的杀菌滴度。
[0047]
图9是比较mena-crm
197
(即，与crm
197
缀合的天然mena多糖)与本发明的乙酰化寡聚物(其中n是7，且寡聚物与crm
197
缀合)的稳定性的图。
具体实施方式
[0048]
为了便于理解本发明，下面定义许多术语和短语。考虑本领域公认的以下术语和短语(包括过去、现在等时态)的同义词或替代词，即使没有具体描述。
[0049]
如在本公开和权利要求中所用，单数形式“一(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定；即，“一个/种(a)”意指“一个/种或多个/种”，除非另有说明。
[0050]
如在短语诸如“a和/或b”中所使用的术语“和/或”旨在包括"a和b"、"a或b"、"a"和"b"。同样地，如短语诸如“a、b和/或c”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
[0051]
除非另有说明，否则所有指定"a％-b％"、"a-b％"、"a％至b％"、"a至b％"、"a％-b"、"a％至b"均给予其普通和习惯的意义。在一些实施方式中，这些指定是同义词。
[0052]
术语“基本上”或“实质的”意味着所描述或请求保护的条件在所有重要方面中起所描述的标准的作用。因此，“基本上不含”意指涵盖在所有重要方面作为无条件(free condition)起作用的条件，即使数值表明存在一些杂质或物质。“实质的”通常意指大于90％、优选大于95％、最优选大于99％的值。在说明书和权利要求书中使用特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“基本上”意指对于特定值具有可接受的误差范围。
[0053]“有效量”意指足以引起参考效果或结果的量。“有效量”可以使用与所述目的相关的已知技术凭经验且以常规方式确定。
[0054]“免疫有效量”或“治疗有效量”指以单一剂量或作为一系列剂量的部分向个体施用该量对于治疗或预防是有效的。该量可以根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类组(例如，非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其他相关因素而不同。预期所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。
[0055]
术语“治疗”是指以下任何一种或多种：(i)预防感染或再感染，如传统疫苗中，(ii)减轻症状的严重程度或消除症状，(iii)延迟症状复发，以及(iv)受试者中所讨论的病原体或病症的实质性或完全消除。因此，治疗可以预防性(感染前)或治疗性(感染后)作用。
[0056]
术语“％w/w”表示给定化合物相对于如所示的组合物的不同化合物或全部含量的重量百分比。
[0057]
类似地，术语“％v/v”表示给定化合物相对于如所示的组合物的不同化合物或全部含量的体积百分比。
[0058]
术语“寡糖”在其含义中包括具有3至10个单糖单元的多糖，如本领域中通常已知的(参见例如，https://en.wikipedia.org/wiki/oligosaccharide)。
[0059]
术语“低聚物”指carba类似物多糖，其中环内氧已被亚甲基(-ch
2-)基团替代，从而提供环己烷主链。
[0060]“聚合度”(dp)表示连接在一起以提供最终寡聚物的单体的数量。在本发明中，除非另有说明，否则dp由式(i)和(ii)中的“n”表示。
[0061]“平均聚合度”(avdp)表示构成寡聚物的平均重复单元数。
[0062]
术语“荚膜多糖/糖”(cps)表示可以在位于细菌的细胞包膜外的层中发现、因此是细菌细胞自身的外包膜的一部分的那些糖。cps在各种各样的细菌的最外表面上表达，且在一些情况下甚至在真菌中表达。
[0063]
除非另有说明，否则术语“缀合”表示所述实体的结合或连接，特别是具有n(即，dp)≥6的本发明的寡聚物与所选蛋白质。
[0064]
如本文所用，术语“烷基”表示饱和的、直链或支链烃部分。术语“c
1-c
6-烷基”指包含1至6个碳原子的烷基部分。
[0065]
如本文所用，术语“卤代烷基”表示饱和的、直链或支链烃部分，其中一个或多个氢原子已被卤原子代替。特别地，提及“卤代烷基”是指提及“氟代烷基”，即，其中卤素是氟。术语“c
1-c
6-卤代烷基”指包含1至6个碳原子的烷基部分，其中一个或多个烃原子已被卤素原子代替。实例包括-cf3、-ch2f、-ch2cf3等。
[0066]
如本文所用，特别地根据z的定义，苯基可以任选地被取代。苯基可以任选地被一个或多个反应性官能团取代以使得能够缀合，如n3、nh2、sh。其他适宜基团是本领域技术人员众所周知的。
[0067]
如本文所用，术语“保护基团”是用于预期目的的任何适宜的保护基团。这些保护基团的选择和使用及其使用的细节可以参见例如greene,t.w.和wuts,p.g.m.,“protective groups in organic synthesis”。适宜的保护基团是本领域技术人员众所周知的。
[0068]
如本文所用，术语“药学上可接受的磷酸根抗衡离子”是适合于磷酸基团的任何抗衡离子，即，在合理医学判断范围内的金属阳离子，其适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称。药学上可接受的磷酸根抗衡离子可以是第1族或第2族金属。此类药学上可接受的磷酸根抗衡离子的特定实例是钠(na
+
)和钾(k
+
)。抗衡离子优选是钠，例如，当本发明的寡聚物或缀合物在缓冲液中时。
[0069]
如上文所述，本发明涉及多糖carba-类似物(即，其中甘露糖胺单元的环氧被亚甲基替代)，其具有至少6的聚合度，具有单体通过1,6连接与第二类似物单体连接的第一类似物，该连接将第一单元的c-1与第二单元的c-6连接，并且其中所述1,6-连接包含磷酸酯部分。值得注意的是，本发明的衍生物不仅能够模拟来自mena血清群的天然多糖，而且预期其相对于天然cps具有改善的稳定性。
[0070]
在一个实施方式中，本发明的寡聚物是由式(ia)定义的。在一个实施方式中，本发明的寡聚物缀合物抗原式由式(iia)定义的。
[0071]
如上文所定义，n是≥6。在一个实施方式中，n是从8至30。在另一个实施方式中，n是从8至20。在一个特定实施方式中，n是从8至15。在一个实施方式中，n是≤15。特别地，n是8或10。在一个实施方式中，n是8。
[0072]
在一个实施方式中，r是h或-p(o)(or")2，其中至少一个r"是na
+
。在一个实施方式中，r是h。
[0073]
在一个实施方式中，r'是na
+
，这样本发明的寡聚物是根据式(ia’)或(ib’)所定义
的，优选地式(ia’)：
[0074][0075]
因此，在一个实施方式中，本发明的寡聚物缀合物抗原是根据式(iia’)或式(iib’)所定义的，优选式(iia’)：
[0076][0077]
如上文所定义，r
x
是h或-c(o)ch3并且在每个重复单元中可以是相同的或不同的，以及ry是h或-c(o)ch3并且在每个重复单元中可以是相同的或不同的，其中在至少一个重复单元中至少一个r
x
或ry是-c(o)ch3，并且其中合起来，在寡聚物中约50至90％的r
x
和ry是-c(o)ch3。因此，应当理解的是，根据式(ia)、(iia)、(ib)和(iib)在方括号内所定义的式指该寡聚物的每个单元具有这个骨架，但是由方括号定义的单体单元考虑到r
x
和ry的不同选项可以对于由方括号定义的每个重复单元进行选择而不一定是相同的。因此，应当意识到的是，取决于n以及针对r
x
和ry的h或-c(o)ch3的选择，可以实现不同的乙酰化％。例如，由方括号定义的寡聚物的每个重复单元根据乙酰化水平可以是相同的或不同的，即，取决于针对每个r
x
和ry的h或-c(o)ch3的选择。
[0078]
如上文所定义，合起来，在寡聚物中约50至90％的r
x
和ry是-c(o)ch3。换言之，寡聚物乙酰化的总量是约50至90％。换言之，在本发明的寡聚物中，在相同或不同的重复单元中至少一个r
x
和一个ry是-c(o)ch3，在3(ry是-c(o)ch3)位和4(r
x
是-c(o)ch3)位的总乙酰化度是约50至90％。为了避免疑义，如上文所述，在寡聚物的每个重复单元中r
x
和ry可以是相同的或不同的。
[0079]
在另一个实施方式中，合起来，在寡聚物中约60至80％的r
x
和ry是-c(o)ch3。换言之，寡聚物乙酰化的总量是约60至80％。为了避免疑义，如上文所述，在寡聚物的每个重复单元中r
x
和ry可以是相同的或不同的。
[0080]
在一个实施方式中，在本寡聚物的至少一个相同重复单元中r
x
和ry两者均是-c(o)ch3，并且优选在寡聚物约40至50％的重复单元中；约10至30％的剩余重复单元可以具有
是-c(o)ch3的一个r
x
或ry，寡聚物中的其余重复单元具有r
x
＝ry＝h。
[0081]
如上文所定义，az是选自以下的氮杂取代基：-nh(co)r1、-n(r1)2和-n3，其中r1独立地选自以下：h、直链或支链c
1-c
6-烷基和直链或支链c
1-c
6-卤代烷基。氮原子直接附接至carba-类似物重复单元。
[0082]
此类az取代基的实例包括-n3、-nh2、-nh-c
1-c6烷基、-n-(c
1-c6烷基)2和-nh(co)-c
1-c6烷基。在一个实施方式中，-c
1-c6烷基是-c
1-c4烷基，特别地是-ch3。因此，根据一个实施方式，az是-nh(co)-c
1-c6烷基，特别地是-nh(co)-ch3，还表示为-nhac(其中ac表示乙酸酯，即，-c(o)ch3)。
[0083]
根据本发明的寡聚物是否与蛋白质缀合，z可以具有不同含义。
[0084]
根据式(ia)或(ib)，本发明的寡聚物没有缀合至蛋白质。因此，如上文所定义，根据式(ia)或(ib)，z是以下中的一者：
[0085]
(i)保护基团，
[0086]
(ii)直链或支链c
1-c6烷基、任选取代的芳基、-c(o)y或者直链或支链c
1-c
6-烷基-x，或者
[0087]
(iii)用于缀合至蛋白质的功能性接头。
[0088]
因此，根据一个实施方式，z是用于对末端糖单元封端的方式，使得其可以是非反应性的或反应性的，例如，进一步链延长或随后修饰。
[0089]
当z旨在是用于对末端carba-类似物单元封端的方式时，其可以包含保护基团或封端基团，如直链或支链c
1-c6烷基、任选取代地苯基、-c(o)-y或者直链或支链-c
1-c6烷基-x，其中x是-nh2、-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-sh或-s-c≡n，并且其中y是h、直链或支链c
1-c
6-烷基或保护基团。
[0090]
如本文所定义的，z可以是用于缀合至蛋白质的功能性接头。在这种情况下，“功能性接头”指用于将多糖缀合至蛋白质的本领域公知的任何接头。
[0091]
在一个实施方式中，x是-nh2。
[0092]
在一个实施方式中，根据式(ia)或(ib)的z选自：-(ch2)
6-nh2、-(ch2)
4-nh2、-(ch2)
3-nh2和-(ch2)
2-nh2，其中氨基任选地被适宜的保护基团保护，例如，-c(o)ch3(这些保护基团的选择和使用及其使用的细节可以参见例如greene,t.w.和wuts,p.g.m.,“protective groups in organic synthesis”)。
[0093]
本发明的寡聚物可以根据有机合成中用于制备多糖carba-类似物的已知合成方式制备。通常，通过在重复单元之间形成1,6-α连接以所需方式连接至少6个甘露糖胺carba-类似物构建块可以实现本发明寡聚物的制备，从而提供聚合度至少6的寡聚物。如在式(i)中所示，所述单体式通过α-(1
→
6)磷酸酯键连接，并且可以使用标准聚合技术进行这种连接，如特别地在gao等，org.biomol.chem.,2012,10,6673中描述的一种。
[0094]
甘露糖胺carba-类似物构建块可以在3位和/或4位具有乙酸酯或者可在合成的任何阶段被乙酸酯替代的保护基团。
[0095]
或者，并且根据一个实施方式，本发明涉及一种制备式(i)的寡聚物的方法，其包括以下步骤：
[0096]
a.制备具有磷酸二酯键的单体；
[0097]
b.使用例如亚磷酰胺对由此获得的单体进行延伸反应。
[0098]
c.寡聚物的o-乙酰化。
[0099]
在一个实施方式中，当ry是c(o)ch3时，步骤(b)和(c)可以相反，以便在延伸反应之前进行o-乙酰化。
[0100]
更详细地，该方法可以包括在路线1中所示的步骤：
[0101][0102][0103]
为了避免疑问，ac旨在指乙酰基，即，-c(o)ch3。
[0104]
路线1：用于制备本发明寡糖的方法
[0105]
(a)tbaf，thf，0℃
→
rt，92％。(b)meona,meoh,rt,85％。(c)dmtrcl,et3n,dcm,rt,91％。(d)2-氰乙基n,n-二异丙基-氯亚磷酰胺，n,n-二异丙基乙胺,dcm,rt,9(94％)。(e)i.11,dci,mecn,ii.cso,mecn,iii.tca,dcm,h2o,94％.(f)i.9,dci,mecn,ii.cso,mecn,iii.tca,dcm,h2o,16(82％),17(95％),18(90％),19(92％),20(88％),21(86％),22(87％)。(g)nh4oh,h2o,二噁烷。(h)h2,pd黑，h2o,acoh,1(99％),2(76％),3(69％),4
(39％),5(88％),6(83％),7(77％),8(44％),(i)：(boc)2o,nahco3,rt,16h；(l)：ac2o/咪唑,40℃,～9d；(m)：tfa,rt,1h。
[0106]
特别地，使用亚磷酰胺构建块对形成磷酸二酯键更有效。我们选择使用二甲氧基三苯甲基(dmtr)醚来暂时掩盖要延长的伯醇功能。每个延伸步骤基于三步顺序的迭代，包括亚磷酰胺与不断增长的链醇的偶联、中间亚磷酸酯氧化为相应的磷酸二酯以及露出(n+1)寡聚物上的伯羟基。如在方案1中所示的，关键构建块9是从中间体10获得的，而中间体10又是从已知的碳环糖12分三个步骤获得的(参见例如，q.gao等，org.biomol.chem.,2012,10,6673-6681)。后一carba甘露糖构建块可以根据现有技术方法由市售的3,4,6-三-o-乙酰基-d-己烯糖制备。因此，通过四丁基氟化铵(tbaf)和naome的连续作用从化合物12中除去伯甲硅烷基醚和乙酰酯，而以85％的收率得到二醇14。接下来，区域选择性地引入dmtr基团，从而以91％的收率提供醇10。通过与2-氰乙基-n,n-二异丙基-氯亚磷酰胺反应，将该化合物转化为延伸块亚磷酰胺9。使用现有的构建块组装目标寡聚物。合成开始于使用已知的亚磷酰胺11在醇10上安装氨基己醇间隔基。使用二氰基咪唑(dci)作为用于活化亚磷酰胺的活化剂，构建块在两步一锅反应中偶联。用(1s)-(+)-(10-樟脑磺酰基)-氧氮丙啶(oxaziridine)(cso)进行原位形成的亚磷酸酯的氧化。dci(pk
