用于保护上皮和屏障完整性的组合物和方法与流程

用于保护上皮和屏障完整性的组合物和方法
1.相关专利申请
2.本技术要求于2019年4月23日提交的美国临时申请第62/837,697号的权益并且通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明总体上涉及视网膜，并且具体地涉及视网膜色素上皮和血视网膜屏障。
4.通过引用并入
5.本文所指出的所有美国专利、美国专利申请公开、外国专利、外国和pct公开的申请、文章及其它文件、参考文献和出版物，以及在由此发布的任何一项或多项专利中作为参考文献引用的所有文献，特此通过引用整体并入本文。所并入的信息是如同在本技术中重复所有文本和其它内容一样多的本技术的一部分，并且将被作为提交的本技术的文本和内容的一部分对待。


背景技术：

6.以下包含对理解本发明可能有用的信息。这并非承认本文明确或隐含地提及的任何信息、出版物或文件是现有技术或对目前所描述或所要求保护的发明是必不可少的。
7.连接蛋白是形成缝隙连接、细胞间通道的蛋白质，所述细胞间通道连接两个相邻细胞的细胞质并且允许离子、代谢物和信号分子在两个缝隙连接半通道(称为半通道)对接后在细胞之间移动。各种连接蛋白同种型在人体内表达，其中最常见的是连接蛋白43。研究已经表明，连接蛋白43通道有助于炎症、细胞迁移和如协调心肌细胞收缩等生理作用的过程。
8.连接蛋白通道在身体的几乎所有组织中都有表达，除了成熟的骨骼肌和如精子和红细胞等可移动细胞类型之外。一个缝隙连接由两个连接体(或半通道)构成，所述两个连接体跨相邻细胞之间的细胞间空间连接并且允许胞内分子在那些细胞之间流动。缝隙连接的每个连接体位于相邻的细胞膜中，并且通过六种单独的连接蛋白(
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)的共价寡聚化形成。形成功能性缝隙连接的前提条件是将连接蛋白组装到半通道中并且将其插入到膜中。对于细胞间通讯，来自一个细胞的半通道必须与相邻细胞的相对膜上的对应物对接，以允许分子通过缝隙连接从一个细胞传递到另一个细胞。
9.然而，连接蛋白43是一种广泛表达的43kda蛋白质，其也已与多种病理性病状有关，其中若干研究提供了未对接的连接蛋白43半通道而不是缝隙连接通道本身促进各种连接蛋白43介导的有害过程的证据。所述过程包含离子失衡和钙波的开始、细胞毒性分子从胞外空间流入到细胞中以及atp通过开放半通道释放从而触发炎性小体通路。炎性小体是在感测各种应激因子时进行组装的多聚体蛋白复合物。炎性小体的形成导致胱天蛋白酶-1介导的激活和促炎细胞因子促白介素(il)-1β和il-18的分泌，其诱导炎性反应。
10.一些报告表明，连接蛋白半通道主要仅在如缺血或缺氧应激等病理情况期间开放。最近的研究支持如下想法：连接蛋白43半通道开放可以有助于如视网膜缺血和脊髓损
伤等损伤后的病变扩散。参见chen ys等人(2015)，青光眼治疗中的神经保护-聚焦连接蛋白43缝隙连接通道阻滞剂(neuroprotection in the treatment of glaucoma-a focus on connexin43 gap junction channel blockers)《欧洲制药学与生物制药学杂志(eur j pharm biopharm)》95(pt b)：182-193；danesh-meyer hv等人(2012)，连接蛋白43模拟肽在视网膜缺血后减少血管渗漏和视网膜神经节细胞死亡(connexin43 mimetic peptide reduces vascular leak and retinal ganglion cell death following retinal ischaemia)《大脑(brain)》135(pt 2)：506-520；guo cx等人(2016)，连接蛋白43模拟肽改善视网膜功能并且减少光损伤的白化大鼠模型的炎症(connexin43 mimetic peptide improves retinal function and reduces inflammation in a light-damaged albino rat model)《眼科学和视觉科学研究(invest ophthalmol vis sci)》57(10)：3961-3973；kerr nm等人(2012)，高压诱导的视网膜缺血再灌注导致在视网膜神经节细胞丧失之前缝隙连接蛋白连接蛋白43上调(high pressure-induced retinal ischaemia reperfusion causes upregulation of gap junction protein connexin43 prior to retinal ganglion cell loss)《实验神经生物学(exp neurol)》234(1)：144-152；zhang j等人(2013)，基于连接蛋白的中枢神经系统的炎症治疗方法(connexin based therapeutic approaches to inflammation in the central nervous system)所述文献载于：《连接蛋白细胞通讯通道：免疫系统和免疫病理学中的作用(connexin cell communication channels：roles in the immune system and immunopathology)》泰勒和弗朗西斯集团(taylor and francis group)，crc出版社(crc press)，波卡拉顿(boca raton)，佛罗里达州(florida)，第273-305页。
11.在视网膜中，连接蛋白43由血管内皮细胞、神经胶质细胞和视网膜色素上皮(rpe)细胞表达。这些是构成内外血视网膜屏障(brb)的细胞类型。具体地，外brb在视网膜中起着至关重要的作用，因为其将提供80％的视网膜血液供应的高度血管化的脉络膜与视网膜的其余部分分离。rpe细胞在生理学上也很重要，并且调控视网膜葡萄糖稳态、血管生成平衡和光感受器功能。rpe细胞病理学涉及许多视网膜疾病，所述视网膜疾病包含糖尿病性视网膜病变，其是一种由于特征在于brb渗漏和新生血管形成，伴随新血管和渗漏血管形成的高血糖相关的血管病理学而发生的慢性视网膜疾病。durham jt、herman im(2011)，糖尿病视网膜病变的微血管修饰(microvascular modifications in diabetic retinopathy)《当代糖尿病报告(curr diab rep)》11(4)：253-264。
12.研究已经表明，糖尿病视网膜病变的病理性事件主要发生在存在高血糖症和炎症两者的情况下，并且阻滞连接蛋白43半通道可以防止rpe细胞中的促炎细胞因子释放和nlrp3炎性小体激活。参见mugisho oo等人(2018)，炎性小体通路通过连接蛋白43半通道介导的atp释放以自分泌方式被扩增并维持(the inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated atp release)《生物化学与生物物理学学报(biochim biophys acta)》1862(3)：385-393。
13.然而，尽管有这些发现，但连接蛋白43是否可以以及如何可以影响rpe细胞的屏障性质仍然未知。这一点尤其重要，因为rpe介导的brb完整性的丧失是糖尿病黄斑水肿的关键特征，所述糖尿病黄斑水肿是诱发视力丧失的糖尿病视网膜病变的结果。


技术实现要素：

14.本文描述且请求保护的本发明具有许多属性和实施例，包含但不限于在本发明内容中阐述或描述或提及的属性和实施例。其不旨在是全面的，并且本文描述和要求保护的发明不限于本介绍中鉴定的特征或实施例，包含这些特征或实施例仅出于说明而非限制的目的。
15.视网膜色素层或视网膜色素上皮(rpe)是位于神经感觉视网膜外部的色素细胞层，所述神经感觉视网膜滋养视网膜视觉细胞并且牢固地连接到下层脉络膜和上层视网膜视觉细胞上。视网膜色素上皮和血视网膜屏障的渗透性的增加涉及多种疾病、病症和病状。
16.本专利描述了半通道阻滞剂用于减轻视网膜色素上皮和血视网膜屏障完整性的破坏的用途。
17.本专利还描述了半通道阻滞剂用于减轻zo-1内化的用途。
18.本专利还描述了半通道阻滞剂用于减轻连接蛋白，特别是连接蛋白43内化的用途。
19.本专利还描述了半通道阻滞剂用于减轻胶原iv上调的用途。
20.一方面，例如，本发明涉及半通道阻滞剂用于调节受试者的rpe渗透性的用途，包含特征在于全部或部分丧失rpe完整性的病状。
21.另一方面，提供了用于调节受试者的brb完整性的方法。
22.另一方面，提供了用于调节受试者的紧密连接完整性的方法。
23.另一方面，提供了用于调节受试者的iv型胶原的方法。
24.另一方面，提供了用于使用本文所述的测定来确认、测量或评估可用于调节rpe渗透性、brb渗透性、zo-1内化、胶原iv调控和/或连接蛋白半通道内化的化合物的活性的方法。测定包含使用arpe-19细胞的测试。参见dunn kc等人，arpe-19，一种具有分化性质的人视网膜色素上皮细胞系(arpe-19，a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties)《实验性眼研究(exp eye res.)》1996年2月；62(2)：155-69。在一个实施例中，测试测定是使用跨arpe-19单层的跨上皮电阻(teer)和fitc-葡聚糖染料渗漏进行的arpe-19细胞rpe分解测定，例如，以在存在已知或潜在的半通道阻滞剂的情况下测量rpe层渗透性。
25.本专利部分描述了化合物和方法用于调节包含连接蛋白43半通道在内的连接蛋白半通道以阻滞或调节rpe渗透性并改善或维持rpe完整性的用途。
26.本专利还部分描述了化合物和方法用于调节包含连接蛋白43半通道在内的连接蛋白半通道以阻滞或调节brb渗透性并改善或维持brb完整性的用途。
27.本发明的方法将可用于通过向将受益于连接蛋白半通道阻滞剂的受试者施用连接蛋白半通道阻滞剂来减轻受试者的rpe渗透性的异常、升高、失调和/或其它不期望的水平。本发明的方法将还可用于通过向将受益于连接蛋白半通道阻滞剂的受试者施用连接蛋白半通道阻滞剂来减轻受试者的brb渗透性的异常、升高、失调和/或其它不期望的水平。
28.本发明的方法将可用于通过向将受益于连接蛋白半通道阻滞剂的受试者施用连接蛋白半通道阻滞剂来减轻受试者的胶原iv的异常、升高、失调和/或其它不期望的水平。例如，vi型胶原形成与患有1型糖尿病的患者的较高动脉僵硬度相关，并且可以用本发明的化合物和组合物进行治疗。1型糖尿病具有患心血管疾病的增加的风险。大动脉僵硬度是心
血管风险和动脉僵硬度的重要决定因素，并且已经显示是死亡率和心血管结果的强预测因子。动脉硬化反映了大动脉的介质中弹性蛋白纤维的碎裂和丧失以及胶原纤维的累积。然而，直到现在，对动脉硬化负责的机制仍是不完全被理解的。这些机制至少部分基于面对高葡萄糖和基线炎症时的半通道开放，并且举例来说，动脉僵硬度可以用如本文所述的半通道开放的调节剂治疗以减轻胶原iv。
29.本发明的方法将还可用于通过向将受益于连接蛋白半通道阻滞剂的受试者施用连接蛋白半通道阻滞剂来减轻受试者的zo-1和/或紧密连接破坏的异常、升高、失调和/或其它不期望的水平。本发明的方法将还可用于通过向将受益于连接蛋白半通道阻滞剂的受试者施用连接蛋白半通道阻滞剂来减轻受试者的连接蛋白半通道内化的异常、升高、失调和/或其它不期望的水平。这些受试者包含例如患有炎性肠病和炎性肠病相关结肠直肠癌的受试者，其特征在于损害上皮屏障的完整性的炎症，并且其中顶端紧密连接蛋白在维持上皮屏障功能和控制细胞旁渗透性中至关重要。
30.本发明的一个目的是提供用于通过向将受益于连接蛋白半通道阻滞剂的受试者施用连接蛋白半通道阻滞剂来减轻受试者的rpe渗透性、brb渗透性、紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化或iv型胶原产生的异常、升高、失调和/或其它不期望的水平的方法。
31.本发明的另一个目的是提供用于治疗疾病、病症和病状的化合物、组合物、调配物、试剂盒和方法，所述疾病、病症和病状将受益于rpe渗透性的调节以维持或增强rpe完整性。
32.本发明的另一个目的是提供用于治疗疾病、病症和病状的化合物、组合物、调配物、试剂盒和方法，所述疾病、病症和病状将受益于brb渗透性的调节以维持或增强brb完整性。本发明的目的还包含提供用于治疗疾病、病症和病状的化合物、组合物、调配物、试剂盒和方法，所述疾病、病症和病状将受益于紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化和/或iv型胶原产生的调节。
33.在一些方面，治疗方法应用于哺乳动物，例如，人。
34.另一方面，本发明提供了一种用于治疗本文所述的一种或多种疾病、病症和病状的半通道阻滞剂。
35.可用于本发明的半通道阻滞剂包含式i的化合物，例如西弗拉姆(xiflam)，和/或前述化合物中的任何化合物的类似物或前药；或拟肽，如派普泰刚(peptagon)(又名肽5(peptide5))或其类似物或前药；或另一种半通道阻滞剂以及本文所述的或通过引用并入本文的其它半通道阻滞剂化合物。
36.一些优选的半通道阻滞剂包含小分子半通道阻滞剂(例如，西弗拉姆(托那博沙(tonabessat))。在一些实施例中，半通道阻滞剂是除西弗拉姆以外的小分子，例如，在以colin green等人的名义提交的美国专利申请公开第20160177298号中的式i或式ii中所描述的半通道阻滞剂，所述美国专利申请公开的公开内容通过引用整体并入本文，如上所述。各个优选的实施例包含使用阻滞或改善或以其它方式拮抗或抑制半通道开放的小分子用于治疗特征至少部分在于rpe或brb或紧密连接完整性的异常、升高、失调和/或其它不期望的、不需要的或有害的水平的疾病、病症和病状，所述疾病、病症和病状包含本文所述或所提及的疾病、病症和病状，以及治疗将受益于rpe或brb或紧密连接完整性、紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化和/或iv型胶原产生的调节的疾病、病症和病状的用途。在各个实
施例中，阻滞或改善或抑制半通道开放的小分子是西弗拉姆的前药或其类似物。
37.在其它实施例中，半通道阻滞剂包含肽和拟肽半通道阻滞剂(例如，派普泰刚、vdcflsrptekt、拟肽)和包括氨基酸序列srptekt或基本上由其组成或由其组成的其它拟肽半通道阻滞剂，以及其它肽半通道调节剂，包含例如缝隙19等。在另一个实施例中，半通道阻滞剂是肽5、gap9、gap19、gap26、gap27或α-连接蛋白羧基端(act)肽，例如，act-1或其它活性抗半通道拟肽。在本发明的任何方面中，半通道阻滞剂是连接蛋白肽或拟肽，所述连接蛋白肽或拟肽包含包括连接蛋白胞外结构域、跨膜区和连接蛋白羧基端肽、基本上由其组成或由其组成的肽或拟肽。所述连接蛋白半通道阻滞肽或拟肽可以是经修饰的或未经修饰的。所述连接蛋白半通道阻滞肽或拟肽是化学、合成或以其它方式制造的。在一些实施例中，所述连接蛋白半通道阻滞肽或拟肽是cx43肽或拟肽。在一些方面，治疗有效的经修饰的或未经修饰的肽或拟肽包括如cx43或cx45等连接蛋白的胞外或跨膜结构域的一部分，例如，包含cx43胞外环2的一部分和cx45胞外环2的一部分在内的连接蛋白胞外环2的一部分。
38.另一方面，本发明提供了半通道阻滞剂在制造用于治疗本文所述或提及的一种或多种疾病、病症和病状的药剂中的用途。所述药剂将包括半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，所述药剂将包括肽半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，所述药剂将包括拟肽半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，所述药剂将包括小分子半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，所述药剂将包括根据美国专利申请公开第20160177298号中的式i或式ii的化合物、基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，所述药剂将包括西弗拉姆(托那博沙)、基本上由其组成或由其组成。
39.与
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包含(including)
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、
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含有(containing)
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或
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特征在于(characterized by)
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同义的术语
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包括(comprising)
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是包含性的或开放性的，并且不排除来自药剂(或在方法的情况下，步骤)的另外的未列举的要素或成分。短语
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由...组成(consisting of)
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不包含在药剂(或在方法的情况下，步骤)中未指定的任何要素、步骤或成分。短语
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基本上由...组成(consisting essentially of)
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是指指定的材料以及不会实质性地影响药剂(或在方法的情况下，步骤)的基本和新颖特性的材料。本发明的基本和新颖特性贯穿本说明书进行描述，并且包含本发明的药剂和方法阻滞或调节连接蛋白缝隙连接半通道以及调节brb完整性、rpe完整性、紧密连接完整性、brb分解、rpe分解、紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化和/或iv型胶原产生中的一种或多种的能力，视情况而定。包含本文所述的药剂和方法在内的本发明的基本和新颖特性的实质性变化包含半通道调节和/或brb完整性、rpe完整性、紧密连接完整性、brb分解、rpe分解、紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化和/或iv型胶原产生中的一种或多种的调节的不想要的或临床上不期望的、有害的、不利的或不良的减少，视情况而定可以是brb分解、rpe分解、紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化。在一个实施例中，所述药剂将包括连接蛋白43半通道阻滞剂，例如，拟肽或小分子连接蛋白43半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。在一个优选的实施例中，所述药剂将包括西弗拉姆(托那博沙)或式i的另一种化合物或基本上由其组成。
40.另一方面，本发明提供了半通道阻滞剂在制造用于调节半通道和/或治疗本文所述或提及的任何疾病、病症和/或病状的药剂(或含有一种或多种药剂和/或容器的包装或试剂盒，使用或不使用说明书)中的用途。一方面，例如，本发明提供了连接蛋白半通道阻滞
剂，包含例如西弗拉姆和/或其类似物或派普泰刚或其类似物，在制造用于治疗病症的药剂或包装或试剂盒中的用途，其中对用于本文所述的目的的半通道的调节可以是有益的。在一个实施例中，所述药剂将包括连接蛋白43半通道阻滞剂，例如，拟肽或小分子连接蛋白43半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，可用于本发明的半通道阻滞剂组合物可以包含药学上可接受的载体，并且可以被调配成丸剂、溶液、微球、纳米颗粒、植入物、基质或水凝胶调配物，例如或可以以冻干形式提供。
41.出于本文所述的目的而被调节的半通道可以是用于此目的的任何所关注连接蛋白。
