用于癌症免疫治疗的组合物和方法与流程

用于癌症免疫治疗的组合物和方法
1.相关申请
2.本技术要求于2019年6月11日提交的美国临时申请no.62/860,182、2019年11月7日提交的62/932,160和2019年10月22日提交的62/924,356的权益。前述申请的整体教导在此引入作为参考。


背景技术：

3.白介素-2(il-2)是诱导抗原活化t细胞的增殖并刺激自然杀伤(nk)细胞的细胞因子。il-2的生物活性通过跨越细胞膜的三个多肽亚基的多亚基il-2受体复合物(il-2r)介导：p55(il-2rα，α亚基，人类中也称为cd25)、p75(il-2r13，β亚基，人类中也称为cd122)和p64(il-2rγ、γ亚基，人类中也称为cd132)。t细胞对il-2的反应取决于多种因素，包括：(1)il-2的浓度；(2)细胞表面上il-2r分子的数量；和(3)由il-2占据的il-2r的数量(即，il-2和il-2r之间的结合相互作用的亲和力)。il-2:il-2r复合物在配体结合后内化，并且不同组分经历差异分类。il-2rα再循环至细胞表面，而与il-2:il-2rβγ复合物相关的il-2被引导至溶酶体并被降解。
4.在癌症患者中全身施用il-2的效果很差。虽然15％至20％的患者对高剂量il-2有客观响应，但大多数没有，并且许多患者遭受严重且危及生命的副作用。阿地白介素(aldesleukin，重组人il-2(rhil-2)，也称为proleukin)被批准并用于转移性黑素瘤和rcc的治疗。
5.在目前使用的疗法中，rhil-2是在患者亚群(黑素瘤中达12％和在rcc中达7％)中引起完全且持久的反应的少数治疗方案之一。需要高剂量的rhil-2来刺激表达中等亲和力il-2受体的细胞，包括记忆cd8
+
t细胞和自然杀伤(nk)细胞，它们是介导抗癌免疫应反的主要细胞类型。
6.已经假设限制rhil-2的治疗功效的影响因素是它优先激活并诱导免疫抑制性cd4
+
t
reg
的扩增，这可以抵消抗癌免疫反应。这种优先激活是通过il-2与t
reg
上表达的高亲和力il-2受体的结合。此外，假设rhil-2与血管和肺内皮细胞上表达的高亲和力il-2r之间的直接相互作用通过毛细血管渗漏综合征导致rhil-2介导的毒性。尽管使用rhil-2的免疫疗法的耐受性差，但它仍然是在患者亚群中引起完全且持久的反应的少数转移性黑素瘤和rcc治疗方案之一。因此，需要新的il-2疗法以更有效地对抗各种癌症。


技术实现要素：

7.与例如高剂量rhil-2疗法(例如阿地白介素)相比，根据本发明的组合物、方法和治疗方案为使用il-2的免疫疗法治疗癌症提供了许多优点。已经发现，当以约6μg/kg/天至约70μg/kg/天，优选以约6μg/kg/天至约15μg/kg/天的剂量，或以基于例如平均60-70kg的成年人的相应固定每日剂量(例如0.4mg/天至约1-4mg)或基于儿童例如约12kg至50kg或更重的儿童的相应固定每日剂量施用时，seq id no:1的融合蛋白的施用在患者中提供循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在循环t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加。
优选地，相比于接受例如高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，根据本发明的方法施用seq id no:1的融合蛋白的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。还发现以相当于或高于高剂量il-2的那些剂量的剂量施用seq id no:1的融合蛋白不伴有经常伴随高剂量rhil-2的施用的毒性和副作用，例如毛细血管渗漏综合征(cls)。
8.优选地，本发明提供治疗患者癌症的方法，其包括向患者施用至少约6μg/kg/天至约15μg/kg/天的剂量，或基于例如60-70kg成人的相应固定剂量(例如约0.4mg/天至约1.0mg/天)，或基于儿童(例如约12kg至约50kg的儿童)的相应固定剂量。优选地，以μg/kg/天计的seq id no:1的融合蛋白的剂量为以下剂量：约6μg/kg/天、8μg/kg/天、10μg/kg/天、12μg/kg/天、14μg/kg/天或15μg/kg/天，或基于例如60-70kg的成人或基于儿童(例如约12kg至50kg或更重的儿童)的相应固定剂量。优选地，seq id no:1的融合蛋白的施用导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加。优选地，循环nk细胞和cd8+细胞的增加高于在向患者施用seq id no:1的融合蛋白之前的基线的至少2倍。优选地，相对于循环treg细胞的增加，循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。优选地，相比于接受高剂量rhil-2治疗的患者中相对于循环treg细胞的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环treg细胞的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。
9.优选地，相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，该患者具有改善的安全性特性。优选地，患者具有较低的毛细血管渗漏综合征或细胞因子释放综合征的风险。优选地，导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在循环t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加。优选地，相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多，并且患者具有较低的毛细血管渗漏综合征的风险。优选地，seq id no:1的融合蛋白的剂量通过静脉内注射或输液施用。
10.优选地，seq id no:1的融合蛋白以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量通过静脉内注射或输液施用，持续连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约9天的休息期。优选地，休息期为至少约16天。优选地，seq id no:1的融合蛋白施用至少两个疗程，第一疗程包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天的时间，随后是至少连续约9天的休息期，由此产生总共14天的疗程，随后是第二疗程，其包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约16天的休息期，由此产生总共21天的疗程。优选地，第二疗程在第一疗程完成后约24小时或更长时间内开始。优选地，第三个21天的疗程在第二施用疗程后。优选地，第三疗程在第二疗程完成后约24小时或更长时间内开始。优选地，第四个21天疗程在第三施用疗程后。优选地，第四疗程在第三疗程完成后约24小时或更长时间内开始。
11.优选地，施用seq id no:1的融合蛋白进一步包括向患者共同施用治疗有效量的治疗剂。优选地，治疗剂是免疫检查点抑制剂或parp抑制剂。优选地，治疗剂是免疫检查点抑制剂。优选地，免疫检查点抑制剂抑制pd-1和pd-l的相互作用。优选地，免疫检查点抑制剂是派姆单抗。
12.优选地，seq id no:1的融合蛋白施用至少两个疗程，第一疗程包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约16天的休息期，由此产生总共21天的疗程，随后是第二疗程，其包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量通过静脉内注射或输液施用至少连续5天，随后是至少连续约16天的休息期，由此产生总共21天的疗程，并且其中在第一疗程的第一天和第二疗程的第一天共同施用派姆单抗；其中在seq id no:1的融合蛋白的施用之前、同时或之后共同施用派姆单抗，优选地其中所述派姆单抗在与seq id no:1的融合蛋白不同的组合物中共同施用。优选地，派姆单抗以200mg的量通过i.v.注射或输液共同施用。
13.优选地，本发明的所有方法都导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加。优选地，相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，所述患者具有改善的安全性特性；且优选地，相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，该患者具有较低的细胞因子释放综合征的风险。优选地，相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，该患者具有较低的毛细血管渗漏综合征的风险。
14.本发明还提供了治疗患者癌症的方法，其包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量向所述患者施用seq id no:1的融合蛋白，其中所述剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约9天的休息期，从而导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加；并且其中循环nk细胞和cd8+细胞的增加高于在向患者施用seq id no:1的融合蛋白之前的基线的至少2倍；优选地，其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。
15.本发明还提供了治疗患者癌症的方法，其包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量向所述患者施用seq id no:1的融合蛋白，其中所述剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约9天的休息期，从而导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加，并且其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，所述患者具有改善的安全性特性；优选地，其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。
16.本发明还提供了治疗患者癌症的方法，其包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg的剂量向患者施用seq id no:1的融合蛋白，其中所述剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约9天的休息期，从而导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加，并且其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，所述患者具有较低的细胞因子释放综合征的风险；优选地，其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。
17.本发明还提供了治疗患者癌症的方法，其包括以每天至少约6μg/kg至约15μg/kg
的剂量向患者施用seq id no:1的融合蛋白，其中所述剂量通过静脉内注射或输液施用连续或非连续的1至约5天，随后是至少连续约9天的休息期，从而导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加，并且相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，所述患者具有的细胞因子释放综合征的风险较低，优选地其中，相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。
18.本发明还提供了包含约6μg/kg至约70μg/kg，和优选约6μg/kg至约15μg/kg的seq id no:1的融合蛋白的药物组合物；优选地，其中所述药物组合物包含约8μg/kg至约15μg/kg的seq id no:1的融合蛋白，优选地其中所述药物组合物包含约8μg/kg的seq id no:1的融合蛋白；优选地，其中所述药物组合物包含约10μg/kg的seq id no:1的融合蛋白；优选地，其中所述药物组合物包含约12μg/kg的seq id no:1的融合蛋白；优选地，其中所述融合蛋白包含约14μg/kg的seq id no:1的融合蛋白；并且优选地，其中所述融合蛋白包含约15μg/kg的seq id no:1的融合蛋白。
19.本发明还提供了治疗患者癌症的方法，其包括以至少约50μg/kg/天至约60μg/kg/天的剂量或以基于平均60-70kg的成人的相应固定每日剂量(例如约3.0mg/天至约3.6mg/天)的剂量向患者施用seq id no:1的融合蛋白，其中所述剂量每周一天通过静脉内注射或输液施用，从而导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在循环t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加，并且其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多，并且其中相比于接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者，所述患者具有的毛细血管渗漏综合征的风险更低。
20.本发明还提供一种药物组合物，其包含至少约6μg/kg至约70μg/kg，并且优选至少约6μg/kg至约15μg/kg，或基于平均60-70kg的成人的相应固定每日剂量(例如约0.4mg至约1.0mg)，或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量的seq id no:1的融合蛋白。
21.本发明还提供了一种药物组合物，其包含约40μg/kg至约70μg/kg，或基于例如平均60-70kg的成人的相应固定剂量(例如约3.0mg至约3.6mg)，或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量的seq id no:1的融合蛋白；优选地，其中所述组合物包含约40μg/kg至约70μg/kg的seq id no:1的融合蛋白。
22.本发明还提供了治疗患者的癌症的方法，其包括向患者施用小于6μg/kg/天(例如约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5和5.9μg/kg/天)的剂量，或基于例如60-70kg的成人的相应固定剂量(例如约0.2mg/天至约0.4mg/天)，或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量的seq id no:1的融合蛋白，从而导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在循环t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加，并且其中相对于循环t调节(treg)的增加，循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。
附图说明
23.本发明的前述和其它的目的、特征和优点将从以下如附图所示的对本发明的优选
实施方案更具体的描述中明显看出，附图中相同附图标记在不同的视图中表示相同的部件。附图不必然按比例绘制，而是重点在于说明本发明的原理。
24.图1显示了seq id no:1的融合蛋白(图面a)及其选择性结合中等亲和力il-2受体(图面b)的结构模型示意图。图面1a和1b中的结构模型是利用与三聚体高亲和力受体结合的人il-2的四元复合物的实验测定的晶体结构产生的(wang等，science.2005；310(5751):1159-1163.doi:10.1126/science.1117893)。
25.图2是实施例1所描述的首次人体(fih)研究中，seq id no:1的融合蛋白作为单一疗法和作为与派姆单抗的组合疗法的静脉内(i.v.)输液的治疗方案的示意图。
26.图3是显示根据本发明在人类患者中各种不同剂量下seq id no:1的融合蛋白的全身暴露的图。
27.图4是显示已使用根据本发明的seq id no:1的融合蛋白治疗的人类患者中循环treg细胞、nk细胞和cd8+细胞反应的图。
28.图5是显示如实施例2所述暴露于高剂量rhil-2的患者的药效学反应的图。
29.图6是显示如实施例2所述暴露于高剂量rhil-2的患者的药效学反应的图。
30.图7是显示用seq id no:1作为单一疗法治疗的那些患者中治疗持续时间和按照肿瘤类型的总体反应的图。
31.图8是显示在用seq id no:1作为与派姆单抗的组合疗法治疗的那些患者中治疗持续时间和按照肿瘤类型的总体反应的图。
32.图9是显示用8seq id no:1作为与派姆单抗的组合疗法治疗的那些患者中按照肿瘤类型的肿瘤尺寸相对于基线的变化的图。
33.图10是显示用8、20或30μg的seq id no:1的小鼠直系同源物治疗的小鼠中炎性细胞因子tnfα和il-6的水平的系列图。
34.图11是显示seq id no:1的第一iv剂量(0.1、0.3、1、3、6或8μg/kg)后(第1周期第1天(c1d1))，患有晚期实体肿瘤的患者中seq id no:1的平均(
±
标准偏差)血清浓度(ng/ml)的图。
35.图12是显示seq id no:1的第一iv剂量(0.1、0.3、1、3、6或8μg/kg)后(第1周期第1天(c1d1))，患有晚期实体肿瘤的患者中的平均(
±
标准偏差)最大血清浓度(c
max
)(左)和从时间0到最后可测量浓度的浓度-时间曲线下面积(auc
last
)(右)的图。
36.图13是显示以0.1、0.3、1、3、6或8μg/kg的剂量用iv seq id no:1的前两个治疗周期后，患有晚期实体肿瘤的患者中的总nk细胞(顶部)、总cd8+t细胞(中间)和t
reg
(底部)的平均(
±
标准误差)绝对计数(细胞/μl血液)的图。
37.图14是显示相对于基线的平均(
±
标准误差)倍数变化(fcb)的图。在以0.1、0.3、1、3、6或8μg/kg的剂量用iv seq id no:1的前两个治疗周期后，患有晚期实体肿瘤的患者中在周期1第8天(c1d8)和周期2第8天(c2d8)的总nk细胞(左)、总cd8+t细胞(中)和t
reg
细胞(右)的绝对计数。
38.图15是显示以0.1、0.3、1、3、6或8μg/kg的剂量用iv seq id no:1的前两个治疗周期后，患有晚期实体肿瘤的患者中ifnγ(左)和il-6(右)的平均(
±
标准误差)最大血清浓度(pg/ml)、(
±
标准误差)的图。
具体实施方式
39.定义
40.本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的根据本发明的具体实施方案的许多等同物。本发明的范围不限于以下描述，而是如所附权利要求中所述。