a 5.2)比常规使用的四唑(pk
a 4.9)更为优选，因为其酸性较低并且适合与酸不稳定的dmtr基团结合使用。使用cso代替碘，因为其在非水性溶剂(如乙腈)中具有更高的溶解度。粗磷酸二酯产物用tca处理以切割dmtr基团。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20)纯化产物，而以94％的收率得到带有间隔基的单体15。随后的偶联全部按照上述程序进行，直到达到所需的8或更高的聚合度。为了延伸更长的寡聚物，使用更大量的亚磷酰胺9并增加偶联反应时间以确保醇的完全转化。每个延伸循环的收率从好到极好，范围在82％至95％之间。从10开始，获得了八聚体22，总收率为40％。使用两步顺序对片段16-22进行脱保护。首先，使用氨水溶液(33％)去除氰乙基(ce)。接下来，在钯黑上通过氢解将如此形成的磷酸二酯上的所有剩余保护基团(苄基醚和羧基苄基氨基甲酸酯)切除，以得到目标非乙酰化寡聚物1-8。
[0107]
非乙酰化的寡聚物1-8可以在3-位和/或4-位以随机方式o-乙酰化，即，使得合起来，在寡聚物中约50至90％的r
x
和ry是-c(o)ch3。这可以通过(i)boc保护游离胺基；(ii)使用例如ac2o/咪唑的o-乙酰化；和(iii)脱保护以获得乙酰化的寡聚物1c-8c或1d至8d来实现。然后，此类乙酰化寡聚物可以使用接头基团如己二酸双琥珀酰亚胺酯(也称为sidea)激活并与蛋白质如crm
197
缀合。
[0108][0109]
路线2：导致制备3-o-乙酰化单体构建块的方法
[0110]
(a)k2co3,meoh；(b)pmbch(ome)2,ppts；(c)bnbr,nah；(d)dibal-h,dcm；(e)dmp,dcm；(f)pph3ch3i,khmds,thf,-78℃；(g)m_二氯苯,t,μ-波；(h)nabh4,etoh/thf；(i)tdscl,lm,dcm；(j)oso4,tmano,3:1丙酮-h2o；(l)(meo)3cme,ptsa,can,然后80％acoh；(m)tf2o,dcm/py,-20℃至rt；然后nan3,19:1dmf-h2o；(n)pph3,thf,6o℃,h2o；然后ac2o,meoh；(o)naome/meoh；(p)tbsotf,2,6-二甲基吡啶,dcm；(q)ddq,然后ac2o,py；(r)hf/吡啶,thf；(s)dmtrcl,吡啶,dcm。
[0111]
或者，3-o-乙酰化单体构建块和4-o-乙酰化构建块可以通过以下路线3中描述的方法制备：
[0112][0113]
路线3：导致制备3-o-乙酰化和4-o-乙酰化单体构建块的方法
[0114]
(a’)k2co3,meoh；(b’)tdscl,咪唑,dmf,-30℃；(c’)bnbr,nah,dmf,0℃；(d’)tbaf,thf；(e’)ibx,acoet；(f’)pph3ch3i,khmds,thf,-78℃至rt；(g’)1,3-二氯苯,nabh4,etoh/thf,230℃；(h’)tipscl,咪唑,dmf；(i’)ticl4,dcm/甲苯2:8,-70℃；(l’)napbr,nah,dmf,0℃；(m’)me3no 2h2o,丙酮/h2o 3:1,oso4；(n’)(meo)3cme,ptsa,acn；(o’)tf2o,dcm/py,-20℃至rt；然后nan3,19:1dmf-h2o；(p’)naome,meoh；(q’)tbsotf,-10℃至70℃,pyr,dmap；(r’)pd/c,h2,acoh，然后ac2o,pyr；(s’)hf pyr,pyr；(t’)dmtrcl,pyr,0℃；(r”)ddq,dcm,h2o；(s”)pph3,h2o,thf，然后dmtrcl,pyr。
[0115]
乙酰化的构建块38、55a、55b和完全乙酰化的构建块(即，在同一单元的c3和c4位置具有o-ac基团)可以通过转化为亚磷酸酯和随后的偶联转化为低聚形式，如上文与化合物9相关描述的。
[0116]
本发明的carba类似物的免疫原性的一个重要先决条件是其模拟相应mena荚膜糖的能力。为了研究这一点，使用具有不同聚合度的carba类似物进行了竞争性elisa。
[0117]
本发明的寡聚物可以单独或与载体蛋白连接或作为甘露糖carba-类似物单元的均聚物或异聚物引入宿主中，包括哺乳动物宿主，优选人类宿主。在一个特定实施方式中，将本发明的寡聚物作为蛋白缀合物使用。因此，在一个其他方面，本发明包括根据通式(iia)或(iib)的包含连接至蛋白的式(i)的本发明的寡聚物的缀合物衍生物：
[0118][0119]
其中n、r、r'、r
x
和ry是如上文所定义的；
[0120]
z是接头或键；和
[0121]
p是蛋白质。
[0122]
通式(ia)或(ib)的寡聚物在与蛋白缀合质时特别有用，优选通过经由磷酸酯部分连接到第一重复单元的c-1碳的z部分。由此获得的式(iia)或(iib)的寡聚物-蛋白缀合的衍生物潜在地用于制备组合物，所述组合物能够在婴儿中引发免疫原性反应，并且还可能能够引发提供记忆效应以延长疫苗接种效力的细胞性应答。
[0123]
在一个实施方式中，寡聚物缀合物优选是由式(iia)定义的，即，其中蛋白质在carba类似物的1位而非6位缀合。
[0124]
当以缀合物递送时，蛋白质(或载体蛋白)可影响免疫原性反应，甚至影响由用一种或多种本发明化合物治疗哺乳动物产生的抗体的精确性质。适宜的蛋白质是那些具有能够与z部分的末端部分反应从而形成本发明的缀合物衍生物的官能团的蛋白质。优选地，所述官能团选自-nh2和-sh，能够与z部分连接而形成酰胺键或硫醚。更优选地，蛋白质具有-nh2基团，适于在与z反应时形成酰胺键。
[0125]
有用的蛋白质是本领域众所周知的。然而，在一个实施方式中，p是选自以下的灭活细菌毒素：白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)、crm
197
、e.coli st和铜绿假单胞菌外毒素(repa)，或者p是聚氨基酸，如聚(赖氨酸：谷氨酸)，或者p是乙型肝炎病毒核心蛋白或spr96-2021或脑膜炎奈瑟氏菌血清群b抗原fhbp-231(即，如wo 2015/128480中所定义的因子h结合蛋白(fhbp)的变体2、变体3和变体l的融合蛋白，其通过引用并入本文)。
[0126]
在一个实施方式中，p是tt、dt或crm
197
。
[0127]
在一个特定实施方式中，p是crm
197
。
[0128]
如上文所定义，根据式(iia)或(iib)，z是接头或键。当z是接头时，其可以衍生自本领域公知的适合将寡糖缀合至蛋白质的任何适宜接头。
[0129]
换言之，未反应形式的z(即当未与寡聚物和蛋白连接时)可具有使其能够充当本发明寡聚物与蛋白质之间的接头的官能团，以使得z是功能性接头(如根据式(ia)和式(ib)所定义的)。优选地，z衍生自包含用于偶联至蛋白载体上的互补基团的胺、羧酸酯或羟基的化合物，但也考虑了本领域已知的提供将寡糖偶联至蛋白质的方式的其他基团。
[0130]
当本发明的寡聚物与蛋白质缀合时，式(iia)或(iib)中优选的z部分衍生自是胺取代的烷氧基的接头，其任选地为被保护的形式。当处于这种形式中时，胺用双功能试剂乙酰化或烷基化，其另一端类似地连接到蛋白质上。
[0131]
在一个实施方式中，根据式(iia)或(iib)，z来源于能够将本发明的寡聚物与蛋白
质连接的同型双功能或异型双功能接头。在该方面中，适用于本发明缀合物的双功能接头包括本领域已知的那些，例如二羧酸，优选丙二酸、琥珀酸、己二酸和辛二酸或其活化形式。或者，可以使用方酸酯。这些类型的试剂特别便于将间隔部分包含胺的化合物连接到蛋白质。优选地，所述双功能接头源自己二酸n-羟基琥珀酰亚胺二酯(sidea)和bs(peg)5。
[0132]
在一些实施方式中，z的长度是至少2个或3个原子。接头的一些非限制性实例包括：-(ch2)
m-a、-ph-a、-(ch2)
a-ph-(ch2)
a-a及其取代形式，其中每个ph表示任选取代的苯基，以及每个a和m独立地表示1-10的整数。“a”表示能够连接或连接蛋白质的官能团或其残基，如-nh2、-oh或-sh、酯、酰胺或其他含羧基的基团、二烯或亲二烯体、马来酰亚胺、炔烃、环炔烃。z可以包括or’、sr’或n(r’)2，其中每个r’独立地是h或c
1-c
6-烷基、酰基、芳基、芳基烷基、杂酰基、杂芳基或杂芳基烷基，并且可以进一步包含a。
[0133]
在一个实施方式中，在式(iia)或(iib)中的z是具有下式的异双功能接头：
[0134]
*-(ch2)
p-nh(co)-(ch2)
p-(x-(ch2)
p
)
p-c(o)-*
[0135]
其中*代表附接点，和其中
[0136]
p独立地选自1至10；和
[0137]
x选自-o-、-s-和-nh-。
[0138]
在一个实施方式中，z具有式*-(ch2)6nhco(ch2)4co*。
[0139]
在另一个实施方式中，z是具有下式的接头：
[0140]
*-(ch2)
m-nhc(o)-(ch2)
m-c(o)-*
[0141]
其中*代表附接点，和其中m独立地选自1至10。
[0142]
在一个替代实施方式中，z具有下式：
[0143][0144]
z接头通常在附接延伸单体之前被引入到待与蛋白质连接的单体中，并且任选地以受保护的形式引入，从而不影响或参与随后的延伸反应。
[0145]
因此，在一个实施方式中，z是具有以下通式的二价接头：
[0146][0147]
其中r是2和6之间的整数，(*)表示附接至寡聚物的附接点和pg表示氢或保护基团，优选选自：烷氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基或苄氧基羰基。蛋白质通过胺附接。
[0148]
当存在时，可以适当地去除pg以允许z部分与蛋白质反应而获得其缀合物。或者，pg可以被去除并且由此获得的游离氨基可以被进一步官能化，例如，通过引入更多的间隔部分，其适用于与蛋白质的连接。
[0149]
在一个实施方式中，提供了根据下式的寡聚物缀合物：
[0150][0151]
其中n、r、r'、r
x
和ry是如上文所定义的。
[0152]
在本发明的一个实施方式中，提供了根据下式的寡聚物缀合物，即，其中r'是na
+
：
[0153][0154]
其中n、r、r
x
和ry是如上文所定义的。
[0155]
当将本发明的随机乙酰化寡聚物缀合物掺入疫苗组合物中时，其显示出比天然mena缀合物更高的乙酰化百分比稳定性，当将carba类似物配制在疫苗中时，乙酰化损失可能不到5％。
[0156]
为了避免疑问，应当注意的是，本发明的寡聚物可以通过本领域公知的任何适宜方法与蛋白质缀合，例如，根据在"the design of semi-synthetic and synthetic glycoconjugate vaccines”,p.constantino等，expert opin.drug.discov中报道的那些。
[0157]
还可以使用与用于将mena糖缀合至载体蛋白的那些方法类似的缀合方法进行缀合反应，并且例如在wo2004/067030中描述的。在一个实施方式中，本发明的寡聚物可以使用利用己二酸二-n-羟基琥珀酰亚胺基酯接头的缀合程序偶联至crm
197
，例如在berti等，acs chem.biol.,2012,7,1420-1428中报道的。在含有三甲胺的dmso中用选定的接头处理后，可以通过与丙酮共沉淀来纯化获得的活化寡聚物并用于缀合。因此，可以通过与crm
197
以100:1的寡聚物/蛋白摩尔比孵育过夜来获得所需的新缀合物。缀合可以考虑式(ia)/(ib)的寡聚物的活化，然后与所选择的蛋白质缀合，或相关蛋白功能性的活化以及随后与本发明的寡糖缀合，通常通过z部分。因此，根据一个实施方式，根据本领域公知的方法，首先用适合的活化剂活化本发明的寡聚物，然后与所选蛋白的-nh2残基偶联。
[0158]
在一个实施方式中，z基团通过与接头的第一末端部分反应而活化，由此接头的另一端可连接至所选蛋白质。例如，并且根据一个实施方式，该方法可包括在三乙胺存在下用sidea活化本发明的寡聚物，以获得起始寡聚物的活化酯。然后可以在磷酸盐缓冲液的存在下使这种活化的酯与crm
197
反应以产生所需的缀合物。
[0159]
缀合后，寡聚物-蛋白质缀合物可以通过本领域公知的多种技术进行纯化。纯化步骤的一个目标是从寡聚体-蛋白质缀合物中去除未结合的寡聚体。通常，本发明的缀合物可以通过多种标准技术从未反应的蛋白和寡聚物中纯化，尤其包括尺寸排阻色谱、密度梯度
离心、疏水相互作用色谱或硫酸铵分级分离，例如在anderson,p.w.等，j.immunol.(1986)137:1181-1186和在jennings,h.j.等，j.immunol.(1981)127:1o11-1018中所描述的。
[0160]
在一个其他实施方式中，z可以是单糖，优选甘露糖胺，如下文所描述的。因此，在一个进一步的实施方式中，本发明还涉及具有下式(iii)的寡聚物，其中：
[0161][0162]
其中r、az和n是如上文所定义的；和
[0163]
z是：
[0164][0165]
以及p和接头是如上结合式(i)和(ii)的z的定义所定义的。
[0166]
例如，以这种方式定义的缀合物的实例如下所示：
[0167][0168]
根据该实施方式，本发明的衍生物可以通过-o-接头z部分直接连接到选定的蛋白质，从而产生具有直接连接到末端单体的碳原子的-o接头-p部分的缀合物衍生物。就接头而言，这可以是根据上述接头z的任何适宜的二价接头。或者，z可以是用于与用带有酮基或醛基的接头衍生的蛋白质缀合的胺。
[0169]
根据本发明的一个进一步的方面，提供了一种免疫原性组合物，其包含(a)如上文所述的缀合物；和(b)至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0170]
通常，药学上可接受的赋形剂可以是任何本身不诱导抗体产生且对接受该组合物的患者无害并且可以在没有过度毒性的情况下给药的物质。药学上可接受的载体和赋形剂是本领域中使用的那些，并且可以包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。根据现有技术，辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等，也可以存在于这些媒介中。
[0171]