42.在肠内，例如，连接蛋白的范围包含以下：连接蛋白26(cx26)、连接蛋白32(cx32)、连接蛋白36(cx36)、连接蛋白37(cx37)、连接蛋白43(cx43)和连接蛋白45(cx45)。
43.在各个实施例中，举例来说，被调配的半通道包括以下中的一种或多种：cx26、连接蛋白30(cx30)、cx32、cx37、连接蛋白40(cx40)、cx43和cx45。在一个实施例中，被调节的半通道包括cx37、cx40或cx43蛋白中的一种或多种。在一个特定实施例中，被调节的半通道和/或半通道包括cx43。在一些实施例中，被调节的半通道可以包含或不包含前述连接蛋白中的任何连接蛋白。在一些方面，半通道阻滞剂是cx37半通道、cx43半通道、cx40半通道和/或cx45半通道的阻滞剂。在某些优选的实施例中，半通道阻滞剂是连接蛋白43半通道阻滞剂。用于本文中所提出的任何用途的本发明的药物组合物还可以包括可以抑制或阻滞cx26、cx30、cx32、cx36、cx37、cx40、cx43、cx45或任何其它连接蛋白或连接蛋白半通道的半通道阻滞剂。在一个实施例中，半通道阻滞剂阻滞血管中的连接蛋白半通道。在其它实施例中，半通道阻滞剂阻滞血液微血管中的连接蛋白半通道。在其它实施例中，半通道阻滞剂阻滞毛细管中的连接蛋白半通道。在其它实施例中，半通道阻滞剂阻滞内皮中的连接蛋白半通道。
44.本发明的此方面的另一个实施例提供了一种包含小分子或其它半通道阻滞剂的药物包装。在一个实施例中，半通道阻滞剂是西弗拉姆。在另一个实施例中，半通道阻滞剂是派普泰刚。
45.在本发明的另一方面，使用用于监测rpe或brb完整性、紧密连接完整性或胶原iv产生的方法来评估或监测受试者的半通道阻滞剂治疗的效果。
46.可以使用某些生物学测定来评估半通道阻滞剂的活性。可以使用以下实例中所描述的方法或用于确定化合物穿过连接蛋白半通道的其它本领域已知或等效的方法来鉴定、评估或筛选已知或候选半通道阻滞剂对分子运动性的影响。各种方法都是本领域已知的，所述方法包含染料转移实验，例如，用可检测标志物标记的分子的转移，以及小荧光渗透性示踪剂的跨膜通过，所述染料转移实验已广泛用于研究半通道的功能状态。本文描述了本发明的此方面的各个实施例，所述实施例包含用于鉴定或评估化合物阻滞半通道的能力的方法，所述方法包括：(a)将测试样品和测试系统放在一起，所述测试样品包括一种或多种测试化合物，并且所述测试系统包括用于评估半通道阻滞的系统，所述系统的特征在于，例如响应于将缺氧或缺血引入所述系统、炎症介质或诱导半通道开放的其它化合物或事件，如胞外ca
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的下降，所述系统表现出染料或经标记的代谢物的增加的转移；以及(b)确定所述系统中的例如染料或其它经标记的代谢物的存在或增加的量。也可以使用阳性和/或阴性对照。任选地，可以向测试系统添加预定量的半通道阻滞剂(例如，派普泰刚或西弗拉
姆)。如本文所述，在一个实施例中，如派普泰刚和西弗拉姆等半通道阻滞剂例如在体外测定中表现出的活性小于约1到5nm，优选地小于约10nm并且更优选地小于约50pm。在体内测定中，这些化合物优选地示出了浓度小于约10-100微摩尔(μm)，并且更优选地浓度小于约50μm的半通道阻滞。其它半通道阻滞剂可以在这些范围内，并且也在小于约200pm的范围内。提供了用于确认、测量或评估如本文所述的有用的半通道调节化合物的活性的测定方法。测定包含使用arpe-19细胞的测试。参见dunn kc等人，arpe-19，一种具有分化性质的人视网膜色素上皮细胞系《实验性眼研究》1996年2月；62(2)：155-69。在一个实施例中，测试测定是使用跨arpe-19单层的跨上皮电阻(teer)和fitc-葡聚糖染料渗漏进行的arpe-19细胞rpe分解测定，例如，以在存在已知或潜在的半通道阻滞剂的情况下测量rpe层渗透性。
附图说明
47.图1a-图1b示出了在arpe-19细胞中，在hg和细胞因子之后，使用具有肽5的半通道阻滞进行的处理防止了teer的降低和fitc-葡聚糖渗透性的升高。(图1a)用hg和细胞因子的组合培养细胞导致在48小时(p＝0.0007)和72小时(p＝0.0030)处teer具有统计学上显著的降低。肽5处理防止了两个时间点处的teer的降低，而在经肽5处理的细胞与基底细胞之间teer没有统计学上显著的差异。使用双向anova与邓尼特多重比较测试(dunnett
′
s multiple comparison
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s test)进行统计学分析。(图1b)用hg和细胞因子的组合培养细胞还导致跨细胞单层的fitc-葡聚糖渗透性在72小时(p＝0.0016)处增加，但是相对于基底条件，用肽5处理防止了这种增加。使用单向anova与邓尼特多重比较测试进行统计学分析。n＝3；**p≤0.01；***p≤0.001。
48.图2a-图2b示出了在hg和细胞因子应用之后，使用半通道阻滞肽5进行的处理防止细胞膜去稳定化。hg和细胞因子不诱导细胞死亡，但是导致ldh的微妙但显著的释放(p＜0.0001)。然而，相对于基底条件，肽5处理防止ldh释放。使用单向anova与邓尼特多重比较测试进行统计学分析。****p＜0.0001；n＝3；比例尺＝100μm。
49.图3示出了使用半通道阻滞肽5进行的处理防止细胞膜上zo-1(绿色)定位的丧失。基本上，zo-1定位于细胞膜(白色箭头)。在hg和细胞因子的情况下，存在膜定位的丧失和zo-1到细胞质的内化的增加。然而，肽5处理维持zo-1定位到细胞膜，类似于基底条件。比例尺＝50μm。
50.图4示出了在hg和细胞因子应用之后，使用具有肽5的半通道阻滞进行的处理防止胶原iv(红色)上调。相对于基底条件，hg和细胞因子导致胶原iv上调(p＝0.0180)。在肽5处理的情况下，胶原iv表达维持在基底水平，而在经肽5处理的细胞与基底细胞之间没有表达差异。比例尺＝100μm；使用单向anova与邓尼特多重比较测试进行统计学分析。*p＜0.05；n＝3。
51.图5a-图5c示出了在hg和细胞因子应用之后，外源添加的atp逆转了由肽5赋予的保护。(图5a)相对于基底条件，hg和细胞因子增加了atp释放(p＝0.0014)，而肽5处理能够减少atp释放(p＝0.0003)，使得基底条件与肽5处理条件之间没有差异。使用单向anova与邓尼特多重比较测试进行统计学分析。**p≤0.01；***p≤0.001；n.s.＝不显著；n＝3。(图5b)通过肽5处理减少了由hg和细胞因子诱导的ldh释放(p＜0.0001)。然而，在存在atp的情况下，ldh水平增加到损伤水平，而在hg和细胞因子损伤的细胞与hg、细胞因子、肽5和atp损
伤的细胞之间没有显著差异。使用单向anova与邓尼特多重比较测试进行统计学分析。****p＜0.0001；n.s.＝不显著；n＝3。(图5c)肽5处理防止来自细胞膜斑块的连接蛋白43蛋白(绿色)的再分布。基本上，连接蛋白43蛋白定位于细胞膜(白色箭头)。在hg和细胞因子的情况下，存在膜斑块定位的丧失和连接蛋白43到细胞的内化的增加。然而，肽5处理主要在缝隙连接斑块中维持连接蛋白43，类似于基底条件。在存在外源添加的atp的情况下，在细胞膜上再次丧失连接蛋白43，类似于hg和细胞因子组。比例尺＝50μm。
具体实施方式
52.视网膜色素上皮(rpe)是位于神经视网膜与脉络膜毛细血管之间的界面中的专门的上皮，在所述界面中，所述视网膜色素上皮形成外血视网膜屏障(brb)。rpe的主要功能如下：(1)营养物质、离子和水的运输；(2)光的吸收和抗光氧化的保护；(3)全反式视网膜重新异构化成11-顺式视网膜，这对于视觉循环至关重要；(4)脱落的光感受器膜的吞噬作用；以及(5)视网膜结构完整性的必需因子的分泌。
53.在健康的眼睛中，rpe分泌色素上皮源性因子(pedf)，这有助于以两种方式维持视网膜以及脉络膜毛细血管结构，所述视网膜以及脉络膜毛细血管结构既作为神经保护因子又作为抗血管生成因子，这两种因子可以抑制内皮细胞增殖并且使脉络膜毛细血管的内皮稳定。simo r等人综述，视网膜色素上皮：除了血视网膜屏障的成分之外的事物-对糖尿病视网膜病变的发病机制的暗示(the retinal pigment epithelium：something more than a constituent of the blood-retinal barrier-implications for the pathogenesis of diabetic retinopathy)《生物医学与生物技术杂志(journal of biomedicine and biotechnology)》第2010卷，文章id 190724，第15页。由rpe合成的另一种血管活性因子是血管内皮生长因子(vegf)，所述血管内皮生长因子在健康的眼睛中由rpe以低浓度分泌，在所述健康的眼睛中，所述血管内皮生长因子防止内皮细胞凋亡，对于完整的脉络膜毛细血管来说是必需的，并且还充当使内皮的穿孔稳定的渗透性因子。出处同前。在健康的眼睛中，pedf和vegf在rpe的相对侧处分泌。pedf分泌到顶侧，在所述顶侧处，pedf作用于神经元和光感受器，而大多数vegf分泌到基面，在所述基面处，vegf作用于脉络膜内皮。出处同前已经在增生性糖尿病视网膜病变和糖尿病黄斑水肿的发展中描述了vegf的过度产生，并且已经观察到pedf表达通过经培养的人rpe细胞中的葡萄糖浓度升高而导致下调，从而导致提出阻滞vegf或刺激pedf作为糖尿病视网膜病变的新治疗方法的策略。
54.本技术涉及令人惊讶的发现：半通道开放的调节对rpe和brb完整性的维持和增强具有直接和即时影响。参见以下实例1-6。已经令人惊讶地发现，连接蛋白半通道可以介导brb完整性和rpe完整性并且在其中发挥关键作用，所述发现在治疗特征全部或部分在于brb和/或rpe完整性丧失并且重要地其增加的渗透性的各种疾病、病症和病状中具有重要意义。
55.还已经发现，包含例如连接蛋白43半通道阻滞剂的半通道阻滞剂可以用于减轻zo-1内化。因此，此类半通道阻滞剂可以用于调节屏障渗透性的方法，以便预防疾病状态下的屏障功能障碍。
56.还已经发现，包含例如连接蛋白43半通道阻滞剂的半通道阻滞剂可以用于减轻iv型胶原上调。因此，半通道阻滞剂可以用于调节疾病状态下的胶原iv的上调的方法。
57.诸位发明人已经表明，高葡萄糖(hg)和细胞因子应用会使跨上皮电阻(teer)降低并且会使跨rpe细胞单层的fitc-葡聚糖染料泄漏增加。此外，结果显示，rpe屏障完整性的这种丧失不是由于细胞死亡，而是由紧密连接蛋白zo-1的内化引起的，并且导致胶原iv的上调。
58.重要的是，如实例1-6所示，发现连接蛋白43半通道阻滞防止teer减少、fitc-葡聚糖染料渗漏增加、zo-1内化和胶原iv沉积上调。据研究报告，与对照相比，人dme患者的胶原iv分泌增加。mugisho oo等人(2018)，非肥胖糖尿病小鼠的玻璃体内促炎细胞因子：糖尿病视网膜病变的体征建模(intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice：modelling signs of diabetic retinopathy)《公共科学图书馆综合(plos one)》13(8)：e0202156。
59.为了更好地理解半通道介导这些过程的机制，在存在肽5半通道阻滞剂的情况下，将atp恢复到培养基中。结果显示，atp逆转由半通道阻滞赋予的保护，使得仅具有hg和细胞因子的细胞与具有hg、细胞因子、肽5和atp的细胞之间在ldh释放和连接蛋白43缝隙连接斑块定位方面没有差异。
60.定义
61.″
小分子
″
在本文中被定义为其分子量低于约600道尔顿到900道尔顿，并且通常是有机化合物。小分子可以是半通道阻滞剂前药的活性剂。在一个实施例中，小分子低于600道尔顿。在另一个实施例中，小分子低于900道尔顿。
62.如本文所使用的，
″
治疗(treatment)
″
(及其语法变化，如
″
治疗(treat)
″
或
″
治疗(treating)
″
)是指改变正在治疗的个体、组织或细胞的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学期间进行。治疗的期望效果包含但不限于预防疾病、病症或病状发生或复发、减轻体征或症状、减少疾病的任何直接或间接病理性后果、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改进预后。在一些实施例中，本发明的化合物、方法和组合物可以用于延迟疾病、病症或病状的发展，或用于减缓疾病、病症或病状的进展。所述术语不一定意味着对受试者进行治疗直到完全恢复。因此，
″
治疗
″
包含减少、减轻或改善特定疾病、病症或病状的症状或严重性，或预防或以其它方式降低发展特定疾病、病症或病状的风险。治疗还可以包含维持或促进病状的完全或部分缓解状态。如本文所使用的
″
治疗
″
还包含在施用半通道阻滞剂之后，改进受试者的rpe完整性、brb完整性和紧密连接完整性，和/或降低受试者的胶原iv产生。
63.术语
″
治疗
″
疾病、病状或病症等，可以指预防、减缓、减少、降低、停止和/或逆转病症、疾病或病状，和/或维持或改进rpe或brb完整性、紧密连接完整性、减轻rpe或brb或紧密连接分解、zo-1内化、连接蛋白内化和/或胶原iv产生。
64.术语
″
预防
″
意指完全或部分预防或改善或控制。
65.如本文所使用的，
″
有效量
″
是指以剂量计并且持续所需的时段以实现所期望的治疗或预防结果的有效的量。例如，并且并非通过限制的方式，
″
有效量
″
可以指能够治疗涉及如本文所述的受损的brb完整性、受损的rpe完整性、受损的紧密连接完整性或增加的胶原iv产生等的疾病、病症或病状的体征和/或症状的本文所公开的化合物或组合物的量，或指能够有益地调节受损的brb完整性、受损的rpe完整性、受损的紧密连接完整性和/或增加的胶原iv产生的半通道化合物或组合物的量。
66.如本文所使用的，本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的
″
治疗有效量
″
可以根据如以下等因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发所期望的应答的能力。治疗有效量优选地也是物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果可以超过其任何毒性或有害效果的量。治疗有效量的半通道阻滞剂将有益地调节受试者的受损的brb完整性、受损的rpe完整性、受损的紧密连接完整性和/或增加的胶原iv产生。
67.如本文所使用的，
″
预防有效量
″
是指以剂量计并且持续所需的时段以实现所期望的预防结果的有效的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病、病症或病状之前或早期阶段用于受试者的，所以预防有效量将小于治疗有效量。
68.术语
″
药物调配物
″
是指呈此类形式以允许其中含有的活性成分，例如半通道阻滞剂的生物活性有效并且不含有对调配物将会施用于的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分的制剂。
69.如本文所使用的，
″
药学上可接受的载体
″
是指药物调配物中可以向受试者安全施用的成分，而不是活性成分。药学上可接受的载体包含但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂和防腐剂。
70.如本文所使用的，术语
″
受试者
″
等(包含
″
个体
″
和
″
患者
″
，所有所述术语在本文中可以互换使用)是指任何哺乳动物，所述哺乳动物包含人、家畜和农场动物，以及动物园、野生动物园、运动动物或宠物动物，如狗、马、猫、绵羊、猪、牛等。优选的哺乳动物是人，包含成人、儿童和老年人。优选的运动动物是马和狗。优选的宠物动物是狗和猫。受试者可以是例如水生公园动物，如海豚、鲸鱼、海豹或海象。在某些实施例中，受试者、个体或患者是人。
71.如本文所使用的，术语
″
半通道
″
是缝隙连接(两个半通道或连接体跨相邻细胞之间的细胞间空间连接以形成缝隙连接)的一部分，并且包含多种连接蛋白，通常是同源或异源的，即，连接蛋白的同聚或异聚六聚体，所述连接蛋白形成用于两个相邻细胞的细胞质之间的缝隙连接的孔。半通道由连接一侧上的细胞供应，其中来自相对细胞的两个半通道通常聚集在一起形成完整的细胞间半通道。然而，在一些细胞中以及在一些情况下的细胞中，半通道本身作为细胞质与胞外空间之间的导管是活性的，从而允许离子和小分子转移。
72.式i的化合物，例如西弗拉姆，和/或前述化合物中的任何化合物的类似物或前药，可以调节半通道，优选地包括任何类型的连接蛋白的半通道的功能和/或活性。因此，除非上下文另有要求，否则提及
″
半通道
″
应被广义地认为包含包括多种不同的连接蛋白中的任何一种或多种、基本上由其组成或由其组成的半通道。然而，举例来说，半通道可以包括任何连接蛋白(包含上文具体提及的连接蛋白)中的一种或多种。在一个实施例中，半通道由上述连接蛋白之一组成。在一个实施例中，半通道包括连接蛋白26、30、32、36、37、40、45和47中的一种或多种。在一个实施例中，半通道由连接蛋白37、40或43之一组成。在一个实施例中，半通道是连接蛋白43半通道。在一个实施例中，半通道是血管半通道。在一个实施例中，半通道是在血管内皮细胞中发现的连接蛋白半通道。在一个实施例中，半通道是在血管平滑肌细胞中发现的连接蛋白半通道。在一个实施例中，半通道是在脉管系统外部的内皮或上皮细胞(例如，肠内皮或上皮)中发现的连接蛋白半通道。在一个特定实施例中，半通道包括连接蛋白30、37和连接蛋白43中的一种或多种。在一个特定实施例中，半通道由连接蛋白30组成。在一个特定实施例中，半通道由连接蛋白37组成。在一个特定实施例中，半通道
由连接蛋白43组成。在一个实施例中，半通道包括不包含连接蛋白26的一种或多种连接蛋白。在一个实施例中，组合物可以包含或不包含任何连接蛋白(包含前述连接蛋白)的半通道阻滞剂。
73.半通道和半通道可以存在于任何类型的细胞中。因此，除非上下文另有要求，否则提及
″
半通道
″
或
″
半通道
″
应被认为包含提及存在于任何细胞类型中的半通道或半通道。在本发明的一个实施例中，半通道或半通道存在于器官中的细胞中，或存在于癌症或肿瘤中。在一个实施例中，半通道是血管半通道。在一个实施例中，半通道是在血管内皮细胞和/或血管平滑肌细胞中发现的连接蛋白半通道。
74.如本文所使用的，
″
半通道的调节
″
是对半通道的一个或多个功能和/或活性的调节，通常是分子在细胞之间通过半通道的流动。此类功能和活性包含例如分子从胞外空间或环境通过半通道流入细胞中，和/或分子从细胞的胞内空间或环境通过半通道流入胞外空间或环境。可用于半通道的调节的化合物可以被称为
″
半通道调节剂
″
。
75.半通道的功能的调节可以通过任何方式发生。然而，仅举例来说，调节可以通过以下中的一个或多个发生：诱导或促进半通道的闭合；防止、阻滞、抑制或减少半通道开放；触发、诱导或促进半通道和/或缝隙连接的细胞内化。如
″
阻滞
″
、
″
抑制
″
、
″
预防
″
、
″
减少
″
和
″
拮抗
″
等词语的使用可以不被视为暗示完全阻滞、抑制、预防或拮抗，但是这可以是优选的，并且应被视为包含部分阻滞、抑制、预防或拮抗，以至少降低半通道和/或半通道的功能或活性。类似地，
″
诱导
″
或
″
促进
″
不应被视为暗示半通道(或半通道组)的完全内化，并且应被视为包含部分内化，以至少降低半通道的功能或活性。
76.如本文所使用的，术语
″
半通道阻滞剂
″
是干扰分子穿过连接蛋白半通道的化合物。半通道阻滞剂可以阻滞或减少半通道开放、阻滞或减少分子通过半通道释放到胞外空间和/或阻滞或减少分子通过半通道进入胞内空间。半通道阻滞剂包含完全或部分阻滞半通道泄漏或分子接近或远离胞外空间的化合物。半通道阻滞剂还包含减少半通道的开放概率的化合物。开放概率是通道保持开放相对于保持关闭的时间百分比的量度(在goldberg gs等人，缝隙连接通道的选择性渗透性(selective permeability of gap junction channels)，《生物化学与生物物理学学报(biochimica et biophysica acta)》1662(2004)96-101中综述的)。半通道阻滞剂的实例包含肽、小分子、抗体和抗体片段。半通道阻滞剂包含半通道调节剂。半通道阻滞剂可以直接或直接干扰分子穿过连接蛋白半通道。
77.如本文所使用的，术语
″
rpe完整性的调节
″
和
″
调节brb完整性
″
是指维持或改进完整性和/或功能，或减缓rpe或brb完整性和/或功能的降低。例如，所述术语还指改进，即，降低不想要的渗透性的增加。rpe或brb完整性调节是用半通道阻滞剂实现的，并且可用于治疗特征全部或部分在于rpe或brb完整性和/或功能的病理性、异常或其它不想要或不期望的降低的疾病、病症和病状。可用于rpe或brb完整性的调节的化合物可以被称为