41.在权利要求中，除非与上下文相反或从上下文明显看出，冠词如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”可以指一个或多于一个。除非与上下文相反或从上下文明显看出，如果组成员的一个、多于一个或所有存在于、被用于或以其他方式与给定的产品或方法相关，则在一个组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被认为是满足的。本发明包括其中所述组中恰好一个成员存在于、使用于或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明包括其中组成员的多于一个或所有存在于、使用于或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。
42.还应当注意，术语“包括”是开放式的，并且允许但不要求包括附加的元素或步骤。当本文使用术语“包括”时，术语“由
…
组成”因此也被涵盖和公开。
43.当给出范围时，其包括端点。而且，应当理解除非另有说明或从上下文和本领域内技术人员的理解可明显看出，否则表示为范围的值可被认为是在本发明的不同实施方案中所述的范围内的任何具体的值或子范围，至范围下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确规定。
44.如本文所用，应用于一个或多个目标值的术语“约”或“大约”是指类似于所述基准值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入所述基准值的任一方向(大于或小于)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的值的范围，除非另有说明或从上下文明显看出(除非这样的数值超过可能值的100％)。
45.如本文所用，术语“基本上”是指表现出所需特征或性质的完全或几乎完全的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)达到完成和/或进行到完整或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于描绘在许多生物和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
46.如本文所用，“组合”、“组合疗法”和/或“组合治疗方案”的任何施用或共同施用形式是指至少两种治疗活性剂或组合物，其可以在单独的或组合的制剂中同时地施用或共同施用，或在分隔数分钟、数小时或数天的不同时间依序地施用或共同施用。通常，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。
47.如本文所用，术语“肠胃外”是指旨在作为注射或输液施用的剂型，包括皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、心内、鞘内和肌内注射，以及通常通过静脉内途径的输液注射。
48.术语“治疗剂”包括在需要此类治疗的个体中施用用于治疗症状或疾病的seq id no:1之外或与seq id no:1组合的任何药剂。这样的附加治疗剂可以包含适合于所治疗的特定适应症的任何活性成分，优选彼此没有不利影响的具有互补活性的那些。
49.术语“化疗剂”是指可以与癌细胞相互作用从而降低细胞的增殖状态和/或杀死细胞的化合物或其衍生物，例如通过损害细胞分裂或dna合成、或通过破坏dna，有效靶向快速分裂的细胞。化疗剂的示例包括但不限于烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺)；代谢拮抗剂(例如甲氨蝶呤(mtx)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)；取代的核苷酸；取代的核苷；dna去甲基化剂(也称为抗代谢物；例如，阿扎胞苷)；抗肿瘤抗生素(例如丝裂霉素、阿霉素)；植物来源的
抗肿瘤剂(例如长春新碱、长春地辛、紫杉醇、abraxane)；顺铂；卡铂；依托泊苷等。这样的药剂可进一步包括但不限于抗癌剂三甲曲沙(tmtx)；替莫唑胺；雷替曲塞；s-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(nbmpr)；6-苄基胍(6-bg)；亚硝基脲，亚硝基脲(吡喃阿拉伯糖基-n-甲基-n-亚硝基脲)(aranose)、卡莫司汀(bcnu，bicnu)、氯唑菌素、乙基亚硝基脲(enu)、氟替莫司汀、洛莫司汀(ccnu)、尼莫司汀、n-亚硝基-n-甲基脲(nmu)、瑞莫司汀(mcnu)、司莫司汀、链脲菌素(streptozotocin)；阿糖胞苷；和喜树碱；或其任一的治疗性衍生物。
50.如本文所用，单一“疗程”如第一疗程、第二疗程、第三疗程等等是指一个治疗方案，其中融合蛋白施用所需的时间段，例如连续或非连续的1至约5天的治疗，或每周施用一次、随后是一定连续天数的休息期。因此，一个疗程包括向患者连续或非连续施用融合蛋白的一段时间，随后是连续数天的休息期，所述休息期中不向患者施用融合蛋白。
51.术语“融合蛋白”是指通过它们各自的n-和c-末端氨基酸残基(反之亦然)之间的肽键，或通过插入的蛋白或肽的n-和c-末端的两个肽键将第一蛋白或肽插入第二蛋白或肽的内部区域中而与其他蛋白或肽连接在一起的蛋白质或肽。肽键是在一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间形成的共价化学键。通过在表达宿主中表达融合蛋白基因产生融合蛋白，其中第一蛋白或肽的编码序列被连接至第二蛋白或肽的编码序列。
52.术语“融合蛋白”指seq id no:1的融合蛋白。本发明还涉及seq id no:1的融合蛋白的变体的用途，所述变体是具有与seq id no:1的约20个氨基酸至全长的连续片段具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。与seq id no:1相比，seq id no:1的变体在限定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)上可具有限定的序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过局部同源性算法(smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981))，通过同源性比对算法(needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970))，通过相似性检索方法(pearson &lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa 85:2444(1988))，通过这些算法的计算机化实现(wisconsin genetics software package,madison,wis.的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或通过人工比对和目视检查(参见例如current protocols in molecular biology(ausubel等，eds.1995supplement))。
53.作为示例，seq id no:1的融合蛋白的变体可包含与至少20个氨基酸，并且优选约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至seq id no:1的全长的seq id no:1的连续片段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
54.术语“il-2疗法”包括基于il-2的免疫疗法的施用及其作为免疫疗法的相关生物功能，包括但不限于维持cd4
+
调节性t细胞和cd4
+
t细胞分化为多种亚群；cd8
+
t细胞和nk细胞细胞毒性活性的促进，以及响应于抗原的t细胞分化程序的调节，从而促进幼稚cd4
+
t细胞分化成t辅助-1(th1)和t辅助-2(th2)细胞而同时抑制t辅助-17(th17)分化。因此，本文所用的“il-2疗法”包括但不限于用rhil-2或rhil-2的变体(如seq id no:1的融合蛋白)的免疫疗法。
55.术语“高剂量il-2”和“hd il-2”包括约或至少约600,000国际单位(iu)/kg体重(kg)/剂，或约或至少约720,000iu/kg/剂的白介素-2(il-2)的剂量。
56.术语“低剂量il-2”和“ld il-2”包括小于约600,000iu/kg体重/剂的白介素-2(il-2)剂量，例如约60,000或约72,000iu/kg/剂，如约60,000至约72,000iu/kg/剂。
57.如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的，可施用根据本公开的组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类和人类)和/或植物。优选地，“患者”是指可能寻求或需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、将接受治疗的人类受试者，或由受过训练的专业人员对于特定疾病或病症进行护理的受试者。“患者”可以是儿童(》1-17岁)。在其它实施方案中，患者可以是婴儿(1岁及以下)。在其他实施方案中，患者可以是儿科患者，其中术语“儿科”如本领域技术人员所理解的使用。例如，儿科患者包括婴儿、儿童和青少年。
58.本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触且没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
59.如本文所用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低发展与感染、疾病、病症和障碍和/或病症相关的病理学的风险。
60.本文所用的术语“蛋白质”或“肽”是指通过肽键连接在一起的至少两个或更多个氨基酸残基。蛋白质或肽的氨基酸序列以标准形式显示，即从氨基末端(n-末端)到羧基末端(c-末端)。
61.术语“重组产生”是指将两个或更多个dna序列操作和组合在一起的技术，其包括重组、pcr(聚合酶链式反应)、体外诱变和直接dna合成。这些技术描述于许多出版的书籍和手册中，包括“当代分子生物学指南”(ausubel eds.2008.john wiley&son)。
62.如本文所用，术语“基本上”是指表现出所需特征或性质的完全或几乎完全的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)达到完成和/或进行到完整或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于描绘在许多生物和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
63.短语“治疗有效量”或“有效量”是指单独或作为药物组合物的一部分并且以单一剂量或作为一系列剂量的部分将药剂向受试者的施用，其量在施用于受试者时能够对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用。治疗有效量可以通过测量相关生理效应来确定，并且可以结合给药方案和受试者病症的诊断分析等来调节。例如，施用后产生的炎性细胞因子的量的测量可以指示是否已经使用治疗有效量。关于与不受调节的细胞分裂相关的癌症或病理，治疗有效量是指具有以下效果的量：(1)减小肿瘤的大小(即肿瘤消退)，(2)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)异常细胞分裂，例如癌细胞分裂，(3)防止或减少癌细胞的转移，和/或(4)在一定程度上缓解(或优选地消除)与部分地涉及不受调节的或异常的细胞分裂或由其引起的病理(包括例如癌症)相关的一种或多种症状。“有效量”也是在施用本发明的治疗活性组合物时产生期望的pd和pk特征和期望的
免疫细胞谱型的量。
64.如本文所用的术语疾病(或病状或病症)的“治疗”或“疗法”是指在可能易患疾病但尚未经历或表现出疾病症状的人类受试者或动物受试者中防止疾病发生(预防性治疗)、抑制疾病(减缓或阻止其发展)、提供疾病症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)以及引起疾病消退。术语“治疗”、“治疗的”、“处理”、“治疗性的”和“疗法”并不是必然指完全治愈或消除疾病或病状。疾病或病状的任何不期望的体征或症状的任何程度的任何缓解均可被认为是治疗和/或疗法。此外，治疗可包括可能使患者的总体健康或外观感觉恶化的行动。关于癌症，这些术语还指受癌症影响的个体的预期寿命可能增加或疾病的一种或多种症状将减少。关于癌症，“治疗”还包括增强或延长受试者中的抗肿瘤反应。
65.在本文所述的癌症的背景下使用的“无进展生存期(pfs)”是指在癌症治疗期间和之后直至患者的客观肿瘤进展或死亡的时间长度。治疗可通过客观或主观参数评估，包括身体检查、神经学检查或心理评估的结果。在优选的方面，pfs可以通过盲法成像中心审核来评估，并且可进一步任选地通过orr或盲法独立中心审核(bicr)来确认。
[0066]“总生存期(os)”可以通过kaplan-meier方法在某些时间点(例如，1年和2年)的os率来评估，并且对应95％ci将通过每种肿瘤类型的研究治疗基于greenwood公式推导。os率被定义为在该时间点存活的参与者的比例。参与者的os被定义为从首次给药日期到因任何原因死亡的日期的时间。
[0067]
如本文所用的“完全反应”是响应于治疗的所有癌症体征的消失。完全反应在本文中也可称为“完全缓解”。
[0068]
如本文所用的术语“部分反应”是指响应治疗的肿瘤大小、或体内癌症程度的降低。部分反应在本文中也可称为“部分缓解”。
[0069]
如本文所用，术语“癌症”应被赋予其通常含义，作为其中异常细胞分裂不受控制的疾病的统称。
[0070]
如本文所用的术语“减少肿瘤”或“肿瘤消退”是指肿瘤团块的大小或体积减小、受试者中转移的肿瘤的数目减少、癌细胞的增殖状态(癌细胞扩增的程度)减弱等。
[0071]
如本文所用，术语“增强”是指允许受试者或肿瘤细胞改善其对本文公开的治疗的反应的能力。例如，增强的反应可以包括至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多的反应性的增加。如本文所用，“增强”还可指增加对治疗(例如包含化学疗法、抗药性免疫活性细胞和免疫检查点抑制剂的组合疗法)有反应的受试者的数目。例如，增强的反应可以指对治疗有反应的受试者的总百分比，其中该百分比为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或以上。
[0072]“免疫检查点蛋白”调节免疫系统中的t细胞功能。t细胞在细胞介导的免疫中起重要作用。免疫检查点蛋白与向t细胞发送信号的特定配体相互作用，并且基本上切断或抑制t细胞功能。癌细胞通过驱动免疫检查点蛋白在其表面上的高水平表达来利用该系统，这导致控制进入肿瘤微环境的t细胞表面上表达免疫检查点蛋白的t细胞，由此抑制抗癌免疫反应。因此，本文称为“免疫检查点蛋白抑制剂”或“免疫检查点抑制剂”的药剂对免疫检查点蛋白的抑制将导致t细胞功能的恢复和针对癌细胞的免疫反应。免疫检查点蛋白的示例包括但不限于：ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、
kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1、chk2、a2ar、ox40、b-7家族配体或其组合。优选地，免疫检查点抑制剂与免疫检查点蛋白的配体相互作用，所述免疫检查点蛋白可以是ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista，kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1、chk2、ox40、a2ar、b-7家族配体或其组合。免疫检查点抑制剂的示例包括但不限于：pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂、ctla-4拮抗剂、腺苷a2a受体拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂、btla拮抗剂、kir拮抗剂、lag3拮抗剂、tim-3拮抗剂、vista拮抗剂或tigit拮抗剂。
[0073]
如本文所用，术语“血管生成抑制剂”是指防止新血管形成的药物、化合物、抗体或其它药剂。在癌症治疗中，血管生成抑制剂可以防止肿瘤生长需要的新血管的生长。血管生成抑制剂包括可以靶向与受体酪氨酸激酶(rtk)相关的一种或多种信号通路的那些药剂。rtk包括但不限于血管内皮生长因子受体1、2和3型(vegfr1-3)；血小板衍生生长因子受体α和β型(pdgfrα/β)和成纤维细胞生长因子受体(fgfr)1、2和3型(fgfr1-3)。根据本发明的优选的血管生成抑制剂具有广泛的靶标选择性且能够实现多种rtk的同时靶向抑制，并且在本文中称为“多受体酪氨酸激酶抑制剂”。
[0074]“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的且具有其母体化合物的所需药理学活性的本公开的化合物的盐。特别地，这样的盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。具体地，这样的盐包括：(1)与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)形成的酸加成盐；或与有机酸(例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等)形成的酸加成盐；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替换时形成的盐；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、n-甲基葡糖胺等)配位时形成的盐。盐进一步包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当该化合物含有碱性官能团时，无毒的有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
[0075]
通常，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或游离碱形式与化学计量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表参见allen，jr.，l.v.，ed.，remington：the science and practice of pharmacy，22nd edition，pharmaceutical press，london，uk(2012)。
[0076]
seq id no：1的融合蛋白
[0077]