免疫原性组合物还可以包含佐剂。佐剂可以是基于铝的佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝。
[0172]
免疫原性组合物还可以包含至少一种来源于脑膜炎奈瑟氏菌血清群c、w135、y和任选地a之一的抗原。
[0173]
本发明的免疫原性组合物可以与其他药物活性物质或其他疫苗联合施用。用于施用的组合物可以包含其他类型的免疫原性化合物，如糖缀合物，例如，诱发免疫应答以提供针对其他脑膜炎病原体的保护。
[0174]
根据本发明的一个进一步的方面，提供了一种疫苗，其包含如上文所述的缀合物，或者如此前所述的免疫原性组合物。
[0175]
疫苗可配制成基本无菌的水性混合物、无热原的缓冲盐水或含磷酸盐的溶液，其可以包含防腐剂或可以不含防腐剂。溶液可以是近似等渗的，其等渗性可以用诸如酒石酸钠、氯化钠、丙二醇等的试剂来调节。本发明的免疫原性寡聚物缀合物在制剂中的浓度可以广泛变化，例如，按重量计从小于约0.1％到多达20％至50％或者更多，并且将主要通过流体体积、粘度等并根据所选施用的特定模式来选择。
[0176]
本发明还可以包括在脊椎动物，优选哺乳动物中产生免疫应答的方法，包括向哺乳动物或其他脊椎动物施用本发明的寡聚物缀合物或本发明的免疫原性组合物。免疫应答优选地是保护性的并且优选地涉及抗体。该方法可以提供强化应答。
[0177]
在一个方面中，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据本发明的寡聚物缀合物，或者根据本发明的免疫原性组合物，或者根据本发明的疫苗。此类方法还可以包括与选自c、w135、y和任选地a的至少一种血清型联合施用。
[0178]
如本文所用，术语“本发明的衍生物”指其寡聚物和寡聚物缀合物。本发明的衍生物还可用于免疫其他哺乳动物，例如，牛、绵羊和猪，以及其他非哺乳动物脊椎动物，包括鱼和家禽。
[0179]
在另一个方面中，本发明涉及一种在受试者中针对脑膜炎a、c、w135或y进行免疫的方法，所述方法包括向受试者施用免疫有效量的根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗。
[0180]
在另一个方面中，本发明涉及一种在受试者中诱导对脑膜炎a、c、w135或y的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用免疫有效量的根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗。
[0181]
在一个实施方式中，所述受试者是人。
[0182]
在一个进一步的方面中，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗在制备用于治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y的药物中的用途。
[0183]
在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗，其用于治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y，或者用于诱导对脑膜炎a、c、w135或y的免疫应答。
[0184]
本发明的免疫原性组合物将通常直接向受试者施用。直接递送可以通胃肠外注射(例如，皮下、腹腔内、静脉内、肌内或向组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺或其他粘膜施用完成。优选肌内施用，例如，向大腿或上臂。注射可以通过针头
(例如，皮下注射针头)进行，但也可以使用无针头注射。
[0185]
本发明还可以用于诱导全身性和/或粘膜免疫。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或强化免疫方案。初次剂量方案之后可以是强化剂量方案。初免剂量之间(例如，在4-16周之间)以及初免和强化免疫之间的适宜时间可以常规确定。感染影响身体的各个部位，因此本发明的组合物可以制备成各种形式。例如，组合物可以制成可注射的，作为液体溶液或混悬液。也可以制备适合在注射前溶解或混悬在液体媒介中的固体形式。组合物可以制备用于局部施用，例如，作为软膏、霜剂或粉末。组合物制备用于口服施用，例如，作为片剂或胶囊，或者作为糖浆(任选地调味的)。组合物可以制备用于肺部施用，例如，作为吸入器，使用细粉或喷雾剂。组合物可以制成栓剂或阴道栓剂。组合物可以制备用于鼻、耳或眼施用，例如，作为滴剂。适于胃肠外注射的组合物是最优选的。组合物优选是无菌的。优选地，其是无热原的。优选地，其是被缓冲的，例如，在ph 6和ph 8之间，通常在ph 7左右。本发明的组合物相对于人可以是等渗的。
[0186]
免疫原性组合物包含免疫有效量的本发明缀合物，以及根据需要的任何其他指定组分。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(例如，包括强化剂量)。组合物可以与其他免疫调节剂联合施用。可以用于本发明组合物中的佐剂包括但不限于不溶性金属盐、水包油乳剂(例如，mf59或aso3，均含有角鲨烯)、皂苷、lps的无毒衍生物(如单磷酰脂质a或3-o-去乙酰化mpl)、免疫刺激寡核苷酸、解毒的细菌adp-核糖基化毒素、微粒、脂质体、咪唑喹诺酮类或其混合物，优选氢氧化铝、磷酸铝或其混合物。其他充当免疫刺激剂的物质在例如watson,pediatr.infect.dis.j.(2000)19:331-332中公开。这些盐包括羟基氧化物和羟基磷酸盐。盐可以采用任何适宜形式(例如，凝胶、结晶、无定形等)。
[0187]
编号的实施方式
[0188]
实施方式1一种式(ia)或(ib)的寡聚物：
[0189][0190]
其中
[0191]
n是≥6；
[0192]
r是h或-p(o)(or")2，其中r"是h或药学上可接受的磷酸根抗衡离子；
[0193]
r'是h或药学上可接受的磷酸根抗衡离子；
[0194]rx
是h或-c(o)ch3，并且在每个重复单元中可以相同或不同；
[0195]ry
是h或-c(o)ch3，并且在每个重复单元中可以相同或不同；
[0196]
其中在至少一个重复单元中至少一个r
x
或ry是-c(o)ch3；以及其中合起来，在所述寡聚物中约50至90％的r
x
和ry是-c(o)ch3；
[0197]
az是选自以下的氮杂取代基：-nh(co)r1、-n(r1)2和-n3，其中r1独立地选自以下：h、
直链或支链c
1-c
6-烷基和直链或支链c
1-c
6-卤代烷基；
[0198]
z是(i)保护基团，
[0199]
(ii)用于与蛋白质缀合的功能性接头，
[0200]
或(iii)直链或支链c
1-c6烷基、任选地取代苯基、-c(o)y或直链或支链c
1-c
6-烷基-x，
[0201]
其中y是h、直链或支链c
1-c
6-烷基或保护基团，和
[0202]
其中x是-nh2、-n3、-c≡ch、-ch＝ch2、-sh或-s-c≡n。
[0203]
实施方式2实施方式1所述的寡聚物，其是由式(ia)定义的。
[0204]
实施方式3实施方式1或实施方式2所述的寡聚物，其中n是8至30。
[0205]
实施方式4实施方式1或实施方式2所述的寡聚物，其中n是8至20。
[0206]
实施方式5实施方式1或实施方式2所述的寡聚物，其中n是8至15。
[0207]
实施方式6根据前述实施方式中任一项所述的寡聚物，其中az是-nhc(o)ch3。
[0208]
实施方式7根据前述实施方式中任一项所述的寡聚物，其中n是8。
[0209]
实施方式8根据实施方式1至7中任一项所述的寡聚物，在至少一个相同的重复单元中r
x
和ry两者是-c(o)ch3。
[0210]
实施方式9根据实施方式1至8中任一项所述的寡聚物，其中在所述寡聚物的40至50％的重复单元中r
x
和ry两者是-c(o)ch3。
[0211]
实施方式10根据实施方式9所述的寡聚物，其中在所述寡聚物的10至20％的剩余重复单元中一个r
x
或ry是-c(o)ch3，在所述寡聚物中其余重复单元具有r
x
＝ry＝h。
[0212]
实施方式11一种式(iia)或(iib)的寡聚物缀合物抗原：
[0213][0214]
其中n、r、r'、r
x
和ry是在实施方式1至10中任一项所定义的；
[0215]
z是接头或键；和
[0216]
p是蛋白质。
[0217]
实施方式12实施方式11所述的缀合物，其是由式(iia)所定义的。
[0218]
实施方式13实施方式11或12所述的缀合物，其中p是选自以下的灭活细菌毒素：白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)、crm
197
、e.coli st和铜绿假单胞菌外毒素(repa)，或者p是聚氨基酸，如聚(赖氨酸：谷氨酸)，或者p是乙型肝炎病毒核心蛋白或spr96-2021。
[0219]
实施方式14实施方式11至13中任一项所述的缀合物，其中p是crm
197
。
[0220]
实施方式15实施方式11至14中任一项所述的缀合物，其中z是具有下式的接头：
[0221]
*-(ch2)
p-nh(co)-(ch2)
p-(x-(ch2)
p
)
p-c(o)-*
[0222]
其中*代表附接点，并且其中
[0223]
p独立地选自1至10；和
[0224]
x选自-o-、-s-和-nh-。
[0225]
实施方式16实施方式11至14中任一项所述的缀合物，其中z是具有下式的接头：
[0226]
*-(ch2)
m-nhc(o)-(ch2)
m-c(o)-*
[0227]
其中m独立地选自1至10。
[0228]
实施方式17一种根据实施方式11至16中任一项所述的缀合物，其具有以下结构：
[0229][0230]
其中n、r、r
x
和ry是在实施方式1至10中任一项所定义的。
[0231]
实施方式18一种免疫原性组合物，其包含(a)根据实施方式11至17中任一项所述的缀合物；和(b)至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0232]
实施方式19根据实施方式18所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。
[0233]
实施方式20根据实施方式18或实施方式19所述的免疫原性组合物，还包含来源于脑膜炎奈瑟氏菌血清群c、w135和任选地a之一的至少一种抗原。
[0234]
实施方式21一种疫苗，其包含根据实施方式11至17中任一项所述的缀合物，或者根据实施方式17至18中任一项所述的免疫原性组合物。
[0235]
实施方式22一种在受试者中治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗或预防有效量的根据实施方式11至17中任一项所述的缀合物，或者根据实施方式18至20中任一项所述的免疫原性组合物，或者根据实施方式21所述的疫苗。
[0236]
实施方式23一种在受试者中针对脑膜炎a、c、w135或y进行免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据实施方式18至20中任一项所述的免疫原性组合物或者根据实施方式21所述的疫苗。
[0237]
实施方式24一种在受试者中诱导针对脑膜炎a、c、w135或y的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据实施方式18至20中任一项所述的免疫原性组合物或者根据实施方式21所述的疫苗。
[0238]
实施方式25根据实施方式22至24中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0239]
实施方式26根据实施方式18至20中任一项所述的免疫原性组合物或者根据实施方式21所述的疫苗在制备用于治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y的药物中的用途。
[0240]
实施方式27根据实施方式18至20中任一项所述的免疫原性组合物，或者根据实施方式21所述的疫苗，其用于治疗或预防脑膜炎a、c、w135或y。
[0241]
实施方式28根据实施方式18至20中任一项所述的免疫原性组合物，或者根据实施方式21所述的疫苗，其用于诱导针对脑膜炎a、c、w135或y的免疫应答。
[0242]
现在将在以下实验部分中更详细地描述本发明，其旨在更好地说明本发明而不对
acnh)。hrms:[c23h29no5+h]+理论值400.21251,实测值400.21179。
[0260]
2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-6-o-(双(4-甲氧基苯基)(苯基))-5-carba-α-d-吡喃甘露糖(10)
[0261]
将二醇14(0.9g,2.25mmol)溶解在无水dcm(30ml)中。向混合物中添加et3n(1.9ml,13.5mmol)。添加dmtrcl(1.16g,3.38mmol)。将反应物搅拌2小时。向反应物中添加h2o，并使用盐水洗涤一次。使用na2so4干燥有机层并真空浓缩。通过快速色谱法(etoac/己烷)纯化粗产物，得到产物10(1.6g,2.04mmol)，收率为91％。1h nmr(400mhz,cd3cn)δ＝1.70-1.85(m,1h,5a
’‑
h),1.91(s,3h,acnh),2.00-2.21(m,2h,5a-h,5-h),3.01-3.19(m,1h,6
’‑
h),3.27-3.37(m,1h,6-h),3.51-3.67(m,1h,h-4),3.73(s,7h,h-3,2x ome),4.06-4.20(m,1h,h-1),4.22-4.32(m,1h,chh bn),4.40-4.62(m,3h,ch2 bn,h-2),4.65-4.73(m,1h,chh bn),6.35-6.44(m,1h,nhac),6.78-7.47(m,23h,harom)。13c nmr(100mhz,cd3cn)δ＝23.2(ch3 acnh),31.6(ch2 c-5a),38.6(ch c-5),53.3(ch c-2),55.8(2x ch3 ome),64.6(ch2 c-6),67.6(ch c-1),72.1(ch2 bn),73.8(ch2 bn),77.2(ch c-4),79.8(ch c-3),86.5(cq dmtr),113.9(charom),127.3-130.7(charom),137.2-159.4(5x cq dmtr),171.1(c＝o acnh)。hrms:[c44h47no7+na]+理论值724.32501，实测值724.32483。