″
rpe或brb调节剂
″
。本发明的化合物可以在用于调节rpe或brb完整性的治疗方法中使用，其中rpe或brb完整性得到调节，例如，其中rpe或brb完整性得到改进、达到平衡和/或达到稳定，包含在治疗特征全部或部分在于rpe或brb完整性的病理性、异常或其它不需要的或不期望的缩减的疾病、病症和病状的方法中使用。rpe和brb的完整性对于防止材料穿过由细胞间粘附和细胞之间的紧密连接产生的屏障的不受调节的泄漏是必需的。
78.如本文所使用的，术语
″
紧密连接完整性的调节
″
和
″
调节紧密连接完整性
″
是指维
持或改进完整性和/或功能，或减缓紧密连接完整性和/或功能的降低。例如，所述术语还指改进，即，降低不想要的渗透性的增加。紧密连接完整性调节是用半通道阻滞剂实现的，并且可用于治疗特征全部或部分在于紧密连接完整性和/或功能的病理性、异常或其它不想要或不期望的降低的疾病、病症和病状。可用于紧密连接完整性的调节的化合物可以被称为
″
紧密连接调节剂
″
。本发明的化合物可以在用于调节紧密连接完整性的治疗方法中使用，其中紧密连接完整性得到调节，例如，其中紧密连接完整性得到改进、达到平衡和/或达到稳定，包含在治疗特征全部或部分在于紧密连接完整性的病理性、异常或其它不想要或不期望的缩减的疾病、病症和病状的方法中使用。
79.如本文所使用的，术语
″
iv型胶原的调节
″
和
″
调节iv型胶原
″
是指降低或减缓iv型胶原产生的增加。例如，所述术语还指改进，即，降低不想要的iv型胶原产生的增加。iv型胶原产生的调节是用半通道阻滞剂实现的，并且可用于治疗特征全部或部分在于iv型胶原产生的病理性、异常或其它不想要或不期望的增加的疾病、病症和病状。可用于iv型胶原产生的调节的化合物可以被称为
″
iv型胶原调节剂
″
。本发明的化合物可以在用于调节iv型胶原产生的治疗方法中使用，其中iv型胶原产生得到调节，例如，其中iv型胶原产生得到减少、减缓、达到平衡和/或达到稳定，包含用于治疗特征全部或部分在于iv型胶原产生的病理性、异常或其它不想要或不期望的增加的疾病、病症和病状的方法中使用。
80.炎性小体是包括胱天蛋白酶1、pycard、nalp以及任选地胱天蛋白酶5(也称为胱天蛋白酶11或ich-3)的多蛋白复合物。炎性小体的确切组成取决于引发炎性小体组装的激活剂。炎性小体促进炎性细胞因子白介素1β(il-1β)和白介素18(il-18)的成熟。根据本发明的半通道阻滞剂可以调节或调控炎性小体活性和炎性小体通路激活。半通道阻滞剂的靶炎性小体包含nlrp3炎性小体。
81.术语
″
肽
″
、
″
拟肽
″
和
″
模拟物
″
包含合成或基因工程化化学化合物，所述化学化合物可以具有与其模拟的蛋白质区域基本上相同的结构和功能特性。在连接蛋白半通道的情况下，这些化合物可以模拟例如，半通道连接蛋白的胞外环。
82.如本文所使用的，术语
″
肽类似物
″
是指具有类似于模板肽的性质的性质的化合物，并且可以是非肽药物。包含肽和基于肽的化合物的
″
拟肽
″
(也称为肽模拟物)还包含此类基于非肽的化合物，如肽类似物。结构上类似于治疗上有用的肽的拟肽可以用于产生等效或增强的治疗或预防效果。在一些方面，肽和拟肽可以是经修饰的或未经修饰的。通常，拟肽是与范例多肽(即，具有生物学或药理学功能或活性的多肽)(例如，相同或相似)的结构或功能模拟物，但是也可以具有任选地被选自例如由以下组成的组的键替代的一个或多个肽键：-ch2nh-、-ch2s-、-ch
2-ch
2-、-ch＝ch-(顺式和反式)、-coch
2-、-ch(oh)ch
2-和-ch2so-。模拟物可以完全由天然氨基酸、合成化学化合物、氨基酸的非天然类似物构成，或是部分天然肽氨基酸和氨基酸的部分非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可以包括任何量的天然氨基酸保守取代，只要这些取代也基本上不改变模拟活性。在连接蛋白半通道的情况下，这些模拟物可以模拟例如涉及连接体-连接体对接和细胞-细胞通道形成的半通道胞外环。拟肽涵盖本文所述的拟肽，以及本领域已知的拟肽，无论是现在已知的还是后来开发的。肽和拟肽半通道阻滞剂还可以被修饰以增加稳定性、改进生物利用度和/或增加细胞膜渗透性。
83.本专利描述了用于调节brb完整性和功能、rpe完整性和功能、紧密连接完整性和
功能以及iv型胶原产生的新方法。brb完整性、rpe完整性、紧密连接完整性和iv型胶原产生是异常的、失调的或无序的，并且可以通过本发明的方法在多种疾病、病症或病状中得到改进，所述多种疾病、病症或病状中的一些疾病、病症或病状的特征在于brb渗透性、rpe渗透性、紧密连接破坏和/或iv型胶原产生的不想要或病理水平。
84.包含半通道阻滞剂的半通道开放的阻滞剂包含小肽和小分子阻滞剂。
85.本发明尤其提供了用于通过施用半通道阻滞剂，如派普泰刚和/或其类似物、式i的化合物，例如西弗拉姆和/或前述化合物中的任何化合物的类似物或前药调节brb完整性、rpe完整性、紧密连接完整性和iv型胶原产生的方法，所述方法用于治疗疾病、病症或病状，其中rpe调节、brb调节、紧密连接调节和/或iv型胶原调节可能是有益的。
86.在一些实施例中，本发明的特征在于式i的化合物，例如西弗拉姆和/或前述化合物中的任何化合物的类似物或前药用于直接且立即阻滞cx43半通道并且使rpe完整性、brb完整性、紧密连接完整性得到浓度和时间依赖性调节和/或使iv型胶原产生得到调节的用途。
87.连接蛋白
88.在各个实施例中，被调节的半通道是任何连接蛋白半通道。在某些实施例中，被调节的半通道是半通道、连接蛋白26(cx26)半通道、连接蛋白30(cx30)半通道、连接蛋白32(cx32)半通道、连接蛋白36(cx36)半通道、连接蛋白37(cx37)半通道、连接蛋白40(cx40)半通道、连接蛋白40.1(cx40.1)半通道、连接蛋白43(cx43)半通道、连接蛋白45(cx45)半通道、连接蛋白46(cx46)半通道、连接蛋白47(cx47)半通道。在一个实施例中，被调节的半通道包括cx26、cx30、cx32、cx36、cx37、cx40、cx43、cx45和/或cx47蛋白中的一种或多种。在一个特定实施例中，被调节的半通道和/或半通道是cx37和/或cx40和/或cx43半通道。在一个特定实施例中，被调节的半通道和/或半通道是cx30和/或cx43和/或cx45半通道。在一些实施例中，被调节的半通道可以包含或不包含前述连接蛋白中的任何连接蛋白。在一些方面，半通道阻滞剂是cx43半通道、cx40半通道和/或cx45半通道的阻滞剂。在某些优选的实施例中，半通道阻滞剂是连接蛋白43阻滞剂。用于本文中所提出的任何用途的本发明的药物组合物还可以包括可以抑制或阻滞cx26、cx30、cx31.1、cx36、cx37、cx40、cx45、cx50或cx57半通道或任何其它连接蛋白半通道(包含同源和异源半通道)的半通道阻滞剂。在一些实施例中，被调节的半通道可以包含或不包含前述连接蛋白半通道中的任何连接蛋白半通道，或可以是异聚半通道。
89.在一个实施例中，用于本发明的治疗的任何施用、共同施用、组合物、试剂盒或方法中的半通道阻滞剂是cx43半通道阻滞剂。其它实施例包含cx45半通道阻滞剂、cx30半通道阻滞剂、cx37半通道阻滞剂、cx40半通道阻滞剂，以及cx26、cx31.1、cx36、cx50和/或cx57半通道或包括以上或本文中提到的任何其它连接蛋白、基本上由其组成或由其组成的半通道的阻滞剂。一些实施例可以包含或不包含前述连接蛋白或半通道中的任何连接蛋白或半通道，或本专利中提到的其它连接蛋白或半通道。
90.半通道阻滞剂
91.小分子半通道阻滞剂
92.半通道阻滞剂的实例包含小分子半通道阻滞剂(例如，西弗拉姆(托那博沙)。在一些实施例中，半通道阻滞剂是除西弗拉姆以外的小分子，例如，式i中所描述的半通道阻滞
剂。各个优选的实施例包含使用阻滞或改善或以其它方式拮抗或抑制半通道开放的小分子，以治疗本文所述或所提及的疾病、病症和病状。在各个实施例中，阻滞或改善或抑制半通道开放的小分子是西弗拉姆的前药或其类似物。
93.在一些实施例中，本发明的特征在于小分子半通道阻滞剂，包含例如式i的化合物，如西弗拉姆，和/或前述化合物中的任何化合物的类似物或前药，用于阻滞例如cx43半通道并且使rpe完整性和功能、brb完整性和功能、紧密连接完整性和功能得到浓度和时间依赖性调节和/或使iv型胶原产生得到调节的用途。
94.举例来说，半通道阻滞剂西弗拉姆可以以iupac名称n-[(3s，4s)-6-乙酰基-3-羟基-2，2-二甲基-3，4-二氢色原烯-4-基]-3-氯-4-氟苯甲酰胺或(3s-顺式)-n-(6-乙酰基-3，4-二氢-3-羟基-2，2-(二甲基-d6)-2h-1-苯并吡喃-4-基)-3-氯-4-氟苯甲酰胺而著称。
[0095]
在一个实施例中，西弗拉姆和/或其类似物或前药选自具有式i的化合物的组：
[0096][0097]
其中，
[0098]
y是c-r1；
[0099]
r1是乙酰基；
[0100]
r2是氢、c
3-8
环烷基、任选地被氧中断或被羟基取代的c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基或经取代的氨基羰基、c
1-6
烷基羰基、c
1-6
烷氧基羰基、c
1-6
烷基羰基氧基、c
1-6
烷氧基、硝基、氰基、卤代、三氟甲基或cf3s；或基团cf
3-a-，其中a是-cf
2-、-co-、-ch
2-、ch(oh)、so2、so、ch
2-o-或conh；或基团cf2h-a
′‑
，其中a
′
是氧、硫、so、so2、cf2或cfh；三氟甲氧基、c
1-6
烷基亚磺酰基、全氟c
2-6
烷基磺酰基、c
1-6
烷基磺酰基、c
1-6
烷氧基亚磺酰基、c
1-6
烷氧基磺酰基、芳基、杂芳基、芳基羰基、杂芳基羰基、膦酰基、芳基羰基氧基、杂芳基羰基氧基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基、芳基磺酰基或杂芳基磺酰基，其中任何芳香族部分任选地被取代、c
1-6
烷基羰基氨基、c
1-6
烷氧基羰基氨基、c
1-6
烷基-硫代羰基、c
1-6
烷氧基-硫代羰基、c
1-6
烷基-硫代羰基氧基、1-巯基c
2-7
烷基、甲酰基或氨基亚磺酰基、氨基磺酰基或氨基羰基，其中任何氨基部分任选地被一个或两个c
1-6
烷基或c
1-6
烷基亚磺酰基氨基、c
1-6
烷基磺酰基氨基、c
1-6
烷氧基亚磺酰基氨基或c
1-6
烷氧基磺酰基氨基取代或被c
1-6
烷基羰基、硝基或氰基或-c(c
1-6
烷基)noh或-c(c
1-6
烷基)nnh2末端取代的乙烯基；或任选地被一个或两个c
1-6
烷基或c
2-7
烷酰基取代的氨基；r3和r4之一是氢或c
1-4
烷基，并且另一个是c
1-4
烷基，cf3或ch2xa是氟、氯、溴、碘、c
1-4
烷氧基、羟基、c
1-4
烷基羰基氧基、-s-c
1-4
烷基、硝基、任选地被一个或两个c
1-4
烷基取代的氨基、氰基或c
1-4
烷氧基羰基；或r3和r4一起是任选地被c
1-4
烷基取代的c
2-5
聚亚甲基；
[0101]
r5是c
1-6
烷基羰基氧基、苯甲酰氧基、ono2、苄氧基、苯氧基或c
1-6
烷氧基，并且r6和
r9是氢，或r5是羟基并且r6是氢或c
1-2
烷基，并且r9是氢；
[0102]
r7是杂芳基或苯基，这两者任选地独立地被选自以下的基团或原子取代一次或多次：氯、氟、溴、碘、硝基、任选地被c
1-4
烷基取代一次或两次的氨基、氰基、叠氮基、c
1-4
烷氧基、三氟甲氧基和三氟甲基；
[0103]
r8是氢、c
1-6
烷基、or
11
或nhcor
10
，其中r
11
是氢、c
1-6
烷基、甲酰基、c
1-6
烷酰基、芳酰基或芳基-c
1-6
烷基，并且r
10
是氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、单或二c
1-6
烷基氨基、氨基、氨基-c1-6烷基、羟基-c
1-6
烷基、卤代-c
1-6
烷基、c
1-6
酰氧基-c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基羰基-c
1-6-烷基、芳基或杂芳基；r
8-n-co-r7基团对于r5基团是顺式的；并且x是氧或nr
12
，其中r
12
是氢或c
1-6
烷基。
[0104]
对于以上列出的任何马库什基团(markush group)，所述基团可以包含或不包含针对所述基团列出的任何物种。供本发明的方法中使用的半通道阻滞剂可以包含或不包含这些化合物中的任何化合物。
[0105]
在另一个实施例中，式i的类似物是化合物卡拉博沙(carabersat)(n-[(3r，4s)-6-乙酰基-3-羟基-2，2-二甲基-3，4-二氢色原烯-4-基]-4-氟苯甲酰胺)或反式(+)-6-乙酰基-4-(s)-(4-氟苯甲酰基氨基)-3，4-二氢-2，2-二甲基-2h-1-苯并[b]吡喃-3r-醇，半水合物。
[0106]
在某些实施例中，西弗拉姆和/或其类似物是呈游离碱或药学上可接受的盐的形式。在其它实施例中，可以使用西弗拉姆和/或其类似物的一种或多种多晶型物、一种或多种异构体和/或一种或多种溶剂化物。
[0107]
在另一个实施例中，半通道调节化合物选自具有式ii的化合物的基团：
[0108][0109]
其中
[0110]
q是o或式＝nhor
43
的肟，其中r
43
[0111]
(i)选自h、c
1-4
氟烷基或任选地经取代的c
1-4
烷基，或
[0112]
(ii)是-a
300-r
300
，其中
[0113]a300
是直接键、-c(o)o*、-c(r3)(r4)o*-、-c(o)o-c(r3)(r4)o*-或-c(r3)(r4)oc(o)o*-，其中用*标记的原子与r
300
直接连接，
[0114]
r3和r4独立地选自h、氟、c
1-4
烷基或c
1-4
氟烷基，或
[0115]
r3和r4与其所连接的原子一起形成环丙基，
[0116]r300
选自基团[1]、[2]、[2a]、[3]、[4]、[5]或[6]；
[0117]
r2是h或b-r
21
，
[0118]
a是直接键、-c(o)o*、-c(r3)(r4)o*、-c(o)o-c(r3)(r4)o*-或-c(r3)(r4)oc(o)o*，其中用*标记的原子与r1直接连接，r3和r4独立地选自h、氟、c
1-4
烷基或c
1-4
氟烷基，或r3和r4与其所连接的原子一起形成环丙基，
[0119]
r1选自基团[1]、[2]、[2a]、[3]、[4]、[5]和[6]，其中用**标记的原子与a直接连接：
[0120][0121]
r5和r6各自独立地选自h、c
1-4
烷基、c
1-4
氟烷基和
[0122]
苄基；
[0123]
r7独立地选自h、c
1-4
烷基和c
1-4
氟烷基；
[0124]
r8选自：
[0125]
(i)h、c
1-4
烷基或c
1-4
氟烷基，
[0126]
(ii)天然或非天然α-氨基酸的侧链或如本文所述的肽，以及
[0127]
(iii)生物素或与生物素化学连接；
[0128]
r9选自h、-n(r
11
)(r
12
)、-n
+
(r
11
)(r
12
)(r
13
)x-和-n(r
11
)c(o)r
14
[0129]
其中r
11
、r
12
和r
13
独立地选自h、c
1-4
烷基和c
1-4
氟烷基，
[0130]r14
是h、c
1-4
烷基或c
1-4
氟烷基，
[0131]r15
选自c
1-4
烷基和c
1-4
氟烷基，
[0132]
x-为药学上可接受的阴离子，
[0133]
其中，
[0134]
b是直接键、-c(o)o*、-c(r
23
)(r
24
)o*、c(o)oc(r
23
)(r
24
)*或
[0135]
c(r
23
)(r
24
)oc(o)o*，其中用*标记的原子与r
21
直接连接，
[0136]r23
和r
24
独立地选自h、氟、c
1-4
烷基和c
1-4
氟烷基，
[0137]r21
选自基团[21]、[22]、[22a]、[23]、[24]、[25]和[26]，其中用**标记的原子与b直接连接：
no：4)、
″
肽11
″
vdcflsrptakt(seq id no：5)、
″
肽12
″
vdcflsrpteat(seq id no：6)、
″
肽5
″
vdcflsrptekt(seq id no：1)、
″
mod1
″
cflsrptekt(seq id no：7)、
″
mod2
″
lsrptekt(seq id no：8)。在一些实施例中，羧基端可以是经修饰的。在一些方面，羧基端修饰可以包括可以任选地进一步与氢或其它部分连接的正烷基链。在一些实施例中，半通道阻滞剂肽可以包含或不包含上文列出的或本文所公开的肽中的任何肽。
[0145]
一方面，本发明涉及药物组合物单独或在试剂盒、包装或其它制造物品内在用于治疗本文所述的疾病、病症或病状的方法中的用途，以及在治疗特征在于例如降低的或无序的rpe完整性、brb完整性、紧密连接完整性和/或增加的或无序的iv型胶原的产生的疾病、病症或病状的方法中的用途。本文中的方法提供了用半通道阻滞剂以足以调节如本文所述的rpe完整性、brb完整性、紧密连接完整性和/或调节iv型胶原产生等的量治疗受试者。在一些优选的方面，半通道阻滞剂是连接蛋白43半通道阻滞剂。在其它方面，半通道阻滞剂是连接蛋白36半通道阻滞剂。在仍其它方面，半通道阻滞剂是连接蛋白37半通道阻滞剂。在其它方面，半通道阻滞剂是连接蛋白45半通道阻滞剂。如上所述，其它连接蛋白半通道的阻滞剂也在本发明范围内。
[0146]
在一些实施例中，
″
前体部分(promoiety)
″
是指充当保护基团的物种，所述保护基团掩盖活性剂内的官能团，由此将所述活性剂转化成前药。通常，前体部分将通过在体内通过酶或非酶方式裂解的键连接到药物上，由此将前药转化成其活性形式。在一些实施例中，前体部分也可以是活性剂。在一些实施例中，前体部分可以与半通道阻滞剂结合。在一些实施例中，前体部分可以例如与肽或拟肽或小分子半通道阻滞剂中的任何肽或拟肽或小分子半通道阻滞剂结合。在一些实施例中，前体部分可以与式i的化合物结合。在一些实施例中，前药可以是另一种半通道化合物，例如，green等人，美国专利申请公开第20160177298号；savory等人，美国专利申请公开第20160318891号；或savory等人，美国专利申请公开第20160318892号中描述的化合物。
[0147]
在一些方面，半通道阻滞剂包含例如抗体或抗体片段、纳米抗体、肽或拟肽、重组融合蛋白、适体、小分子或与连接蛋白半通道结合的单链可变片段(scfv)以及本文所述的其它物质。在一个目前优选的实施例中，连接蛋白半通道是cx43半通道。
[0148]
在其它实施例中，半通道阻滞剂是连接蛋白43肽或拟肽，有时称为半通道阻滞肽或拟肽，并且包含经修饰的或未经修饰的cx肽或拟肽，所述经修饰的或未经修饰的cx肽或拟肽包括连接蛋白胞外结构域、跨膜区和连接蛋白羧基端肽、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，治疗上有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽包括连接蛋白43或连接蛋白45的胞外或跨膜结构域的一部分。连接蛋白43的蛋白质序列如下所示。
[0149]
连接蛋白43(seq id no：9)
[0150]
[0151][0152]
表1示出了连接蛋白43和连接蛋白45的胞外环。在一些实施例中，治疗上有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽包括如连接蛋白43或连接蛋白45，优选地连接蛋白43等连接蛋白(胞外环2)的e2胞外结构域的一部分。在一些实施例中，治疗上有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽包括如连接蛋白43或连接蛋白45，优选地连接蛋白43等连接蛋白的c末端结构域的一部分。如果肽或拟肽阻滞剂包括连接蛋白的胞内结构域的一部分，则在一些实施例中，肽可以与细胞内化转运蛋白缀合，并且在一些情况下，可以阻滞与连接蛋白43结合的闭锁小带(zo-1)。
[0153]
表1：连接蛋白43和连接蛋白45的胞外环
[0154]
e1
[0155]
hucxn43 esawgdeqsafrcntqqpgcenvcydksfpishvr(seq id no：10)
[0156]
hucx45 gesiyydeqskfvcnteqpgcenvcydafaplshvr(seq id no：11)
[0157]
e2
[0158]
hucxn43 lliqwyiygfslsavytckrdpcphqvdcflsrptekt(seq id no：12)
[0159]