wo 2013/184942中描述的重组人il-2变体融合蛋白是与il-2受体的il-2rα部分的细胞外结构域融合的环状序列重组(cp)的il-2变体，并且在本文中称为“seq id no：1的融合蛋白”或“融合蛋白”，并且具有以下氨基酸序列：
[0078][0079]
可以预期与seq id no：1密切相关的融合蛋白(例如在seq id no：1的全长上具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列同一性的那些融合蛋白)也可适于根据本发明的方法的施用。可以预期与seq id no：1密切相关的融合蛋白(例如在seq id no:1的至少约20个氨基酸至全长的连续序列上具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列同一性的那些融合蛋白)也可适于根据本发明的方法的施用。
[0080]
seq id no:1的融合蛋白可使用生物重组表达系统或任何蛋白合成仪产生。重组蛋白表达的策略是本领域内众所周知的，且通常包括用含有编码seq id no:1的融合蛋白的遗传模板的dna载体转染细胞，然后培养细胞使得它们转录和翻译融合蛋白。通常，然后裂解细胞以提取表达的蛋白质用于随后的纯化。原核和真核体内蛋白表达系统被广泛使用。优选地，seq id no:1的融合蛋白在cho细胞中产生。
[0081]
本发明提供了至少约6μg/kg至约70μg/kg的seq id no:1的融合蛋白剂量的药物组合物，并且优选至少约6μg/kg至至少约15μg/kg的seq id no:1的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂，或基于平均60-70kg成人(例如约0.4mg至约1.0mg)或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量的药物组合物。本发明还提供至少约6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15μg/kg的剂量，或基于例如平均60-70kg成人或基于例如约12kg至约50kg或更重的儿童的相应固定剂量的药物组合物。
[0082]
本发明还提供了至少约3μg/kg至至少约5.5μg/kg的seq id no:1的融合蛋白的剂量和药学上可接受的赋形剂或基于平均60-70kg成人的相应固定剂量(例如约0.2mg至约0.4mg)的药物组合物。本发明还提供了至少约3、3.5、4、4.5、5、5.5μg/kg的剂量或基于平均60-70kg成人或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量的药物组合物。
[0083]
本发明还提供了至少约40μg/kg至至少约70μg/kg的剂量的seq id no:1的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂或基于平均60-70kg成人(例如约3.0mg至约3.6mg)或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量的药物组合物。
[0084]
如本文所用，药学上可接受的赋形剂包括适合于所需的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。remington’s the science and practice of pharmacy,21st edition,a.r.gennaro(lippincott,williams&wilkins,baltimore,md.,2006；通过引用并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂及其制备的已知技术。
[0085]
除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的
生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则其用途预期在本公开的范围内。
[0086]
用于口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、混悬液、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。
[0087]
除惰性稀释剂外，口服组合物可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂(例如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合)混合。
[0088]
可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性混悬剂)可使用合适的分散剂、润湿剂和/或助悬剂根据已知技术配制。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载体和溶剂是水、ringer’s溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。无菌不挥发的油通常被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发的油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(例如油酸)可用于制备注射剂。
[0089]
可注射制剂可被消毒，例如通过经由细菌截留过滤器过滤和/或通过并入无菌固体组合物形式的灭菌剂消毒，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌注射介质中。在药物剂的配制和/或制造中的一般考虑可以发现于例如remington’s the science and practice of pharmacy,21st edition,a.r.gennaro(lippincott,williams&wilkins,baltimore,md.,2006；通过引用并入本文)。
[0090]
seq id no:1的融合蛋白(图1a)被设计为选择性地结合并激活中等亲和力il-2r，而不是高亲和力il-2r。seq id no:1的融合蛋白的il-2rα结构域用于在空间上阻碍seq id no:1的融合蛋白与高亲和力il-2r的结合，但仍允许与中等亲和力il-2r的结合。
[0091]
体外和体内非临床药效学(pd)数据支持由seq id no:1的融合蛋白通过中等亲和力il-2受体的选择性信号传导，由此导致效应细胞(例如nk细胞和cd8+细胞)的活化和扩增，同时最小化免疫抑制性t
reg
的活化和扩增。此外，在小鼠体内，seq id no:1的融合蛋白在引起效应细胞相对于t
reg
的相等或更大扩增的剂量下展现出相对于rhil-2改善的耐受性。
[0092]
另外的非临床数据表明，iv或sc施用seq id no:1的融合蛋白在小鼠同源肿瘤模型中导致等同的肿瘤生长抑制，以及以任一施用方式向食蟹猴施用后nk和cd8
+
t细胞的相似外周扩增。
[0093]
实施例1所描述的首次人体临床数据表明seq id no:1的融合蛋白以剂量依赖性方式激活cd8+细胞和nk细胞的扩增，而不存在treg的剂量依赖性激活。因此，seq id no:1的融合蛋白可以相比于高剂量rhil-2引起等同或更多nk细胞和cd8+细胞的扩增的浓度在人类患者中施用，但与高剂量rhil-2相比具有低得多(至少低两倍)的免疫抑制性treg的相对扩增(表2)。该结果是出乎意料的。
[0094]
给药方案
[0095]
优选地，根据本发明的方法和给药方案向癌症患者施用seq id no:1的融合蛋白。
优选的施用途径是静脉内，例如静脉内注射和静脉内输液，例如经由中心静脉通路。另外的施用途径包括皮下、肌内、口服、鼻和肺部施用。优选地，融合蛋白可以作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
[0096]
优选地，本发明提供用于静脉内(i.v.)施用的药物组合物，其包含以μg/kg为单位的seq id no:1的融合蛋白的剂量，如通常优选用于计算儿科患者中的剂量，但也可用于计算成人的剂量，优选以下剂量：约0.1μg/kg至约70μg/kg；约1μg/kg至约70μg/kg；约1μg/kg至约50μg/kg；约1μg/kg至约30μg/kg；约1μg/kg至约25μg/kg；约1μg/kg至约15μg/kg；约1μg/kg至约10μg/kg；约1μg/kg至约5μg/kg；约1μg/kg至约3μg/kg；约6μg/kg至约70μg/kg；约6μg/kg至约50μg/kg；约6μg/kg至约30μg/kg；约6μg/kg至约25μg/kg；约6μg/kg至约15μg/kg；约6μg/kg至约10μg/kg；约6μg/kg至约8μg/kg；约8μg/kg至约70μg/kg；约8μg/kg至约50μg/kg；约8μg/kg至约30μg/kg；约8μg/kg至约25μg/kg；约8μg/kg至约15μg/kg；约8μg/kg至约10μg/kg；约10μg/kg至约70μg/kg；约10μg/kg至约50μg/kg；约10μg/kg至约30μg/kg；约10μg/kg至约25μg/kg；约10μg/kg至约15μg/kg；约12μg/kg至约12μg/kg；约12μg/kg至约50μg/kg；约12μg/kg至约30μg/kg；约12μg/kg至约25μg/kg；约12μg/kg至约15μg/kg；约14μg/kg至约70μg/kg；约14μg/kg至约50μg/kg；约14μg/kg至约30μg/kg；约14μg/kg至约25μg/kg；约30μg/kg至约70μg/kg；约30μg/kg至约50μg/kg；约40μg/kg至约70μg/kg；约40μg/kg至约50μg/kg；约50μg/kg至约70μg/kg；约50μg/kg至约60μg/kg；或其基于例如60-70kg成人的相应固定剂量(例如约1mg至约4mg)或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量。
[0097]
优选地，seq id no:1的融合蛋白以至少约6μg/kg/天至至少约15μg/kg/天的剂量或基于例如平均60-70kg成人的相应固定每日剂量(例如约0.4mg/天至约1.0mg/天)或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定每日剂量通过i.v输液施用至患者。优选地，剂量为约6μg/kg/天。优选地，剂量为约8μg/kg/天。优选地，剂量为约10μg/kg/天。优选地，剂量为约12μg/kg/天。优选地，剂量为约14μg/kg/天。优选地，剂量为约15μg/kg/天。优选地，剂量为约6μg/kg/天、6.5μg/kg/天、7μg/kg/天、7.5μg/kg/天、8μg/kg/天、8.5μg/kg/天、9μg/kg/天、9.5μg/kg/天、11μg/kg/天、11.5μg/kg/天、12μg/kg/天、12.5μg/kg/天、13μg/kg/天、13.5μg/kg/天、14μg/kg/天、14.5μg/kg/天、15μg/kg/天或基于平均60-70kg成人的相应固定每日剂量或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定每日剂量。
[0098]
甚至可以考虑向患者施用更高的剂量，例如16μg/kg/天、18μg/kg/天、20μg/kg/天、22μg/kg/天、24μg/kg/天、26μg/kg/天、28μg/kg/天、30μg/kg/天、40μg/kg/天、60μg/kg/天、70μg/kg/天的剂量或基于例如平均60-70kg成人的相应固定每日剂量(例如约1mg至约4mg)或基于例如约12kg至约50kg或更重的儿童的相应固定剂量。
[0099]
优选地，seq id no:1的融合蛋白以每天单次i.v.输液施用。单次i.v.输液可能需要5分钟至2小时。
[0100]
优选地，施用融合蛋白的给药方案提供一个或多个疗程。单个疗程可以在1-90天的天数内进行。优选地，单个疗程延伸14天或21天的时间。治疗过程可包括连续的多天，其中通过i.v.输液向患者每天施用一次融合蛋白，随后连续多天不向患者施用融合蛋白，本文也称其为“休息期”。可以预期的是，如果例如患者在连续每日施用时感到不适，则施用日
可以是非连续的。优选地，向患者施用融合蛋白连续的至少约1、2、3、4或5天。优选地，融合蛋白的施用不需要是连续的且可在非连续的1、2、3、4或5天的过程中进行。优选地，通过i.v.输液每天一次向患者施用融合蛋白连续的1至约5天。优选地，每天一次向患者施用融合蛋白非连续的1至5天，例如第1天输液和下一次输液前间隔一天或两天等，在休息期前达到所需的总输液天数。
[0101]
优选地，第一疗程包括通过i.v.输液施用融合蛋白，每天一次，连续五(5)天，随后为9天的休息期，达到持续约14天的第一疗程。优选地，第二疗程在第一疗程之后。第二疗程可在第一疗程后的任何时间开始，但优选在第一疗程结束后约24小时或更长时间内开始。
[0102]
优选地，第二疗程包括通过i.v.输液每天一次施用seq id no:1的融合蛋白，连续五(5)天，随后为连续至少约16天的休息期，达到持续约21天的疗程。附加的疗程如第三、第四和第五疗程可以在第二疗程之后，优选在前一疗程结束后约24小时内开始。优选地，第一疗程之后的所有疗程是至少约21天的疗程。
[0103]
优选地，融合蛋白与下文所述的另一治疗剂和/或抗癌剂一起施用。优选地，治疗剂是免疫检查点抑制剂派姆单抗。优选地，派姆单抗在与融合蛋白不同的组合物中施用，并且优选地在融合蛋白输液之前、之后或同时通过i.v.输液施用。优选地，派姆单抗以约200μg的剂量或根据标准处方建议每天一次施用。优选地，派姆单抗在每个疗程的第一天与融合蛋白一起施用。示例性的治疗方案如图2所示。优选地，当共同施用融合蛋白和派姆单抗时，使用融合蛋白的第一疗程和所有后续的疗程(例如疗程2、3、4和5)通常为约21天疗程，其中融合蛋白通过i.v.输液每天一次施用连续五(5)天，然后在下一个疗程之前是至少连续约16天的休息期。如上所述，施用天数不需要是连续的，并且可以在非连续的1、2、3、4或5天中进行。
[0104]
本发明还提供了一种给药方案，其中seq id no:1的融合蛋白周期性施用，例如仅每约3天一次至每约60天一次。优选地，周期性给药是每约3天一次至每约21天一次。优选地，周期性给药是每3天一次、每4天一次、每7天一次、每14天一次或每21天一次。根据该周期性给药，例如每周一次给药方案，融合蛋白的剂量按照每周一次施用，例如，其中剂量为约40μg/kg至约70μg/kg；优选地，其中所述剂量为约50μg/kg至约60μg/kg；或基于例如60kg至70kg成人或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的其相应固定剂量。
[0105]
优选地，在每个治疗周期的第1天、第7天、第14天和第21天通过i.v.输液施用seq id no:1的融合蛋白。优选地，在每个治疗周期的第1天和第14天通过i.v.输液施用seq id no:1的融合蛋白。优选地，在每个治疗周期的第1天和第21天通过i.v.输液施用seq id no:1的融合蛋白。优选地，在每个治疗周期的第1天、第7天和第14天通过i.v.输液施用seq id no:1的融合蛋白。优选地，在每个治疗周期的第1天、第7天和第21天通过i.v.输液施用seq id no:1的融合蛋白。
[0106]
优选地，seq id no:1的融合蛋白周期性施用，例如，在治疗周期中的一天或多天通过i.v.输液向患者施用seq id no:1的融合蛋白，其中治疗周期中的每次i.v.施用间隔约7天、约14天或约21天或其任何组合，只要seq id no:1的施用不在连续日以约6μg/kg/天至约15μg/kg/天的剂量或以约16μg/kg/天至约70μg/kg/天的剂量或基于例如平均60-70kg成人的相应固定每日剂量(例如约1mg至约4mg)或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定每日剂量发生。
[0107]
优选地，seq id no:1的融合蛋白周期性施用，例如，在治疗周期中的一天或多天通过i.v.输液向患者施用，其中治疗周期中的每次i.v.施用间隔约7天、约14天或约21天或其任何组合，只要seq id no:1的施用不在连续日，优选以约16μg/kg/天至约70μg/kg/天的剂量；优选以约16μg/kg/天至约50μg/kg/天的剂量；优选以约16μg/kg/天至约30μg/kg/天的剂量；优选以约16μg/kg/天至约20μg/kg/天的剂量；优选以约30μg/kg/天至约50μg/kg/天的剂量；或基于例如平均60-70kg成人的相应固定每日剂量(例如约1mg至约4mg)或基于例如约12kg至约50kg或更重的儿童的相应固定剂量发生。
[0108]
优选地，周期性给药是通过i.v.输液施用。优选地，第二治疗剂/抗癌剂(例如派姆单抗)是与seq id no:1的融合蛋白共同施用，优选在seq id no:1的融合蛋白施用之前、之后或同时或在同一天通过i.v.输液施用。
[0109]
本发明的方法还考虑了其中以小于约6μg/kg/天的剂量或以基于60-70kg人或基于约12kg至约50kg或更重的儿童的其固定等同剂量每天一次施用seq id no:1的融合蛋白的给药方案。例如，可向患者施用约3、3.5、4、4.5、5、5.5μg/kg/天的剂量或基于例如平均60-70kg成人的相应固定每日剂量或基于儿童(例如约12kg至约50kg或更重的儿童)的相应固定剂量。根据上文所述涉及6μg/kg/天至15μg/kg/天之间的剂量的任何给药方案，可以施用小于约6μg/kg/天或基于60-70kg人的其固定等同剂量的每天一次给药方案。
[0110]
上述本发明的所有给药方案优选地导致患者中循环nk细胞和cd8+细胞的剂量依赖性增加，而不存在t调节(treg)细胞的剂量依赖性增加，并且优选地导致患者中相对于循环treg细胞的增加更多的循环nk细胞和cd8+细胞的增加。与高剂量或低剂量rhil-2疗法相比，本发明的所有给药方案优选地需要更低频率的给药，例如相比于高剂量或低剂量rhil-2的每天给药3次，每天一次给药seq id no:1的融合蛋白。
[0111]
优选地，施用seq id no:1的融合蛋白导致的循环cd8+t细胞的增加是相比于基线的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、约9倍、约10倍或更多。优选地，由seq id no:1的融合蛋白的施用导致的循环cd8+t细胞的增加的比率相对于循环t调节细胞的增加的比率更大。
[0112]
优选地，seq id no:1的融合蛋白及其药物组合物与一种或多种免疫检查点抑制剂组合以治疗和/或预防各种疾病、病症和病状(例如，癌症)受到利用特定施用参数的影响，所述特定施用参数用于最小化与单独疗法本身的施用相关的任何不良反应。举例而言，在包含免疫检查点抑制剂(例如派姆单抗)的治疗方案中添加seq id no:1的融合蛋白的施用可允许实现治疗目标所需的免疫检查点抑制剂的量减少，因此减少(或甚至消除)严重且致命的免疫介导的不良反应，所述不良反应促使fda对于某些免疫检查点抑制剂(例如派姆单抗)要求“黑框”警告。