[0262]
1-o-((n,n-二异丙基氨基)-o-2-氰乙基-亚磷酰胺))-2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-6-o-(双(4-甲氧基苯基)(苯基))-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖(9)
[0263]
将醇10(1.5g,2.14mmol)与acn共蒸发3次，并溶解在无水dcm(22ml)中。向混合物中添加新鲜活化的和dipea(0.6ml,3.2mmol)。向混合物中添加2-氰乙基n,n-二异丙基-氯亚磷酰胺(0.6ml,2.6mmol)。将反应物搅拌2小时。向溶液中添加h2o，并使用盐水/nahco3的1：1溶液洗涤一次。使用na2so4干燥有机层并真空浓缩。通过快速色谱法(dcm/丙酮/etsn)纯化粗产物，得到产物9(1.81g,2.0mmol)，收率为94％(非对映异构体的混合物)。1h nmr(400mhz,cd3cn)δ＝1.04-1.24(m,12h,4x异丙氨基),1.70-1.85(m,1h,5a
’‑
h),1.92(s,3h,acnh),2.00-2.21(m,2h,5a-h,5-h),2.55-2.75(m,2h,ch2氰乙基),2.98-3.10(m,1h,6
’‑
h),3.27-3.37(m,1h,6-h),3.47-3.70(m,3h,2x ch异丙氨基,h-4),3.70-3.88(m,9h,h-3,ch2氰乙基,2x ome),4.06-4.20(m,1h,h-1),4.22-4.32(m,1h,chh bn),4.40-4.62(m,3h,ch2 bn,h-2),4.65-4.73(m,1h,chh bn),6.35-6.44(m,1h,nhac),6.78-7.47(m,23h,harom)。13c nmr(100mhz,cd3cn)δ＝20.7(ch2氰乙基),22.9(ch3 acnh),24.5-24.7(2x ch3异丙氨基),30.6(ch2 c-5a),38.5(ch c-5),43.7(2x ch异丙氨基),51.7(ch c-2),55.5(2x ch3 ome),59.1(ch2氰乙基),64.2(ch2 c-6),70.5(ch c-1),71.5(ch2 bn),74.3(ch2 bn),77.8(ch c-4),79.5(ch c-3),86.2(cq dmtr),113.6(charom),127.3-130.7(charom),136.8-159.2(5x cq dmtr),170(c＝o acnh)。31p nmr(162mhz,cd3cn)δ＝146.9,147.26。
[0264]
典型规模(0.03-0.3mmol)的亚磷酰胺偶联、氧化和脱三苯甲基化的一般程序
[0265]
起始醇与acn共蒸发3次，并加入新鲜活化的和dci(acn中的0.25m溶液，1.5eq)。将溶液搅拌15min。向混合物中加入亚磷酰胺试剂(0.1-0.16m acn溶液，1.3-3eq)并搅拌直至原料完全转化(～2小时)。随后将cso(0.5m acn溶液，2eq)加入到反应混合物中并搅拌15min。使用etoac稀释混合物，并使用盐水/nahco3的1：1溶液洗涤。将水层用etoac
76.9(2x ch c-4),79.2-79.5(2x ch c-3),128.2-129.1(charom),138.9-139.6(5x cq bn),170.8(2x c＝o acnh)。31p nmr(162mhz,cd3cn)δ＝-2.60,-2.58,-2.34,-2.32,-2.22,-2.17。hrms:[c66h83n5o17p2+h]+理论值1280.53320，实测值1280.53320。
[0270]
1-o-三-((2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)2-氰乙基)-6-己基-苄基-氨基甲酸酯(17)
[0271]
使用如上所述的一般程序将醇16(0.215g,0.167mmol)与亚磷酰胺9(1.6ml 0.16m在acn中,0.25mmol)偶联、氧化、脱三苯甲基化。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20,dcm/meoh 1:1)纯化粗产物，得到产物17(0.285g,0.158mmol)，收率为95％。1h nmr(400mhz,cd3cn)δ＝1.25-1.40(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.40-1.51(m,2h,ch2己基间隔基),1.58-1.71(m,2h,ch2己基间隔基),1.80-1.92(m,12h,3x 5a
’‑
h,3x acnh),1.96-2.30(m,6h,3x 5a-h,3x 5-h),2.68-2.83(m,6h,3x ch2氰乙基),2.93(bs,1h,oh),3.00-3.11(m,2h,ch2己基间隔基),3.59-3.89(m,9h,3x h-6,3x h-4),3.96-4.22(m,11h,3x h-3,ch2己基间隔基,3x ch2氰乙基),4.31-4.86(m,18h,3x h-1,3x h-2,6x ch2 bn),5.03(s,2h,ch2 bn间隔基),5.78(bs,1h,nh),6.55-6.65(m,1h,nhac),6.9-7.15(m,2h,2x nhac),7.19-7.40(m,35h,harom)。13c nmr(100mhz,cd3cn)δ＝20.0-20.1(3x ch2氰乙基),22.9-23.0(3x ch3 acnh),25.5(ch2己基间隔基),26.5(ch2己基间隔基),28.9-29.2(3x ch2 c-5a),30.1(ch2己基间隔基),30.5(ch2己基间隔基),38.0-40.0(3x ch c-5),41.1(ch2己基间隔基),50.8-51.4(3x ch c-2),62.5-63.0(3x ch2 c-6),63.0-63.3(3x ch2氰乙基),66.3(ch2 bn间隔基),68.4(ch2己基间隔基),72.1-74.1(6x ch2 bn),75.2-75.5(3x ch c-1),75.5-76.1(3x ch c-4),79.3-79.5(3x ch c-3),128.2-129.1(charom),138.9-139.7(7x cq bn),170.9-171.2(3x c＝o acnh)。31p nmr(162mhz,cd3cn)δ＝-2.82,-2.77,-2.62,-2.58,-2.36,-2.33,-2.24,-2.20,-2.16。hrms：[c92h114n7o24p3+h]+理论值1795.72333，实测值1795.22333。
[0272]
1-o-四-((2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)2-氰乙基)-6-己基-苄基-氨基甲酸酯(18)
[0273]
使用如上所述的一般程序将醇17(0.267g,0.148mmol)与亚磷酰胺9(1.4ml 0.16m在acn中,0.22mmol)偶联、氧化、脱三苯甲基化。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20,dcm/meoh 1:1)纯化粗产物，得到产物18(0.299g,0.129mmol)，收率为87％。1h nmr(400mhz,(cd3)2co)δ＝1.31-1.47(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.47-1.57(m,2h,ch2己基间隔基),1.62-1.75(m,2h,ch2己基间隔基),1.85-2.02(m,16h,4x 5a
’‑
h,4x acnh),2.07-2.17(m,8h,4x 5a-h,4x 5-h),2.82-3.00(m,8h,4x ch2氰乙基),3.08-3.18(m,2h,ch2己基间隔基),3.66-4.01(m,12h,4x h-6,4x h-4),4.04-4.36(m,14h,4x h-3,ch2己基间隔基,4x ch2氰乙基),4.40-4.94(m,24h,4x h-1,4x h-2,8x ch2 bn),5.05(s,2h,ch2 bn间隔基),6.39(bs,1h,nh),7.17-7.42(m,45h,harom),7.42-7.80(m,4h,nhac)。13c nmr(100mhz,(cd3)2co)δ＝20.0-20.1(4x ch2氰乙基),23.1-23.2(4x ch3 acnh),25.8(ch2己基间隔基),26.8(ch2己基间隔基),29.2-29.8(4x ch2 c-5a),30.8(ch2己基间隔基),30.8(ch2己基间隔基),38.3-40.3(4x ch c-5),41.4(ch2己基间隔基),51.2-51.5(4x ch c-2),62.6-63.4(4x ch2 c-6),63.4-63.6(4x ch2氰乙基),66.2(ch2 bn间隔基),68.8(ch2己基间隔基),72.0-75.0(8x ch2 bn),75.6-75.8(4x ch c-1),76.5-77.2(4x ch c-4),79.7-79.8
(4x ch c-3),128.1-129.1(charom),139.3-140.1(9x cq bn),170.7-171.2(4x c＝o acnh)。31p nmr(162mhz,cd3)2co)δ＝-2.84,-2.77,-2.68,-2.47,-2.42,-2.37,-2.30,-1.96,-1.91,-1.89。hrms：[c118h145n9o31p4+2h]++理论值1155.45892，实测值1155.45892。
[0274]
1-o-五-((2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)2-氰乙基)-6-己基-苄基-氨基甲酸酯(19)
[0275]
使用如上所述的一般程序将醇18(0.277g,0.120mmol)与亚磷酰胺9(1.1ml 0.16m在acn中,0.18mmol)偶联、氧化、脱三苯甲基化。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20,dcm/meoh 1:1)纯化粗产物，得到产物19(0.31g,0.110mmol)，收率为92％。1h nmr(400mhz,(cd3)2co)δ＝1.31-1.46(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.46-1.58(m,2h,ch2己基间隔基),1.62-1.75(m,2h,ch2己基间隔基),1.84-2.02(m,20h,5x 5a
’‑
h,5x acnh),2.07-2.19(m,10h,5x 5a-h,5x 5-h),2.82-2.97(m,10h,5x ch2氰乙基),3.08-3.18(m,2h,ch2己基间隔基),3.67-4.02(m,15h,5x h-6,5x h-4),4.04-4.36(m,17h,5x h-3,ch2己基间隔基,5x ch2氰乙基),4.38-4.95(m,30h,5x h-1,5x h-2,10x ch2 bn),5.05(s,2h,ch2 bn间隔基),6.43(bs,1h,nh),7.16-7.41(m,55h,harom),7.42-7.86(m,5h,nhac)。13c nmr(100mhz,(cd3)2co)δ＝19.8-20.0(5x ch2氰乙基),23.0-23.1(5x ch3 acnh),25.7(ch2己基间隔基),26.7(ch2己基间隔基),29.2-30.0(5x ch2 c-5a),30.7(ch2己基间隔基),30.7(ch2己基间隔基),38.2-40.2(5x ch c-5),41.2(ch2己基间隔基),51.0-51.4(5x ch c-2),62.5-63.2(5x ch2 c-6),63.3-63.5(5x ch2氰乙基),66.1(ch2 bn间隔基),68.7(ch2己基间隔基),72.0-75.0(10x ch2 bn),75.6-75.8(5x ch c-1),76.5-77.2(5x ch c-4),79.7-79.8(5x ch c-3),128.0-129.0(charom),139.2-140.0(11x cq bn),170.7-171.2(5x c＝o acnh)。31p nmr(162mhz,cd3)2co)δ＝-2.84,-2.77,-2.68,-2.47,-2.42,-2.37,-2.30,-1.96,-1.88,-1.89,-1.86,-1.84,-1.79。hrms：[c144h176n11o38p5+2h]++理论值1412.55219，实测值1412.55219。
[0276]
1-o-六-((2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)2-氰乙基)-6-己基-苄基-氨基甲酸酯(20)
[0277]
使用如上所述的一般程序将醇19(0.280g,0.099mmol)与亚磷酰胺9(1.24ml 0.16m在acn中,0.20mmol)偶联、氧化、脱三苯甲基化。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20,dcm/meoh 1:1)纯化粗产物，得到产物20(0.29g,0.087mmol)，收率为88％。1h nmr(500mhz,(cd3)2co)δ＝1.31-1.46(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.46-1.57(m,2h,ch2己基间隔基),1.63-1.74(m,2h,ch2己基间隔基),1.84-2.02(m,24h,6x 5a
’‑
h,6x acnh),2.07-2.30(m,12h,6x5a-h,6x 5-h),2.82-2.97(m,12h,6x ch2氰乙基),3.09-3.18(m,2h,ch2己基间隔基),3.67-4.04(m,18h,6x h-6,6x h-4),4.04-4.38(m,20h,6x h-3,ch2己基间隔基,6x ch2氰乙基),4.38-5.00(m,36h,6x h-1,6x h-2,12x ch2 bn),5.05(s,2h,ch2 bn间隔基),6.42(bs,1h,nh),7.16-7.41(m,65h,harom),7.42-7.89(m,6h,nhac)。13c nmr(100mhz,(cd3)2co)δ＝19.9-20.0(6x ch2氰乙基),23.0-23.1(6x ch3 acnh),25.7(ch2己基间隔基),26.8(ch2己基间隔基),29.2-30.2(6x ch2 c-5a),30.4(ch2己基间隔基),30.7(ch2己基间隔基),38.2-40.2(6x ch c-5),41.3(ch2己基间隔基),51.0-51.4(6x ch c-2),62.5-63.4(6x ch2 c-6),63.4-63.5(6x ch2氰乙基),66.2(ch2 bn间隔基),68.7(ch2己基间隔