hucx45 ligqyflygfqvhpfyvcsrlpchpkidcfisrptekt(seq id no：13)
[0160]
不同的连接蛋白同种型的e2结构域的序列以与表2中以粗体显示的肽seq id no：14和肽seq id no：15同源的氨基酸显示。应注意，肽seq id no：15的最后4个氨基酸是第四膜结构域的一部分。
[0161]
表2提供了可以用于制备本文所述的肽半通道阻滞剂的连接蛋白家族成员的胞外结构域。在某些非限制性实施例中，表2中提供的肽及其片段用作肽半通道阻滞剂。在其它非限制性实施例中，包括此表中的肽的约8个到约15个或约11个到约13个氨基连续氨基酸酸、基本上由其组成或由其组成的半通道阻滞剂肽是本发明的肽半通道阻滞剂。在其它实施例中，对肽或其片段进行保守氨基酸改变。
[0162]
表2：胞外结构域
[0163]
肽 vdcflsrptekt(seq id no：1)
[0164]
肽 srptektifii(seq id no：16)
[0165]
hucxn43 lliqwyiygfslsavytckrdpcphqvdcflsrptektifii(seq id no：17)
[0166]
hucx45 ligqyflygfqvhpfyvcsrlpchpkidcfisrptektifll(seq id no：18)
[0167]
其它肽半通道阻滞剂来自连接蛋白43(氨基酸119-144)l2肽的细胞质环和连接蛋白43的l2肽的子部分。在一些实施例中，这些肽可以包含或不包含例如缝隙19，kqieikkfk(seq id no：19)的九个氨基酸序列；天然缝隙19序列，dgvnvemhlkqieikkfkygieehgk(seq id no：20)；缝隙19的his144
→
glu l2衍生物，如由shibayama(shibayama，j.等人，《生物物理学杂志(biophys.j.)》91，405404063，2006)报告的，dgvnvemhlkqieikkfkygieeqgk(seq id no：21)；tat-缝隙19序列，ygrkkrrqrrrkqieikkfk(seq id no：22)；sh3结合结构域，cssptaplspmsppgyk(seq id no：23)或其子部分ptaplspmspp(seq id no：24)；ct9或ct10肽的c末端序列，具有或不具有增加细胞渗透的tat前导序列，rprddei(seq id no：25)、srprddlei(seq id no：26)、ygrkkrrqrrrsrprddei(seq id no：27)或ygrkkrrqrrrrprddei(seq id no：28)。可以包含或不包含在供本文所公开的方法、试剂盒或制品的组合物中使用的其它拟肽序列是由dhein(dhein，s.，《naunyn-schmiedeberg的药理学档案(naunyn-schmiedeberg
′
s arch.pharm.)》，350：174-184，1994)报告的序列；aap10肽、h2n-gly-ala-gly-4hyp-pro tyr-conh2(seq id no：29)和zp123肽(罗普肽(rotigapeptide))、ac-d-tyr-pro-d-4hyp-gly-d-ala-gly-nh2(seq id no：310)，(dhein，s.等人《细胞通讯与粘附(cell commun.adhes.)》10，371-378，2013)。罗普肽包含与天然l-形式的肽相比具有增强的效力的d-形式的肽。
[0168]
在下表3中提供了在本公开的某些实施例中可以包含或不包含的示例性连接蛋白43(cx43)或cx26、cx30、cx30.3、cx31、cx31.1、cx32、cx36、cx37、cx40.1、cx43、cx46、cx46.6或cx40肽阻滞剂(e2和t2是指肽在例如第二胞外结构域或第二跨膜结构域中的位置)。
[0169]
表3
[0170]
[0171]
[0172]
[0173][0174]
在一些实施例中，连接蛋白43阻滞剂可以包括例如肽或拟肽，所述肽或拟肽包括例如seq id no：2(srptekt)、基本上由其组成或由其组成。肽或拟肽还可以包括例如seq id no：1(vdcflsrptekt)。肽可以含有一个或多个经修饰的氨基酸、氨基酸类似物，或可以以其它方式被修饰以改进生物利用度或增加穿过细胞膜的渗透。例如，seq id no：1可以被修饰以获得seq id no：20-25和27。在一些方面，包括例如seq id no：2(srptekt)或seq id no：2(vdcflsrptekt)、基本上由其组成或由其组成的肽或拟肽包括7到40个氨基酸或氨基酸类似物，并且不包括c末端肽。在一些实施例中，肽也可以用作前体部分。
[0175]
在一些方面，连接蛋白45阻滞剂可以是肽或拟肽，所述肽或拟肽包括拮抗或抑制或阻滞连接蛋白-连接蛋白相互作用的连接蛋白45蛋白的部分、基本上由其组成或由其组成。表4中提供了连接蛋白45肽和拟肽阻滞剂的示例性肽序列。
[0176]
表4：样品连接蛋白45阻滞剂肽或拟肽的序列
[0177]
[0178][0179]
在一些实施例中，连接蛋白45阻滞剂可以包括例如肽或拟肽，所述肽或拟肽包括连接蛋白45的e2或c末端结构域的一部分、基本上由其组成或由其组成，例如包括seq id no：150(srptekt)、基本上由其组成或由其组成。肽或拟肽还可以包括例如seq id no：149(dcfisrptekt)。在一些实施例中，肽的长度可以仅为3个氨基酸，包含srl、pch、lcp、chp、iyy、skf、qpc、vcy、apl、hvr或更长。
[0180]
在一些方面，连接蛋白40半通道阻滞剂可以是肽或拟肽，所述肽或拟肽包括连接蛋白40蛋白的部分、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，连接蛋白43阻滞剂可以包括例如通过连接子在n端处与两个十二烷基缀合的seq id no：2(srptekt)、seq id no：1(vdcflsrptekt)或seq id no：1、基本上由其组成或由其组成。肽可以含有一个或多个经修饰的氨基酸、氨基酸类似物，或可以以其它方式被修饰，例如与细胞内化转运蛋白缀合或结合。
[0181]
在另一个非限制性但优选的实施例中，半通道阻滞剂包括肽，所述肽包括对应于如cx43、或cx45、或cx26、cx37或cx40等连接蛋白的跨膜区的一部分的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在特定的非限制性实施例中，抗连接蛋白化合物是具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括具有包括连接蛋白的约3个到约30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽，例如，连接蛋白43或45蛋白序列，连接蛋白序列的约5个到约20个连续氨基酸、具有包
括连接蛋白序列的约8个到约15个连续氨基酸的氨基酸序列的肽或具有包括连接蛋白序列的约11个、12个或13个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。其它非限制性实施例包含抗连接蛋白化合物，所述抗连接蛋白化合物是具有包括连接蛋白序列的至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个或30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。在一些方面，半通道阻滞剂可以包含或不包含任何前述物质中的任何物质。
[0182]
在其它抗连接蛋白化合物中，模拟肽是基于对应于连接蛋白43蛋白序列的位置37-76和178-208处的氨基酸的连接蛋白43的胞外结构域。因此，本文所述的某些肽具有对应于连接蛋白43蛋白序列的位置37-76和178-208处的区域的氨基酸序列。肽不需要具有与连接蛋白43蛋白序列的那些部分相同的氨基酸序列，并且可以进行保守氨基酸改变，使得肽在本文所述且以其它方式本领域已知的测定中保留结合活性或功能活性。在其它实施例中，模拟肽是基于连接蛋白内除胞外结构域以外的肽靶区域(例如，连接蛋白43蛋白序列的不对应于位置37-76和178-208的部分)。
[0183]
在非限制性但优选的实施例中，半通道阻滞剂包括肽、基本上由其组成或由其组成，所述肽包括对应于连接蛋白45的跨膜区或连接蛋白45的c末端区域的一部分的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在特定的非限制性实施例中，例如，抗连接蛋白化合物是具有包括已知连接蛋白45序列的约3个到约30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽、具有包括已知连接蛋白45序列的约5个到约20个连续氨基酸的氨基酸序列的肽、具有包括已知连接蛋白45序列的约8个到约15个连续氨基酸的氨基酸序列的肽或具有包括已知连接蛋白45序列的约11个、12个或13个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。其它非限制性实施例包含抗连接蛋白化合物，所述抗连接蛋白化合物是具有包括已知连接蛋白45序列的至少约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个或30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。在本文所提供的某些抗连接蛋白化合物中，模拟肽是基于对应于已知连接蛋白45序列的位置46-75和199-228处的氨基酸的连接蛋白45的胞外结构域。因此，本文所述的某些肽具有对应于已知连接蛋白45序列的位置46-75和199-228处的区域的氨基酸序列。肽不需要具有与已知连接蛋白45序列的那些部分相同的氨基酸序列。可以进行保守氨基酸改变，使得肽在本文所述且以其它方式本领域已知的测定中保留结合活性或功能活性。在其它实施例中，模拟肽是基于连接蛋白内除胞外结构域以外的肽靶区域(例如，已知连接蛋白45序列的不对应于位置46-75和199-228的部分)。公开各种连接蛋白序列的wo2006/134494通过引用整体并入本文。在一些方面，半通道阻滞剂可以包含或不包含任何前述物质中的任何物质。
[0184]
其它连接蛋白半通道阻滞剂
[0185]
包含肽、拟肽、抗体、抗体片段等在内的半通道阻滞剂，例如连接蛋白36、37、43或45阻滞剂也是合适的半通道阻滞剂。示例性半通道阻滞剂可以包含但不限于多肽(例如，抗体、其结合片段和合成构建体)和其它缝隙连接阻滞剂和缝隙连接蛋白磷酸化剂。在一些方面，半通道阻滞剂是cx26、cx30、cx31.1、cx36、cx37、cx40、cx43、cx50、cx57的阻滞剂。半通道阻滞剂，例如连接蛋白36、37、43或45阻滞剂包含，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(包含，例如，fab、f(ab
′
)2和fv片段)；单链抗体；单链fv；和单链结合分子，如包括例如结合结构域、铰链、ch2和ch3结构域、基本上由其组成或由其组成的单链结合分子；重组抗体和抗体片段，所述重组抗体和抗体片段能够与可以与特定抗体或其它结合分子接触的抗原
决定簇(即，分子的所述部分，通常被称为表位)结合。包含抗体、抗体片段等在内的这些结合蛋白可以是嵌合的或人源化的或以其它方式使其在待施用于的受试者体内具有较低免疫原性，并且可以是合成的、重组产生的或在表达文库中产生的。设想了本领域已知的或后来发现的任何结合分子，如本文所提及的和/或本领域更详细描述的结合分子。例如，结合蛋白不仅包含抗体等，而且还包含配体、受体、拟肽或与靶标(例如，连接蛋白、半通道或相关分子)结合的其它结合片段或分子(例如，通过噬菌体展示产生)。
[0186]
结合分子通常将具有所期望的特异性，包含但不限于结合特异性和所期望的亲和力。亲和力的ka例如可以大于或等于约104m-1、大于或等于约106m-1、大于或等于约107m-1、大于或等于约108m-1。甚至大于约108m-1的亲和力是合适的，如等于或大于约109m-1、约1010m-1、约10
11
m-1和约10
12
m-1的亲和力。使用常规技术可以容易地确定根据本发明的结合蛋白的亲和力，例如由scatchard等人，(1949)《纽约科学院年鉴(ann.n.y.acad.sci.)》51：660描述的技术。
[0187]
用于关闭缝隙连接(例如，磷酸化连接蛋白43酪氨酸和/或丝氨酸残基)的示例性化合物已经在美国专利第7,153,822号和美国专利第7,250,397号中进行报告。green等人，wo 2006134494中报告了示例性肽和拟肽。还参见wo 2006069181和wo 2003032964。用于关闭缝隙连接的其它药剂的实例包含抗连接蛋白药剂，例如抗连接蛋白多核苷酸(例如，连接蛋白抑制剂，如α-1连接蛋白寡脱氧核苷酸)、抗连接蛋白肽(例如，抗体和抗体结合片段)和拟肽(例如，α-1抗连接蛋白肽或拟肽)、缝隙连接关闭或阻滞化合物、半通道关闭或阻滞化合物和连接蛋白羧基末端多肽，例如，据报告与zo-1或zo-1结合位点结合的多肽。
[0188]
可用于本发明的其它半通道阻滞剂还包含阻滞连接蛋白半通道但维持连接蛋白缝隙连接功能的化合物，或可以与其组合。例如，线性肽rrnyrrny、环肽cyrp-71和拟肽分子zp2519被证明靶向cx43羧基末端结构域并且在低ph条件下防止基于cx43的缝隙连接闭合(verma v等人，防止酸化诱导的心脏缝隙连接闭合的第一拟肽分子的设计和表征(design and characterization of the first peptidomimetic molecule that prevents acidification-induced closure of cardiac gap junctions)《心律(heart rhythm)》7：1491-1498(2010)；verma v等人，基于cx43结合肽的
″
rxp
″
系列的连接蛋白43的新颖的药效团(novel pharmacophores of connexin43 based on the
″
rxp
″
series of cx43-binding peptides)《循环研究(circ.res.)》105：176-184(2009))。这些物质具有用于防止缝隙连接闭合的潜在转化价值。此外，这些分子是潜在的半通道阻段剂，并且可以因此具有旨在防止缝隙连接闭合以及抑制半通道开放的双层作用。
[0189]
抗连接蛋白药剂包含具有包括连接蛋白，如连接蛋白43(seq id no：19)的约5到20个连续氨基酸的氨基酸序列的肽、具有包括连接蛋白43的约8到15个连续氨基酸的氨基酸序列的肽或具有包括连接蛋白43的约11到13个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。其它抗连接蛋白药剂包含具有包括连接蛋白43的至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。其它抗连接蛋白43阻滞剂包括连接蛋白43的胞外结构域，例如，肽或拟肽，所述肽或拟肽包括srptekt或vdcflsrptekt、基本上由其组成或由其组成。其它抗连接蛋白43阻滞剂包括连接蛋白43的c端区域，参见wo2006/069181，或其修饰版本。
[0190]
肽化学修饰
[0191]
在某些实施例中，本发明的连接蛋白43阻滞剂肽可以在氨基或羧基端处与细胞内化转运蛋白连接。与本发明的连接蛋白43阻滞剂肽连接的细胞内化转运蛋白可以是本领域已知的或新发现的任何内化序列，或其保守变体。细胞内化转运蛋白和序列的非限制性实例包含触角足突变序列、tat、hiv-tat、穿膜肽、antp-3a(antp突变体)、布福林ii、转运素、map(模型两亲性肽)、k-fgf、ku70、朊蛋白、pvec、pep-1、synb1、pep-7、hn-1、bgsc(双-胍基-亚精胺-胆固醇和bgtc(双胍基-tren-胆固醇)。
[0192]
下表5中提供了示例性细胞内化肽的其它序列。
[0193]
表5
[0194][0195]
在本发明的一个实施例中，连接蛋白43阻滞剂肽的氨基酸序列可以选自由本文列出的任何肽seq id或其保守变体组成的组。在本发明的另外的实施例中，连接蛋白43阻滞剂肽可以包括seq id no：30-90的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在本发明的另一个实施例中，连接蛋白43阻滞剂肽进一步包括细胞内化转运蛋白。在另外的实施例中，连接蛋白43半通道阻滞剂肽可以在氨基端处与细胞内化转运蛋白连接。
[0196]
当本文提及特定蛋白质时，可以考虑衍生物、变体和片段。蛋白质衍生物和变体是本领域的技术人员所充分理解，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰可以落入以下三类中的一种或多种：插入变体、取代变体或缺失变体。插入包含氨基和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入可以是比氨基或羧基端融合的插入更小的插入，例如，约一到四个残基。缺失的特征在于从蛋白质序列中去除一个或多个氨基酸残基。可以组合取代、缺失、插入或其任何组合以得到最终构建体。取代变体是至少一个
残基已经被去除并且在其位置中插入不同残基的变体。此类取代被称为保守取代。本领域的技术人员已知，一个氨基酸残基被在生物学上和/或化学上类似的另一个氨基酸残基替代是保守取代。保守取代可以用一个疏水残基替代另一个疏水残基或用一个极性残基替代另一个极性残基。每个明确公开的序列的保守取代的变化都包含在本文所提供的肽内。保守取代通常对所得多肽的生物活性几乎没有或没有影响。保守取代可以是肽中的基本上不影响肽的生物功能的氨基酸取代。肽可以包含一个或多个氨基酸取代、2-10个保守取代、2-5个保守取代或4-9个保守取代。
[0197]
化学结构修饰：
[0198]
在某些实施例中，半通道阻滞剂肽或拟肽的化学结构可以被合成修饰以增加活性或半衰期。例如，在一些实施例中，可以通过连接子部分将肽与疏水化合物缀合来修饰肽或拟肽。疏水化合物可以是例如一个或多个正烷基，所述正烷基可以是例如c6-c14烷基。在一些实施例中，肽可以在n端处与如在chen，ys等人，《药学科学杂志(j.pharm.sci.)》，102：2322-2331(2013)中所描述的一个或两个十二烷基(c12)基团缀合，所述文献通过引用并入本文。在一个实施例中，肽序列cflsrptekt或vd cflsrptekt可以与两个十二烷基缀合，以产生可以调节连接蛋白43，
″
c12-c12-cxn43 mp
″
(seq id no：171)的经修饰的肽。所得结构如下所示。
[0199][0200]
结构：c12-c12-cxn43 mp(seq id no：171)的结构。r1和r2可以是氢或烷基。在一些方面，r1＝r2＝正十二烷基链。
[0201]
化学递送修饰：
[0202]
可用于本发明的半通道阻滞剂还可以调配成微颗粒(微球，mp)或纳米颗粒(纳米球，np)调配物或两者。微粒药物递送系统包含纳米颗粒(1到1,000nm)和微颗粒(1到1,000μm)，其进一步被分类为纳米球和微球以及纳米胶囊和微胶囊。在纳米胶囊和微胶囊中，药物颗粒或液滴被包埋在聚合物膜中。微粒系统具有通过注射递送的优点，并且其大小和聚合物组成显著地影响其体为生物学行为。微球在玻璃体内停留的时段比纳米球长得多，因此微颗粒在注射之后起到类似储器的作用。纳米颗粒快速扩散并且在组织和细胞中内化。
[0203]
评估半通道阻滞剂活性：可以使用各种的方法来评估半通道阻滞剂的活性或功效。在本发明的一个方面，举例来说，使用如本文所述的用于调节rpe完整性、brb完整性、紧密连接完整性和/或调节iv型胶原产生的测定来评估或监测受试者的半通道阻滞剂治疗的效果。
[0204]
还可以使用某些生物学测定来评估半通道阻滞剂的活性。可以使用以下实例中所描述的方法或用于确定化合物穿过连接蛋白半通道的其它本领域已知或等效的方法来鉴定、评估或筛选已知或候选半通道阻滞剂对分子运动性的影响。各种方法都是本领域已知的，所述方法包含染料转移实验，例如，用可检测标志物标记的分子的转移，以及小荧光渗
透性示踪剂的跨膜通过，所述染料转移实验已广泛用于研究半通道的功能状态。参见例如，schlaper，ka等人当前所使用的用于半通道的鉴定和表征的方法(currently used methods for identification and characterization of hemichannels)《细胞通讯与粘附》15：207-218(2008)。还可以使用体内方法。参见例如，danesh-meyer，hv等人，连接蛋白43模拟肽在视网膜缺血后减少血管渗漏和视网膜神经节细胞死亡《大脑》，135：506-520(2012)；davidson，jo等人(2012)连接蛋白半通道阻滞改进了胎儿缺血模型中的结果(connexin hemichannel blockade improves outcomes in a model of fetal ischemia)《神经病学年鉴(annals of neurology)》71：121-132(2012)的方法。