[0113]
通常，本文所述的使用seq id no:1的融合蛋白的单一疗法或任何组合疗法的施用参数规定剂量量小于可能对受试者产生不可逆毒性的量(即，最大耐受剂量“mtd”)且不小于对受试者产生可测量效果所需的量。这样的量是通过例如与adme相关的药代动力学和药效学参数并考虑施用途径和其它因素来确定的。
[0114]
有效剂量(ed)是在服用它的受试者的某些部分中产生治疗反应或所需效果的药剂的剂量或量。药剂的“中值有效剂量”或ed50是在其所施用的群体的50％中产生治疗反应或所需效果的药剂的剂量或量。尽管ed50通常用作药剂效果的合理预期的量度，但考虑到
所有相关因素，其不一定是临床医生认为合适的剂量。因此，在一些情况下，有效量可以大于计算的ed50，在其他情况下，有效量可以小于计算的ed50，并且在另外的其他情况下，有效量可以与计算的ed50相同。
[0115]
此外，seq id no:1的融合蛋白的有效剂量可以是当以一个或多个剂量施用于受试者时，相对于健康受试者产生期望结果的量。例如，对于经历特定病症的受试者，有效剂量可以是改善该病症的诊断参数、量度、标志物等至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％的剂量，其中100％被定义为正常受试者表现出的诊断参数、量度、标志物等。
[0116]
优选地，如果在初始治疗后癌症再次发生，则向患者再次施用seq id no:1的融合蛋白。例如，如果患者最初接受实体肿瘤治疗，并且肿瘤复发或发生更多肿瘤，则作为例如seq id no:1的另一疗程或系列疗程向患者施用seq id no:1。
[0117]
优选地，根据本发明的方法和给药方案将seq id no:1的融合蛋白施用于癌症患者。优选的施用途径是静脉内，例如静脉内注射和静脉内输液，例如经由中心静脉通路。其它优选的施用途径包括皮下、肌内、口服、鼻和肺部施用。
[0118]
本发明的治疗方案被施用于患者直到患者治愈或直到患者不再受益于该治疗方案。
[0119]
改善的安全性特性
[0120]
rhil-2在人和动物中的毒性已被充分证明。在大多数癌症试验中使用高剂量的rhil-2时，记录到相当大的毒性，而仅偶尔出现肿瘤反应。人重组白介素-2(rhil-2)的一种主要剂量限制性毒性是毛细血管渗漏综合征(cls)，本文中也称其为血管渗漏综合征(vls)。cls的特征在于伴随着体液和蛋白质外渗的血管渗透性增加，由此导致间质水肿和器官衰竭。cls的表现包括液体潴留、体重增加、外周水肿、胸膜和心包积液、腹水、全身水肿以及严重时的肺部和心血管衰竭的迹象。症状在患者之间是高度可变的，并且不清楚原因。
[0121]
内皮细胞(ec)损伤的病理机制是复杂的，并可能涉及ec和白细胞的活化或损伤、细胞因子和炎性介质的释放、细胞-细胞和细胞-基质粘附以及细胞骨架功能的改变。cls限制了可施用于人类的il-2的剂量，且在某些情况下，需要停止治疗。
[0122]
本发明的方法降低了通常与高剂量治疗相关的副作用的风险，而同时保持了il-2疗法的所需治疗活性，所述副作用包括但不限于cls以及细胞因子释放综合征(crs)，另一种通常伴随cls和/或与cls重叠的与细胞因子的免疫疗法相关的综合征。
[0123]
如实施例所述的人类临床试验中的剂量递增研究令人惊讶地揭示，以与高剂量rh-il-2相当的浓度向患者施用seq id no:1的融合多肽不会导致经常与高剂量rhil-2治疗相关的某些副作用(例如毛细血管渗漏综合征)的频率和严重程度。如概述人类临床研究的实施例中所述，即使超过了自然杀伤细胞和cd8+t细胞活化的ec50值，6μg/kg/天或更高的剂量，仍未达到剂量限制性毒性(dlt)。因此，与例如标准rhil-2治疗相比，特别是与高剂量rhil-2疗法相比，本发明的方法可以改善患有癌症且需要il-2疗法的患者的安全性特性。
[0124]
如本文所用，“改善的安全性特性”或者与例如标准rhil-2疗法相关的和特别地与高剂量rhil-2疗法相比的“副作用的较低风险”或“副作用的频率或严重性的降低”可以用
几种方式评估。可以量化il-2疗法的副作用或症状。il-2疗法的副作用或症状可以在半定量量表上定量，例如0至5，其中0表示不存在，1至4表示严重程度的可鉴别的增加，并且5表示最大严重程度。临床试验通常使用1-5级，其中：1代表轻度不良事件(副作用)；2表示中度不良事件(副作用)；3表示严重不良事件(副作用)；4表示危及生命或致残的不良事件(副作用)；5表示与不良事件(副作用)相关的死亡。或者，il-2疗法的副作用或症状可量化为二元事件，即存在或不存在，0或1。其它半定量量表对于本领域技术人员来说是显而易见的。在另一个实施方案中，il-2疗法的副作用或症状可以在定量量表上定量，例如：每体积的量，例如每体积组织液的细胞因子的量；温度；持续时间；率；酶活性；氧饱和度等。本领域技术人员将容易地理解如何评估和定量il-2疗法的任何副作用或症状，并且能够毫无困难或过度负担地这样做。例如，本领域技术人员将能够测量：血浆或血清中的细胞因子浓度；体温(发热)；心率(心动过速)；血压(低血压)；心功能障碍；肾损害；血清或血浆酶浓度(肝功能)等。il-2疗法的副作用或症状的任何定量可与对照比较，例如未接受il-2疗法的健康对照受试者比较，或与接受例如标准高剂量rhil-2治疗的其它对照受试者比较。
[0125]
il疗法的副作用的“较低风险”可以是与例如高剂量rhil-2疗法相比，il-2疗法的副作用的表现降低约1％、降低约2％、降低约3％、降低约4％、降低约5％、降低约6％、降低约7％、降低约8％、降低约9％、降低约10％、降低约20％、降低约30％、降低约40％、降低约50％、降低约60％、降低约70％、降低约80％、降低约90％、降低约100％。或者，治疗il-2疗法的副作用或症状可以是il-2疗法的副作用或症状减少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多。由此可见，“不太严重的副作用”是指il-2疗法的副作用或症状的这种降低。
[0126]
优选地，根据本发明的融合蛋白的给药方案降低了毛细血管渗漏综合征(cls)(本文也称为血管渗漏综合征(vls))的频率和严重性。
[0127]
也可以通过本发明的治疗方案降低的通常与rhil-2免疫疗法相关的其它副作用的风险包括但不限于细胞因子释放综合征(crs)。crs是一种严重的免疫疗法的副作用，其症状可能在临床上与cls的症状重叠，且也可能引起与crs完全不同的症状。crs被认为是由释放大量细胞因子(包括il-6、ifn-γ、tnf、il-2、il-2-受体α、il-8、il-10和gmcsf)的增殖t细胞导致的。crs患者可经历以下任何一种或多种：发烧、心血管症状(包括心动过速、低血压、心律失常、心脏射血分数降低)、肺部症状(包括水肿、缺氧、呼吸困难和肺炎)、通常由肾灌注减少引起的急性肾伤害、肝和肠胃症状(包括血清转氨酶和胆红素升高、腹泻、结肠炎、恶心和腹痛)、血液学症状(包括血细胞减少如3-4级贫血症、血小板减少症、白细胞减少症、嗜中性白细胞减少症和淋巴细胞减少症)、凝血紊乱(包括延长前凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间(ptt))、d-二聚体升高、低血纤蛋白原、弥散性血管内凝血、巨噬细胞活化综合征(mas)、出血、b细胞发育不全和低丙球蛋白血症)、感染性疾病(包括菌血症、沙门氏菌、尿路感染、病毒感染如流感、呼吸道合胞病毒和带状疱疹病毒)、肌肉骨骼症状(包括肌酸激酶升高、肌痛和虚弱)、神经症状(包括谵妄、精神错乱和癫痫)。
[0128]
与例如小鼠中的rhil-2相比，seq id no:1的施用已展现出诱导更低水平的炎性细胞因子。参见实施例4和图10。
[0129]
seq id no:1的施用也展现出在人类中诱导更高水平的所需细胞因子如ifn，同时诱导更低水平的炎性细胞因子如il-6。参见实施例5和图15。
[0130]
mas与crs在临床上重叠，受试者可能经历肝脾肿大、淋巴结病、全血细胞减少症、肝功能障碍、弥散性血管内凝血、低纤维蛋白原血症、高铁蛋白血症和高甘油三酯血症。与crs一样，患有mas的受试者表现出细胞因子(包括ifn-γ和gmcsf)的水平升高。
[0131]
免疫疗法(包括il-2疗法)的另一个副作用是肿瘤溶解综合征(tls)，其发生在由于疗法导致细胞死亡而释放细胞内容物时，最通常发生于淋巴瘤和白血病。tls的特征在于血液离子和代谢物失衡，并且其症状包括恶心、呕吐、急性尿酸肾病、急性肾衰竭、癫痫、心律失常和死亡。
[0132]
神经毒性可由免疫疗法(包括il-2疗法)引起，且其症状可包括脑水肿、谵妄、幻觉、言语障碍、运动不能性缄默症、头痛、精神错乱、觉醒的改变、共济失调、失用症、面神经麻痹、震颤、辨距不良和癫痫。
[0133]
经历il-2免疫疗法的患者可发生一种或多种不一定由cls、crs、mas或tls引起的副作用或症状，包括贫血、失语症、心律失常、关节痛、背痛、血液和骨髓病症、血液和淋巴系统病症，心脏病症、寒战、凝血病症、结肠炎、神志不清、全身症状、咳嗽、食欲减退、腹泻、定向障碍、眩晕、呼吸困难、脑病、疲劳、发烧、胃肠病症、一般心血管病症、出血、肝障碍、高血糖症、低钾血症、甲状腺功能减退、alt增加、ast增加、c反应蛋白增加、感染发热性中性粒细胞减少症、白细胞减少症、萎靡、异常代谢实验室测试结果、代谢营养病症、粘膜炎症、肌肉骨骼病症、肌痛恶心、神经系统病症、神经病症、中性粒细胞减少症水肿、疼痛、掌跖红斑、感觉异常、肺炎、瘙痒、肺部疾病、发热、皮疹、肾泌尿生殖系统疾病、呼吸系统疾病、皮肤和皮下组织疾病、嗜睡、言语障碍、出汗胸纵隔疾病、血小板减少症、震颤、肿瘤闪耀(tumor flare)、肿瘤溶解综合征、血管疾病和呕吐。
[0134]
癌症适应症
[0135]
使用seq id no:1的融合蛋白的本发明的治疗方案可用于治疗许多类型的癌症。如本文所用，术语“癌症”应被赋予其通常含义，作为其中异常细胞分裂不受控制的疾病的总称。特别地，并且在本发明的实施方案的背景下，癌症是指血管生成相关的癌症。癌细胞可以侵入附近的组织并且可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其它部分。存在几种主要类型的癌症，例如，癌瘤(carcinoma)是开始于皮肤或或者内衬或覆盖内脏器官的组织的癌症。肉瘤是开始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔组织或支持组织的癌症。白血病是开始于血液形成组织(如骨髓)并导致大量异常血细胞产生并进入血流的癌症。淋巴瘤是开始于免疫系统的细胞的癌症。
[0136]
当正常细胞丧失其以特定的、受控的和协调的单元发挥作用的能力时，肿瘤形成。通常，实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块(一些脑肿瘤确实具有充满液体的囊肿和中心坏死区域)。单个肿瘤甚至可以在其内具有不同的细胞群，且具有不同的出错过程。实体肿瘤可以是良性的(不是癌性的)或恶性的(癌性的)。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型被命名。实体肿瘤的示例是肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。白血病(血液的癌)通常不形成实体肿瘤。
[0137]
代表性癌症包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病，成人；急性淋巴细胞白血病，儿童；急性骨髓性白血病，成人；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童；aids相关淋巴瘤；aids相关的恶性肿瘤；肛门癌；星形细胞瘤，儿童期小脑；星形细胞瘤，儿童期脑；胆管癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌，儿童；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；胶质母细胞瘤，儿童；胶质母细
胞瘤，成人；脑干胶质瘤，儿童；脑肿瘤，成人；脑肿瘤，脑干胶质瘤，儿童；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤，儿童；脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童；脑肿瘤，室管膜瘤，儿童；脑肿瘤，成神经管细胞瘤，儿童；脑肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤，儿童；脑肿瘤，儿童(其他)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；乳腺癌，儿童；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌，儿童：类癌瘤，儿童；类癌瘤，胃肠；肾上腺皮质癌；癌瘤，胰岛细胞；原发性未知癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤，儿童；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童；子宫颈癌；儿童期癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性髓性白血病；慢性骨髓增生性疾病；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；结肠直肠癌，儿童；皮肤t细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤，儿童；上皮癌，卵巢；食道癌；食管癌，儿童；尤文氏肿瘤家族；颅外生殖细胞肿瘤，儿童；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃的)癌；胃(胃的)癌，儿童；胃肠类癌瘤；生殖细胞肿瘤，颅外，儿童；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤，儿童期脑干；神经胶质瘤，儿童视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童(原发性)；霍奇金淋巴瘤，成人；霍奇金淋巴瘤，儿童；妊娠期间的霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波济肉瘤；肾癌；喉癌；喉癌，儿童；白血病，急性淋巴母细胞，成人；白血病，急性淋巴母细胞，儿童；白血病，急性骨髓性，成人；白血病，急性骨髓性，儿童；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性髓性；白血病，毛细胞；唇和口腔癌；肝癌，成人(原发性)；肝癌，儿童(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；成淋巴细胞性白血病，急性成人；成淋巴细胞性白血病，儿童急性；淋巴细胞性白血病，慢性；淋巴瘤，aids相关；淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)；淋巴瘤，皮肤t细胞；淋巴瘤，霍奇金氏，成人；淋巴瘤，霍奇金；儿童；妊娠期霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤，非霍奇金，成人；淋巴瘤，非霍奇金，儿童；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦氏；男性乳腺癌；恶性间皮瘤，成人；恶性间皮瘤，儿童；恶性胸腺瘤；成神经管细胞瘤，儿童；黑素瘤；黑素瘤，眼内；默克尔细胞癌；间皮瘤，恶性；转移性鳞状颈部癌伴隐匿性原发性；多发性内分泌瘤综合征，儿童；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病；骨髓发育不良综合征；髓性白血病，慢性；髓样白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；鼻咽癌，儿童；成神经细胞瘤；神经纤维瘤；非霍奇金淋巴瘤，成人；非霍奇金淋巴瘤，儿童；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌，儿童；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌，儿童；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，儿童的、胰腺癌，胰岛细胞；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；垂体肿瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金淋巴瘤；妊娠和非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性肝癌，成人；原发性肝癌，儿童；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌，儿童；肾盂和输尿管，移行细胞癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童；唾液腺癌；唾液腺癌，儿童；肉瘤，尤因肿瘤家族；肉瘤，卡波济氏肉瘤；骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童；肉瘤，软组织，成人；肉瘤，软组织，儿童；塞扎里综合征；皮肤癌；皮肤癌，儿童；皮肤癌(黑素瘤)；皮肤癌，默克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成人；软组织肉瘤，儿童；鳞状颈癌伴隐匿性原发性，转移性；胃(胃的)癌；胃(胃的)癌，儿童；幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童；t细胞淋巴
瘤，皮肤；睾丸癌；胸腺瘤，儿童；胸腺瘤，恶性；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养层肿瘤，妊娠；原发部位未知，儿童期癌症；儿童期罕见癌症；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；视觉神经通路和下丘脑胶质瘤，儿童；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和维尔姆斯瘤，等。
[0138]
肿瘤可分类为恶性或良性的。在这两种情况下，存在细胞的异常聚集和增殖。在恶性肿瘤的情况下，这些细胞表现的更具有侵略性，获得增强的侵袭性的特性。最终，肿瘤细胞甚至可以获得脱离它们所起源的微观环境、扩散至身体的另一区域(具有非常不同的环境，通常不利于它们的生长)并在该新位置继续它们的快速生长和分裂的能力。这被称为转移。一旦恶性细胞转移，实现治愈就更加困难。良性肿瘤具有较低的侵入倾向并且转移的可能性较低。
[0139]
如本文所用的术语“减少肿瘤”是指肿瘤块的大小或体积的减小，受试者中转移的肿瘤的数量减少，癌细胞的增殖状态(癌细胞倍增的程度)减少等。
[0140]