基),72.2-75.6(12x ch2 bn),75.6-75.8(6x ch c-1),76.5-77.2(6x ch c-4),79.7-79.8(6x ch c-3),128.1-129.1(charom),139.2-140.0(13x cq bn),170.7-171.2(6x c＝o acnh)。31p nmr(162mhz,cd3)2co)δ＝-2.84,-2.77,-2.68,-2.45,-2.42,-2.37,-2.31,-1.94,-1.81,-1.78。hrms：[c170h207n13o45p6+nh4]+理论值3356.312，实测值3357.010。
[0278]
为了制备其中n＝6的寡聚物，可以再上述步骤之后进行下面描述的一般脱保护程序。
[0279]
1-o-七-((2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)2-氰乙基)-6-己基-苄基-氨基甲酸酯(21)
[0280]
使用如上所述的一般程序将醇20(0.140g,0.042mmol)与亚磷酰胺9(0.8ml 0.1m在acn中,0.84mmol)偶联、氧化、脱三苯甲基化。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20,dcm/meoh 1:1)纯化粗产物，得到产物21(0.139g,0.036mmol)，收率为86％。1h nmr(500mhz,(cd3)2co)δ＝1.31-1.46(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.46-1.57(m,2h,ch2己基间隔基),1.63-1.74(m,2h,ch2己基间隔基),1.84-2.02(m,28h,7x 5a
’‑
h,7x acnh),2.07-2.30(m,14h,7x 5a-h,7x 5-h),2.82-2.97(m,14h,7x ch2氰乙基),3.09-3.18(m,2h,ch2己基间隔基),3.67-4.04(m,21h,7x h-6,7x h-4),4.04-4.38(m,23h,7x h-3,ch2己基间隔基,7x ch2氰乙基),4.38-5.00(m,42h,7x h-1,7x h-2,14x ch2 bn),5.05(s,2h,ch2 bn间隔基),6.42(bs,1h,nh),7.16-7.41(m,75h,harom),7.42-7.89(m,7h,nhac)。13c nmr(125mhz,(cd3)2co)δ＝19.9-20.0(7x ch2氰乙基),23.0-23.1(7x ch3 acnh),25.7(ch2己基间隔基),26.8(ch2己基间隔基),29.2-30.2(7x ch2 c-5a),30.4(ch2己基间隔基),30.7(ch2己基间隔基),38.2-40.2(7x ch c-5),41.3(ch2己基间隔基),51.0-51.4(7x ch c-2),62.5-63.4(7x ch2 c-6),63.4-63.5(7x ch2氰乙基),66.2(ch2 bn间隔基),68.7(ch2己基间隔基),72.2-75.6(14x ch2 bn),75.6-75.8(7x ch c-1),76.5-77.2(7x ch c-4),79.7-79.8(7x ch c-3),128.1-129.1(charom),139.2-140.0(15x cq bn),170.7-171.2(7x c＝oacnh)。31p nmr(202mhz,cd3)2co)δ＝-2.84,-2.77,-2.68,-2.45,-2.42,-2.37,-2.31,-1.94,-1.81,-1.78。hrms：[c196h238n15o52p7+2h]++理论值1926,73908，实测值1926,73908。
[0281]
1-o-八-((2-乙酰氨基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)2-氰乙基)-6-己基-苄基-氨基甲酸酯(22)n＝8
[0282]
使用如上所述的一般程序将醇22(0.105g,0.027mmol)与亚磷酰胺9(0.7ml 0.1m在acn中,0.68mmol)偶联、氧化、脱三苯甲基化。通过尺寸排阻色谱(sephadex lh-20,dcm/meoh 1:1)纯化粗产物，得到产物22(0.103g,0.023mmol)，收率为87％。1h nmr(500mhz,(cd3)2co)δ＝1.31-1.46(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.46-1.57(m,2h,ch2己基间隔基),1.63-1.74(m,2h,ch2己基间隔基),1.84-2.02(m,32h,8x 5a
’‑
h,8x acnh),2.07-2.30(m,16h,8x 5a-h,8x 5-h),2.82-2.97(m,16h,8x ch2氰乙基),3.09-3.18(m,2h,ch2己基间隔基),3.67-4.04(m,24h,8x h-6,8x h-4),4.04-4.38(m,26h,8x h-3,ch2己基间隔基,8x ch2氰乙基),4.38-5.00(m,48h,8x h-1,8x h-2,16x ch2 bn),5.05(s,2h,ch2 bn间隔基),6.42(bs,1h,nh),7.16-7.41(m,85h,harom),7.42-7.89(m,8h,nhac)。13c nmr(125mhz,(cd3)2co)δ＝19.9-20.0(8x ch2氰乙基),23.0-23.1(8x ch3 acnh),25.7(ch2己基间隔基),26.8(ch2己基间隔基),29.2-30.2(8x ch2 c-5a),30.4(ch2己基间隔基),30.7(ch2己
基间隔基),38.2-40.2(8x ch c-5),41.3(ch2己基间隔基),51.0-51.4(8x ch c-2),62.5-63.4(8x ch2 c-6),63.4-63.5(8x ch2氰乙基),66.2(ch2 bn间隔基),68.7(ch2己基间隔基),72.2-75.6(16x ch2 bn),75.6-75.8(8x ch c-1),76.5-77.2(8x ch c-4),79.7-79.8(8x ch c-3),128.1-129.1(charom),139.2-140.0(17x cq bn),170.7-171.2(8x c＝o acnh)。31p nmr(202mhz,cd3)2co)δ＝-2.84,-2.77,-2.68,-2.45,-2.42,-2.37,-2.31,-1.94,-1.81,-1.78。hrms：[c222h269n17o59p8+2h]++理论值2184.33410，实测值2184.33410。
[0283]
典型规模(5-40μmol)脱保护的一般程序
[0284]
将起始醇溶解在nh3(水溶液30-33％，每10μmol 1ml)和二噁烷中(直至完全溶解)。将反应混合物搅拌2小时。将混合物真空浓缩。1h nmr和31p nmr分析表明完全转化为半保护中间体。将粗品溶解在milliq h2o中，并通过含有dowex na+阳离子交换树脂(类型：50wx4-200，储存在0.5m naoh的h2o溶液中，使用前用milliq h2o和meoh冲洗)的柱洗脱。将粗品溶解在milliq h2o(每10μmol 2ml)中。向反应混合物中加入4-5滴冰acoh。混合物用ar吹扫。向溶液中加入一小部分pd黑。将反应混合物用h2吹扫几秒钟，并在h2气氛下搅拌3天。向混合物中添加硅藻土。过滤溶液并真空浓缩。通过尺寸排阻色谱法(toyopearl hw-40)纯化粗品。将纯化合物溶解在milliq h2o中，通过含有dowex na+阳离子交换树脂(类型：50wx4-200，储存在0.5m naoh水溶液中，使用前用milliq h2o和meoh冲洗)的柱洗脱并冻干。
[0285]
1-o-八-(2-乙酰氨基-2-脱氧-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖基-1-o-磷酰基)-6-己基-胺(8)n＝8
[0286]
使用上述一般程序将醇22(23.2μmol)脱保护。以44％的收率(25.9mg,10.2μmol)获得纯的寡聚物8。1h nmr(500mhz,d2o)δ＝1.33-1.43(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.57-1.69(m,4h,2x ch2己基间隔基),1.73-2.08(m,48h,8x 5a
’‑
h,8x 5a-h,8x 5-h,8x acnh),2.92-3.00(m,2h,ch2己基间隔基),3.48-3.68(m,8h,8x h-4),3.68-3.76(m,2h,ch2己基间隔基),3.81-4.22(m,24h,8x h-3,8x h-6),4.25-4.36(m,8h,8x h-1),4.37-4.53(m,8h,8x h-2)。
13
c nmr(126mhz,d2o)δ＝21.9(8x ch
3 acnh),24.4(ch2己基间隔基),25.1(ch2己基间隔基),26.6(ch2己基间隔基),28.0(8x ch
2 c-5a),29.5(ch2己基间隔基),38.6(8x ch c-5),39.4(ch2己基间隔基),53.5(8x ch c-2),61.9(8x ch
2 c-6),66.2(ch2己基间隔基),70.1(8x ch c-1),70.4(8x ch c-4),71.9(8x ch c-3),174.7(8x c＝o acnh)。
31
p nmr(202mhz,d2o)δ＝0.25,0.37,0.41,0.44,0.48。hrms：[c
78h145
n9o
57
p8+h]
++
理论值1183.83071，实测值1183.83071。
[0287]
根据本发明的随机乙酰化carba寡聚物的产生
[0288]
1.作为boc衍生物的胺保护
[0289]
将干燥carba-类似物dp6(n＝6)、dp7(n＝7)和dp8(n＝8)溶解在h2o：二噁烷1:1v/v中，然后在4℃下添加nahco3(2.95eq)和(boc)2o(1.13eq)。然后将反应物在室温下保持磁力搅拌过夜，然后通过sephadex g10柱(洗脱液：h2o)纯化产物，并干燥含有化合物的级分。
[0290]
2.随机o-乙酰化
[0291]
将来自步骤1的干燥boc保护的carba-类似物重悬在乙腈中，然后加入乙酸酐(分子中的每个-oh基团为3.6eq)和咪唑(1.8eq)。将反应物保持在40℃下并延长乙酰化反应时
间，直到达到目标乙酰化％(-75％)(通过1h-nmr监测)。然后干燥粗乙酰化化合物。
[0292]
为了避免疑问，“随机o-乙酰化”旨在指没有最终控制r
x
和ry中的哪些以及多少是-c(o)ch3。然而，使用nmr技术，可能确定寡聚物中的总o-乙酰化％。
[0293]
3.boc脱保护
[0294]
将来自步骤2的干燥粗o-乙酰化carba-类似物溶解在ch2cl2:tfa 4:1v/v中，并将反应在室温下伴随磁力搅拌保持1h。然后，将粗反应物干燥，重新溶解在水中，并通过sephadex g10柱(洗脱剂：h2o)纯化。
[0295]
用于乙酰化％测定的nmr方案
[0296]
将样品在真空下干燥，在0.6ml d2o中重构并转移到5mm nmr管中。通过标准的单维脉冲程序在400mhz和25℃下收集质子nmr谱。采集和处理由topspin bruker软件进行。
[0297]
通过对5-5.4ppm的h3+h
4 o-ac(即，乙酸酯基团的h)的峰和约3ppm的紧接接头的nh2的ch2的三重峰进行积分确定了在carba-类似物中的o-乙酰化％，其以值2给出。看图1，通过假设在o-乙酰化为100％时，dp6的h3+h
4 o-ac的积分值必须为12(对于dp7为14，和对于dp8为16)，可以应用以下比例：
[0298]
12:100＝9.04:x，其中x＝乙酰化％
[0299]
最终产品通过1h-nmr进行表征，以确认鉴定结构并确定合成糖的o-乙酰化％(图2和表1)。
[0300]
图2描述了最终随机乙酰化carba-类似物的1h nmr，以及用于确定乙酰化％的积分，其中n＝8。
[0301]
carba-类似物随机o-乙酰化度％(通过1h-nmr)dp 675dp 778dp 875
[0302]
表1
[0303]
对于n＝8的式(ia)的相同随机乙酰化carba类似物，乙酰基在3和4位之间的分布通过
31
p nmr谱(101mhz，d2o)确定。记录的谱如图3所示：其显示了在c3和c4位置发生44％程度的同时乙酰化(即，寡聚物的相同重复单元中的r
x
和ry均为-c(o)ch3)，并且在c3或c4处的乙酰化(即，在同一重复单元中，r
x
为-c(o)ch3且ry为h或者r
x
为h且ry为-c(o)ch3)至28％的程度；且27％的重复单元是非乙酰化的。
[0304]
根据方案2产生选择性乙酰化的carba单体构建块(即，其中r
x
是h和ry是-c(o)ch3)
[0305]
d-己烯糖(23)
[0306][0307]
向3,4,6-三-o-乙酰基-d-己烯糖(10.0g,36.7mmol)的混合物中加入k2co3(508mg,3.67mmol)的meoh
无水
(150ml)溶液，然后在n2下在室温下搅拌。1小时后反应完成并用乙酸淬灭以达到ph 7。溶剂减压蒸发，且d-己烯糖粗品，透明油状物，直接用于下一步。
[0308]
4,6-o-(4-甲氧基亚苄基)-d-己烯糖(24)
[0309][0310]
在n2下向在无水dmf(100ml)中的粗化合物23加入茴香醛二甲基缩醛(9.40ml,55.1mmol)，然后加入对甲苯磺酸吡啶(922mg,3.67mmol)。将反应在25-30℃和真空(180mbar)下在旋转蒸发仪上进行2.5-3小时。然后减压蒸发dmf，粗产物用100ml dcm萃取。将有机层依次用50ml nh4cl、50ml蒸馏水和50ml盐水溶液洗涤。最后，用50ml dcm萃取收集的水层。然后，将混合物在na2so4上干燥，并在减压下蒸发以获得4,6-o-(4-甲氧基亚苄基)-d-己烯糖，其为白色粉末，收率为45％。