[0205]
一种用于鉴定或评估化合物阻滞半通道的能力的方法，所述方法包括：(a)将测试样品和测试系统放在一起，所述测试样品包括一种或多种测试化合物，并且所述测试系统包括用于评估半通道阻滞的系统，所述系统的特征在于，例如响应于将高葡萄糖、缺氧或缺血引入所述系统、炎症介质或诱导半通道开放的其它化合物或事件，如胞外ca
2+
的下降，所述系统表现出染料或经标记的代谢物的增加的转移；以及(b)确定所述系统中的例如染料或其它经标记的代谢物的存在或增加的量。也可以使用阳性和/或阴性对照。任选地，可以向测试系统添加预定量的半通道阻滞剂(例如，派普泰刚或西弗拉姆)。
[0206]
优选地，如派普泰刚和西弗拉姆等半通道阻滞剂在体外测定中表现出的活性小于约1到5nm，优选地小于约10nm并且更优选地小于约50pm。在体内测定中，这些化合物优选地示出了浓度小于约10-100微摩尔(μm)，并且更优选地浓度小于约50μm的半通道阻滞。其它半通道阻滞剂可以在这些范围内，并且在小于约200pm的范围内。
[0207]
在一个实施例中，施用包括一种或多种半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成的组合物。半通道阻滞剂可以以qd、bid、tid、qid或每周剂量，例如，qiw、biw、qw施用。半通道阻滞剂也可以prn(即，根据需要)和hs(临睡(hora somni)，即，睡前)施用。
[0208]
剂型和调配物以及施用：
[0209]
除非另有明确说明，否则关于剂药的所有描述都适用于本发明的半通道阻滞剂。
[0210]
半通道阻滞剂可以如本文所述的进行给药、施用或调配。
[0211]
可以向需要治疗的受试者施用半通道阻滞剂。因此，根据本发明，提供了调配物，通过所述调配物可以调节连接蛋白半通道，例如连接蛋白43半通道或连接蛋白45半通道，以瞬时和位点特异性方式降低连接蛋白半通道的开放概率。
[0212]
半通道阻滞剂可以以基本上分离的形式存在于调配物中。应当理解，产物可以与不会干扰产物的预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍然被认为是基本上分离的。本发明的产物还可以呈基本上纯化的形式，在这种情况下，所述产物通常将包括例如约80％、85％或90％，例如至少约88％、至少约90％、95％或98％、或至少约99％的拟肽或小分子半通道阻滞剂或制剂的干质量。
[0213]
可以通过能够将药剂递送到受试者体内的靶位点的任何方式向受试者施用半通道阻滞剂。举例来说，可以通过以下途径之一施用半通道阻滞剂：口服、局部、全身(例如，静脉内、动脉内、腹膜内、经皮、鼻内或通过栓剂)、肠胃外(例如肌内、皮下或静脉内或动脉内注射)、通过植入以及通过如渗透泵、经皮贴剂等装置的输注。还在以下文献中概述了示例性施用途径：binghe，w.和b.wang(2005)《药物递送：原理与应用(drug delivery：principles and applications)》，binghe wang、teruna siahaan、richard soltero，霍博
肯，新泽西州，威利-国际科学出版社(wiley-interscience)，c2005中。在一个实施例中，全身施用半通道阻滞剂。在另一个实施例中，半通道阻滞剂口服施用。在另一个实施例中，例如，向所关注器官、癌症或肿瘤局部或直接地施用半通道阻滞剂。
[0214]
在一些方面，半通道阻滞剂可以作为植入物提供或与植入物结合提供。在一些方面，可以提供持续递送。在一些实施例中，微针、针、离子电渗装置或植入物可以用于施用半通道阻滞剂。植入物可以是，例如，可溶解的圆盘材料，如在s.pflugfelder等人，《acs纳米(acs nano)》，9(2)，第1749-1758页(2015)中描述的圆盘材料。在一些方面，半通道阻滞剂，例如本发明的连接蛋白43半通道阻滞剂可以通过心室内和/或鞘内和/或硬膜外(extradural)和/或硬膜下和/或硬膜外(epidural)途径施用。
[0215]
半通道阻滞剂可以施用一次或多于一次，或周期性地施用。半通道阻滞剂还可以prn(根据需要)施用或按照预定时间表施用或两者皆有。在一些方面，每天、每周、每月、每两个月或每季度或这些时段的任何组合施用半通道阻滞剂。例如，治疗可以在一段时间内每天施用，随后每周和/或每月施用等。本文提出了施用阻滞剂的其它方法。一方面，在第1天到第5天、第10天、第30天、第45天、第60天、第75天、第90天或第100天到第180天之间的时间，以足以治疗患者的量向患者施用半通道阻滞剂。
[0216]
半通道阻滞剂，如派普泰刚，例如，和/或其类似物或前药、式i的化合物，例如西弗拉姆，和前述化合物中的任何化合物的类似物或前药、或式ii的化合物可以单独地施用或与一种或多种另外的成分组合施用，并且可以调配成包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体的药物组合物。
[0217]
″
药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂
″
旨在包含可用于制备药物组合物、可以与式i的化合物，例如西弗拉姆，以及前述化合物中的任何化合物的类似物或式ii的化合物共同施用，同时允许其执行其预期功能并且通常是安全无毒的并且在生物学上或其它方面都不是令人期望的物质。药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂包含适于兽医使用以及人类药用的稀释剂、载剂和/或赋形剂。考虑到式i的化合物，例如西弗拉姆，和前述化合物中的任何化合物的类似物的性质，本领域的普通技术人员将容易理解合适的载体和/或赋形剂。然而，举例来说，稀释剂、载体和/或赋形剂包含溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、聚合剂和脂质剂、乳剂等。进一步举例来说，合适的液体载体，尤其是用于可注射溶液的液体载体包含水、盐水溶液、右旋糖水溶液等，其中等渗溶液优选用于静脉内、脊柱内和脑池内施用，并且如脂质体等媒剂也尤其适于药剂施用。
[0218]
组合物可以采取任何标准已知剂型的形式，包含片剂、丸剂、胶囊、半固体、粉末、缓释调配物、溶液、悬浮液、酏剂、气溶胶、注射用液体、凝胶、乳膏、经皮递送装置(例如，经皮贴剂)、如器官插入物(例如，眼睛)等插入物或任何其它适当的组合物。考虑到待治疗的病状的性质和待使用的活性剂，本发明所涉及的领域的普通技术人员将容易地理解最适当的剂型，而无需任何过度的实验。应当理解，一种或多种半通道阻滞剂，如派普泰刚和/或其类似物、式i的化合物(例如，西弗拉姆)和前述化合物中的任何化合物的类似物和/或式ii的化合物可以调配成单一组合物。在某些实施例中，优选的剂型包含可注射溶液和口服调配物。
[0219]
考虑到剂型和施用模式，可用于本发明的组合物可以含有任何适当水平的半通道阻滞剂，如派普泰刚，例如和/或其类似物、式i的化合物(例如，西弗拉姆)和前述化合物中
的任何化合物的类似物和/或式ii的化合物。然而，举例来说，本发明中的使用组合物可以含有大约0.1重量％到大约99重量％，优选地大约1％到大约60％的半通道阻滞剂，这取决于施用方法。
[0220]
除了标准稀释剂、载体和/或赋形剂之外，根据本发明的组合物可以与一种或多种另外的成分一起调配，或以此类方式调配，以便增强半通道阻滞剂，如派普泰刚和/或其类似物、式i的化合物(例如，西弗拉姆)和前述化合物中的任何化合物的类似物和/或式ii的化合物的活性或生物利用度，有助于保护其完整性或增加其半衰期或保质期，使得在向受试者施用之后能够缓慢释放或提供例如其它令人期望的益处。例如，缓慢释放的媒剂包含大分子单体、聚(乙二醇)、透明质酸、聚(乙烯基吡咯烷酮)或水凝胶。进一步举例来说，组合物还可以包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、缓冲剂等。本发明所涉及的领域的技术人员可以鉴定出对于特定目的可能是令人期望的另外的添加剂。
[0221]
可以通过缓释系统施用半通道阻滞剂。缓释组合物的合适的实例包含呈成形制品，例如膜或微胶囊的形式的半渗透性聚合物基质。缓释基质包含聚交酯(美国专利第3,773,919号；ep 58,481)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-d-(-)-3-羟基丁酸(ep 133,988)。缓释组合物还包含脂质体包埋的化合物。含有半通道阻滞剂的脂质体可以通过已知的方法来制备，所述方法包含例如在以下文献中描述的方法：de 3,218,121；ep 52,322；ep 36,676；ep 88,046；ep 143,949；ep 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及ep 102,324。通常，脂质体属于小(约200到800埃)单层类型，其中脂质含量大于约30摩尔百分比的胆固醇，所选择的比例根据最有效的疗法进行调整。例如，还可以使用pgla纳米颗粒或微颗粒或原位离子激活的胶凝系统进行缓慢释放递送。
[0222]
另外，设想的是，根据本发明使用的半通道阻滞剂药物组合物可以与在特定情况下可能对受试者具有治疗益处或其它益处的另外的活性成分或药剂一起调配。考虑到本文中的对本发明的描述和待治疗的病症的性质，本发明所涉及的领域的普通技术人员将理解合适的另外的活性成分。
[0223]
可以根据如可以在如gennaro ar：例如《雷明顿：药学科学与实践(remington：the science and practice of pharmacy)》，第20版，利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(lippincott，williams&wilkins)，2000的此类标准参考文献中找到的标准技术来调配组合物。然而，进一步举例来说，可以使用us2013/0281524或us5948811中提供的信息。
[0224]
在某些实施例中，本发明提供了一种组合产物，所述组合产物包括(a)半通道阻滞剂和(b)一种或多种另外的活性剂、基本上由其组成或由其组成，其中组分(a)和(b)适于同时或顺序地施用。
[0225]
在本发明的特定实施例中，根据本发明的组合产物以这样的方式使用，使得组分中的至少一种组分被施用，而另一种组分仍对正在治疗的受试者具有效果。
[0226]
适于储存和/或施用药物组合物的任何容器可以用于供本发明的方法中使用的半通道阻滞剂产物。
[0227]
在一些方面，半通道阻滞剂，例如连接蛋白43半通道阻滞剂可以被调配成向施用位点提供受控和/或分区释放。在本发明的一些方面，调配物可以是立即释放剂型或延长释
放剂型或缓释剂型。在一些方面，剂型可以包括速释剂型与延长释放剂型和/或缓释剂型的组合两者。在一些方面，可以通过以速释形式组合经修饰或未经修饰的肽或拟肽，例如或其它半通道阻滞剂来获得半通道阻滞剂的速释和缓释和/或延长释放。在本发明的一些方面，半通道阻滞剂是例如本公开的连接蛋白43阻滞剂或其它半通道阻滞剂。在本发明的一些方面，剂型可以是植入物，例如可生物降解或不可生物降解植入物。
[0228]
在本发明的一些方面，半通道阻滞剂，例如，连接蛋白43半通道阻滞剂，可以调配成用于例如通过调整颗粒的大小或包衣而实现的阻滞剂的分区释放。例如，在一些方面，可以施用半通道阻滞剂，例如，连接蛋白43阻滞剂的颗粒调配物，以供本发明的方法中使用。在一些方面，包括颗粒的药物递送系统可以包括平均直径小于1,000nm，例如1-1000nm的纳米颗粒和/或平均直径在1到1,000μm之间的微颗粒。纳米颗粒或微颗粒可以是例如纳米球或微球，或经包封的纳米胶囊和微胶囊，其中半通道阻滞剂包封在聚合物包衣中。颗粒调配物还可以包括脂质体。在一些方面，半通道阻滞剂可以包含或不包含连接蛋白45、cx26、cx30、cx31.1、cx36、cx37、cx40、cx50或cx57半通道或血管中的任何其它连接蛋白半通道的阻滞剂。优选的连接蛋白靶标是cx36、cx37、cx43和cx45半通道。特别优选的靶标是cx43半通道。
[0229]
本发明包括用于调节用于治疗各种病症的半通道的功能的方法。本发明的方法包括根据需要单独地或与一种或多种其它药剂或疗法组合地施用半通道阻滞剂。
[0230]
在另一个实施例中，半通道阻滞剂，例如，式i的化合物(例如，西弗拉姆)、式ii的化合物、或肽或拟肽半通道阻滞剂可以全身施用，如通过静脉内、动脉内或腹膜内施用，使得最终循环浓度为大约0.001到大约150微摩尔或高达200微摩尔、300微摩尔、400微摩尔、500微摩尔、600微摩尔、700微摩尔、800微摩尔、900微摩尔或1000微摩尔。最终循环浓度可以为0.001微摩尔、0.002微摩尔、0.003微摩尔、0.004微摩尔、0.005微摩尔、0.006微摩尔、0.007微摩尔、0.008微摩尔、0.009微摩尔、0.01微摩尔、0.02微摩尔、0.03微摩尔、0.04微摩尔、0.05微摩尔、0.06微摩尔、0.07微摩尔、0.08微摩尔、0.09微摩尔、0.1微摩尔、0.2微摩尔、0.3微摩尔、0.4微摩尔、0.5微摩尔、0.6微摩尔、0.7微摩尔、0.8微摩尔、0.9微摩尔、1.0微摩尔、1.1微摩尔、1.2微摩尔、1.3微摩尔、1.4微摩尔、1.5微摩尔、1.6微摩尔、1.7微摩尔、1.8微摩尔、1.9微摩尔、2.0微摩尔、2.1微摩尔、2.2微摩尔、2.3微摩尔、2.4微摩尔、2.5微摩尔、2.6微摩尔、2.7微摩尔、2.8微摩尔、2.9微摩尔、3.0微摩尔、3.1微摩尔、3.2微摩尔、3.3微摩尔、3.4微摩尔、3.5微摩尔、3.6微摩尔、3.7微摩尔、3.8微摩尔、3.9微摩尔、4.0微摩尔、4.1微摩尔、4.2微摩尔、4.3微摩尔、4.4微摩尔、4.5微摩尔、4.6微摩尔、4.7微摩尔、4.8微摩尔、4.9微摩尔、5.0微摩尔、5.1微摩尔、5.2微摩尔、5.3微摩尔、5.4微摩尔、5.5微摩尔、5.6微摩尔、5.7微摩尔、5.8微摩尔、5.9微摩尔、6.0微摩尔、6.1微摩尔、6.2微摩尔、6.3微摩尔、6.4微摩尔、6.5微摩尔、6.6微摩尔、6.7微摩尔、6.8微摩尔、6.9微摩尔、7.0微摩尔、7.1微摩尔、7.2微摩尔、7.3微摩尔、7.4微摩尔、7.5微摩尔、7.6微摩尔、7.7微摩尔、7.8微摩尔、7.9微摩尔、8.0微摩尔、8.1微摩尔、8.2微摩尔、8.3微摩尔、8.4微摩尔、8.5微摩尔、8.6微摩尔、8.7微摩尔、8.8微摩尔、8.9微摩尔、9.0微摩尔、9.1微摩尔、9.2微摩尔、9.3微摩尔、9.4微摩尔、9.5微摩尔、9.6微摩尔、9.7微摩尔、9.8微摩尔、9.9微摩尔、10.0微摩尔、11微摩尔、12微摩尔、13微摩尔、14微摩尔、15微摩尔、16微摩尔、17微摩尔、18微摩尔、19微摩尔、20微摩尔、21微摩尔、22微摩尔、23微摩尔、24微摩尔、25微摩尔、26微摩尔、27微摩尔、28微摩尔、29微
摩尔、30微摩尔、31微摩尔、32微摩尔、33微摩尔、34微摩尔、35微摩尔、36微摩尔、37微摩尔、38微摩尔、39微摩尔、40微摩尔、41微摩尔、42微摩尔、43微摩尔、44微摩尔、45微摩尔、46微摩尔、47微摩尔、48微摩尔、49微摩尔、50微摩尔、51微摩尔、52微摩尔、53微摩尔、54微摩尔、55微摩尔、56微摩尔、57微摩尔、58微摩尔、59微摩尔、60微摩尔、61微摩尔、62微摩尔、63微摩尔、64微摩尔、65微摩尔、66微摩尔、67微摩尔、68微摩尔、69微摩尔、70微摩尔、71微摩尔、72微摩尔、73微摩尔、74微摩尔、75微摩尔、76微摩尔、77微摩尔、78微摩尔、79微摩尔、80微摩尔、81微摩尔、82微摩尔、83微摩尔、84微摩尔、85微摩尔、86微摩尔、87微摩尔、88微摩尔、89微摩尔、90微摩尔、91微摩尔、92微摩尔、93微摩尔、94微摩尔、95微摩尔、96微摩尔、97微摩尔、98微摩尔、99微摩尔、100微摩尔、100微摩尔、110微摩尔、120微摩尔、130微摩尔、140微摩尔或150微摩尔，或任何两个所列举数值之间的任何浓度，或如上文所述的更高浓度以及所述范围内的任何浓度。如本文所提及的，本发明还包括还向受试者施用一种或多种另外的活性剂的组合疗法。考虑到本文之前所讨论的所述药剂的性质和原理，技术人员将理解一种或多种活性剂的期望的剂量。活性半通道调节剂的优选的最终循环浓度或连接蛋白半通道靶标处或附近的半通道调节剂的浓度(所述半通道调节剂例如托那博沙、式i的半通道调节剂化合物、式ii的半通道调节剂化合物、拟肽(例如，肽5)等)在10-250微摩尔、10-100微摩尔、10-75微摩尔、10-50微摩尔、10-35微摩尔、10-30微摩尔和10-25微摩尔的范围内并且包含25微摩尔。
[0231]
半通道阻滞剂和任选地一种或多种其它活性剂的施用可以在病症的进展期间、或在病症或病症的一种或多种症状发展之前或之后的任何时间进行。在一个实施例中，周期性地施用半通道阻滞剂持续延长的时段，以帮助对症状的持续管理。在另一个实施例中，周期性地施用半通道阻滞剂持续延长的时段或终生，以防止或延迟病症的发展。
[0232]
在一些实施例中，半通道阻滞剂，例如连接蛋白43半通道阻滞剂可以作为包括一种或多种颗粒的药物组合物施用。在一些方面，药物组合物可以是例如速释调配物或控释调配物，例如迟释颗粒。在其它方面，半通道阻滞剂可以调配在微粒调配物，一个或多个颗粒中以便选择性地递送到待治疗区域。在一些实施例中，颗粒可以是例如纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊、脂质体、聚合物胶束或树状物。在一些实施例中，颗粒可以是微颗粒。纳米颗粒或微颗粒可以包括可生物降解聚合物。在其它实施例中，半通道阻滞剂作为植入物或基质制备或施用，或被调配成向施用位点提供分区释放。
[0233]
在一些实施例中，所调配的半通道阻滞剂是连接蛋白37或连接蛋白40或连接蛋白43或连接蛋白45半通道阻滞剂。连接蛋白37或连接蛋白40或连接蛋白43阻滞剂是优选的。最优选的是连接蛋白43半通道阻滞剂。如本文所使用的，
″
基质
″
包含例如如聚合物基质、可生物降解或不可生物降解基质等基质，以及可用于制备植入物或用于递送半通道阻滞剂的应用结构的其它载体。植入物包含储器植入物和可生物降解基质植入物。
[0234]
在一些实施例中，向受试者施用半通道阻滞剂，例如连接蛋白43和半通道阻滞剂，从而提供治疗有效量的连接蛋白43半通道阻滞剂，使用可以使用微针、微针阵列、针或植入物来施用半通道阻滞剂。在一些实施例中，可以使用微针来施用半通道阻滞剂。在一些实施例中，微针的穿透可以在组织或器官或器官区室内控制到所期望深度。在一些实施例中，还可以仅使用半通道阻滞剂或使用半通道阻滞剂和其它药剂来涂覆微针。在一些方面，通过微针施用的半通道阻滞剂和/或药物药剂的体积可以为约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、
8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、31μl、32μl、33μl、34μl、35μl、36μl、37μl、38μl、39μl、40μl、41μl、42μl、43μl、44μl、45μl、46μl、47μl、48μl、49μl、50μl、55μl、60μl、65μl、70μl、75μl、80μl、85μl、90μl、95μl、100μl、105μl、110μl、115μl、120μl、125μl、130μl、135μl、140μl、145μl、150μl、155μl、160μl、165μl、170μl、175μl、180μl、185μl、190μl、195μl、200μl、205μl、210μl、215μl、220μl、225μl、230μl、235μl、240μl、245μl、250μl、255μl、260μl、265μl、270μl、275μl、280μl、295μl或300μl，或任何两个所列举数值之间的任何体积范围或任何两个所列举数值之间的任何体积。本发明的任何合适的调配物可以通过微针注射施用，所述调配物包含例如纳米颗粒或微颗粒调配物或可由微针注射的其它调配物。
[0235]
连接蛋白半通道阻滞剂的组合的制品/试剂盒：
[0236]
在本发明的另一个实施例中，提供了一种含有可用于治疗上文所述的疾病和病症的材料的制品或
″
试剂盒
″