本发明的治疗方案特别适用于治疗实体肿瘤，其包括但不限于：淋巴瘤、黑素瘤、肾细胞癌(rcc)、晚期实体肿瘤、先前已接受治疗性疗法但对先前疗法不显效的肿瘤。优选地，本发明的治疗方案特别适用于治疗实体肿瘤，包括但不限于：淋巴瘤、黑素瘤、肾细胞癌(rcc)、肝细胞癌(hcc)、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、头颈部鳞状细胞癌(scchn)并且包括晚期实体肿瘤和先前已接受抗癌疗法治疗但对先前疗法不显效的肿瘤。
[0141]
补充免疫疗法和其他组合疗法
[0142]
虽然seq id no:1的融合蛋白可以在根据本发明的治疗方案中用作单一疗法，但在本发明的背景下也考虑了seq id no:1的融合蛋白与其它抗癌治疗的组合。其它治疗性治疗方案包括其它治疗性免疫疗法，例如过继性细胞转移方案、抗原特异性疫苗接种、dna修复蛋白的抑制(例如核酸酶聚(腺苷5
’‑
二磷酸核糖)聚合酶的抑制剂(“聚(adp-核糖)聚合酶”parp抑制剂”)和免疫检查点抑制性分子的阻断，例如细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)和程序性死亡1(pd-1)抗体。
[0143]
免疫检查点蛋白调节免疫系统中的t细胞功能。t细胞在细胞介导的免疫中起重要作用。免疫检查点蛋白与向t细胞内发送信号的特定配体相互作用，并且基本上切断或抑制t细胞功能。癌细胞通过驱动免疫检查点蛋白在其表面上的高水平表达来利用该系统，这导致控制进入肿瘤微环境的t细胞表面上表达免疫检查点蛋白的t细胞，由此抑制抗癌免疫反应。因此，本文称为“免疫检查点蛋白(icp)抑制剂”的药剂对免疫检查点蛋白的抑制将导致t细胞功能的恢复和针对癌细胞的免疫反应。免疫检查点蛋白的示例包括但不限于：ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1、chk2、a2ar、ox40、b-7家族配体或其组合。优选地，免疫检查点抑制剂与免疫检查点蛋白的配体相互作用，所述免疫检查点蛋白可以是ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1、chk2、ox40、a2ar、b-7家族配体或其组合。优选地，免疫检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。优选地，免疫检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。优选地，pd1免疫检查点抑制剂包含一种或多种抗pd-1抗体，包括纳武单抗和派姆单抗。
[0144]
本文所述的组合疗法方法包括施用与seq id no:1的融合蛋白组合的至少一种免疫检查点抑制剂。本发明不限于任何特定的免疫检查点抑制剂，只要当该免疫检查点抑制
剂以有效量作为单一疗法或与seq id no:1的融合蛋白组合施用时抑制靶免疫检查点蛋白的一种或多种活性。在一些情况下，由于例如协同效应，免疫检查点抑制剂对免疫检查点蛋白的最小抑制在seq id no:1的存在下可能是足够的。许多免疫检查点抑制剂是本领域内已知的。
[0145]
示例性的基于pd-1/pd-l1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的治疗剂。使用基于pd-1/pd-l1的免疫检查点抑制的示例性治疗方法描述于美国专利no.8,728,474和9,073,994和欧洲专利no.1537878b1中，并且例如包括抗pd-1抗体的用途。示例性的抗pd-1抗体描述于例如美国专利no.8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性的抗pd-1抗体包括，例如纳武单抗(bristol-myers squibb co.)、派姆单抗(merck sharp&dohme corp.)、pdr001(novartis pharmaceuticals)和pidilizumab(ct-011，cure tech)。示例性的抗pd-l1抗体描述于例如美国专利no.9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗pd-l1抗体包括例如阿替利珠单抗(genentech)、度伐单抗(astrazeneca)、medi4736、阿维鲁单抗和bms 936559(bristol myers squibb co.)。
[0146]
在某些实施方案中，本文所述的方法或组合物与ctla-4抑制剂组合施用。在ctla-4通路中，t细胞上的ctla-4与抗原呈递细胞(而不是癌细胞)表面上的其配体(例如cd80，也称为b7-1和cd86)的相互作用导致t细胞抑制。示例性的基于ctla-4的免疫检查点抑制方法描述于美国专利no.5,811,097、5,855,887、6,051,227中。示例性抗ctla-4抗体描述于美国专利no.6,984,720、6,682,736、7,311,910；7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379，8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984，国际(pct)公开号wo98/42752、wo00/37504和wo01/14424，以及欧洲专利no.ep1212422b1中。示例性的ctla-4抗体包括伊匹单抗或替西木单抗(tremelimumab)。
[0147]
优选地，本发明的方法或组合物与(i)pd-1或pd-l1抑制剂，例如本文公开的pd-1或pd-l1抑制剂，和(ii)ctla-4抑制剂，例如本文公开的ctla-4抑制剂组合施用。
[0148]
fda批准的免疫检查点蛋白抑制剂的示例包括：
[0149]
·
伊匹单抗
[0150]
·
派姆单抗
[0151]
·
阿替利珠单抗
[0152]
·
度伐单抗
[0153]
·
阿维鲁单抗
[0154]
·
纳武单抗
[0155]
本发明的优选治疗方案组合根据本发明施用的seq id no:1的融合蛋白与免疫检查点抑制剂(派姆单抗)。优选地，在根据本发明的治疗方案的每个治疗周期的第一天施用派姆单抗。优选地，根据制造商的建议施用200mg派姆单抗，通常每3周或21天一次。
[0156]
除了免疫检查点抑制剂之外或代替免疫检查点抑制剂，使用根据本发明的seq id no:1的融合蛋白的治疗方案还可以与其他治疗剂和/或抗癌剂组合。优选地，治疗剂和/或
抗癌剂是抗体。优选地，治疗剂是治疗性蛋白质。优选地，治疗剂是小分子。优选地，抗癌剂是抗原。优选地，治疗剂是细胞群体。优选地，治疗剂是治疗性抗体。优选地，治疗剂是另一种细胞毒性剂和/或化疗剂。本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。“化疗剂”包括可用于治疗癌症的化合物。
[0157]
抗体
[0158]
优选地，seq id no:1的施用可以与治疗性抗体组合。产生抗体及其抗原结合片段的方法是本领域熟知的，并且公开于例如美国专利no.7,247,301、us2008/0138336和美国专利no.7,923,221中，所有这些以全文引用的方式并入本文中。可用于本发明的方法的治疗性抗体包括但不限于批准用于临床试验或开发用于临床用途的任何本领域公认的治疗性抗体。在一些实施方案中，多于一种治疗性抗体可以包括在本发明的组合疗法中。治疗性抗体的非限制性示例包括但不限于以下：
[0159]
·
曲妥单抗(herceptin
tm
，genentech,south san francisco,calif.)，其用于治疗her-2/neu阳性乳腺癌或转移性乳腺癌；
[0160]
·
贝伐单抗(genentech的avastin
tm
)，其用于治疗结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、非小细胞肺癌或肾细胞癌；
[0161]
·
利妥昔单抗(genentech的rituxan
tm
)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病；
[0162]
·
帕妥珠单抗(genentech的omnitarg
tm
)，其用于治疗乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌或卵巢癌；
[0163]
·
西妥昔单抗(imclone systems incorporated,new york,n.y.的erbitux
tm
)，其可用于治疗结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、脑癌、胰腺癌、食道癌、肾细胞癌、前列腺癌、宫颈癌或膀胱癌；
[0164]
·
imc-1c11(imclone systems incorporated)，其用于治疗结肠直肠癌、头颈癌以及其它潜在的癌症靶标；
[0165]
·
托西莫单抗和托西莫单抗与碘i
131
(corixa corporation,seattle,wash的bexxar
tm
)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤，其可以是cd20阳性的、滤泡性的非霍奇金淋巴瘤；具有和不具有转化，其疾病是利妥昔单抗难治的并且在化疗后复发；
[0166]
·
in
111
替伊莫单抗；y
90
替伊莫单抗；i
111
替伊莫单抗和y
90
替伊莫单抗(biogen idec,cambridge,mass的zevalin
tm
)，其用于治疗淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其可包括复发性滤泡性淋巴瘤；复发性或难治性、低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤；或转化的b细胞非霍奇金淋巴瘤；
[0167]
·
emd 7200(emd pharmaceuticals,durham,n.c.)，其用于治疗非小细胞肺癌或宫颈癌；
[0168]
·
sgn-30(seattle genetics,bothell,wash的靶向cd30抗原的遗传工程化单克隆抗体)，其用于治疗霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤；
[0169]
·
sgn-15(seattle genetics的靶向lewisγ相关抗原的遗传工程化单克隆抗体，其缀合至阿霉素)，其用于治疗非小细胞肺癌；
[0170]
·
sgn-33(seattle genetics的靶向cd33抗原的人源化抗体)，其用于治疗急性髓性白血病(aml)和骨髓增生异常综合征(mds)；
[0171]
·
sgn-40(seattle genetics的靶向cd40抗原的人源化单克隆抗体)，其用于治疗多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤；
[0172]
·
sgn-35(seattle genetics的靶向cd30抗原的遗传工程化单克隆抗体，其缀合至澳瑞他汀e)，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤；
[0173]
·
sgn-70(seattle genetics的靶向cd70抗原的人源化抗体)，其用于治疗肾癌和鼻咽癌；
[0174]
·
sgn-75(seattle genetics的由sgn70抗体和澳瑞他汀衍生物组成的缀合物)；以及
[0175]
·
sgn-17/19(seattle genetics的与美法仑前药缀合的包含抗体和酶的融合蛋白)，其用于治疗黑素瘤或转移性黑素瘤。
[0176]
用于本发明方法的治疗性抗体不限于本文所述的那些。例如，下列批准的治疗性抗体也可用于本发明的方法中：用于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的本妥昔单抗(adcetris
tm
)、用于黑素瘤的伊匹单抗(mdx-101；yervoy
tm
)、用于慢性淋巴细胞性白血病的奥法木单抗(arzerra
tm
)、用于结肠直肠癌的帕尼单抗(vectibix
tm
)、用于慢性淋巴细胞性白血病的阿仑单抗(campath
tm
)、用于慢性淋巴细胞性白血病的奥法木单抗(arzerra
tm
)、用于急性骨髓性白血病的吉妥珠单抗(mylotarg
tm
)。
[0177]
根据本发明使用的抗体还可以靶向由免疫细胞表达的分子，例如但不限于替西木单抗(cp-675,206)和伊匹单抗(mdx-010)，其靶向ctla4且具有肿瘤排斥，防止再激发和增强肿瘤特异性t细胞反应的作用；ox86，其靶向ox40并增加肿瘤位点处的抗原特异性cd8+t细胞并增强肿瘤排斥；ct-011，其靶向pd1并具有维持和扩增肿瘤特异性记忆t细胞和激活nk细胞的作用；bms-663513，其靶向cd137并引起已建立肿瘤的消退，以及cd8+t细胞的扩增和维持，和达利珠单抗(zenapax
tm
)，其靶向cd25并引起cd4+cd25+foxp3+treg的瞬时耗竭并增强肿瘤消退和增加效应t细胞的数目。这些抗体的更详细讨论可参见例如weiner等，nature rev.immunol 2010；10:317-27。
[0178]
优选地，抗体是促炎性和/或促致瘤性细胞因子靶向抗体，其包括但不限于抗tnf抗体、抗il-1ra受体靶向抗体、抗il-1抗体、抗il-6受体抗体和抗il-6抗体。优选的抗体包括靶向促炎性t辅助17型细胞(th17)的那些。
[0179]
所述治疗性抗体可以是抗体的片段；包含抗体的复合物；或包含抗体的缀合物。抗体可以任选地是嵌合的或人源化的或全人的。
[0180]
治疗性蛋白和多肽
[0181]
优选地，本发明的方法包括根据本发明的治疗方案将seq id no:1的融合蛋白与治疗性蛋白或肽组合施用。有效治疗癌症的治疗性蛋白是本领域熟知的。优选地，治疗性多肽或蛋白是“自杀蛋白”，其本身或在其它化合物存在下引起细胞死亡。
[0182]
这种自杀蛋白的代表性示例是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。另外的示例包括水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶、细菌基因胞嘧啶脱氨酶(其将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化还原酶、羧肽酶g2、β-葡糖醛酸酶、青霉素-v-酰胺酶、青霉素-g-酰胺酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶、羧肽酶a、亚麻苦苷酶(也称为β-葡糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌deo基因，尽管其它基因是本领域已知的。在一些实施方案中，自杀蛋白将前药转化为毒性化合物。
[0183]
如本文所用，“前药”是指可用于本发明方法的可转化为毒性产物(即对肿瘤细胞有毒性)的任何化合物。前药通过自杀蛋白转化为毒性产物。此类前药的代表性示例包括：用于胸苷激酶的更昔洛韦、阿昔洛韦和fiau(1-(2-脱氧-2-氟-β-d-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘-尿嘧啶)；用于氧化还原酶的异环磷酰胺；用于vzv-tk的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷；用于胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶；用于β-葡糖醛酸酶的多柔比星；用于硝基还原酶的cb1954和呋喃西林；和用于羧肽酶a的n-(氰基乙酰基)-l-苯丙氨酸或n-(3-氯丙酰基)-l-苯丙氨酸。前药可以由本领域内的普通技术人员容易地施用。本领域技术人员能够容易地确定前药的最合适剂量和施用途径。
[0184]
优选地，治疗性蛋白或多肽是癌抑制剂，例如p53或rb，或编码这种蛋白或多肽的核酸。本领域技术人员熟知各种这样的癌抑制剂以及如何获得它们和/或编码它们的核酸。
[0185]
抗癌/治疗性蛋白或多肽的其它示例包括促凋亡治疗性蛋白和多肽，例如p15、p16或p21
waf-1
。
[0186]
细胞因子和编码它们的核酸也可用作治疗性蛋白和多肽。示例包括：gm-csf(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；tnf-α(肿瘤坏死因子α)；干扰素(包括但不限于ifn-α和ifn-γ)；和白细胞介素(包括但不限于白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-β(il-beta)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-4(il-4)、白细胞介素-5(il-5)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-8(il-8)、白细胞介素-10(il-10)、白细胞介素-12(il-12)、白细胞介素-13(il-13)、白细胞介素-14(il-14)、白细胞介素-15(il-15)、白细胞介素-16(il-16)、白细胞介素-18(il-18)、白细胞介素-23(il-23)、白细胞介素-24(il-24))，尽管其它实施方案是本领域已知的。
[0187]
杀细胞基因的其它示例包括但不限于突变的细胞周期蛋白g1基因。举例来说，杀细胞基因可以是细胞周期蛋白g1蛋白的显性负突变(例如wo/01/64870)。
[0188]
疫苗
[0189]
优选地，本发明的治疗方案包括seq id no:1的融合蛋白的施用与用于刺激癌症特异性免疫反应的癌症疫苗的施用的组合，例如先天免疫反应和适应性免疫反应，以产生针对癌症的宿主免疫(参见例如overwijk等，journal of experimental medicine 2008；198:569-80)。示例性疫苗包括但不限于例如抗原疫苗、全细胞疫苗、树突状细胞疫苗和dna疫苗。根据疫苗的具体类型，疫苗组合物可包括一种或多种已知增强受试者对疫苗的免疫反应的合适佐剂。
[0190]
疫苗可以是例如基于细胞的(即使用来自患者自身癌细胞的细胞来鉴定和获得抗原而产生的)。示例性疫苗包括基于肿瘤细胞的疫苗和基于树突状细胞的疫苗，其中将来自受试者的活化免疫细胞与其它蛋白质一起递送给该同一受试者，以进一步促进这些肿瘤抗原引发的免疫细胞的免疫活化。基于肿瘤细胞的疫苗包括全肿瘤细胞和基因修饰的肿瘤细胞。可以任选地加工全肿瘤细胞疫苗以增强抗原呈递，例如通过照射肿瘤细胞或肿瘤裂解物。根据所用疫苗的类型，疫苗施用还可以伴随佐剂，例如卡介苗(bcg)或匙孔血蓝蛋白(klh)。也可以使用质粒dna疫苗，并且可以通过直接注射或基因枪施用。还考虑使用肽疫苗、病毒基因转移载体疫苗和抗原修饰的树突状细胞(dc)。
[0191]
优选地，所述疫苗是基于治疗性癌症肽的疫苗。肽疫苗可使用已知序列或从受试者自身肿瘤分离的抗原来产生，并且包括新抗原和修饰的抗原。示例性的基于抗原的疫苗