[0311]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0312]
7.43(2h,td,j 8.6,j 4.7,8-h),6.90(2h,dt,j 8.8,j 4.9,9-h),6.33(1h,ddd,j 6.1,j 1.6,j 0.4,1-h),5.55(1h,s,7-h),4.76(1h,dd,j 6.1,j2.0,2-h),4.49(1h,br d,j 7.3,3-h),4.35(1h,dd,j 10.3,j 5.0,5-h),3.93-3.87(1h,m,6-h),3.83-3.79(1h,m,6-h),3.80(3h,s,-ome),3.77-3.75(1h,m,4-h),2.47(1h,s,-oh)。
[0313]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0314]
159.4(11-c),143.3(1-c),128.6(8-c),126.7(9-c),112.8(10-c),102.7(2-c),100.9(7-c),79.8(4-c),68.9(5-c),67.6(6-c),65.7(3-c),54.4(ome)。
[0315]
3-o-苄氧基-4,6-o-(4-甲氧基亚苄基)-d-己烯糖(25)
[0316][0317]
在0℃下向24(16.05g,60.7mmol)在dmf(350ml)中的溶液中分批加入矿物油中的60％氢化钠(7.29g,182mmol)-nah可以预先用无水正己烷洗除其矿物油3次。在相同温下搅拌30分子后，除去冰浴。加入苄基溴(14.4ml,121mmol)并将反应物搅拌过夜，同时将温度升温至室温。然后用甲醇(20ml)淬灭混合物并在减压下蒸发dmf。有机相用100ml etoac萃取，然后有机层用nh4cl、nahco3和盐水(各50ml)洗涤。有机层用na2so4干燥并减压蒸发溶剂。通过硅胶快速柱色谱法(etoac/己烷＝3:7)纯化残留物，得到3-o-苄氧基-4,6-o-(4-甲氧基亚苄基)-d-己烯糖(18.43g,86％)，其为白色粉末。
[0318]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0319]
7.42(2h,dt,j 8.5,j 4.6,8-h),7.37-7.23(7h,m,h
arom
),6.90(2h,dt,j 8.9,j 4.9,9-h),6.34(1h,dd,j 6.2,j 1.4,1-h),5.58(1h,s,7-h),4.81(1h,dd,j 6.17,j 2.06,2-h),4.79(1h,d,j 12.1,10-h ch
2 ph),4.70(1h,d,j 12.1,10-h ch
2 ph),4.36-4.32(2h,m,3-h,6a-h),4.00(1h,dd,j 9.8,j 7.4,6b-h),3.88(1h,td,j 10.1,j 4.7,5-h),3.81(1h,t,j 10.1,4-h),3.80(3h,s,-ome)。
[0320]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0321]
160.2(11-c),144.5(1-c),138.6(13-c),129.9(8-c),129.9-127.2(c
arom 9,14,15,16-c),113.7(10-c),102.4(2-c),101.3(7-c),80.1(5-c),73.2(4-c),72.1(6-c),68.8(3-c),68.4(12-c),55.4(-ome)。
[0322]
3-o-苄氧基-4-o-(4-甲氧基苄氧基)-d-己烯糖(26)
[0323][0324]
将己烯糖25(780mg,2.20mmol)溶解在dcm(20ml)中，在0℃冷却并在rt搅拌20分钟。然后在0℃逐滴加入dibal-h 1m的己烷溶液(11.0ml，11.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌2h。通过通常称为rochelle盐的酒石酸钾钠四水合物在蒸馏水中(1.5g酒石酸盐在7.5ml水中)的溶液淬灭反应20分钟。然后将混合物用dcm(30ml)萃取，有机层用蒸馏水和盐水(各40ml)洗涤两次。最后用dcm(20ml)萃取水层。将有机相分组并在na2so4上干燥。将溶剂在减压下蒸发。残留物通过硅胶快速色谱纯化(etoac/己烷＝1:3)，得到3-o-苄氧基-4-o-(4-甲氧基苄氧基)-d-己烯糖，其为白色固体，收率为84％。
[0325]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0326]
7.34-7.20(7h,m,h
arom
),6.83(2h,dt,j 8.7,j 4.8,9-h),6.34(1h,dd,j 6.1,j 1.2,1-h),4.82(1h,dd,j 6.1,j 2.6,2-h),4.75(1h,d,j 11.1,10-h ch
2 ph),4.63(1h,d,j 11.1,10-h ch
2 ph),4.61(1h,d,j 11.8,7-h ch
2 ph(4-ome)),4.52(1h,d,j 11.8,7-h ch
2 ph(4-ome)),4.19(1h,ddd,j 6.3,j 2.4,j 2.3,3-h),3.87(1h,dt,j 8.8,j 4.2,5-h),3.81-3.79(2h,m,6-h),3.77(1h,dd,j 8.7,j 6.3,4-h),3.71(3h,s,-ome),2.65(1h,s,-oh)。
[0327]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0328]
159.2(11-c),144.4(1-c),138.1(13-c),130.1(8-c),129.7-127.6(c
arom 9,14,15,16-c),113.7(10-c),100.1(2-c),77.5(5-c),75.6(3-c),74.1(4-c),73.3(12-c),70.4(7-c),61.4(6-c),55.1(-ome)。
[0329]
1,5-脱水-3-o-苄氧基-4-o-(4-甲氧基苄氧基)-2,6,7-三脱氧-d-阿拉伯-庚-1,6-二烯醇(dienitol)(28)
[0330][0331]
向先前的醇26(650mg,1.82mmol)的无水dcm(6.1ml)溶液中加入dmp(926mg,2.18mmol)。然后，将混合物在室温(25℃)下搅拌1小时。
[0332]
同时，在-78℃下用新鲜的pph3ch3i(1.48g,3.65mmol)在无水thf(12.0ml)中制备内鎓盐并搅拌25分钟。然后，在-78℃下滴加khmds(7.3ml,3.65mmol,0.5m在甲苯中)。将混合物依次在-78℃下搅拌20min，在0℃下搅拌50min并且最后在-78℃下搅拌30min，以形成内鎓盐。
[0333]
此外，氧化反应用na2s2o3(30ml)和nahco3(30ml)的溶液淬灭10分钟。然后醛用dcm(3
×
40ml)处理，用na2so4干燥，减压蒸发dcm。
[0334]
然后在-78℃下将无水thf(11.0ml)中的醛滴加到内鎓盐中。将反应物搅拌过夜。将混合物用nh4cl(20ml)和dcm(50ml)处理。然后有机层再次用dcm(2
×
30ml)萃取，用nacl(80ml)洗涤并用na2so4干燥。通过快速色谱法(正己烷/etoac＝7:3)纯化残留物，得到呈黄色油状的烯烃，两步的收率为83％。
[0335]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0336]
7.37-7.27(4h,m,h
arom
),7.24(2h,dt,j 8.6,j 5.5,9-h),6.86(2h,td,j 8.7,j 5.5,10-h),6.41(1h,dd,j 6.1,j 1.3,1-h),6.04(1h,ddd,j 17.2,j 10.6,j 6.6,6-h),5.43(1h,dt,j 2.9,j 17.3,7b-h),5.31(1h,dt,j 2.6,j 10.6,7a-h),4.88(1h,dd,j 6.2,j 2.7,2-h),4.70(1h,d,j 10.9,11-h,ch
2 ph),4.64(1h,d,j 11.7,8-h,ch
2 ph(4-ome)),4.62(1h,d,j 10.9,11-h ch
2 ph),4.58(1h,d,j 11.7,8-h ch
2 ph(4-ome)),4.31(1h,dd,j 7.1,j 8.0,5-h),4.19(1h,ddd,j 6.2,j 2.5,j 1.5,3-h),3.79(3h,s,-ome),3.59(1h,dd,j 8.6,j 6.2,4-h)。
[0337]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0338]
159.4(12-c),144.6(1-c),138.5(14-c),134.5(6-c),130.3(9-c),129.8-127.8(c
arom 10,15,16,17-c),118.4(7-c),113.9(11-c),100.5(2-c),78.2(5-c),78.0(4-c),75.5(3-c),73.6(8-c),70.8(13-c),55.4(-ome)。
[0339]
(3r,4r,5r)-4-o-苄氧基-3-o-(4-甲氧基苄氧基)-5-(羟基甲基)环己烯(29)
[0340][0341]
在室温下将烯烃28(200mg,0.57mmol)溶解在m-dcb(1.43ml,0.4m)中。然后在265℃微波下进行claisen重排10min。反应性醛的黄色溶液消耗后立即倒入nabh4(86mg,2.27mmol)在thf/etoh(10ml,4:1)中的混合物，并在室温下搅拌1h(tlc上的单点，橙色溶液)。使用蒸馏水(10ml)淬灭反应物。水相增加10ml蒸馏水并用dcm(3
×
20ml)萃取。最后，使用na2so4干燥有机层。残留物通过快速色谱法(正己烷/etoac＝8:2)纯化，得到无色油状的醇7，两步的收率为78％。
[0342]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0343]
7.28-7.16(7h,m,h
arom
),6.79(2h,br d,j 8.3,14-h),5.67-5.64(1h,m,1-h),5.64-5.59(1h,m,2-h),4.88(1h,d,j 11.3,8-h ch
2 ph),4.64(1h,d,j 11.3,8-h ch
2 ph),4.56(1h,d,j 11.2,12-h ch
2 ph(4-ome)),4.48(1h,d,j 11.7,12-h ch
2 ph(4-ome)),4.12(1h,br d,4-h),3.71(3h,s,-ome),3.57-3.47(3h,m,3-h,6-h),2.35(1h,s,-oh),2.07-2.00(1h,m,7-h),1.97-1.88(1h,m,5-h),1.82-1.75(1h,m,7-h)。δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0344]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0345]
159.4(17-c),138.5(9-c),132.1(14-c),130.5-128.0(c
arom 10,11,12,15-c),127.7(1-c),126.1(2-c),114.0(16-c),82.3(3-c),80.9(4-c),74.4(8-c),71.1(13-c),
65.9(6-c),55.4(-ome),40.7(5-c),28.1(7-c)。
[0346]
4-o-苄基-3-o-(4-甲氧基苄氧基)-6-o-叔己基二甲基甲硅烷基-5-甲基环己烯(30)
[0347][0348]
在rt下将醇29(715mg,2.02mmol)溶解在无水thf(17ml)中。加入咪唑(125mg,1.83mmol)并将混合物在室温下搅拌5min，然后在0℃下搅拌10min。然后滴加叔己基二甲基二甲硅烷基氯(1.19ml,6.05mmol)以注意白色沉淀的形成。因此在第一次沉淀时除去冰浴，将剩余的tdscl缓慢加入混合物中，升温至rt并搅拌过夜。通过tlc(pent/acoet 3:1)监测反应。有机相用etoac萃取，然后用蒸馏水洗涤(5次)。通过快速色谱法(nhex/acoet 95:5)纯化残留物，而以定量收率形成黄色油状化合物30。
[0349]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0350]
7.37-7.16(7h,m,h
arom
),6.88-6.84(2h,m,14-h),5.75(1h,ddq,j 9.0,j 4.3,j 2.4,1-h),5.64(1h,br d,2-h),4.91(1h,d,j 11.0,8-h ch2ph),4.68(1h,d,j 11.0,8-h ch
2 ph),4.64(1h,d,j 11.3,12-h ch2ph(4-ome)),4.60(1h,d,j 11.3,12-h ch
2 ph(4-ome)),4.16(1h,ddq,j 7.1,j 3.6,j 1.8,3-h),3.86(1h,dd,j 9.8,j 4.8,6-h),3.79(3h,s,-ome),3.64(1h,dd,j 10.0,j 6.6,4-h),3.63-3.58(1h,m,6-h),2.28-2.16(1h,m,7-h),2.10(1h,dt,j 18.4,j 5.3,7-h),1.91(1h,ttd,j 10.5,j 5.1,j 2.7,5-h),1.64(1h,hept,j 6.9,17-h),0.90(6h,d,j 6.9,18-h),0.87(6h,s,16-h),0.13(6h,s,15-h)。
[0351]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0352]
159.3(14-c),139.3(9-c),133.8(17-c),131.0-128.0(c
arom 10,11,12,15-c),127.6(1-c),126.3(2-c),113.9(16-c),81.5(3-c),79.7(4-c),74.7(8-c),71.5(13-c),62.6(6-c),55.4(-ome),41.4(5-c),34.3(21-c),28.7(7-c),25.3(19-c),20.5-20.3(20-c),18.8-18.7(22-c),-3.27