。试剂盒包括容器，所述容器包括连接蛋白半通道阻滞剂、基本上由其组成或由其组成。试剂盒可以进一步包括容器上或与容器相关的标签或包装插页。术语
″
包装插页
″
用于指通常包含在治疗产物的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于涉及使用此类治疗产物的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。合适的容器包含例如，瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由如玻璃或塑料等各种材料形成。容器容纳用于有效治疗病状的半通道阻滞剂或其调配物并且可以具有无菌接入端口(例如，容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选择的病状，如本文所述或所提及的疾病、病症和/或病状中的任何疾病、病症和/或病状。标签或包装插页还可以指示组合物可以用于治疗其它病症。可替代地或另外，制品可以进一步包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(ringer
′
s solution)和右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和使用者立场上期望的其它材料，所述材料包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
[0237]
试剂盒可以进一步包括向有需要的患者施用半通道阻滞剂的指导。
[0238]
还提供了制造商的制品，所述制品包括含有半通道阻滞剂化合物、组合物或调配物以及用于治疗受试者的说明书的器皿、基本上由其组成或由其组成。例如，在另一方面，本发明包含一种制品，所述制品包括含有治疗有效量的一种或多种连接蛋白半通道阻滞剂肽或拟肽和/或包含小分子的其它半通道阻滞剂连同包含用于治疗受试者的使用说明书、基本上由其组成或由其组成。
[0239]
在一些方面，制品可以包括基质，所述基质包括单独或组合的一种或多种连接蛋白半通道阻滞剂肽或拟肽或另一种半通道阻滞剂，如小分子半通道阻滞剂。
[0240]
剂量、量和浓度：
[0241]
如将理解的，所施用的半通道阻滞剂的剂量、施用时段和总体施用方案可能在受试者之间有所不同，这取决于这些变量，如待递送到的靶位点、待治疗的受试者的任何症状的严重性、待治疗的病症的类型、单位剂量的大小、所选择的施用模式以及受试者的年龄、性别和/或总体健康状况以及本领域的普通技术人员已知的其它因素。
[0242]
描述了可以用于治疗本文所提及的疾病、病症或病状的有效剂量的实例。在一些方面，治疗有效量的半通道阻滞剂，例如连接蛋白43半通道阻滞剂，为约0.001微克/毫升到
约1.0微克/毫升、或约0.001mg/ml到约0.01mg/ml、或约0.1mg/ml到约100mg/ml或更多的浓度或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或任何两个所列举数值之间的任何剂量。剂量可以为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.005mg/ml、0.006mg/ml、0.007mg/ml、0.008mg/ml、0.009mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml、3.1mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.1mg/ml、4.2mg/ml、4.3mg/ml、4.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml、4.7mg/ml、4.8mg/ml、4.9mg/ml、5.0mg/ml、5.1mg/ml、5.2mg/ml、5.3mg/ml、5.4mg/ml、5.5mg/ml、5.6mg/ml、5.7mg/ml、5.8mg/ml、5.9mg/ml、6.0mg/ml、6.1mg/ml、6.2mg/ml、6.3mg/ml、6.4mg/ml、6.5mg/ml、6.6mg/ml、6.7mg/ml、6.8mg/ml、6.9mg/ml、7.0mg/ml、7.1mg/ml、7.2mg/ml、7.3mg/ml、7.4mg/ml、7.5mg/ml、7.6mg/ml、7.7mg/ml、7.8mg/ml、7.9mg/ml、8.0mg/ml、8.1mg/ml、8.2mg/ml、8.3mg/ml、8.4mg/ml、8.5mg/ml、8.6mg/ml、8.7mg/ml、8.8mg/ml、8.9mg/ml、9.0mg/ml、9.1mg/ml、9.2mg/ml、9.3mg/ml、9.4mg/ml、9.5mg/ml、9.6mg/ml、9.7mg/ml、9.8mg/ml、9.9mg/ml、10.0mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/ml、61mg/ml、62mg/ml、63mg/ml、64mg/ml、65mg/ml、66mg/ml、67mg/ml、68mg/ml、69mg/ml、70mg/ml、71mg/ml、72mg/ml、73mg/ml、74mg/ml、75mg/ml、76mg/ml、77mg/ml、78mg/ml、79mg/ml、80mg/ml、81mg/ml、82mg/ml、83mg/ml、84mg/ml、85mg/ml、86mg/ml、87mg/ml、88mg/ml、89mg/ml、90mg/ml、91mg/ml、92mg/ml、93mg/ml、94mg/ml、95mg/ml、96mg/ml、97mg/ml、98mg/ml、99mg/ml或100mg/ml或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或任何两个所列举数值之间的任何剂量。在一些实施例中，治疗有效量的半通道阻滞剂以在约0.5mg/ml到约50mg/ml的范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻滞剂以在约0.3mg/ml到约30mg/ml的范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻滞剂以在约0.1mg/ml或1.0mg/ml到约10mg/ml的范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻滞剂以在约0.1mg/ml或1.0mg/ml到约0.3mg/ml或3.0mg/ml的范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻滞剂以约3.0mg/ml的浓度存在。
[0243]
在一些方面，半通道阻滞剂可以以介于约0.001mg/kg到约100mg/kg之间、介于约0.001mg/kg到约0.01mg/kg之间、介于约0.01mg/kg到约0.1mg/kg之间、介于0.1mg/kg到约1mg/kg之间、介于约1mg/kg到约10mg/kg之间或介于约10mg/kg到约100mg/kg之间的治疗有效剂量或任何两个所列举剂量之间的任何范围或任何两个所列举剂量之间的任何剂量施用。在一些方面，剂量可以为0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.005mg/ml、0.006mg/ml、0.007mg/ml、0.008mg/ml、0.009mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、
0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml、3.1mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.1mg/ml、4.2mg/ml、4.3mg/ml、4.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml、4.7mg/ml、4.8mg/ml、4.9mg/ml、5.0mg/ml、5.1mg/ml、5.2mg/ml、5.3mg/ml、5.4mg/ml、5.5mg/ml、5.6mg/ml、5.7mg/ml、5.8mg/ml、5.9mg/ml、6.0mg/ml、6.1mg/ml、6.2mg/ml、6.3mg/ml、6.4mg/ml、6.5mg/ml、6.6mg/ml、6.7mg/ml、6.8mg/ml、6.9mg/ml、7.0mg/ml、7.1mg/ml、7.2mg/ml、7.3mg/ml、7.4mg/ml、7.5mg/ml、7.6mg/ml、7.7mg/ml、7.8mg/ml、7.9mg/ml、8.0mg/ml、8.1mg/ml、8.2mg/ml、8.3mg/ml、8.4mg/ml、8.5mg/ml、8.6mg/ml、8.7mg/ml、8.8mg/ml、8.9mg/ml、9.0mg/ml、9.1mg/ml、9.2mg/ml、9.3mg/ml、9.4mg/ml、9.5mg/ml、9.6mg/ml、9.7mg/ml、9.8mg/ml、9.9mg/ml、10.0mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/ml、61mg/ml、62mg/ml、63mg/ml、64mg/ml、65mg/ml、66mg/ml、67mg/ml、68mg/ml、69mg/ml、70mg/ml、71mg/ml、72mg/ml、73mg/ml、74mg/ml、75mg/ml、76mg/ml、77mg/ml、78mg/ml、79mg/ml、80mg/ml、81mg/ml、82mg/ml、83mg/ml、84mg/ml、85mg/ml、86mg/ml、87mg/ml、88mg/ml、89mg/ml、90mg/ml、91mg/ml、92mg/ml、93mg/ml、94mg/ml、95mg/ml、96mg/ml、97mg/ml、98mg/ml、99mg/ml或100mg/ml或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或任何两个所列举数值之间的任何剂量。
[0244]
应当理解，施用可以包含单个日剂量、多个离散分次剂量的施用或连续施用，视情况而定。举例来说，可以每天一次或多于一次地施用单位剂量，例如每天1次、2次、3次、4次、5次或6次，以达到所期望的总日剂量。举例来说，单位剂量的半通道阻滞剂可以以单个日剂量或多个离散剂量施用或连续施用，以达到大约0.1到10mg、10到100mg、100到1000mg、1000到2000mg或2000mg到5000mg、0.1到大约2000mg、大约0.1到大约1000mg、大约1到大约500mg、大约1到大约200mg、大约1到大约100mg、大约1到大约50mg或大约1到大约25mg的日剂量或任何两个所列举剂量之间的任何范围或任何两个所列举剂量之间的任何剂量。
[0245]
进一步举例来说，单位剂量的半通道阻滞剂可以每天施用一次或多于一次(例如，1次、2次、3次、4次、5次或6次，通常每天1到4次)，使得总日剂量在大约1到大约1000mg的范围内(对于70kg成人)，例如大约1到大约500mg或500mg到1000mg、1000到2000mg或2000mg到5000mg或任何两个所列举剂量之间的任何范围或任何两个所列举剂量之间的任何剂量。例如，半通道阻滞剂，如派普泰刚和/或其类似物、式i的化合物(例如，西弗拉姆)和前述化合物中的任何化合物的类似物可以以大约0.01到大约15mg/kg/天，例如大约0.1到大约6mg/kg/天，例如大约1到大约6mg/kg/天，例如6mg/kg/天到100mg/kg/天的剂量范围或任何两个所列举剂量之间的任何范围或任何两个所列举剂量之间的任何剂量施用于受试者。在一个
实施例中，西弗拉姆可以以大约2mg到大约40mg的剂量每天口服施用一次。
[0246]
在一个实施例中，在循环内，半通道阻滞剂的剂量在作用位点处为大约0.001微摩尔到0.1微摩尔、0.1微摩尔和高达大约200微摩尔或更高，以在作用位点处实现那些浓度。举例来说，剂量可以为(但不限于)约0.001微摩尔、0.002微摩尔、0.003微摩尔、0.004微摩尔、0.005微摩尔、0.006微摩尔、0.007微摩尔、0.008微摩尔、0.009微摩尔、0.01微摩尔、0.02微摩尔、0.03微摩尔、0.04微摩尔、0.05微摩尔、0.06微摩尔、0.07微摩尔、0.08微摩尔、0.09微摩尔、0.1微摩尔、0.2微摩尔、0.3微摩尔、0.4微摩尔、0.5微摩尔、0.6微摩尔、0.7微摩尔、0.8微摩尔、0.9微摩尔、1.0微摩尔、1.1微摩尔、1.2微摩尔、1.3微摩尔、1.4微摩尔、1.5微摩尔、1.6微摩尔、1.7微摩尔、1.8微摩尔、1.9微摩尔、2.0微摩尔、2.1微摩尔、2.2微摩尔、2.3微摩尔、2.4微摩尔、2.5微摩尔、2.6微摩尔、2.7微摩尔、2.8微摩尔、2.9微摩尔、3.0微摩尔、3.1微摩尔、3.2微摩尔、3.3微摩尔、3.4微摩尔、3.5微摩尔、3.6微摩尔、3.7微摩尔、3.8微摩尔、3.9微摩尔、4.0微摩尔、4.1微摩尔、4.2微摩尔、4.3微摩尔、4.4微摩尔、4.5微摩尔、4.6微摩尔、4.7微摩尔、4.8微摩尔、4.9微摩尔、5.0微摩尔、5.1微摩尔、5.2微摩尔、5.3微摩尔、5.4微摩尔、5.5微摩尔、5.6微摩尔、5.7微摩尔、5.8微摩尔、5.9微摩尔、6.0微摩尔、6.1微摩尔、6.2微摩尔、6.3微摩尔、6.4微摩尔、6.5微摩尔、6.6微摩尔、6.7微摩尔、6.8微摩尔、6.9微摩尔、7.0微摩尔、7.1微摩尔、7.2微摩尔、7.3微摩尔、7.4微摩尔、7.5微摩尔、7.6微摩尔、7.7微摩尔、7.8微摩尔、7.9微摩尔、8.0微摩尔、8.1微摩尔、8.2微摩尔、8.3微摩尔、8.4微摩尔、8.5微摩尔、8.6微摩尔、8.7微摩尔、8.8微摩尔、8.9微摩尔、9.0微摩尔、9.1微摩尔、9.2微摩尔、9.3微摩尔、9.4微摩尔、9.5微摩尔、9.6微摩尔、9.7微摩尔、9.8微摩尔、9.9微摩尔、10.0微摩尔、11微摩尔、12微摩尔、13微摩尔、14微摩尔、15微摩尔、16微摩尔、17微摩尔、18微摩尔、19微摩尔、20微摩尔、21微摩尔、22微摩尔、23微摩尔、24微摩尔、25微摩尔、26微摩尔、27微摩尔、28微摩尔、29微摩尔、30微摩尔、31微摩尔、32微摩尔、33微摩尔、34微摩尔、35微摩尔、36微摩尔、37微摩尔、38微摩尔、39微摩尔、40微摩尔、41微摩尔、42微摩尔、43微摩尔、44微摩尔、45微摩尔、46微摩尔、47微摩尔、48微摩尔、49微摩尔、50微摩尔、51微摩尔、52微摩尔、53微摩尔、54微摩尔、55微摩尔、56微摩尔、57微摩尔、58微摩尔、59微摩尔、60微摩尔、61微摩尔、62微摩尔、63微摩尔、64微摩尔、65微摩尔、66微摩尔、67微摩尔、68微摩尔、69微摩尔、70微摩尔、71微摩尔、72微摩尔、73微摩尔、74微摩尔、75微摩尔、76微摩尔、77微摩尔、78微摩尔、79微摩尔、80微摩尔、81微摩尔、82微摩尔、83微摩尔、84微摩尔、85微摩尔、86微摩尔、87微摩尔、88微摩尔、89微摩尔、90微摩尔、91微摩尔、92微摩尔、93微摩尔、94微摩尔、95微摩尔、96微摩尔、97微摩尔、98微摩尔、99微摩尔、100微摩尔、110微摩尔、120微摩尔、130微摩尔、140微摩尔、150微摩尔、160微摩尔、170微摩尔、180微摩尔、190微摩尔、200微摩尔、210微摩尔、220微摩尔、230微摩尔、240微摩尔、250微摩尔、260微摩尔、270微摩尔、280微摩尔、290微摩尔、300微摩尔、310微摩尔、320微摩尔、330微摩尔、340微摩尔、350微摩尔、360微摩尔、370微摩尔、380微摩尔、390微摩尔、400微摩尔、410微摩尔、420微摩尔、430微摩尔、440微摩尔、450微摩尔、460微摩尔、470微摩尔、480微摩尔、490微摩尔或500微摩尔的最终循环浓度或任何两个所列举浓度之间的任何范围或任何两个所列举数值之间的任何浓度。在o
′
carroll等人，2008中描述了预期阻滞半通道但不解偶联缝隙连接的剂量的另外的实例，所述文献内容通过引用并入本文。在一些实施例中，西弗拉姆可以以较低剂量使用，例如，0.001到20微摩尔。低剂量可以为0.001微摩尔、0.002微摩尔、0.003微摩尔、
0.004微摩尔、0.005微摩尔、0.006微摩尔、0.007微摩尔、0.008微摩尔、0.009微摩尔、0.01微摩尔、0.02微摩尔、0.03微摩尔、0.04微摩尔、0.05微摩尔、0.06微摩尔、0.07微摩尔、0.08微摩尔、0.09微摩尔、0.1微摩尔、0.2微摩尔、0.3微摩尔、0.4微摩尔、0.5微摩尔、0.6微摩尔、0.7微摩尔、0.8微摩尔、0.9微摩尔、1.0微摩尔、1.1微摩尔、1.2微摩尔、1.3微摩尔、1.4微摩尔、1.5微摩尔、1.6微摩尔、1.7微摩尔、1.8微摩尔、1.9微摩尔、2.0微摩尔、2.1微摩尔、2.2微摩尔、2.3微摩尔、2.4微摩尔、2.5微摩尔、2.6微摩尔、2.7微摩尔、2.8微摩尔、2.9微摩尔、3.0微摩尔、3.1微摩尔、3.2微摩尔、3.3微摩尔、3.4微摩尔、3.5微摩尔、3.6微摩尔、3.7微摩尔、3.8微摩尔、3.9微摩尔、4.0微摩尔、4.1微摩尔、4.2微摩尔、4.3微摩尔、4.4微摩尔、4.5微摩尔、4.6微摩尔、4.7微摩尔、4.8微摩尔、4.9微摩尔、5.0微摩尔、5.1微摩尔、5.2微摩尔、5.3微摩尔、5.4微摩尔、5.5微摩尔、5.6微摩尔、5.7微摩尔、5.8微摩尔、5.9微摩尔、6.0微摩尔、6.1微摩尔、6.2微摩尔、6.3微摩尔、6.4微摩尔、6.5微摩尔、6.6微摩尔、6.7微摩尔、6.8微摩尔、6.9微摩尔、7.0微摩尔、7.1微摩尔、7.2微摩尔、7.3微摩尔、7.4微摩尔、7.5微摩尔、7.6微摩尔、7.7微摩尔、7.8微摩尔、7.9微摩尔、8.0微摩尔、8.1微摩尔、8.2微摩尔、8.3微摩尔、8.4微摩尔、8.5微摩尔、8.6微摩尔、8.7微摩尔、8.8微摩尔、8.9微摩尔、9.0微摩尔、9.1微摩尔、9.2微摩尔、9.3微摩尔、9.4微摩尔、9.5微摩尔、9.6微摩尔、9.7微摩尔、9.8微摩尔、9.9微摩尔、10.0微摩尔、11微摩尔、12微摩尔、13微摩尔、14微摩尔、15微摩尔、16微摩尔、17微摩尔、18微摩尔、19微摩尔或20微摩尔。
[0247]
在一个实施例中，在循环内，半通道阻滞剂，如派普泰刚和/或其类似物的剂量在作用位点处为大约0.001微摩尔和高达大约200微摩尔或200到2000或5000微摩尔或更高，以在作用位点处实现那些浓度。举例来说，剂量可以为(但不限于)约1微摩尔、5微摩尔、10微摩尔、20微摩尔、50微摩尔、100微摩尔、200微摩尔、250微摩尔、500微摩尔、1000微摩尔、2000微摩尔、3000微摩尔、4000微摩尔或5000微摩尔的最终循环浓度或任何两个所列举剂量之间的任何范围或任何两个所列举剂量之间的任何剂量。在o
′
carroll等人，2008中讨论了有效阻滞半通道但不解偶联缝隙连接的派普泰刚的剂量。
[0248]
在一些实施例中，西弗拉姆可以以较低剂量使用，例如，1到20微摩尔、1到50微摩尔、20到30、30到40或40到50微摩尔。低剂量可以为0.001微摩尔、0.002微摩尔、0.003微摩尔、0.004微摩尔、0.005微摩尔、0.006微摩尔、0.007微摩尔、0.008微摩尔、0.009微摩尔、0.01微摩尔、0.02微摩尔、0.03微摩尔、0.04微摩尔、0.05微摩尔、0.06微摩尔、0.07微摩尔、0.08微摩尔、0.09微摩尔、0.1微摩尔、0.2微摩尔、0.3微摩尔、0.4微摩尔、0.5微摩尔、0.6微摩尔、0.7微摩尔、0.8微摩尔、0.9微摩尔、1.0微摩尔、1.1微摩尔、1.2微摩尔、1.3微摩尔、1.4微摩尔、1.5微摩尔、1.6微摩尔、1.7微摩尔、1.8微摩尔、1.9微摩尔、2.0微摩尔、2.1微摩尔、2.2微摩尔、2.3微摩尔、2.4微摩尔、2.5微摩尔、2.6微摩尔、2.7微摩尔、2.8微摩尔、2.9微摩尔、3.0微摩尔、3.1微摩尔、3.2微摩尔、3.3微摩尔、3.4微摩尔、3.5微摩尔、3.6微摩尔、3.7微摩尔、3.8微摩尔、3.9微摩尔、4.0微摩尔、4.1微摩尔、4.2微摩尔、4.3微摩尔、4.4微摩尔、4.5微摩尔、4.6微摩尔、4.7微摩尔、4.8微摩尔、4.9微摩尔、5.0微摩尔、5.1微摩尔、5.2微摩尔、5.3微摩尔、5.4微摩尔、5.5微摩尔、5.6微摩尔、5.7微摩尔、5.8微摩尔、5.9微摩尔、6.0微摩尔、6.1微摩尔、6.2微摩尔、6.3微摩尔、6.4微摩尔、6.5微摩尔、6.6微摩尔、6.7微摩尔、6.8微摩尔、6.9微摩尔、7.0微摩尔、7.1微摩尔、7.2微摩尔、7.3微摩尔、7.4微摩尔、7.5微摩尔、7.6微摩尔、7.7微摩尔、7.8微摩尔、7.9微摩尔、8.0微摩尔、8.1微摩尔、8.2微摩尔、