包括其中抗原是肿瘤特异性抗原的那些。例如，肿瘤特异性抗原可以选自癌症-睾丸(cancer-testis)抗原、分化抗原和广泛存在的过表达的肿瘤相关抗原等。当用于本发明的方法时，基于来自肿瘤相关抗原的肽的重组肽疫苗可以与佐剂或免疫调节剂一起施用或配制。用于基于肽的疫苗的示例性抗原包括但不限于以下抗原，因为该列表仅是说明性的。例如，肽疫苗可包含癌症-睾丸抗原如mage、bage、ny-eso-1和ssx-2，它们由在成人组织中正常沉默但在肿瘤细胞中转录再活化的基因编码。或者，肽疫苗可包含组织分化相关抗原，即正常组织来源并由正常组织和肿瘤组织共有的抗原。例如，疫苗可包含黑素瘤相关抗原如gp100、melan-a/mart-1、mage-3或酪氨酸酶；或者可以包含前列腺癌抗原如psa或pap。疫苗可包含乳腺癌相关抗原，例如乳腺珠蛋白-a。可包含在用于本方法的疫苗中的其它肿瘤抗原包括例如cea、muc-1、her1/nue、htert、ras和b-raf。可用于疫苗的其它合适抗原包括与癌症干细胞或emt过程相关的sox-2和oct-4。
[0192]
抗原疫苗包括多抗原和单抗原疫苗。示例性癌抗原可包括具有约5至约30个氨基酸、或约6至25个氨基酸、或约8至20个氨基酸的肽。
[0193]
如上所述，免疫刺激佐剂(不同于rslail-2)可用于疫苗，特别是基于肿瘤相关抗原的疫苗，以帮助产生有效的免疫反应。例如，疫苗可并入病原体相关分子模式(pamp)以帮助提高免疫力。其它合适的佐剂包括单磷酰脂质a或其它脂多糖；toll样受体(tlr)激动剂，例如咪喹莫特、瑞喹莫德(r-848)、tlr3、imo-8400和雷他莫德。适用的其它佐剂包括热休克蛋白。
[0194]
遗传疫苗通常使用携带表达盒的病毒或质粒dna载体。在施用后，它们转染体细胞或树突状细胞作为炎性反应的一部分，从而导致交叉引发或直接抗原呈递。优选地，遗传疫苗是在一次免疫中提供多种抗原递送的疫苗。遗传疫苗包括dna疫苗、rna疫苗和基于病毒的疫苗。
[0195]
用于本发明方法的dna疫苗是构建用于递送和表达肿瘤抗原的细菌质粒。dna疫苗可通过任何合适的施用方式施用，例如皮下或皮内注射，但也可直接注射到淋巴结中。其它递送模式包括例如基因枪、电穿孔、超声、激光、脂质体、微粒和纳米颗粒。
[0196]
优选地，疫苗包含一种新抗原或多种新抗原。优选地，疫苗是基于新抗原的疫苗。优选地，基于新抗原的疫苗(nbv)组合物可以编码串联的多种癌症新抗原，其中每种新抗原是衍生自癌细胞中突变的蛋白质的多肽片段。例如，新抗原疫苗可以包含含有编码多种免疫原性多肽片段(每一种为癌细胞中突变的蛋白质的多肽片段)的核酸构建体的第一载体，其中每种免疫原性多肽片段包含一个或多个突变的氨基酸，所述突变的氨基酸侧翼为来自原始蛋白质的可变数量的野生型氨基酸，并且每种多肽片段头尾相连以形成免疫原性多肽。形成免疫原性多肽的每个免疫原性多肽片段的长度可以变化。
[0197]
也可以使用病毒基因转移载体疫苗；在这样的疫苗中，重组工程病毒、酵母、细菌等被用于将癌症特异性蛋白引入患者的免疫细胞。在可以是肿瘤裂解性或非肿瘤裂解性的基于载体的方法中，由于例如其固有的免疫刺激性质，载体可以提高疫苗的效力。示例性的基于病毒的载体包括来自痘病毒科的载体，如痘苗病毒、改性痘苗病毒株ankara和禽痘病毒。还适合使用的是癌症疫苗prostvac，其含有可复制的痘苗病毒启动载体和不可复制的禽痘加强载体(fowlbox-boosting vector)。每个载体含有psa的转基因和三种共刺激分子cd80、cd54和cd58，统称为tricom。其它合适的基于载体的癌症疫苗包括trovax和tg4010
(编码muc1抗原和il-2)。使用的其它疫苗包括基于细菌和酵母的疫苗，例如重组单核细胞增生李斯特菌和酿酒酵母。
[0198]
前述疫苗可与佐剂和其它免疫增强剂组合和/或配制以增强功效。根据具体的疫苗，施用可以是肿瘤内或非肿瘤内的(即全身性的)。
[0199]
可用于疫苗接种的其它癌症抗原包括但不限于(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞，(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞，(v)肿瘤上的胚胎抗原，(vi)自体肿瘤细胞，(vii)肿瘤特异性膜抗原，(viii)肿瘤相关膜抗原，(ix)生长因子受体，(x)生长因子配体，和(xi)与癌症相关的任何其它类型的抗原或抗原呈递细胞或物质。
[0200]
癌抗原可以是上皮癌抗原(例如乳腺、胃肠、肺)、前列腺特异性癌抗原(psa)或前列腺特异性膜抗原(psma)、膀胱癌抗原、肺(例如小细胞肺)癌抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原或结肠直肠癌抗原。
[0201]
在另一个实施方案中，癌抗原是淋巴瘤抗原(例如非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)、b细胞淋巴瘤癌抗原、白血病抗原、骨髓瘤(即多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)抗原、急性成淋巴细胞性白血病抗原、慢性骨髓性白血病抗原或急性骨髓性白血病抗原。所描述的癌抗原仅是示例性的，并且在本发明中可以靶向任何癌抗原。
[0202]
优选地，癌抗原是在所有人类腺癌(胰腺、结肠、乳腺、卵巢、肺、前列腺、头和颈)上发现的粘蛋白-1蛋白或肽(muc-1)，其包括多发性骨髓瘤和一些b细胞淋巴瘤。患有炎性肠病(克罗恩病或溃疡性结肠炎)的患者发生结肠直肠癌的风险增加。muc-1是i型跨膜糖蛋白。muc-1的主要胞外部分具有大量由20个氨基酸组成的串联重复，其包含免疫原性表位。在一些癌症中，其以被免疫系统识别的非糖基化形式暴露(gendler等，j biol chem 1990；265:15286-15293)。
[0203]
在另一个实施方案中，癌抗原是与黑素瘤和结肠癌相关的突变b-raf抗原。这些突变的绝大多数代表在核苷酸1796处t-a的单核苷酸变化，其导致在b-raf的活化区段内的残基599处缬氨酸变为谷氨酸。raf蛋白也作为活化的ras蛋白的效应物与癌症间接相关，该活化的ras蛋白为存在于所有人类癌症的约三分之一中的致癌形式。正常的非突变b-raf参与细胞信号传导，将信号从细胞膜传递至细胞核。该蛋白质通常仅在需要传递信号时才有活性。相反，已经报道突变体b-raf是持续活性的，从而破坏信号传递(mercer和pritchard,biochim biophys acta(2003)1653(1):25-40；sharkey等，cancer res.(2004)64(5):1595-1599)。
[0204]
优选地，癌抗原是人表皮生长因子受体-2(her-2/neu)抗原。具有过表达her-2/neu的细胞的癌症被称为her-2/neu
+
癌症。示例性her-2/neu
+
癌症包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、肝癌(例如肝细胞腺癌)、肠癌和膀胱癌。
[0205]
her-2/neu具有与表皮生长因子受体(egfr)具有40％同源性的大约645aa的细胞外结合结构域(ecd)、高度疏水的跨膜锚定结构域(tmd)和与egfr具有80％同源性的大约580aa的羧基端细胞内结构域(icd)。her-2/neu的核苷酸序列可获自genbank
tm
。登录号ah002823(人her-2基因、启动子区和外显子1)；m16792(人her-2基因，外显子4)：m16791(人her-2基因，外显子3)；m16790(人her-2基因，外显子2)；和m16789(人her-2基因、启动子区
和外显子1)。her-2/neu蛋白的氨基酸序列可从genbank
tm
获得。登录号aaa58637。基于这些序列，本领域技术人员可以使用已知的试验开发her-2/neu抗原以发现产生有效免疫反应的适当表位。
[0206]
示例性her-2/neu抗原包括p369-377(her-2/neu衍生的hla-a2肽)；dher2(corixa corporation)；li-key mhc ii类表位杂合体(generex biotechnology corporation)；肽p4(氨基酸378-398)；肽p7(氨基酸610-623)；肽p6(氨基酸544-560)和p7的混合物；肽p4、p6和p7的混合物；her2[9
754
]等。
[0207]
优选地，癌抗原是表皮生长因子受体(egfr)抗原。egfr抗原可以是egfr变体1抗原、egfr变体2抗原、egfr变体3抗原和/或egfr变体4抗原。具有过表达egfr的细胞的癌症被称为egfr癌症。示例性egfr癌症包括肺癌、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、脑癌和膀胱癌。
[0208]
优选地，癌抗原是血管内皮生长因子受体(vegfr)抗原。vegfr被认为是癌症诱导的血管生成的调节剂。具有过表达vegfr的细胞的癌症称为vegfr
+
癌症。示例性vegfr
+
癌症包括乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、白血病和淋巴细胞性白血病。
[0209]
优选地，癌抗原是前列腺特异性抗原(psa)和/或前列腺特异性膜抗原(psma)，其在雄激素非依赖性前列腺癌中普遍表达。
[0210]
优选地，癌抗原是gp-100。糖蛋白100(gp100)是黑素瘤相关的肿瘤特异性抗原。
[0211]
优选地，癌抗原是癌胚抗原(cea)。具有过表达cea的细胞的癌症被称为cea
+
癌症。示例性cea
+
癌症包括结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌。示例性的cea抗原包括cap-1(即cea aa 571-579)、cap1-6d、cap-2(即cea aa 555-579)、cap-3(即cea aa 87-89)、cap-4(cea aa 1-11)、cap-5(即cea aa 345-354)、cap-6(即cea aa 19-28)和cap-7。
[0212]
优选地，癌抗原是糖抗原10.9(ca19.9)。ca 19.9是与lewis a血型物质有关的寡糖并且与结肠直肠癌相关。
[0213]
优选地，癌抗原是黑素瘤癌抗原。黑素瘤癌抗原可用于治疗黑素瘤。示例性黑素瘤癌抗原包括mart-1(例如，mart-126-35肽、mart-127-35肽)；mart-1/melana；pmel17；pmel17/gp100；gp100(例如，gp100肽280-288、gp100肽154-162、gp100肽457-467)；trp-1；trp-2；ny-eso-1；p16；β-连环蛋白；mum-1；等。
[0214]
优选地，癌抗原是突变型或野生型ras肽。突变型ras肽可以是突变型k-ras肽、突变型n-ras肽和/或突变型h-ras肽。ras蛋白中的突变通常发生在位置12(例如，精氨酸或缬氨酸替换甘氨酸)、13(例如，天冬酰胺替换甘氨酸)、61(例如，谷氨酰胺替换亮氨酸)和/或59。突变型ras肽可用作肺癌抗原、胃肠癌抗原、肝癌抗原、髓样癌抗原(例如急性白血病、脊髓发育不良)，皮肤癌抗原(例如黑素瘤、基底细胞、鳞状细胞)，膀胱癌抗原、结肠癌抗原、结肠直肠癌抗原和肾细胞癌抗原。
[0215]
在本发明的另一个实施方案中，癌抗原是突变型和/或野生型p53肽。p53肽可用作结肠癌抗原、肺癌抗原、乳腺癌抗原、肝细胞癌抗原、淋巴瘤癌抗原、前列腺癌抗原、甲状腺癌抗原、膀胱癌抗原、胰腺癌抗原和卵巢癌抗原。
[0216]
癌抗原可以是细胞、蛋白质、肽、融合蛋白、编码肽或蛋白质的dna、编码肽或蛋白质的rna、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、碳水化合物、脂多糖、脂质、其两种或更多种的化学连接的组合，其两种或更多种的融合体，或其两种或更多种的混合物，或编码其两种或更多种的
病毒，或编码其两种或更多种的溶瘤病毒。在另一个实施方案中，癌抗原是包含约6至约24个氨基酸；约8至约20个氨基酸；约8至约12个氨基酸；约8至约10个氨基酸；或约12至约20个氨基酸的肽。在一个实施方案中，癌抗原是具有mhc i类结合基序或mhc ii类结合基序的肽。在另一个实施方案中，癌抗原包含对应于一个或多个细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位的肽。
[0217]
细胞疗法
[0218]
优选地，本发明的方法包括seq id no:1的融合蛋白的施用与治疗性细胞疗法的施用组合。可用于治疗癌症的细胞疗法是众所周知的，并且公开于例如美国专利no.7,402,431中。在一个优选的实施方案中，所述细胞疗法是t细胞移植。在优选的方法中，t细胞在移植入受试者之前用il-2离体扩增。用于细胞疗法的方法公开于例如美国专利no.7,402,431、us2006/0057121、美国专利no.5,126,132、美国专利no.6,255,073、美国专利no.5,846,827、美国专利no.6,251,385、美国专利no.6,194,207、美国专利no.5,443,983、美国专利no.6,040,177、美国专利no.5,766,920和us2008/0279836中。
[0219]
放射疗法
[0220]
优选地，本发明的治疗方案包括seq id no:1的融合蛋白的施用与放射疗法进一步组合。术语“放射疗法”可与术语“放疗”互换使用，是使用强能量束杀死癌细胞的癌症治疗类型。放射治疗最常使用x射线，但也可使用γ射线、电子束或质子。术语“放射疗法”最通常是指外部射束放射治疗。在这种类型的放疗中，高能量束来自患者身体外部的机器，其将能量束瞄准身体上的精确点。每个环节快速且无痛，持续约15分钟。如本文所用，术语“环节”或“治疗环节”是指每次放疗治疗。放射治疗“方案”或“时间表”通常由在设定的时间段内施用的特定数量的治疗组成，取决于癌症的类型和阶段。
[0221]
小分子
[0222]
优选地，本发明的治疗方案包括seq id no:1的融合蛋白的施用与抗癌小分子的施用组合。有效治疗癌症的小分子是本领域熟知的并且包括参与肿瘤生长的因子(例如egfr、erbb2(也称为her2)、erbb3、erbb4或tnf)的拮抗剂。非限制性示例包括靶向一种或多种酪氨酸激酶受体(例如vegf受体、fgf受体、egf受体和pdgf受体)的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(rtki)。
[0223]
许多治疗性小分子rtki是本领域已知的，包括但不限于瓦他拉尼(ptk787)、埃罗替尼(tarceva
tm
)、osi-7904、zd6474(zactima
tm
)、zd6126(ang453)、zd1839、舒尼替尼(sutent
tm
)、司马沙尼(su5416)、amg706、ag013736、伊马替尼(gleevec
tm
)、mln-518、cep-701、pkc-412、拉帕替尼(gsk572016)、velcade
tm
、azd2171、索拉非尼(nexavar
tm
)、xl880和chir-265。小分子蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如jiang等，cancer metastasis rev.2008；27:263-72中公开的那些)也可用于实施本发明的方法。这样的抑制剂可以靶向例如hsp2、prl、ptp1b或cdc25磷酸酶。
[0224]
靶向bcl-2/bcl-xl的小分子(例如us2008/0058322中公开的那些)也可用于实施本发明的方法。用于本发明的其它示例性小分子公开于zhang等，nature reviews:cancer 2009；9:28-39中。特别地，导致免疫原性细胞死亡的化疗剂(例如蒽环类)(kepp等，cancer and metastasis reviews 2011；30:61-9)非常适合于与延长pk il-2的协同作用。
[0225]
其它细胞毒性和化疗剂
[0226]
优选地，本发明的方法包括将seq id no:1的融合蛋白的施用与化疗剂的施用组合，所述化疗剂包括但不限于烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢剂、其它抗肿瘤抗生素和植物来源的药剂。
[0227]
烷化剂是通过与生物学上重要的分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基形成共价键而损害细胞功能的药物。烷基化的最重要的位点是dna、rna和蛋白质。烷化剂的活性依赖于细胞增殖，但不是细胞周期阶段特异性的。适用于本发明的烷化剂包括但不限于双氯乙胺类(氮芥类，例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、尿嘧啶氮芥)、氮丙啶类(例如噻替派)、烷基烷酮磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲(例如bcnu、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素)、非经典烷化剂(例如，六甲蜜胺、达卡巴嗪和丙卡巴肼)和铂化合物(例如，卡铂、奥沙利铂和顺铂)。
[0228]
抗肿瘤抗生素(如阿霉素)在鸟嘌呤-胞嘧啶和鸟嘌呤-胸腺嘧啶序列处插入dna，导致自氧化和形成引起链断裂的游离氧自由基。适用于本发明的其它抗生素药剂包括但不限于蒽环类抗生素(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和蒽二酮)、丝裂霉素c、博来霉素、更生霉素和普卡霉素。
[0229]
适用于本发明的抗代谢剂包括但不限于氟尿苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、亚叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、阿糖胞苷、喷司他丁、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、天冬酰胺酶和吉西他滨。
[0230]
植物来源的药剂包括紫杉烷类，其是从紫杉属植物的针叶中提取的前体的半合成衍生物。这些药物具有新的14元环(即紫杉烷)。与引起微管分解的长春花生物碱不同，紫杉烷类(例如紫杉醇)促进微管组装和稳定性，因此阻断细胞周期在有丝分裂中。其它植物来源的药剂包括但不限于长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春利定、长春瑞滨、依托泊苷、替尼泊苷和多西他赛。
[0231]
用于组合疗法的组合物
[0232]
优选地，seq id no:1的融合蛋白与一种或多种另外的治疗剂或其它治疗剂(例如治疗性抗体)一起(同时或依次)施用。优选地，在施用一种或多种治疗剂(例如治疗性抗体)之前施用seq id no:1的融合蛋白。优选地，seq id no:1的融合蛋白与一种或多种治疗剂(例如治疗性抗体)并行施用。优选地，在一种或多种治疗剂(例如治疗性抗体)的施用之后施用seq id no:1的融合蛋白。优选地，同时施用seq id no:1和一种或多种治疗剂(例如治疗性抗体)。在其它实施方案中，依次施用seq id no:1的融合蛋白和一种或多种治疗剂(例如治疗性抗体)。优选地，seq id no:1的融合蛋白和一种或多种治疗剂(例如治疗性抗体)彼此在1、2或3天内施用。
[0233]