‑‑
3.46(18-c)。
[0353]
4-o-苄基-3-o-(4-甲氧基苄氧基)-6-o-叔己基二甲基甲硅烷基-5a-carba-α-d-吡喃葡萄糖(31)
[0354][0355]
将化合物30(230mg，0.46mmol)溶解在丙酮(1.69ml)和水(562μl)的混合物中。在室温下加入oso4(537μl，基于250mg oso4在4.5ml h2o和18ml丙酮中的制剂)和tmano(116mg，1.02mmol)的溶液。反应在25℃下进行48h。加入饱和na2s2o3水溶液(2ml)并将混合物在室温下搅拌以减少oso4。有机相通过chcl3(15ml)萃取，用盐水(10ml)洗涤，最后用
c),71.8(1-c),61.8(6-c),55.4(-ome),39.6(5-c),34.3(21-c),28.8(7-c),25.3(19-c),21.4(ch3,-oac),20.5-20.4(20-c),18.8-18.7(22-c),-3.28
‑‑
3.53(18-c)。
[0367]
1-o-乙酰基-2-叠氮基-4-o-苄氧基-3-o-(4-甲氧基苄氧基)-6-o-叔己基二甲基甲硅烷基-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖
[0368][0369]
将化合物32(220mg,0.38mmol)溶解在dcm/吡啶(5:1，0.05m)的混合物中并在-10℃在氮气下搅拌10分钟。在-10℃下滴加三氟甲磺酸酐(355μl,2.11mmol)。将反应混合物依次搅拌30min以缓慢达到0℃以及在0℃下再搅拌30min。反应完成后，将有机相用nahco3和盐水洗涤。将有机层用na2so4干燥，得到的粗品与甲苯共蒸发(3次)后直接用于下一步。接下来，将干燥的粗品在40℃下溶解在dmf/h2o(19:1,0.2m)中。在室温下加入叠氮化钠(125mg,1.92mmol)和15-冠-5(15.2μl,0.08mmol)，并将反应物在40℃下处理过夜。在三氟甲磺酸中间体完全消失后，蒸发溶剂并且最终通过快速色谱法(nhex/etoac)纯化残留物以允许以82％的收率形成标题化合物叠氮化物，其为无色油。
[0370]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0371]
7.38-7.14(7h,m,h
arom
),6.86(2h,dt,j 8.6,j 4.9,14-h),4.98-4.94(1h,m,1-h),4.88(1h,d,j 10.7,8-h ch
2 ph),4.66(1h,d,j 19.1,12-h ch
2 ph(4-ome)),4.63(1h,d,j 19.5,12-h ch
2 ph(4-ome)),4.59(1h,d,j 10.9,8-h ch
2 ph),3.87-3.84(1h,m,2-h),3.84(1h,dd,j 6.3,j 2.7,6-h),3.80(3h,s,-ome),3.82-3.75(2h,m,4-h,3-h),3.52(1h,dd,j 9.9,j 2.1,6-h),2.00(3h,s,-oac),1.91-1.82(2h,m,5-h,7-h),1.65-1.57(2h,m,7-h,17-h),0.89(6h,d,j 6.9,18-h),0.85(6h,d,j 1.2,16-h),0.07(6h,d,j 4.1,15-h)。
[0372]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0373]
169.8(c(o),-oac),159.6(14-c),138.9(9-c),130.2(17-c),129.8-127.8(c
arom 10,11,12,15-c),114.0(16-c),81.1(4-c),77.0(3-c),75.4(8-c),72.9(13-c),70.6(1-c),62.2(6-c),61.4(2-c),55.4(-ome),39.8(5-c),34.4(21-c),27.1(7-c),25.3(19-c),21.2(ch3,-oac),20.6-20.5(20-c),18.8-18.7(22-c),-3.35
‑‑
3.52(18-c)。
[0374]
1-o-乙酰基-2-乙酰氨基-4-o-苄氧基-3-o-(4-甲氧基苄氧基)-6-o-叔己基二甲基甲硅烷基-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖(33)
[0375][0376]
所示叠氮化物(334mg,0.56mmol)、pph3(366mg,1.40mmol)和催化量的吡啶(13.6μl,0.17mmol)的混合物加入thf/h2o中(85:15,0.14m)并在60℃下搅拌24h。原料消失后，将
4.5,3-h),3.97(1h,dd,j 9.7,j 3.6,6-h),3.81(3h,s,-ome),3.54(1h,t,j 9.9,4-h),3.48(1h,dd,j 9.7,j 2.2,6-h),2.09-2.02(1h,m,5-h),2.01(3h,s,-nhac),1.78-1.69(1h,m,7-h),1.69-1.59(1h,m,17-h),1.52-1.45(1h,m,7-h),0.93(6h,d,j 6.9,18-h),0.87(6h,s,16-h),0.86(6h,s,20-h),0.84(6h,s,16-h),0.12(6h,d,j 12.0,19-h),0.09(6h,d,j 9.4,15-h)。
[0388]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0389]
170.7(c(o),-nhac),159.5(14-c),139.1(9-c),130.2(17-c),130.0(15-c),128.6-127.7(c
arom 10,11,12-c),114.0(16-c),78.5(3-c),77.6(4-c),75.5(8-c),71.4(13-c),67.7(2-c),62.6(6-c),55.4(-ome),53.4(1-c),38.6(5-c),34.6(21-c),30.4(7-c),25.9(25-c),25.2(19-c),23.6(ch
3-nhac),20.7-20.6(20-c),18.9-18.8(22-c),18.0(24-c),-3.37
‑‑
3.58(18-c),-4.82
‑‑
4.92(23-c)。
[0390]
1-o-叔丁基甲硅烷基-2-乙酰氨基-4-o-苄氧基-3-o-(4-甲氧基苄氧基)-6-o-叔己基二甲基甲硅烷基-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖
[0391][0392]
向冷却的(0℃)14(71mg,0.10mmol)在dcm(3.4ml)中的溶液添加新鲜制备的磷酸盐缓冲液(362μl,ph 7.5,10mm)。在1h内分小份加入新鲜制备的ddq(50.0mg,0.22mmol)，然后将混合物升温至rt并搅拌30min。混合物用nahco3稀释，水层用dcm萃取两次。合并的有机层用na2so4干燥并真空浓缩。通过柱色谱法(nhex/etoac)纯化得到橙色固体化合物15，收率为72％。
[0393]
dan van der es,thesis,2016,universiteit leiden,pp160。
[0394]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0395]
7.41-7.27(5h,m,h
arom
),5.52(1h,d,j 5.4,nhac),4.73(2h,s,8-h ch
2 ph),4.26(1h,br d,j 2.7,1-h),4.16(1h,dt,j 9.0,j 3.8,3-h),4.06(1h,dd,j 9.0,j 4.5,2-h),3.94(1h,dd,j 9.9,j 3.7,6-h),3.53(1h,dd,j 10.0,j 2.1,6-h),3.46(1h,t,j 9.5,4-h),2.73(1h,s,-oh),2.10-2.03(1h,m,5-h),2.00(3h,s,-nhac),1.81-1.69(1h,m,7-h),1.69-1.59(1h,m,14-h),1.51(1h,dt,j 13.7,j 3.2,7-h),0.93(6h,d,j 6.9,15-h),0.88(6h,s,17-h),0.87(6h,s,13-h),0.14-0.04(12h,m,16-h,12-h)。
[0396]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0397]
170.1(c(o),-nhac),138.8(9-c),128.7-127.7(c
arom 10,11,12-c),79.6(4-c),74.8(8-c),70.7(3-c),67.6(1-c),62.9(6-c),56.5(2-c),38.5(5-c),34.6(16-c),31.2(7-c),25.9(20-c),25.3(14-c),23.6(ch3,-nhac),20.7-20.6(15-c),18.9-18.8(17-c),18.0(19-c),-3.37
‑‑
3.53(13-c),-4.80
‑‑
4.90(18-c)。
[0398]
1-o-叔丁基甲硅烷基-2-乙酰氨基-4-o-苄氧基-6-o-叔己基二甲基甲硅烷基-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖(36)
[0399][0400]
将所示的醇(180mg,0.32mmol)在室温下在氮气下溶解于无水dcm(3.2ml)中。依次加入吡啶(257μl,3.18mmol)、乙酸酐(601μl，6.36mmol)和催化量的dmap(7.8mg，0.06mmol)，搅拌混合物至反应结束。溶液用meoh淬灭，然后减压浓缩。通过快速色谱法(nhex/etoac)纯化允许以定量收率形成黄色油状化合物36。
[0401]
δ1h(400mhz；cdcl3)
[0402]
7.37-7.13(5h,m,h
arom
),5.44(1h,dd,j 10.3,j 4.5,3-h),5.27(1h,d,j 7.4,nhac),4.70(2h,d,j 10.9,8-h ch
2 ph),4.61(1h,d,j 10.9,8-h ch
2 ph),4.31(1h,dt,j 7.3,j 3.8,2-h),4.10(1h,br d,j 2.7,1-h),3.97(1h,dd,j 9.8,j 3.2,6-h),3.61(1h,t,j 10.3,4-h),3.46(1h,dd,j 9.8,j 2.0,6-h),2.18-2.11(1h,m,5-h),2.00(3h,s,-nhac),1.98(3h,s,-oac),1.79-1.70(1h,m,7-h),1.70-1.61(1h,m,14-h),1.52(1h,dt,j 14.3,j 2.8,7-h),0.95(6h,d,j 6.9,15-h),0.90(6h,s,17-h),0.88(6h,s,13-h),0.13(6h,d,j 15.1,16-h),0.09(6h,d,j 14.8,12-h)。
[0403]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0404]
170.0(c(o),-nhac),169.8(c(o),-oac),138.7(9-c),128.6-127.6(c
arom 10,11,12-c),76.2(4-c),75.1(8-c),73.2(3-c),68.1(1-c),62.3(6-c),54.0(2-c),38.7(5-c),34.6(16-c),30.6(7-c),25.8(20-c),25.3(14-c),23.6(ch3,-nhac),21.2(ch3,-oac),20.7-20.6(15-c),19.0-18.9(17-c),18.1(19-c),-3.41
‑‑
3.62(13-c),-4.90
‑‑
4.99(18-c)。
[0405]
2-乙酰氨基-4-o-苄氧基-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖(37)
[0406][0407]
在0℃下将化合物36(120mg,0.20mmol)溶解在无水thf(2.0ml)中。逐滴加入hf/py 30％(420ml)溶液，并将反应物搅拌过夜，从0℃缓慢升温至rt。使用nahco3(3ml)淬灭混合物。有机层用etoac萃取两次，用盐水洗涤并用na2so4干燥。在二氧化硅上过滤得到的粗化合物37，以60％的收率提供白色固体。
[0408]
δ1h(400mhz；cd3od)
[0409]
7.37-7.26(5h,m,h
arom
),5.33(1h,dd,j 8.4,j 4.4,3-h),4.72(2h,d,j 11.4,8-h ch
2 ph),4.66(1h,d,j 11.4,8-h ch
2 ph),4.45(1h,t,j 4.8,2-h),4.10(1h,br d,j 2.7,1-h),3.87(1h,q,j 4.5,1-h),3.78-3.73(2h,m,4-h,6-h),3.68(1h,dd,j 10.6,j 4.2,6-h),2.17-2.09(1h,m,5-h),2.04(1h,s,-oh),2.03(1h,s-oh),2.02(3h,s,-nhac),1.98(3h,s,-oac),1.83(2h,dd,j 7.8,j 3.8,7-h)。
[0410]
δ
13
c(100mhz；cdcl3)
[0411]
173.6(c(o),-nhac),172.0(c(o),-oac),140.0(9-c),129.3-128.6(c
arom 10,11,
12-c),77.2(4-c),74.9(8-c),74.7(3-c),68.2(1-c),63.1(6-c),54.0(2-c),40.7(5-c),30.9(7-c),22.5(ch3,-nhac),21.1(ch3,-oac)。
[0412]
2-乙酰氨基-4-o-苄氧基-6-o-二甲氧基三苯甲基-5a-carba-α-d-吡喃甘露糖(38)
[0413][0414]
将化合物37(15mg，42.7μmol)在氮气下于室温溶解于无水dcm中。相继加入无水吡啶(5.2μl，64.0μmol)和dmtrcl(217mg，64.0μmol)，然后在室温下搅拌混合物3h。然后向反应物中添加h2o。有机层用盐水洗涤一次，用na2so4干燥并真空浓缩。通过快速色谱法(nhex/acoet，0.1％tea)纯化以74％的收率提供白色固体的化合物38。