8.3微摩尔、8.4微摩尔、8.5微摩尔、8.6微摩尔、8.7微摩尔、8.8微摩尔、8.9微摩尔、9.0微摩尔、9.1微摩尔、9.2微摩尔、9.3微摩尔、9.4微摩尔、9.5微摩尔、9.6微摩尔、9.7微摩尔、9.8微摩尔、9.9微摩尔、10.0微摩尔、11微摩尔、12微摩尔、13微摩尔、14微摩尔、15微摩尔、16微摩尔、17微摩尔、18微摩尔、19微摩尔或20微摩尔。
[0249]
在一些实施例中，其半通道阻滞剂的合适的治疗有效剂量可以为半通道阻滞剂的至少约1.0mg/ml。在一些实施例中，半通道阻滞剂的治疗有效剂量可以为约0.001mg/ml到0.01mg/ml、约0.01mg/ml到约0.1mg/ml或约0.1mg/ml到约100mg/ml。在一些实施例中，半通道阻滞剂的合适的治疗有效剂量可以为约约0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.4ug/ml、0.5ug/ml、0.6ug/ml、0.7ug/ml、0.8ug/ml、0.9ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、3.0ug/ml、4.0ug/ml、5.0ug/ml、6.0ug/ml、7.0ug/ml、8.0ug/ml、9.0ug/ml、10.0ug/ml、11.0ug/ml、12.0ug/ml、13.0ug/ml、14.0ug/ml、15.0ug/ml、16.0ug/ml、17.0ug/ml、18.0ug/ml、19.0ug/ml、20.0ug/ml、21.0ug/ml、22.0ug/ml、23.0ug/ml、24.0ug/ml、25.0ug/ml、26.0ug/ml、27.0ug/ml、28.0ug/ml、29.0ug/ml、30.0ug/ml、31.0ug/ml、32.0ug/ml、33.0ug/ml、34.0ug/ml、35.0ug/ml、36.0ug/ml、37.0ug/ml、38.0ug/ml、39.0ug/ml、40.0ug/ml、41.0ug/ml、42.0ug/ml、43.0ug/ml、44.0ug/ml、45.0ug/ml、46.0ug/ml、47.0ug/ml、48.0ug/ml、49.0ug/ml、50.0ug/ml、52.5ug/ml、55.0ug/ml、57.5ug/ml、60.0ug/ml、62.5ug/ml、65.0ug/ml、67.5ug/ml、70.0ug/ml、72.5ug/ml、75.0ug/ml、77.5ug/ml、80.0ug/ml、82.5ug/ml、85.0ug/ml、87.5ug/ml、90.0ug/ml、92.5ug/ml、95.0ug/ml、97.5或约100.0ug/ml或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或子范围或落入约0.1到约100ug/ml的范围内的任何剂量。在一些实施例中，半通道阻滞剂的合适的治疗有效剂量可以为约0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.3ug/ml、0.4ug/ml、0.5ug/ml、0.6ug/ml、0.7ug/ml、0.8ug/ml、0.9ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、3.0ug/ml、4.0ug/ml、5.0ug/ml、6.0ug/ml、7.0ug/ml、8.0ug/ml、9.0ug/ml、10.0ug/ml、11.0ug/ml、12.0ug/ml、13.0ug/ml、14.0ug/ml、15.0ug/ml、16.0ug/ml、17.0ug/ml、18.0ug/ml、19.0ug/ml、20.0ug/ml、21.0ug/ml、22.0ug/ml、23.0ug/ml、24.0ug/ml、25.0ug/ml、26.0ug/ml、27.0ug/ml、28.0ug/ml、29.0ug/ml、30.0ug/ml、31.0ug/ml、32.0ug/ml、33.0ug/ml、34.0ug/ml、35.0ug/ml、36.0ug/ml、37.0ug/ml、38.0ug/ml、39.0ug/ml、40.0ug/ml、41.0ug/ml、42.0ug/ml、43.0ug/ml、44.0ug/ml、45.0ug/ml、46.0ug/ml、47.0ug/ml、48.0ug/ml、49.0ug/ml、50.0ug/ml、52.5ug/ml、55.0ug/ml、57.5ug/ml、60.0ug/ml、62.5ug/ml、65.0ug/ml、67.5ug/ml、70.0ug/ml、72.5ug/ml、75.0ug/ml、77.5ug/ml、80.0ug/ml、82.5ug/ml、85.0ug/ml、87.5ug/ml、90.0ug/ml、92.5ug/ml、95.0ug/ml、97.5或约100.0ug/ml或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或子范围、或落入约0.1mg/ml到约100mg/ml的范围内的任何剂量。在一些实施例中，半通道阻滞剂以在约0.5mg/ml到约50mg/ml的范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻滞剂以在约0.3mg/ml到约30mg/ml的范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻滞剂以在约0.1mg/ml或1.0mg/ml到约10mg/ml的范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻滞剂以在约0.1mg/ml或1.0mg/ml到约0.3mg/ml或3.0mg/ml的范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻滞剂，如连接蛋白43半通道阻滞剂和/或连接蛋白45半通道阻滞剂以约3.0mg/ml的浓度存在。在这些方面中的任一方面中，半通道阻滞剂可以是连接蛋白43或连接蛋白45半通道阻滞剂。当半通道阻滞剂是经修饰或未经修饰的肽或拟肽时，剂量可以减少1-10倍、25-50倍、100-200倍或
1000倍。
[0250]
在某些实施例中，半通道阻滞剂，例如连接蛋白43半通道阻滞剂，可以在治疗位点处和/或邻近治疗位点以约0.001微摩尔(μm)或0.05μm到约200μm、或高达300μm或高达1000μm或高达2000μm或高达3200μm或更高，例如高达约10mm、20mm或30mm的最终浓度以及这些剂量数值内的任何剂量和剂量范围施用。在一个实施例中，半通道阻滞剂组合物以大于约1000μm应用。优选地，半通道阻滞剂组合物以约1000μm到约10mm的最终浓度应用，更优选地，抗连接蛋白药剂组合物以约3mm到约10mm的最终浓度应用，并且更优选地，半通道阻滞剂组合物以约1-3mm到约5-10mm的最终浓度应用。半通道阻滞剂浓度可以为0.001微摩尔、0.002微摩尔、0.003微摩尔、0.004微摩尔、0.005微摩尔、0.006微摩尔、0.007微摩尔、0.008微摩尔、0.009微摩尔、0.01微摩尔、0.02微摩尔、0.03微摩尔、0.04微摩尔、0.05微摩尔、0.06微摩尔、0.07微摩尔、0.08微摩尔、0.09微摩尔、0.1微摩尔、0.2微摩尔、0.3微摩尔、0.4微摩尔、0.5微摩尔、0.6微摩尔、0.7微摩尔、0.8微摩尔、0.9微摩尔、1.0微摩尔、1.1微摩尔、1.2微摩尔、1.3微摩尔、1.4微摩尔、1.5微摩尔、1.6微摩尔、1.7微摩尔、1.8微摩尔、1.9微摩尔、2.0微摩尔、2.1微摩尔、2.2微摩尔、2.3微摩尔、2.4微摩尔、2.5微摩尔、2.6微摩尔、2.7微摩尔、2.8微摩尔、2.9微摩尔、3.0微摩尔、3.1微摩尔、3.2微摩尔、3.3微摩尔、3.4微摩尔、3.5微摩尔、3.6微摩尔、3.7微摩尔、3.8微摩尔、3.9微摩尔、4.0微摩尔、4.1微摩尔、4.2微摩尔、4.3微摩尔、4.4微摩尔、4.5微摩尔、4.6微摩尔、4.7微摩尔、4.8微摩尔、4.9微摩尔、5.0微摩尔、5.1微摩尔、5.2微摩尔、5.3微摩尔、5.4微摩尔、5.5微摩尔、5.6微摩尔、5.7微摩尔、5.8微摩尔、5.9微摩尔、6.0微摩尔、6.1微摩尔、6.2微摩尔、6.3微摩尔、6.4微摩尔、6.5微摩尔、6.6微摩尔、6.7微摩尔、6.8微摩尔、6.9微摩尔、7.0微摩尔、7.1微摩尔、7.2微摩尔、7.3微摩尔、7.4微摩尔、7.5微摩尔、7.6微摩尔、7.7微摩尔、7.8微摩尔、7.9微摩尔、8.0微摩尔、8.1微摩尔、8.2微摩尔、8.3微摩尔、8.4微摩尔、8.5微摩尔、8.6微摩尔、8.7微摩尔、8.8微摩尔、8.9微摩尔、9.0微摩尔、9.1微摩尔、9.2微摩尔、9.3微摩尔、9.4微摩尔、9.5微摩尔、9.6微摩尔、9.7微摩尔、9.8微摩尔、9.9微摩尔、10.0微摩尔、11微摩尔、12微摩尔、13微摩尔、14微摩尔、15微摩尔、16微摩尔、17微摩尔、18微摩尔、19微摩尔、20微摩尔、21微摩尔、22微摩尔、23微摩尔、24微摩尔、25微摩尔、26微摩尔、27微摩尔、28微摩尔、29微摩尔、30微摩尔、31微摩尔、32微摩尔、33微摩尔、34微摩尔、35微摩尔、36微摩尔、37微摩尔、38微摩尔、39微摩尔、40微摩尔、41微摩尔、42微摩尔、43微摩尔、44微摩尔、45微摩尔、46微摩尔、47微摩尔、48微摩尔、49微摩尔、50微摩尔、51微摩尔、52微摩尔、53微摩尔、54微摩尔、55微摩尔、56微摩尔、57微摩尔、58微摩尔、59微摩尔、60微摩尔、61微摩尔、62微摩尔、63微摩尔、64微摩尔、65微摩尔、66微摩尔、67微摩尔、68微摩尔、69微摩尔、70微摩尔、71微摩尔、72微摩尔、73微摩尔、74微摩尔、75微摩尔、76微摩尔、77微摩尔、78微摩尔、79微摩尔、80微摩尔、81微摩尔、82微摩尔、83微摩尔、84微摩尔、85微摩尔、86微摩尔、87微摩尔、88微摩尔、89微摩尔、90微摩尔、91微摩尔、92微摩尔、93微摩尔、94微摩尔、95微摩尔、96微摩尔、97微摩尔、98微摩尔、99微摩尔或100微摩尔；或0.001毫摩尔、0.002毫摩尔、0.003毫摩尔、0.004毫摩尔、0.005毫摩尔、0.006毫摩尔、0.007毫摩尔、0.008毫摩尔、0.009毫摩尔、0.01毫摩尔、0.02毫摩尔、0.03毫摩尔、0.04毫摩尔、0.05毫摩尔、0.06毫摩尔、0.07毫摩尔、0.08毫摩尔、0.09毫摩尔、0.1毫摩尔、0.2毫摩尔、0.3毫摩尔、0.4毫摩尔、0.5毫摩尔、0.6毫摩尔、0.7毫摩尔、0.8毫摩尔、0.9毫摩尔、1.0毫摩尔、1.1毫摩尔、1.2毫摩尔、1.3毫摩尔、1.4毫摩尔、1.5毫摩尔、1.6毫摩
尔、1.7毫摩尔、1.8毫摩尔、1.9毫摩尔、2.0毫摩尔、2.1毫摩尔、2.2毫摩尔、2.3毫摩尔、2.4毫摩尔、2.5毫摩尔、2.6毫摩尔、2.7毫摩尔、2.8毫摩尔、2.9毫摩尔、3.0毫摩尔、3.1毫摩尔、3.2毫摩尔、3.3毫摩尔、3.4毫摩尔、3.5毫摩尔、3.6毫摩尔、3.7毫摩尔、3.8毫摩尔、3.9毫摩尔、4.0毫摩尔、4.1毫摩尔、4.2毫摩尔、4.3毫摩尔、4.4毫摩尔、4.5毫摩尔、4.6毫摩尔、4.7毫摩尔、4.8毫摩尔、4.9毫摩尔、5.0毫摩尔、5.1毫摩尔、5.2毫摩尔、5.3毫摩尔、5.4毫摩尔、5.5毫摩尔、5.6毫摩尔、5.7毫摩尔、5.8毫摩尔、5.9毫摩尔、6.0毫摩尔、6.1毫摩尔、6.2毫摩尔、6.3毫摩尔、6.4毫摩尔、6.5毫摩尔、6.6毫摩尔、6.7毫摩尔、6.8毫摩尔、6.9毫摩尔、7.0毫摩尔、7.1毫摩尔、7.2毫摩尔、7.3毫摩尔、7.4毫摩尔、7.5毫摩尔、7.6毫摩尔、7.7毫摩尔、7.8毫摩尔、7.9毫摩尔、8.0毫摩尔、8.1毫摩尔、8.2毫摩尔、8.3毫摩尔、8.4毫摩尔、8.5毫摩尔、8.6毫摩尔、8.7毫摩尔、8.8毫摩尔、8.9毫摩尔、9.0毫摩尔、9.1毫摩尔、9.2毫摩尔、9.3毫摩尔、9.4毫摩尔、9.5毫摩尔、9.6毫摩尔、9.7毫摩尔、9.8毫摩尔、9.9毫摩尔、10.0毫摩尔、11毫摩尔、12毫摩尔、13毫摩尔、14毫摩尔、15毫摩尔、16毫摩尔、17毫摩尔、18毫摩尔、19毫摩尔、20毫摩尔、21毫摩尔、22毫摩尔、23毫摩尔、24毫摩尔、25毫摩尔、26毫摩尔、27毫摩尔、28毫摩尔、29毫摩尔、30毫摩尔、31毫摩尔、32毫摩尔、33毫摩尔、34毫摩尔、35毫摩尔、36毫摩尔、37毫摩尔、38毫摩尔、39毫摩尔、40毫摩尔、41毫摩尔、42毫摩尔、43毫摩尔、44毫摩尔、45毫摩尔、46毫摩尔、47毫摩尔、48毫摩尔、49毫摩尔、50毫摩尔、51毫摩尔、52毫摩尔、53毫摩尔、54毫摩尔、55毫摩尔、56毫摩尔、57毫摩尔、58毫摩尔、59毫摩尔、60毫摩尔、61毫摩尔、62毫摩尔、63毫摩尔、64毫摩尔、65毫摩尔、66毫摩尔、67毫摩尔、68毫摩尔、69毫摩尔、70毫摩尔、71毫摩尔、72毫摩尔、73毫摩尔、74毫摩尔、75毫摩尔、76毫摩尔、77毫摩尔、78毫摩尔、79毫摩尔、80毫摩尔、81毫摩尔、82毫摩尔、83毫摩尔、84毫摩尔、85毫摩尔、86毫摩尔、87毫摩尔、88毫摩尔、89毫摩尔、90毫摩尔、91毫摩尔、92毫摩尔、93毫摩尔、94毫摩尔、95毫摩尔、96毫摩尔、97毫摩尔、98毫摩尔、99毫摩尔或100毫摩尔或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或任何两个所列举数值之间的任何剂量。
[0251]
另外，半通道阻滞剂，例如连接蛋白43半通道阻滞剂可以约1μm到约50μm的最终浓度存在于调配物中，并且可替代地，连接蛋白43半通道阻滞剂，例如以约5μm到约20μm的最终浓度或约10到约15μm的最终浓度存在。在某些其它实施例中，半通道阻滞剂以约10μm的最终浓度存在。在又另一个实施例中，半通道阻滞剂以约1-15μm的最终浓度存在。在其它实施例中，半通道阻滞剂以约20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、10-200μm、200-300μm、300-400μm、400-500μm、500-600μm、600-700μm、700-800μm、800-900μm、900-1000或1000-1500μm或1500μm-2000μm、2000μm-3000μm、3000μm-4000μm、4000μm-5000μm、5000μm-6000μm、6000μm-7000μm、7000μm-8000μm、8000μm-9000μm、9000μm-10,000μm、10,000μm-11,000μm、11,000μm-12,000μm、12,000μm-13,000μm、13,000μm-14,000μm、14,000μm-15,000μm、15,000μm-20,000μm、20,000μm-30,000μm、30,000μm-50,000μm或更高或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或子范围、或落入约20μm到约50,000μm的范围内的任何剂量存在。
[0252]
本文所述的半通道阻滞剂中的每种半通道阻滞剂的约每天1纳克(mg)/kg体重与约每天1mg/kg体重之间的仍其它剂量水平。在某些实施例中，主题化合物中的每种主题化合物的剂量通常将在每kg体重约1ng到约1微克、每kg体重约1ng到约0.1微克、每kg体重约1ng到约10ng、每kg体重约10ng到约0.1微克、每kg体重约0.1微克到约1微克、每kg体重约
20ng到约100ng、每kg体重约0.001mg到约0.01mg、每kg体重约0.01mg到约0.1mg或每kg体重约0.1mg到约1mg的范围内。在某些实施例中，主题化合物中的每种主题化合物的剂量通常将在每kg体重约0.001mg到约0.01mg、每kg体重约0.01mg到约0.1mg、每kg体重约0.1mg到约1mg的范围内。如果使用多于一种半通道阻滞剂，则每种半通道阻滞剂的剂量不必与另一种半通道阻滞剂的剂量在同一范围内。例如，一种连接蛋白半通道阻滞剂的剂量可以在每kg体重约0.01mg到约10mg之间，并且另一种连接蛋白半通道阻滞剂的剂量可以在每kg体重约0.1mg到约1mg、每kg体重0.1到约10mg、每kg体重0.1到约20mg、每kg体重0.1到约30mg、每kg体重0.1到约40mg或每kg体重约0.1到约50mg之间。剂量也可以为约0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10.0mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、50mg/kg、51mg/kg、52mg/kg、53mg/kg、54mg/kg、55mg/kg、56mg/kg、57mg/kg、58mg/kg、59mg/kg、60mg/kg、61mg/kg、62mg/kg、63mg/kg、64mg/kg、65mg/kg、66mg/kg、67mg/kg、68mg/kg、69mg/kg、70mg/kg、71mg/kg、72mg/kg、73mg/kg、74mg/kg、75mg/kg、76mg/kg、77mg/kg、78mg/kg、79mg/kg、80mg/kg、81mg/kg、82mg/kg、83mg/kg、84mg/kg、85mg/kg、86mg/kg、87mg/kg、88mg/kg、89mg/kg、90mg/kg、91mg/kg、92mg/kg、93mg/kg、94mg/kg、95mg/kg、96mg/kg、97mg/kg、98mg/kg、99mg/kg或100mg/kg体重或所列举剂量中的任何两个剂量之间的任何范围或子范围、或落入每kg体重约0.001到约100mg的范围内的任何剂量。
[0253]
如上所述，半通道阻滞剂，例如连接蛋白37、40或43半通道阻滞剂的剂量可以在单个或分次应用中施用。剂量可以施用一次，或可以重复应用。通常，将根据需要每周、每两周或每3周、每月或每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月或每24个月或更久重复应用，以预防、减缓或治疗本文所述的任何疾病、病症或
病状。还可以每隔12小时到7天或更长时间应用剂量。例如，可以隔12小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或以落入这些时间中的任何两个时间之间或12小时与7天之间的任何时间间隔应用剂量。连接蛋白43半通道阻滞剂例如可以施用长达四、六、八、十、十二、十四、十六、十八、二十、二十二、二十四或二十六周。对于一些适应症，可以采用更频繁的给药。
[0254]
制造和纯度：
[0255]
可以如先前所述那样制备小分子半通道阻滞剂，包含式i和ii的半通道阻滞剂。可以使用合适的方法进行合成抗体和结合片段以及包含拟肽和肽类似物在内的肽和多肽的方法。参见例如，lihu yang等人，《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》，1；95(18)：10836-10841(1998年9月1日)；harlow和lane(1988)《抗体：实验室手册(
″
antibodies：a laboratory manuel
″
)》，冷泉港出版社(cold spring harbor publications)，纽约；harlow和lane(1999)，《使用抗体：实验室手册(
″
using antibodies
″
a laboratory manuel)》，冷泉港出版社，纽约。
[0256]
在一些实施例中，本发明的调配物是基本上纯的。基本上纯的意指调配物包括少于约10％、5％或1％，并且优选地少于约0.1％的任何杂质。在一些实施例中，包含连接蛋白43调节剂的代谢物在内的总杂质将不超过1-15％。在一些实施例中，包含连接蛋白43调节剂的代谢物在内的总杂质将不超过2-12％。在一些实施例中，包含连接蛋白43调节剂的代谢物在内的总杂质将不超过3-11％。在其它实施例中，包含连接蛋白43调节剂的代谢物在内的总杂质将不超过4-10％。
[0257]
实例
[0258]
这些实例中所描述的工作评估并证明了半通道阻滞剂对brb完整性、rpe完整性、紧密连接完整性和zo-1内化以及iv型胶原产生的减少具有积极作用。
[0259]
实例1
[0260]
方法