所述一种或多种治疗剂可以是用作癌症辅助疗法的那些，例如细胞因子、化疗剂、小分子、抗原或治疗性抗体，并且是本领域公知的和上文讨论的。另外的药剂的其它非限制性示例包括gm-csf(扩增单核细胞和嗜中性粒细胞群体)、il-7(对记忆t细胞的产生和存活重要)、干扰素α、肿瘤坏死因子α、il-12和治疗性抗体(例如抗pd-1、抗pd-l、抗ctla4、抗cd40、抗ox40和抗cd137)、parp抑制剂、抗体。在一些实施方案中，受试者在相同的预防期、病症发生时和/或治疗期接受seq id no:1的融合蛋白和一种或多种治疗剂。
[0234]
优选地，本发明提供了包含seq id no:1的融合蛋白和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的单独药物组合物，以及包含一种或多种治疗剂(例
如治疗性抗体)和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的另一种药物组合物。
[0235]
优选地，本发明提供了药物组合物，其在同一组合物中包含seq id no:1的融合蛋白和一种或多种治疗剂或抗癌剂，以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。
[0236]
试剂盒
[0237]
还提供了包含配制用于sc施用的seq id no:1的融合蛋白和任选的任何其它化疗剂或抗癌剂的试剂盒。试剂盒通常为容纳各种组分的物理结构的形式，如下所述，并且可用于例如实施上述方法。试剂盒可包括可能为适合施用于受试者的药物组合物的形式的seq id no:1的融合蛋白(在例如无菌容器中提供)。药物组合物可以准备好使用的形式或以需要例如在施用前由使用者重构或稀释的形式提供。当组合物为需要由使用者重构的形式时，试剂盒还可包括与seq id no:1的融合蛋白一起包装或分开包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。当考虑组合疗法(例如seq id no:1的融合蛋白和一种或多种免疫检查点抑制剂)时，试剂盒可单独地包含几种药剂或它们可能已经在该试剂盒中组合。类似地，当需要另外的补充疗法(例如seq id no:1的融合蛋白、免疫检查点抑制剂和另外的补充疗法或药剂)时，试剂盒可以单独包含几种药剂或它们中的两种或更多种可能已经在试剂盒中组合。
[0238]
本发明的试剂盒可设计用于适当维持其中容纳的组分所需的条件(例如冷藏或冷冻)。试剂盒可以含有标签或包装插页，其包括识别其中组分的信息和其使用说明(例如给药参数、活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学、副作用、禁忌症等)。
[0239]
试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器内，并且所有各种容器可以在单个包装内。标签或插页可包括制造商信息，例如批号和过期日期。标签或包装插页可以例如整合到容纳组分的物理结构中、单独包含在物理结构内或固定到试剂盒的组件(例如安瓿、注射器或小瓶)上。
[0240]
标签或插页可另外包括或并入计算机可读媒体中，例如磁盘(例如硬盘、卡、存储磁盘)、光盘(例如cd或dvd-rom/ram)、dvd、mp3、磁带或电存储介质(例如ram和rom)或这些的混合(例如磁/光存储媒体、flash介质或记忆型卡)。在一些实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但提供了用于从远程来源(例如经由互联网网站)获得说明书的手段。
[0241]
等同物和范围
[0242]
当给出范围时，其包括端点。此外，应理解，除非另外指明或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可在本发明的不同实施方案中假定在所述范围内的任何具体值或子范围，至范围下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确规定。
[0243]
此外，应当理解，落入现有技术的本发明的任何特定实施方案可以从权利要求的任何一个或多个中明确地排除。由于这样的实施方案被认为是本领域内技术人员已知的，因此它们可以被排除，即使该排除没有在此明确阐述。
[0244]
出于任何原因，本发明组合物的任何具体实施方案；任何生产方法；任何使用方法，无论是否涉及现有技术的存在，都可以从任何一个或多个权利要求中排除。
[0245]
实施例
[0246]
实施例1-在患有晚期实体肿瘤的受试者中作为单一疗法和与派姆单抗组合静脉内施用的seq id no:1的融合蛋白的1期研究。
[0247]
seq id no:1的融合蛋白是被设计为选择性地活化由il-2rβ和γ组成的中等亲和力il-2r以活化细胞毒性cd8
+
t细胞和nk细胞的环状序列重组il-2和il-2受体α(il-2rα)的融合体。中等亲和力il-2r主要在效应淋巴细胞上表达，其在驱动抗肿瘤免疫反应中起重要作用。野生型il-2激活由il-2rα、β和γc组成的高亲和力il-2r，从而在低于激活携带中等亲和力il-2r的效应细胞的浓度下驱动免疫抑制性cd4
+
调节t(t
reg
)细胞的扩增。中等亲和力il-2r的选择性活化具有增强肿瘤杀伤的潜力，并且在鼠模型中展现出具有相对于il-2增强的抗肿瘤活性。
[0248]
方法
[0249]
seq id no:1的融合蛋白正在患有晚期难治性实体肿瘤的人类受试者中的1期研究中进行研究。融合蛋白以无菌、白色至灰白色的冻干粉末提供，用于iv或sc施用。包含在融合蛋白制剂中的赋形剂是柠檬酸一水合物、柠檬酸三钠二水合物、蔗糖和聚山梨醇酯20。对于iv施用，无菌注射用水，美国药典(usp)，单独供应用于重构。单独提供用于稀释的含有1％聚山梨酯20的柠檬酸盐缓冲液(ps20稀释剂)。根据需要单独提供盐水溶液(0.9％氯化钠注射液，usp)进行额外稀释。
[0250]
将四种不同剂量(0.1、0.3、1、3μg/kg/天)的融合蛋白作为30分钟静脉内输液向患者施用，每天一次，连续5天，在14天(第一周期)或21天(后续周期)的治疗周期中重复。研究的第一部分是剂量递增，主要目的是研究融合蛋白的安全性和耐受性并测定最大耐受剂量(mtd)和推荐的2期剂量(rp2d)。rp2d将等于或小于mtd，并且将基于在剂量递增期间观察到的安全性、pk、药效学和初步抗肿瘤活性数据选择相关给药时间表。图2显示了本研究遵循的治疗方案。
[0251]
将四种不同剂量(0.1、0.3、1、3μg/kg/天)的融合蛋白作为30分钟静脉内输液施用，每天一次，连续5天，在14天(第一周期)或21天(后续周期)的治疗周期中重复。在第一周期的第1天，还以200mg的剂量施用免疫检查点抑制剂派姆单抗。图2显示了本研究遵循的治疗方案。
[0252]
作为本临床研究方案的一部分施用的较高剂量(6μg/kg/天和8μg/kg/天)的讨论见下文(另见图11-15)
[0253]
3级治疗相关不良事件
[0254]
与其它细胞因子疗法一致，发热和寒战是治疗中出现最常见的融合蛋白相关不良事件。至今还没有观察到明显的毛细血管渗漏综合征。未报告4级或5级不良事件。在3μg/kg剂量水平下，3级发热性中性粒细胞减少症和3级低白蛋白血症各有一例事件符合剂量限制性毒性(dlt)的方案定义。在与研究者讨论后，确定这些不应被视为dlt，并对dlt定义进行了修改，从而允许继续剂量递增。
[0255]
血清细胞因子水平的升高
[0256]
响应于融合蛋白的治疗观察到血清il-6和ifn-γ水平的剂量依赖性升高。il-6水平在给药后4小时达到峰值，并在给药后8-10小时恢复至基线。发热与最大il-6的时间一致，并在给药后8-12小时恢复至基线。
[0257]
以0.1、0.3、1.3μg/kg/天剂量施用给药的结论。
[0258]
·
在用融合蛋白治疗的患者中，融合蛋白全身暴露的剂量成比例增加(图3)。
[0259]
·
如在患者的外周血中所测量的循环nk细胞和cd8+t细胞的剂量依赖性增加(图4)。
[0260]
·
t
reg
的可变和非剂量依赖性增加(图4)。
[0261]
·
血清il-6水平的剂量相关的短暂升高与寒战和发热的ae的发作相符合。
[0262]
·
无毛细血管渗漏综合征的迹象。
[0263]
群组5的6μg/kg/天的施用
[0264]
剂量递增研究的群组5的十一(11)名患有晚期实体肿瘤的患者在重复周期中接受每天6μg/kg的融合蛋白，每天iv施用，持续5天，随后是治疗停止期。在周期1期间，治疗停止期为9天，导致14天(2周)的周期长度。周期2和随后的周期具有16天的治疗停止期，导致周期长度为21天(3周)。对于前2个治疗周期，受试者在可获得医疗支持措施和重症监护病房(如果需要)的医疗机构作为住院病人接受融合蛋白。在不存在剂量限制性毒性(dlt)的情况下，受试者在门诊接受随后剂量的融合蛋白。
[0265]
群组56μg/kg/天的施用的结论
[0266]
·
在用融合蛋白治疗的患者中，融合蛋白全身暴露的剂量成比例增加(图3)。
[0267]
·
如在患者的外周血中所测量的循环nk细胞和cd8
+
t细胞的剂量依赖性增加(图4)。
[0268]
·
t
reg
的可变和非剂量依赖性增加(图4)。
[0269]
·
血清il-6水平的剂量相关的短暂升高与寒战和发热的ae的发作相符合。
[0270]
·
无细胞因子释放综合征的迹象。
[0271]
·
无毛细血管渗漏综合征的迹象。
[0272]
·
在6μg/kg/天的给药方案下，没有患者具有剂量限制性毒性，该给药方案等同于高剂量rhil-2施用(阿地白介素)。
[0273]
·
鉴于该6μg/kg/天给药方案的结果，特别是缺乏剂量限制性毒性，据信最大耐受剂量(mtd)高于8μg/kg/天给药方案、10μg/kg/天施用给药方案和甚至15μg/kg/天给药方案的剂量。
[0274]
另外的结果-单一疗法剂量递增期间的抗肿瘤活性：
[0275]
总共36名患者接受至多6μg/kg/天剂量的seq id no:1，并且发现与以上报告的相同。尚未达到seq id no:1的最大耐受剂量。在具有可评估扫描的27名患者中，14名(52％)具有稳定的疾病(图7)。一名患有重度预治疗的胰腺癌的患者具有长期的稳定疾病并且继续接受6μg/kg/天的seq id no:1单一疗法超过6个月。
[0276]
与派姆单抗的组合治疗期间的抗肿瘤活性
[0277]
26名患者接受seq id no:1与派姆单抗的组合。在26名患者中，18名具有可评价的扫描。18名患者中的12名(67％)在疗程中具有稳定的疾病或变好(图8)。
[0278]
1例卵巢癌患者具有确认的部分反应。1名三阴性乳腺癌患者显示靶病灶尺寸减小50％以上(图9)。
[0279]
实施例2-在用高剂量il-2治疗的肾细胞癌(rcc)患者中的外周血淋巴细胞反应。
[0280]
背景
[0281]
重组人白介素-2(rhil-2，阿地白介素)被批准并用于治疗转移性黑素瘤和肾细胞
癌
1-8
。然而，由相关的毛细血管渗漏综合征和导致的低血压，rhil-2的使用限于具有正常心脏和肺功能的患者
9-12
。
[0282]
尽管rhil-2治疗相关的耐受性差，但它仍然是转移性黑素瘤和肾细胞癌的少数治疗方案之一，其在患者亚群中引起完全和持久的反应，在黑素瘤中高达12％、在肾细胞癌中高达7％
7,8
。已经假设rhil-2优先激活并诱导免疫抑制性cd4+treg的扩增
13
，且需要高剂量的il-2来诱导在潜在的肿瘤杀伤性cd8+t细胞和自然杀伤(nk)细胞上表达的受体复合物上的信号传导。
[0283]
公开的数据显示在接受高剂量il-2治疗的黑素瘤患者亚群中,免疫抑制诱导的t细胞共刺激阳性(icos+)treg细胞显著扩增
14
。然而，不容易获得相对于treg细胞特异性定量和比较细胞毒性效应细胞(如cd8+t细胞和nk细胞)的扩增水平的数据。本研究的主要目的是评估高剂量il-2对循环cd8+t细胞、nk细胞和treg细胞数量的药效学作用。
[0284]
方法
[0285]
·
这是一项单中心，开放标签研究。
[0286]
·
研究中心：beth israel deaconess medical center,boston,ma
[0287]
·
研究参与者：接受高剂量阿地白介素(il-2)治疗的肾细胞癌患者群组。
[0288]
·
本研究经beth israel deaconess medical center irb批准，方案编号06-105。
[0289]
·
以600,000国际单位/kg的剂量每8小时通过15分钟静脉内输液施用阿地白介素，最多14个剂量(周期1)。随后休息9天，重复该方案(周期2)，最多28个剂量，如耐受的。
[0290]
·
在每个患者的四个时间点收集用于通过流式细胞术进行免疫分型的全血样品：
[0291]
o周期1首次剂量前
[0292]
o周期1在最后剂量后24小时内
[0293]
o周期2首次剂量前
[0294]
o周期2在最后剂量后24小时内
[0295]
·
通过流式细胞术定量cd8+t细胞、nk细胞和treg细胞。
[0296]
·
在整个研究期间监测安全性和抗肿瘤活性。
[0297]
·
基于放射学报告临床评估反应，并记录最佳反应。
[0298]
结果
[0299]
基线人口统计学特征：
[0300]
·
纳入10名肾细胞癌患者
[0301]
·
中位年龄55(范围39-62)
[0302]
·
男性/女性6/4
[0303]
·
0＝9/1＝1的ecog ps
[0304]
·
先前治疗的中位数2(范围1-3)。
[0305]
接受的剂量数
[0306]
·
周期1：中位数11(范围8-13)
[0307]
·
周期2：中位数6(范围0-11)
[0308]
·
总量(周期1+周期2)：中位数17(范围11-23)。
[0309]
最佳临床反应
[0310]
·
部分反应(pr)：5
[0311]
·
混合反应：1
[0312]
·
进展性疾病(pd)：4.
[0313]
药效学反应
[0314]
·
施用高剂量il-2导致循环treg的强健扩增，并且相比于循环总cd8+t细胞和nk细胞的～2倍扩增，～4倍的平均最大扩增。
[0315]
·
响应于高剂量il-2观察到nk细胞/treg和cd8+t细胞/treg比率的最小变化或没有变化。
[0316]
·
观察到药效学反应的高受试者间变异性，没有临床反应和接受的剂量数没有之间的明显相关性。
[0317]
观察到的所有治疗出现不良事件(表1)与高剂量il-2的已知不良事件谱一致
15
。
[0318]
表1：治疗出现的不良事件
[0319][0320][0321]
*包括5名患者中的毛细血管渗漏综合征
[0322]
结论
[0323]
·
在该患者群组中观察到的安全性特征和临床反应与之前发表的数据相似
15
。
[0324]
·
在用高剂量il-2治疗的患者中观察到t
reg
超过cd8+t细胞和nk细胞的更强健扩增，这与il-2的已知生物活性一致。
[0325]
·
这些结果在将来可用于评价用新型细胞因子治疗剂观察到的免疫反应的可能差异。
[0326]
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[0341]
15.marabondo s和kaufman hl.expert opin drug saf.2017；16(12):1347-1357.
[0342]
实施例3-seq id no:1与高剂量rhil-2的药效学反应的比较。
[0343]
为了比较对seq id no:1和高剂量rhil-2治疗的最大反应的目的，将实施例1和2的数据组合。比较结果示于表2中。
[0344]
表2诱导的倍数变化
[0345][0346]
数据还显示，相比于在接受高剂量重组人il-2(rhil-2)治疗的患者中相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加，相对于循环t调节(treg)的增加的循环nk细胞和cd8+细胞的增加更多。根据表2，相比于高剂量rhil-2疗法治疗的患者中循环免疫抑制性t
reg
的约4倍增加，当根据本发明的治疗方案向患者施用seq id no:1的融合蛋白时，循环免疫抑制性t
reg
具有接近2倍的增加。
[0347]
实施例4：在小鼠中seq id no:1与高剂量rhil-2的药效学反应的比较
[0348]
在小鼠中，与seq id no:1相比，rhil-2治疗诱导更高水平的全身性促炎性细胞因子。在第1天和第4天给药后2、4、6和24小时(n＝4只动物/时间点)，在用rhil-2(20μg、50μg
和75μg)或seq id no:1(8μg、20μg和30μg)每天sc治疗4天的雌性c57bl/6小鼠中测定血清细胞因子产生。图10数据显示ifnγ和il-6的细胞因子产生。在具有如败血症中与感染相关的炎症或患有慢性炎性疾病(如类风湿性关节炎)的个体中发现tnfα和il-6水平升高。阻断tnfα和il-6通路的抗体被指定用于治疗类风湿性关节炎，并且抗il-6药物被用于减轻在某些类型的抗癌治疗(例如嵌合抗原受体(car)t细胞治疗)期间产生的炎症的效应。因此，如图10中观察到的减少的促炎性细胞因子诱导表明，seq id no:1的治疗比rhil-2的治疗耐受性更好并且可能更安全。
[0349]
实施例5-临床试验研究的继续，1/2期扩展剂量至8μg/kg/天的部分a
[0350]
缩写列表：
[0351]
[0352]
[0353][0354]
总体研究设计和计划
[0355]
这是一项全球性、多中心、开放标签、连续组1/2期研究，该研究与获得实施例1和2的数据和信息的研究相同。
[0356]
研究具有三个部分：部分a，剂量递增单一疗法部分；部分b，剂量扩展单一疗法部分；和部分c，与派姆单抗的组合疗法部分(也参见实施例1)。研究概述见表3。
[0357]
表3
[0358]
[0359][0360]
缩写：dlt＝剂量限制性毒性；nsclc＝非小细胞肺癌；pd-1＝程序性死亡受体-1；pd-l1＝程序性死亡配体-1；rcc＝肾细胞癌；rp2d＝推荐的2期剂量；scchn＝头颈部鳞状细胞癌；tbd＝待确定。a不超过5名眼黑色素瘤受试者可入该群组。b受试者的seq id no:1剂量可根据研究者的判断按需要减少一个剂量水平。
[0361]
在研究的部分a中，患有晚期实体肿瘤的受试者在重复周期中通过每天iv施用接受seq id no:1，持续5天，随后停止治疗。在周期1期间，停止治疗期为9天，导致周期长度为14天(2周)。周期2和后续周期的停止治疗期为16天，周期长度为21天(3周)。对于前2个治疗周期，受试者在可获得医疗支持措施和重症监护病房(如果需要)的医疗机构作为住院病人接受seq id no:1。在不存在dlt的情况下，仍在研究中的受试者在门诊接受后续剂量的seq id no:1。
[0362]
在剂量递增中，研究中的群组使用标准3+3研究设计，每个群组3至6名受试者接受表3所示剂量水平的seq id no:1。基于最小预期生物效应水平选择0.1μg/kg/天的起始剂量。根据表3增加后续群组中的剂量，直到因dlt停止或达到mtd。如果在拟定剂量范围内未达到rp2d或mtd，则考虑附加的剂量水平。
[0363]
在剂量递增期间，使用3+3研究设计评价每个群组的安全性和耐受性，其中允许4至7名受试者过度招募，并且每个群组至少3名可评价的受试者以特定的剂量和时间表接受iv seq id no:1。如果3名受试者均未经历dlt，则下一个剂量水平将开放用于招募。如果3名受试者中的1名经历dlt，则将以相同剂量水平招募另外3名受试者。如果没有观察到另外的dlt，则下一个剂量水平将开放用于招募。
[0364]