[0415]
δ1h(400mhz；cd3od)
[0416]
7.40-7.05(14h,m,h
arom
),6.79(4h,dd,j 8.9,j 1.7,13-h),5.24(1h,dd,j 7.9,j 4.3,3-h),4.53(1h,d,j 11.3,8-h ch
2 ph),4.38(1h,t,j 4.8,2-h),4.31(1h,d,j 11.3,8-h ch
2 ph),3.79(1h,q,j 5.2,1-h),3.72(3h,s,-ome),3.72(3h,s,-ome),3.61(1h,t,j 8.1,4-h),3.34-3.26(1h,m,6-h),3.05(1h,t,j 8.3,6-h),2.34-2.24(1h,m,5-h),2.08-1.98(1h,m,7-h),1.95(3h,s,-nhac),1.86(3h,s,-oac),1.85-1.79(1h,m,7-h)。
[0417]
δ
13
c(100mhz；cd3od)
[0418]
173.6(c(o),-nhac),172.0(c(o),-oac),160.0(17-c),146.7(9-c),137.6(14-c),137.5(14-c),137.3(9-c),131.4(18-c),129.9-126.3(c
arom 10,11,12,15,19,20,21-c),114.0(16-c),87.2(13-c),77.3(4-c),74.5(3-c),74.4(8-c),68.0(1-c),65.0(6-c),55.7(-ome),54.1(2-c),39.2(5-c),31.9(7-c),22.5(ch3,-nhac),21.1(ch3,-oac)。
[0419]
参考实施例：制备无乙酰化的寡聚物缀合物-crm
197-mena
[0420]
dp6(无oac)和crm
197-mena dp8(无oac)
[0421]
将初始寡聚物(dp6和dp8)真空干燥，溶解在1:9h2o:dmso溶液中至最终氨基浓度为40mmol/ml，并在与氨基相比5倍摩尔过量的三乙胺存在下与12倍摩尔过量的二-n-羟基琥珀酰亚胺己二酸酯接头(sidea)反应。将反应物在室温下温和搅拌下保持3h。通过用4倍体积的乙酸乙酯沉淀，然后用1ml相同溶剂洗涤10次沉淀来纯化活化的寡糖。最终，将沉淀真空干燥，测定引入的n-羟基琥珀酰亚胺酯基团的含量。
[0422]
已在50mm nah2po
4 ph 7中使用40:1的活性酯(ae)：蛋白摩尔比制备缀合物，在室温下伴随轻轻搅拌过夜。通过切向流过滤(vivaspin)使用30kda的截止值并使用pbs ph 7.2作为缓冲液纯化缀合物。通过sds-page、总蛋白含量的微bca2和总糖含量的maldi分析表征缀合物。
[0423]
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。在预制的3-8％聚丙烯酰胺凝胶(invitrogen)上进行sds-page。电泳运行在tris-乙酸盐sds电泳缓冲液(invitrogen)中进行，每个样品上样5μg蛋白，使用电压为150v的电泳室进行
约40分钟。通过添加3μllds样品缓冲液制备样品。电泳运行后，凝胶在h2o中洗涤3次，然后用考马斯染色。
[0424]
实施例2：制备根据式(iia)的本发明寡聚物缀合物
[0425]
用己二酸二-n-羟基琥珀酰亚胺基酯接头(sidea)活化如上所述制备的随机o-乙酰化的carba-类似物，并且对于dp6oac，寡糖获得的活化百分比估计为56％，对于dp7oac为79％，对于dp8oac为84％。
[0426]
将活化的寡糖(即，活化的o-乙酰化carba类似物)冻干以准备进行缀合步骤。缀合物是通过应用图4中报告的化学反应获得的，并且在同一图中显示了sds-page表征，其中可以观察到缀合物的拖尾。
[0427]
纯化的糖缀合物(即，包括随机o-乙酰化carba类似物的那些)通过微bca以蛋白含量表征和通过hpaec-pad以糖含量表征，如表2所示。
[0428] 蛋白质μg/ml糖μg/mlsacc/protw/wcarba dp6 oac-crm
197 conj378.895.70.25carba dp7 oac-crm
197 conj417.9113.40.27carba dp8 oac-crm
197 conj1388.5185.30.13
[0429]
表2
[0430]
小鼠免疫以及通过elisa和血清杀菌测定(rsba和hsba)的体外抗体应答分析。
[0431]
在无菌条件下制备抗原制剂。在第1、14和28天对10只小鼠(balb/c)的组进行免疫；在第0天(免疫前)、第27天(2后)和第42天(3后)进行取血。以糖剂量和以糖类计每剂量2μg/小鼠的剂量施用疫苗。以0.12mg al
3+
的剂量使用佐剂aipo4。
[0432]
用于carba mena缀合物的疫苗制剂如下：
[0433]
将324.96μl aipo4(4.43mg/ml，含有2mg/ml nacl)添加到目标缀合物中。通过添加ph 7.2的pbs缓冲液，使体积达到1.2ml，aipo4的浓度为1.2mg/ml。溶液最终用pbs以1:1v/v稀释至2.4ml的体积，最终浓度为0.6mg/ml的aipo4。以200μl/小鼠注射制剂。该程序也用于从储备溶液配制mena-crm
197
。
[0434]
血清的elisa。通过elisa测量了由糖缀合物诱导的抗体应答。在该分析中，将免疫前的血清作为阴性对照。通过在ph 8.2的pbs缓冲液中加入100μl/孔的5μg/ml多糖溶液，然后在4℃下孵育过夜，用hsa-deoac(如文献
21
中所述制备)或mena cps涂覆板。hsa-deoac mena cps、crm
197
缀合物和crm
197
在ph 7.2pbs缓冲液中以2μg/ml的蛋白质浓度涂覆。通过用含有0.05％吐温20(sigma)的pbs缓冲液(tpbs)洗涤三次，从板上去除涂覆溶液。然后通过添加tpbs中3％的100μl/孔的bsa溶液并在37℃下孵育板1h来进行封闭步骤。通过用tpbs洗涤3次，从板上除去封闭溶液。将200μl/孔的预稀释血清(1:25用于免疫前阴性对照，1:200-1:500用于参考血清，1:25至1:200用于测试血清)添加到板的每一列的第一个孔中，而在其他孔中分配100μl tpbs。然后通过将100μl血清溶液在孔之间转移，沿每列进行八次两倍系列稀释。一抗稀释后，将板在37℃下孵育2h。然后用tpbs洗涤三次，然后加入二抗碱性磷酸盐缀合物(抗小鼠igg 1:10000，sigma-aldrich)的100μl/孔tpbs溶液，并将板在37℃下孵育1h。使用tpbs洗涤3次后，添加100μl/孔的0.5m二乙醇胺缓冲液ph 9.6中的1mg/ml p-npp(sigma)。最后，将板在室温下孵育30min，然后使用酶标仪spectramax 190在405nm处读数。血清滴度表示为对应于截止od＝1的血清稀释度的倒数。
[0435]
每个免疫组以单一小鼠滴度的几何平均值(gmt)表示，具有95％ci。统计和图形分析由graphpad prism 7软件完成。
[0436]
免疫学评价
[0437]
为了测试具有和不具有随机乙酰化的缀合的carba dp6和dp8类似物的免疫原性，使用新糖缀合物免疫八只balb/c雌性小鼠的组。将缀合的同尺寸的mena多糖作为对照。小鼠用间隔两周的三个皮下(s.c.)剂量(基于糖2μg)进行免疫。评价了抗mena cps应答，且数据表明用没有o-乙酰化的carbamena糖抗原获得的缀合物没有应答，其糖链长度为6(n＝6)和8(n＝8)。相反，与非乙酰化疫苗相比，在寡聚物随机o-乙酰化后获得的carbamena缀合物诱导了对天然mena cps的显著更高的应答(表3和图5)。相比之下，o-乙酰化疫苗诱导的应答低于基准mena-crm
197
缀合物，但dp8仅低2倍，这在测试的那些之间提供了较好的应答。
[0438]
用于carba mena缀合物的疫苗制剂如下所示：
[0439]
将324.96μl的aipo4(4.43mg/ml，含有2mg/ml nacl)添加到目标缀合物中。通过添加ph 7.2的pbs缓冲液，使体积达到1.2ml，aipo4的浓度为1.2mg/ml。溶液最终用pbs以1:1v/v稀释至2.4ml的体积，最终浓度为0.6mg/ml的aipo4。以200μl/小鼠注射制剂。该程序也用于从储备溶液配制mena-crm
197
。
[0440]
表3报告了两剂和三剂之后的elisa反应。可以看出，第2组和第3组是根据本发明的那些。对于第2组，使用如上所述的具有n＝6和随机乙酰化的寡聚物缀合物。对于第3组，使用如上所述的具有n＝8和随机乙酰化的寡聚物缀合物。第2组和第3组的乙酰化水平为约75％。
[0441][0442]
表3
[0443]
图5a和图5b提供了两剂和三剂后的elisa滴度。p值指基准天然mena-crm
197
与其他组之间的比较。
[0444]
如下所述进行第二免疫学研究，将上述本发明的随机o-乙酰化的carbamena dp8类似物与仅在3位选择性o-乙酰化o-乙酰化百分比约70％的carbamena dp8以及与作为阳性对照的mena疫苗进行比较，其均缀合至crm
197
。
[0445]
使用上述缀合物免疫3组balb/c小鼠，每组10只。用间隔两周的三个皮下(s.c.)剂量(基于糖2μg；200μl/小鼠的制剂)对小鼠进行免疫。用于carba mena缀合物的疫苗制剂与上文针对第一免疫学研究报道的相同。评价了抗mena cps应答，数据显示在第三次免疫后，
3o-乙酰化carbamena dp8的总igg应答比mena疫苗基准低约10倍。相反，与3o-乙酰化缀合物相比，本发明的随机o-乙酰化carbamena dp8缀合物诱导了显著更高的针对天然mena cps的应答，并且基本上等同于mena疫苗基准的应答(图6)。
[0446][0447][0448]
体外杀菌测定
[0449]
通过用体外杀菌试验测量补体介导的脑膜炎奈瑟氏菌裂解来分析疫苗接种诱导的功能性抗体。
[0450]
使用市售批次的幼兔补体作为rsba的活性补体来源，而在知情同意下从志愿者供体处获得的人血浆作为hsba的补体来源。简言之，使脑膜炎奈瑟氏菌菌株在巧克力琼脂平板上在37℃下在5％co2中生长过夜。将菌落接种在含有0.25％葡萄糖的mueller-hinton肉汤中以达到0.05-0.08的od
600
，并在37℃下振荡孵育。当细菌悬浮液达到0.25-0.27的od
600
时，将细菌在测定缓冲液(含有1％bsa和0.1％葡萄糖的dpbs)中以工作稀释度(约104cfu/ml)稀释。每个孔中的总体积为50μl，其中包含25μl连续两倍稀释的测试血清、12.5μl工作稀释度的细菌和12.5μl补体源。混合测试血清并且在56℃下热灭活30分钟。阴性对照包括分别与补体血清而无测试血清以及与测试血清和热灭活的补体一起温育的细菌。添加幼兔补体后立即使用倾斜法(时间0)将阴性对照接种在mueller-hinton琼脂平板上。将微量滴定板在37℃下孵育1小时，然后将每个样品一式两份点在mueller-hinton琼脂板上，同时使用倾斜法(时间1)接种对照。使琼脂平板在37℃下孵育过夜并计数对应于时间0和时间1的菌落(存活细菌)。将血清杀菌滴度定义为与时间0时每毫升对照cfu相比，在反应混合物中细菌孵育60min后导致每毫升菌落形成单位(cfu)减少50％的血清稀释度。通常，在有补体存在而没有测试血清的情况下(阴性对照)孵育的细菌在60min的孵育时间内的cfu/ml增加150％到200％。脑膜炎球菌血清型a的参照菌株是f8238。
[0451]
图7和表4中报告的结果显示了抗mena抗体对mena菌株的杀菌能力。特别地，天然mena-crm
197
疫苗和使用随机o-乙酰化的合成carba-类似物(第2组和第3组)获得的疫苗在用人类补体进行测试时也能够保持显著的杀菌活性。
[0452]
图7描述用兔(rsba)和人(hsba)补体获得的两剂和三剂后的sba滴度。
[0453][0454]
表4
[0455]
图8显示了在三个剂量后，由上述选择性3-o-乙酰化carbamena dp8和本发明随机乙酰化carbamena dp8的crm
197-缀合物引发的人补体介导的血清杀菌滴度。mena-crm
197
疫苗仍为阳性对照。
[0456]
随机o-乙酰化carbamena-crm
197
缀合物诱导的sba滴度在三个剂量后与mena疫苗基准在统计学上相当，而3o-乙酰化carbamena-crm
197
缀合物在血清中诱导的sba滴度远低于疫苗基准，如用幼兔补体和人补体所测量的。
[0457]
统计学方法
[0458]
对从elisa获得的数据进行非参数t检验，mann-whitney使用graphpad软件进行比较所关注的两组(即，crm
197-mena avdp15和crm
197-mena dp6oac或dp8oac)之间的等级。elisa数据报告为几何平均值，具有95％ci。此外，将方差分析(anova)模型在log10抗体滴度上拟合，包括组(除4和5之外的所有组)、时间以及组和时间的相互作用作为固定效应。使用异质方差模型，因为没有假设组之间存在相同的方差。对于每个终点，该模型用于估计组几何平均值及其95％ci以及几何平均值比率(o-乙酰化制剂对比基准)和95％ci。不同的是，对于sba数据，由于每个组在每个时间点(血清混合物)都有单一观察结果，因此只进行了图形分析。
[0459]
最终缀合物中水解的mena和carbamena寡聚物的定量方案
[0460]
hpaec-pad用于量化从mena和本发明的carbamena缀合物随时间释放的单体的量。图9中报告的滴度是通过在干燥烘箱中用终浓度6m的hcl在110℃下水解样品2小时获得的。孵育后，样品在speedvac系统中干燥，然后用水重新溶解并在0.45μm过滤。使用carbamena dp7在0.5-5.0μg/ml范围内构建的标准曲线进行定量，通过nmr进行定量，并作为样品处理。分析在配备carbopac pa1色谱柱和保护装置的ics 5000系统(dionex-thermo fisher)上进行。在100mm氢氧化钠存在下以1.0ml/min用乙酸钠梯度进行洗脱，并且通过使用碳水化合物的四重波形在脉冲积分安培法中检测峰。结果使用chromeleon 7.2色谱数据系统
(cds)软件进行阐明。
[0461]
结论
[0462]
基于获得的数据，可以得出结论，本发明的carba mena寡聚物可用于开发更稳定形式的mena疫苗，并且oac部分与寡聚物长度组合是引发针对mena菌株的功能性免疫应答的关键。