[0261]
细胞培养-将成人视网膜色素上皮细胞(arpe-19；美国的美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)，usa)在补充有10％胎牛血清(fbs；美国英杰公司(invitrogen，usa))和1x抗生素和抗真菌剂混合物(aa，100x储备)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基营养混合物(dulbecco
′
s modified eagle medium nutrient mixture)f-12(dmem-f12；美国的赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific inc.，usa))中在37℃下在加湿的5％co2培养箱中进行培养。使细胞在t75烧瓶中生长，并且每周更换两次培养基，直到汇合。
[0262]
hg和/或细胞因子激发-在第6-12代时，将细胞以2.5
×
105个细胞/毫升铺板在8孔室载玻片中进行免疫组织化学研究、铺板在6孔板中进行teer和fitc-葡聚糖研究或铺板在96孔板中进行乳糖脱氢酶(ldh)和atp释放测定，直至汇合，此后，将培养基更换为在含有1x aa的无血清dmem-f12中处理24小时。如先前所述的[23，20，21]，诱导dr样条件。简而言之，用32.5mm hg和促炎细胞因子、肿瘤坏死因子α(tnf-α；10ng/ml；美国的派普泰克公司(peprotech，usa))和白介素-1β(il-1β；10ng/ml；美国的派普泰克公司)的组合激发细胞。
[0263]
治疗应用-将肽5(h-val-asp-cys-phe-leu-ser-arg-pro-thr-glu-lys-thr-oh；中国的中国肽公司(china peptides，china))以25μm的浓度与hg和促炎细胞因子的组合同时施用于细胞[20]。对于评估胞外atp的效果的实验，在损伤和肽5处理的同时向细胞中添
加外源atp(100nm)。
[0264]
跨上皮电阻(teer)的测量-将细胞以2.5
×
105个细胞/毫升接种在生长培养基中的6孔板(美国康宁公司(corning incorporated，usa))的聚酯膜上并且温育72小时。然后将培养基更换为含有处理的无血清铺板培养基。在使用具有stx3电极的evom2(美国的世界精密仪器公司(world precision instruments，usa))处理之后，在0小时、24小时、48小时和72小时处获得teer测量值。净teer值是通过从获自含有细胞的室的实验值中减去没有细胞的transwell插入物中的电阻来计算的。将净teer乘以插入物面积，以得到以ω.cm2为单位的teer。相对于基底条件报告teer数据。样品大小是每孔三个读数，在单独的实验中重复三次。
[0265]
fitc-葡聚糖细胞旁渗透性的测量-通过测量70,000da异硫氰酸荧光素(fitc)-葡聚糖(d1820，美国的赛默飞世尔科技公司)跨细胞单层的移动来检查arpe-19细胞之间的紧密连接的完整性。在72小时的teer测量之后，用1000μl fitc-葡聚糖(10μg/ml)替代插入物中的1000μl用过的培养基并且温育1小时。去除插入物并且将样品转移到96孔板中，以用于通过分光光度法(激发490nm和发射520nm)进行定量。fitc-葡聚糖渗透性表达为相对于不含细胞和不含处理的空白孔的百分比。样品大小是每孔三个读数，在单独的实验中重复三次。
[0266]
atp释放测定-如先前所述的[20]使用atplite发光atp检测试剂盒(美国的珀金埃尔默公司(perkinelmer，usa))测量释放到细胞培养基中的atp。atp释放表示为基底条件的百分比。样品大小是每组六个孔，在单独的实验中重复三次。
[0267]
乳酸脱氢酶(ldh)测定-将细胞以2.5
×
105个细胞/毫升接种在96孔板中直到汇合，此后将培养基更换为在含有1x aa的无血清dmem-f12中处理72小时。在含有处理的培养基中温育72小时之后，从每个孔中取出50μl培养基来测量ldh释放。样品大小是每组六个孔，在单独的实验中重复三次。根据制造商说明书(美国的西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich，usa))，使用ldh测定试剂盒评估所释放的ldh的量。简而言之，ldh将nad还原为nad+，nad+然后将四唑鎓染料转化成可溶性且有色的甲臜。使用synergy 2多模式读板器(美国的伯腾仪器有限公司(biotek instruments inc.，usa))测量培养基中的甲臜染料在490nm处(od490)的吸光度。相对于基底条件计算ldh释放(％)。
[0268]
免疫组织化学-将细胞以2.5
×
105个细胞/毫升接种在8孔室载玻片上进行免疫组织化学实验。在处理培养基中温育72小时之后，将细胞用4％多聚甲醛固定10分钟并且用含0.1％triton x-100的磷酸盐缓冲盐水(pbs)渗透10分钟。然后将细胞与兔抗zo-1(1∶400；美国的英杰公司)、兔抗连接蛋白43(1∶2000；美国的西格玛-奥德里奇公司)或小鼠抗胶原iv(1∶1000；美国的西格玛-奥德里奇公司)在4℃下温育过夜，随后在pbs中洗涤三次，持续15分钟。应用山羊抗兔alexa-488(1∶500；美国的英杰公司)或山羊抗小鼠cy3(1∶500；美国的杰克逊免疫研究公司(jackson immuno research，usa)二级抗体并将其在室温下温育3小时。仅二级对照未揭示非特异性标记。将细胞核用dapi(1∶1000；美国的西格玛-奥德里奇公司)进行染色，并且使用citifluor
tm
抗褪色试剂固定载玻片。在单独的实验中重复标记三次。
[0269]
胶原iv免疫标记的图像分析和定量-在奥林巴斯fv1000共聚焦激光扫描显微镜(日本的奥林巴斯集团(olympus，japan))上拍摄图像。使用奥林巴斯fv-10asw观察器和
imagej软件(美国国家卫生研究院(national institute of health，usa))的1.46r版处理图像。定性地评估zo-1和连接蛋白43表达两者的定位变化。从每个孔拍摄的四个图像中对胶原iv标记进行定量，并且重复实验三次。使用imagej软件，将每个图像分成rgb通道，其中胶原iv在红色通道中。将图像转换成8位二进制图像，并且将相等阈值应用于每个图像以减少背景并避免偏差。然后使用imagej中的
″
量度
″
特征对由胶原iv覆盖的总面积进行定量。胶原iv结果表达为未经处理(基底)细胞的百分比。
[0270]
统计分析-数据表示为算术平均值
±
s.d。使用graphpad prism 6、使用单向anova或双向anova与邓尼特多重校正测试进行各组之间的统计比较。在相应图例中提供了用于每个数据集的具体统计方法。调整后的p＜0.05被认为指示统计学上显著的差异。
[0271]
实例2
[0272]
用半通道阻滞剂进行的处理防止了teer的降低并且防止了细胞旁渗透性的对应增加
[0273]
与基底条件相比，hg和细胞因子的组合导致在48小时(p＝0.0007)和72小时(p＝0.0030)处teer降低(图1a)。相对于基底条件(32.77
±
2.23％)，在添加hg和炎性细胞因子(38.42
±
1.84％)后72小时，伴随着fitc-葡聚糖渗透性的显著升高(p＝0.0016)(图1b)。用具有肽5的半通道阻滞进行的处理减少了两个时间点处的teer的降低，使得在48小时(p＝0.2238)和72小时(p＝0.3778)两者处在经肽5处理的细胞与基底细胞之间没有统计学上显著的差异。类似地，使用模型阻滞剂肽5(33.2
±
2.87％)的半通道阻滞在72小时处防止fitc-葡聚糖渗透性的升高。
[0274]
实例3
[0275]
半通道阻滞剂处理防止胶原iv上调
[0276]
arpe-19细胞在基底条件下沉积低水平的胶原iv(图4)。在添加hg和炎性细胞因子的情况下，与基底细胞(31.25
±
36.06％)相比，胶原iv沉积有所增加(618.5
±
332.3％；p＝0.0180)。用肽5进行的半通道阻滞剂处理防止胶原iv上调，其中在经肽5处理的细胞(40.32
±
43.16％)与基底细胞(p＝0.9976)之间没有统计学上显著的差异。
[0277]
实例4
[0278]
连接蛋白半通道阻滞防止细胞膜上的连接蛋白43定位的丧失
[0279]
基本上，连接蛋白43蛋白定位于可以被免疫组织化学标记的斑块中的细胞膜上(图5c)。在添加hg和炎性细胞因子的情况下，细胞膜上的连接蛋白43斑块标记丧失并且蛋白质的胞内定位增加。用具有肽5的半通道阻滞剂进行处理防止了连接蛋白43定位再分布远离细胞膜并进入细胞质。
[0280]
实例5
[0281]
肽5防止hg和细胞因子诱导的atp释放
[0282]
相对于基底条件(98.25
±
21.91％；p＝0.0014)，hg和细胞因子(196.5
±
12.15％)诱导了atp释放的增加(图5a)。用具有肽5(66.67
±
21.91％)的半通道阻滞剂进行的处理防止了hg和细胞因子介导的atp释放(p＝0.0003)，使得基底细胞与经肽5处理的细胞之间没有统计学上显著的差异。
[0283]
实例6
[0284]
肽5以atp依赖性方式防止hg和细胞因子诱导的细胞损伤
[0285]
为了证实保护作用是基于半通道阻滞剂处理，在存在hg和炎性细胞因子以及肽5的情况下，将外源atp添加到细胞培养基中。如先前所示，在添加hg和细胞因子的情况下，ldh释放增加并且向细胞质的连接蛋白43内化增加；然而，在存在肽5的情况下，连接蛋白43保持其正常模式并且ldh释放保持低水平。然而，外源添加的atp逆转了由肽5半通道阻滞剂所赋予的保护，如通过再一次增加的ldh释放(图5b)和连接蛋白43缝隙连接定位的变化(图5c)所测量的。
[0286]
讨论
[0287]
将teer和fitc-葡聚糖渗透性用作标志物，以在不具有或具有使用半通道阻滞剂(在这种情况下是肽5半通道阻滞剂)进行的处理的情况下用hg和促炎细胞因子的组合评估损伤后的arpe-19细胞的屏障性质。结果显示，阻滞连接蛋白43半通道能够防止hg和细胞因子介导的teer的降低和fitc-葡聚糖渗透性的升高，这支持连接蛋白43半通道可以通过rpe和brb完整性/功能调节有效地介导例如dme中的rpe破坏和brb破坏的想法。重要的是，还证明了阻滞连接蛋白43半通道保护紧密连接完整性并维持细胞膜上的zo-1定位。
[0288]
还已经报道了胞外基质组分的分泌增加为应激rpe细胞的特征。trudeau和同事发现，hg和il-1β的组合在体外增加了rpe细胞对胶原iv基因和蛋白质的表达。trudeau k等人(2011)，非诺贝特酸减少了在模拟糖尿病环境条件下生长的人视网膜色素上皮细胞中的纤连蛋白和iv型胶原过度表达：视网膜渗透性的功能含义(fenofibric acid reduces fibronectin and collagen type iv overexpression in human retinal pigment epithelial cells grown in conditions mimicking the diabetic milieu：functional implications in retinal permeability)《眼科学和视觉科学研究》52(9)：6348-6354。这与本文的结果一致，所述结果显示arpe-19细胞对胶原iv的表达响应于hg和细胞因子而增加。此外，与正常供体相比，已经在具有经证实的dr诊断的供体的基底膜中发现更高的胶原iv表达(roy s等人(1994)，人糖尿病视网膜病变中的基底膜胶原的增加的表达(increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy)《临床研究杂志(j clin invest)》93(1)：438-442)，这进一步证明了本文中的半通道阻滞剂处理防止胶原iv上调的这个发现的重要性。先前的研究已经表明，减少胶原iv上调防止基底膜增厚，所述基底膜增厚进而可以防止rpe屏障分解。出处同前。因此，例如用连接蛋白43半通道阻滞剂的阻滞半通道不仅可以通过保护紧密连接而且还可以通过帮助维持细胞稳态来保护rpe完整性。这一点也通过本文中关于从arpe-19细胞释放ldh的发现得到支持。虽然所示出的ldh释放水平指示与细胞死亡相反的细胞膜完整性丧失，但是半通道阻滞能够防止ldh释放的增加，这也支持连接蛋白43半通道阻滞将有助于维持细胞膜完整性的概念。综上所述，zo-1、胶原iv和ldh结果支持如下想法：阻滞由病理性和不受调节的连接蛋白43半通道开放诱导的atp依赖性炎性小体激活导致紧密连接、基底膜和细胞膜结构的维持。
[0289]
与这些结果一致的是本文中的在hg和细胞因子的组合损伤后缝隙连接的连接蛋白43定位被破坏的发现。先前已经报道，在dr的小鼠模型和具有经证实的dr诊断的供体中，视网膜中的连接蛋白43蛋白质表达增加。mugisho oo等人(2017)，在糖尿病视网膜病变的小鼠模型和人供体视网膜中的连接蛋白43表达的免疫组织化学表征(immunohistochemical characterization of connexin43 expression in a mouse model of diabetic retinopathy and in human donor retinas)《国际分子科学学报
(int j mol sci)》18(12)：2567。本研究支持连接蛋白43缝隙连接斑块也可以在质膜中再分布或在疾病中内化的想法。由于正常细胞功能需要通过缝隙连接进行的细胞-细胞连通，细胞膜上的缝隙连接的丧失表明导致细胞稳态丧失的病理性状态。连接蛋白43半通道阻滞维持细胞膜上的正常缝隙连接的连接蛋白43分布，并且因此维持细胞稳态。参见eugenin ea等人(2012)，缝隙连接通道在人中枢神经系统的生理和病理病状期间的作用(the role of gap junction channels during physiologic and pathologic conditions of the human central nervous system)《神经免疫药理学杂志(j neuroimmune pharmacol)》7(3)：499-518。
[0290]
先前的研究还报道胞外atp是引发nlrp3炎性小体通路的关键信号分子。上述实验评估了atp在连接蛋白43半通道介导的rpe屏障分解中的作用。结果表明，在存在外源添加的atp的情况下，ldh释放增加并且连接蛋白43缝隙连接被破坏，即使连接蛋白43半通道阻滞剂肽5也存在于培养基中。这些发现指示连接蛋白43半通道在rpe屏障渗透性中的作用也可能涉及atp释放的介导。
[0291]
总之，虽然先前的研究已经表明rpe屏障完整性的丧失主要是独立于连接蛋白43活性的zo-1(紧密连接)相关缺陷，obert e等人(2017)，用连接蛋白43模拟肽αct1靶向紧密连接蛋白闭锁小带1降低vegf依赖性rpe病理生理学(targeting the tight junction protein，zonula occludens-1，with the connexin43 mimetic peptide，alphact1，reduces vegf-dependent rpe pathophysiology)《柏林分子医学杂志(j mol med(berl))》95(5)：535-552，本研究表明，发生的rpe和brb完整性和功能的丧失以及紧密连接完整性和功能的丧失，例如主要是由连接蛋白半通道，并且具体地是连接蛋白43半通道的病理性开放引发的。连接蛋白43半通道开放导致atp释放，其进而又激活nlrp3炎性小体通路。此处发现，这导致细胞膜上的zo-1和缝隙连接的连接蛋白43定位的丧失，其促使由胶原iv表达和ldh释放反映的屏障完整性和功能以及细胞稳态的丧失。这些结果进一步支持以下概念：靶向半通道可以防止rpe和brb完整性的丧失，以及紧密连接完整性的丧失和胶原iv产生的增加，这些都发生在各种疾病、病症和病状中。如上所述，优选的连接蛋白半通道靶标不仅包含cx43半通道，而且还包含也在视网膜中发现的cx36、cx37和cx45半通道。
[0292]
***
[0293]
本文描述且请求保护的本发明具有许多属性和实施例，包含但不限于本详细公开中阐述或描述或提及的那些。其并不旨在是概括所有的，并且本文描述且请求保护的本发明并不限于本详细公开中鉴定的特征或实施例或受本发明内容中鉴定的特征或实施例限制，所述特征或实施例仅包含用于说明性而非限制性目的。本领域的普通技术人员将容易认识到，许多组分和参数可以改变或修改至一定程度、或者取代已知的等效物，而不背离本发明的范围。应该理解，此类修改和等效物在本文中引入，如同个别阐述一样。本发明还包含本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
[0294]
本文参考或提到的所有专利、出版物、科学论文、网站及其它文件和材料指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且每个此类参考的文件和材料在此以引用的方式并入，其程度如同其已个别地以引用的方式全文并入或在本文中全文阐述一样。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学论文、网站、可电子获得的信息以及其它参考的材料或
文件的任何和所有材料和信息实际并入本说明书内的权利。本说明书中对任何专利申请、专利和出版物的提及不是，也不应被视为承认或任何形式的暗示它们构成有效现有技术或在全世界任何国家构成公知常识的一部分。
[0295]
本文描述的具体方法和组合物是优选实施例的代表，并且是示例性的而不意欲作为对本发明范围的限制。考虑本说明书后，其它目的、方面和实施例将被本领域的技术人员想到，并且涵盖在如由权利要求范围限定的本发明的精神内。在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本文公开的本发明作出各种替代和修改对于本领域的技术人员而言是显而易见的。在本文中适当地说明性描述的本发明可以在不存在没有在本文中特别公开为必需的任何一个元件或多个元件或一个限制或多个限制的情况下实践。因此，例如，在本文的每种情况下，以及在本发明的实施例或实例中，术语
″
包括
″
、
″
基本上由...组成
″
和
″
由...组成
″
中的任何一个可以用本说明书中的其它两个术语中的任一个来替代。在本文中适当地说明性描述的方法和过程可以以不同的步骤顺序实施，并且其并不必限制于本文或权利要求中所指示的步骤顺序。除非上下文另有明确规定，否则也如本文以及在所附权利要求书中所使用的，单数形式
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一个(a)
″
、
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一种(an)
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和
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所述(the)
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包含复数指代物。本专利决不能被解释为限制于本文具体公开的具体实施例或实施例或方法。本专利决不能被解释为受由专利商标局的任何审查者或任何其它官员或雇员进行的任何陈述限制，除非此类陈述由申请人以回答的书面形式特别地而没有限定或保留明确地采用。此外，提供题目、标题等被以增强读者对本文档的理解，并且不应被视为限制了本发明的范围。本文提及的本发明的各方面、实施例或组分的任何实例都被视为非限制性的。
[0296]
已采用的术语和表达作为描述性而非选择性的术语使用，并且在此类术语和表达的使用中不预期不包含所示和所述特征的任何等效物或其部分，但应认识到在如要求保护的本发明范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施例和任选特征具体公开，但本领域的技术人员可以采用公开的本文概念的修改和变化，并且此类修改和变化被视为在如由附加权利要求限定的本发明的范围内。
[0297]
在本文中宽泛地且概括性地描述了本发明。落入一般性公开内容内的较窄种类和亚属分类中的每一个也形成本发明的一部分。这包含本发明的一般性描述，其条件或否定限制为从属中除去任何主题，不管删去的材料是否在此具体详述。
[0298]
其它实施例处于下述权利要求内。另外，在根据马库什基团描述本发明的特征或方面的情况下，本领域的技术人员将认识到，本发明也由此以马库什基团的任何单个成员或成员子组的形式进行描述。