如果两个或更多个受试者在一个剂量水平经历dlt，则不会发生进一步的剂量递增。可在mtd的检索中测试一个或多个较低剂量水平，其被定义为紧接在其中6名可评价受试者中的≥2名经历dlt的剂量水平以下的剂量水平。在任何剂量递增之前，召开安全审查委员会(src)电话会议，至少包括已招募受试者的研究者和赞助者的医疗监查员，以审查当前群组的安全性数据，并决定是否需要剂量递增。
[0365]
剂量限制性毒性将通过实施例1、表1中描述的任何以下事件来定义。
[0366]
在如实施例1中所述确定rp2d后，开始研究的第二部分(即部分b)。在研究的这一部分，招募最多41名黑素瘤受试者和最多41名rcc受试者以接受rp2d的seq id no:1。这些群组的招募将遵循部分反应(未确认)simon’s两阶段设计招募。反应评估将基于recist指南。
[0367]
在该研究的第三部分(部分c)，受试者接受seq id no:1与派姆单抗的组合(参见实施例1)。部分c独立于部分a和部分b的单一疗法并且与部分a和部分b的单一疗法同时运行。
[0368]
利用3-至6-受试者磨合期评估seq id no:1与派姆单抗组合的安全性。在安全磨合期，招募任何肿瘤类型的受试者。转换受试者(群组4)不适合参与部分c的安全磨合期。
[0369]
在安全磨合期中，前3名受试者以1μg/kg/天的剂量水平接受seq id no:1(实施例1)。如通过src评估的，所有3名受试者的第一个21天周期均耐受治疗，然后研究进展至3μg/kg/天剂量水平。如通过src评估的，前6名受试者的第一个21天周期充分耐受治疗，因此开放扩展群组c1、c2、c3和c4。
[0370]
如入选标准(实施例1)中所述的根据受试者的肿瘤类型和用pd-1/pd-l1通路抑制剂的先前治疗，多达20名受试者被纳入c1、c2、c3群组中的每一个。患有rcc或黑素瘤的受试者不符合入组c1、c2或c3群组的条件。在部分a或部分b中进行seq id no:1单一疗法的受试者(其在最少2个周期后经历疾病进展或在最少4个周期后经历sd和其预期耐受组合疗法治疗)适合部分c、c4群组的治疗。在单一疗法中具有pr或cr的受试者不适合转换，除非随后证实疾病进展。
[0371]
受试者每3周接受200mg的派姆单抗与seq id no:1的组合，每天iv施用，持续5天，然后16天治疗停止期，每个周期的周期长度为21天(3周)(实施例1)。
[0372]
如实施例中所描述的测定单一疗法的rp2d后，开放招募c5、c6和c7群组。因为超过6μg/kg/天的seq id no:1的单一治疗剂量表现出被耐受，那么组合组中seq id no:1的剂量也增加。在c5、c6和c7群组中，最多53名患有黑素瘤的受试者，最多42名患有nsclc的受试者和最多36名患有头颈部鳞状细胞癌的受试者可被招募接受rp2d的seq id no:1与派姆单抗的组合。这些群组的招募将遵循如下所概述的pr(未确认)simon’s两阶段招募。反应评估将基于recist和irecist指南。如果根据实施例1确定rp2d为6μg/kg/天，则考虑群组c1、c2、c3和c4中已分配至1μg/kg/天或3μg/kg/天剂量水平且已充分耐受组合疗法的受试者的剂量递增。
[0373]
肿瘤评估
[0374]
在每个偶数治疗周期后，通过在基线和约每5-6周测量已知疾病的程度来测定抗肿瘤活性。
[0375]
进行适当的放射学程序(计算机断层扫描、磁共振成像、放射性核素成像)以评价疾病区域。用卡尺测量浅表皮肤肿瘤并拍照用于评价。根据a、b和c部分的标准recist和irecist标准进行反应的测定。根据recist指南，肿瘤评估为cr、pr、sd或pd。根据irecist指南，将肿瘤评估为免疫cr(icr)、免疫pr(ipr)、免疫sd(isd)或免疫pd(ipd)。为了本研究的目的，在确定这一评估前，受试者必须满足sd/isd的定义至少12周。
[0376]
在免疫治疗剂的研究中，cr、pr或sd已经显示在通过recist标准表征为pd的肿瘤负荷增加后发生。常规反应标准(例如recist)可能不能充分评估免疫治疗剂的活性。放射
学评估的pd可能并不意味着治疗失败，因为对免疫治疗的反应可能在常规pd之后发生。可测量的抗肿瘤活性的出现对于免疫治疗可能比细胞毒性治疗花费更长的时间。对于免疫治疗剂，应该允许临床上不显著的pd，其被定义为在存在其它反应性病变的情况下的小的新病变，其也可能发生，即使受试者对免疫疗法有反应。稳定的疾病也可能代表具有irecist的抗肿瘤活性。因此，recist和irecist被用于确保对seq id no:1的肿瘤反应的更全面评价。
[0377]
orr/iorr是显示cr/icr或pr或ipr的受试者数量除以可评价抗肿瘤活性的受试者数量。还确定反应的持续时间。在研究的剂量递增部分(部分a)、研究的剂量扩展部分(部分b)和研究的组合治疗部分(部分c)中分别计算受试者的orr/iorr。收集肿瘤图像并集中储存。集中化的读数可用于评估在部分b群组和部分c的c5、c6和c7群组的第二阶段(n2)中开始的扫描。抗肿瘤活性将如下表示：
[0378]
·
基于recist的orr
[0379]
·
基于irecist的iorr
[0380]
·
根据recist的dcr
[0381]
·
根据irecist的idcr
[0382]
·
根据recist的dor
[0383]
·
根据irecist的idor
[0384]
·
根据recist的pfs
[0385]
·
根据irecist的免疫pfs(ipfs)
[0386]
·
根据recist的drr(部分b和部分c5、c6、c7)
[0387]
·
根据irecist的idrr(部分b和部分c5、c6、c7)。
[0388]
药代动力学、药效学和免疫原性的评估
[0389]
药代动力学
[0390]
在预定的时间点从每个受试者获得用于评价seq id no:1pk的血清样品。经验证的使用meso scale discovery平台的电化学发光方法将用于定量人血清中的seq id no:1。进行非区室pk分析以估计seq id no:1的pk参数。
[0391]
免疫原性
[0392]
在预定的时间点从每个受试者获得用于评价抗seq id no:1抗体诱导的血清样品。经验证的使用meso scale discovery平台的电化学发光方法用于检测人血清中seq id no:1的抗药物抗体。基于给药前和给药后样品结果的比较评估每个研究受试者的免疫反应诱导。
[0393]
药效学和生物标志物
[0394]
在从研究中的所有受试者处收集的血液和血清样品中评估各种生物标志物的药效学反应。对肿瘤组织样品进行另外的生物标记物分析，其对于研究受试者是任选的。
[0395]
基于血液的生物标志物
[0396]
seq id no:1的药效学效应通过在预定时间点通过流式细胞术测量来自每个受试者的外周血中的循环cd8+t细胞、t
reg
和nk细胞来评估。此外，在预定时间点从每个受试者获得血清样品。测定多种促炎性细胞因子(包括干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α、il-1β、il-6和il-10)的浓度。还在预定的时间点测量循环肿瘤dna(ctdna)。
[0397]
肿瘤组织生物标志物
[0398]
肿瘤活检
[0399]
在研究期间，在基线时从同意受试者通过活组织检查收集新鲜肿瘤样品。通过免疫组织化学和/或免疫荧光分析这些样品的免疫活化标志物。它们也用于使用例如nanostring方法的基因表达分析。治疗时与基线结果的比较用于证实对肿瘤微环境的药理学影响。基线肿瘤组织的分析用于相关性分析。
[0400]
一般统计方法
[0401]
下面描述统计分析方法。一般而言，提供了用于评价的变量的汇总统计(n，连续变量的平均值、标准差、中位数、最小值和最大值，及分类变量的每个类别中受试者的数量和百分比)。分别总结了部分a、部分b和部分c的数据。基线被定义分别对于每个部分第一剂研究治疗施用之前的最后值。
[0402]
总反应率
[0403]
根据recist1.1的定义，orr的评价基于研究者对放射或摄影图像的审查。总反应率被定义为具有cr或pr客观证据的受试者占可评价抗肿瘤活性的受试者数量的比例。
[0404]
在分析阶段，考虑到用于确认的任何要求，将每个受试者的最佳orr指定为研究治疗开始后记录的最佳反应。如适用，排除疾病进展或新抗癌治疗开始后记录的反应。
[0405]
在研究的剂量递增部分(部分a)、研究的剂量扩展部分(部分b)和研究的组合治疗部分(部分c)中分别计算那些受试者的orr。按照频率、百分比和95％置信区间(ci)给出orr总结。在给定小样本量的情况下，使用精确方法获得ci。通过蜘蛛图(随时间的变化％)和瀑布图(最佳变化％)绘制每次访视时报告的所有病变的直径总和。游泳者图用于展示受试者中反应的特征。
[0406]
免疫总反应率
[0407]
使用irecist分配的反应具有前缀“i”(即，免疫)以将它们与使用recist1.1分配的反应区分开。用于建立客观肿瘤反应的原理在很大程度上与recist1.1没有变化，但是irecist的主要变化是，如果在下一次评估时recist1.1进展之后肿瘤收缩，则重置该条的概念。irecist基于recist1.1原理定义iupd(免疫未确认进展性疾病)。如果从未满足iupd标准，则原理遵循recist1.1。然而，如果iupd的标准已满足，则下一个时间点反应可以是iupd、isd、ipr或icr或者icpd(免疫确认的进展性疾病)。对于irecist，考虑到确认的任何要求，最佳总体反应(ibor)是从研究治疗开始直到研究治疗结束记录的最佳时间点反应。免疫总反应率是基于ibor。在研究的剂量递增部分(部分a)、研究的剂量扩展部分(部分b)和研究的组合治疗部分(部分c)中分别计算那些受试者的ibor。使用蜘蛛图、瀑布图和游泳者图展示受试者的反应特征。
[0408]
疾病控制率
[0409]
疾病控制率被定义为第4周期或之后具有cr、pr或sd客观证据的受试者的比例。在研究的剂量递增部分(部分a)、研究的剂量扩展部分(部分b)和研究的组合治疗部分(部分c)中分别计算那些受试者的dcr。按照频率、百分比和95％ci呈现dcr的总结。在给定小样本量的情况下，使用精确方法获得ci。
[0410]
免疫疾病控制率
[0411]
免疫疾病控制率被定义为第4周期或之后具有icr、ipr或isd客观证据的受试者的
比例。在研究的剂量递增部分(部分a)、研究的剂量扩展部分(部分b)和研究的组合治疗部分(部分c)中分别计算那些受试者的idcr。按照频率、百分比和95％ci呈现idcr的总结。在给定小样本量的情况下，使用精确方法获得ci。
[0412]
反应持续时间(部分b和部分c)
[0413]
反应持续时间被定义为从首次记录反应(cr或pr)到第一次记录客观肿瘤进展或因任何原因死亡的时间。截至分析截止日期存活且无进展的受试者将在开始任何新的抗癌治疗之前在其最后可评估的肿瘤反应评估时审查。在死亡或有记录的进展的访视之前具有两次或更多次连续缺失反应评估的受试者将在受试者被记录为无进展的肿瘤评估的最后日期进行审查。在病变部位处开始任何新的抗癌治疗之前从未达到cr或pr的受试者将从分析中排除。计算recist反应者的反应速率。对于部分b，dor计算如下(以周计)：(部分b中pd/死亡的日期—部分b中首次反应(cr或pr)日期+1)/7，对于部分c，dor计算如下(以周计)：(部分c中pd/死亡日期—部分c中首次反应(cr或pr)日期+1)/7。使用kaplan-meier方法估算部分b和部分c的dor分布。基于经历cr或pr的受试者的抗肿瘤可评价群体，提供了中位点估计dor以及双侧95％ci。提供了kaplan-meier曲线。
[0414]
免疫反应持续时间(部分b和部分c)
[0415]
免疫反应的持续时间被定义为从第一次记录反应(icr或ipr)到第一次记录客观肿瘤进展或因任何原因导致死亡的时间。截至分析截止日期存活且无进展的受试者将在开始任何新的抗癌治疗之前在其最后可评估的肿瘤反应评估时进行审查。在死亡或有记录进展的访视之前具有两次或更多次连续缺失反应评估的受试者将在受试者被记录为无进展的最后肿瘤评估日期进行审查。在病变部位处开始任何新的抗癌治疗之前从未达到icr或ipr的受试者从分析中排除。计算irecist反应者的反应率。对于部分b，idor计算如下(以周计)：(部分b中ipd/死亡日期—部分b中的首次反应(icr或ipr)日期+1)/7，对于部分c，idor计算如下(以周计)：(部分c中ipd/死亡日期—部分c中首次反应(icr或ipr)日期+1)/7。使用kaplan-meier估算部分b和部分c的idor分布。基于经历icr或ipr的受试者的抗肿瘤可评价群体，提供了中位点估计idor以及双侧95％ci。提供kaplan-meier曲线。
[0416]
持久反应率(部分b和部分c)
[0417]
持久反应率被定义为具有持续连续6个月且在开始研究药物的12个月内任何时间开始的客观反应(按照recist1.1的完全或部分反应)的受试者的百分比。按每种肿瘤类型总结drr。drr总结以频率、百分比和95％ci表示。在给定小样本量的情况下，使用精确方法获得ci。
[0418]
免疫持久反应率(idrr)被定义为具有持续连续的6个月且在开始研究药物的12个月内任何时间开始的客观反应(按照irecist的完全或部分反应)的受试者的百分比。按每种肿瘤类型总结idrr。idrr总结以频率、百分比和95％ci表示。在给定小样本量的情况下，使用精确方法获得ci。
[0419]
无进展生存(部分b和部分c)
[0420]
无进展存活被定义为从seq id no:1的第一剂量到首次记录客观肿瘤进展或因任何原因导致死亡的时间。没有疾病进展或没有死亡的受试者在受试者无进展的最后已知时间进行审查。如果受试者在记录的进展或死亡之前开始新的抗癌治疗(全身或局部)，或受试者由于未记录的临床疾病进展而从研究中移除，则在干预之前受试者记录为无进展的最
后评估时审查该受试者。在记录进展(或死亡)的访视之前具有两次或更多次连续缺失反应评估的受试者在受试者被记录为无进展的最后肿瘤评估日期进行审查。对于部分b，pfs计算如下(以周计)：(部分b中的pd/死亡日期—部分b中的首次给药日期+1)/7，对于部分c，pfs计算如下(以周计)：(部分c中pd/死亡日期—部分c中首次给药日期+1)/7。采用kaplan-meier法估计pfs的存活分布。基于抗肿瘤可评价人群，提供了中位pfs以及双侧95％ci。此外，还提供了kaplan-meier曲线。使用kaplan-meier估计值来估计6个月和1年pfs率。
[0421]
无免疫进展生存(部分b和部分c)
[0422]
无免疫进展存活被定义为从seq id no:1的第一剂量到首次记录客观肿瘤进展或因任何原因导致死亡的时间。没有疾病进展或没有死亡的受试者在受试者无进展的最后已知时间进行审查。如果受试者在记录的进展或死亡之前开始新的抗癌治疗(全身或局部)，或受试者由于未记录的临床疾病进展而从研究中移除，则在干预之前将受试者记录为无进展的最后评估时审查该受试者。在记录进展(或死亡)的访视之前具有两次或更多次连续缺失反应评估的受试者在受试者被记录为无进展的最后肿瘤评估日期被审查。对于部分b，ipfs计算如下(以周计)：(部分b中的ipd/死亡日期—部分b中的首次给药日期+1)/7，对于部分c，pfs计算如下(以周计)：(部分c中的ipd/死亡日期—部分c中的首次给药日期+1)/7。使用kaplan-meier法估计ipfs的存活分布。基于抗肿瘤可评价群体，提供了中位ipfs和双侧95％ci。此外，还提供了kaplan-meier曲线。使用kaplan-meier估计值来估计6个月和1年ipfs率。
[0423]
药代动力学分析
[0424]
使用描述性统计以图形和表格形式呈现和总结个体血清浓度和浓度-时间数据。使用描述性统计总结药代动力学参数。提供个体pk浓度的受试者列表。根据标称(方案规定)采样时间总结浓度数据。使用phoenix winnonlin professional(6.1版或更高版本，pharsightcorporation)通过非区室分析方法计算药代动力学参数；从施用开始实际经过的时间将用于估计个体血清pk参数。适当时进行剂量比例性和其他pk分析。
[0425]
药效学分析
[0426]
描述性总结了药效学数据。在可能的情况下，通过相关性分析或目测检查评估seq id no:1的血清pk参数或浓度与药效学反应之间的关系。
[0427]
免疫原性分析
[0428]
测定抗seq id no:1抗体的存在，并按群组/剂量水平总结数据。
[0429]
组织生物标志物分析
[0430]
总结了基线值、治疗后值以及til密度、细胞毒性til比率、免疫抑制til和免疫细胞介导杀伤信号强度的变化。对于源自肿瘤组织的终点估计抗肿瘤功效终点(最佳总反应，无进展存活)与基线状态(或值)之间的相关性。基于基线状态或者低值和高值分别总结功效终点。对于源自肿瘤组织的终点估算抗肿瘤功效终点(最佳总反应，无进展存活)与在治疗后相对于基线的变化之间的相关性。
[0431]
接受6μg/kg剂量的seq id no:1的患者中的部分和完全反应
[0432]
来自正在进行的1/2期研究的初始数据提供了接受6μg/kg的seq id no:1的部分b单一疗法剂量扩展群组中尿道黑素瘤患者的部分反应。在加入研究之前，患者接受了尿道黑色素瘤的手术切除治疗，随后接受了一年的辅助纳武单抗治疗。在研究中，该患者在第1
周期和第8周期治疗之间显示血清乳酸脱氢酶(ldh)降低。研究期间，患者在每个治疗周期中的受益如下：周期2-稳定疾病(sd)；目标病变从基线增加8％；周期4-sd；目标病变从基线减少17％；周期6部分反应(pr)病变从基线减少32％；周期8-根据recist确认的pr，目标病变从基线减少35％。
[0433]
接受3μg/kg剂量的seq id no:1与派姆单抗组合的患者中的部分和完全反应
[0434]
来自正在进行的接受3μg/kg剂量的seq id no:1和派姆单抗的组合的患者的1/2期研究的初始数据，分别在患有以下类型的癌症的患者中产生至少一完全反应(cr)和几种部分反应(pr)：卵巢(cr)；卵巢(pr)；卵巢(pr)；食管(pr)；和tnbc(按照irecist的ipr)。
[0435]
群组68μg/kg/天的扩展剂量数据
[0436]
iv施用后seq id no:1的药代动力学
[0437]
如实施例1中所述，rp2d被确定为6μg/kg的日剂量。根据研究设计，新的群组6开始在研究中招募以8μg/kg的日剂量测试。招募了两名患者，预期再招募最多4名患者。以下是从入组的前两名患者接收的数据。
[0438]
第一iv剂量(周期1第1天)后seq id no:1血清浓度对时间分布描绘于图11中。图12显示了在实施例1中描述的部分a中评价的剂量范围内seq id no:1的平均峰值(c
max
)和总血清暴露(auc)。
[0439]
在seq id no:1的第一iv剂量后，在30分钟(0.5小时)输液结束时，血清seq id no:1浓度达到峰值，然后以指数方式下降。seq id no:1的全身暴露(c
max
和auc
last
)随剂量增加而增加。c
max
的增加在0.1μg/kg至8μg/kg的剂量范围内大致与剂量成比例。auc
last
的增加在0.1μg/kg至3μg/kg的剂量范围内大于与比例剂量，但在3μg/kg至8μg/kg的剂量范围内大致与剂量成比例。
[0440]
选择6μg/kg剂量作为推荐的2期剂量(实施例1)用于seq id no:1的iv施用。在8μg/kg下的招募正在进行，有两名患者在该剂量水平下接受治疗。
[0441]
iv施用后seq id no:1的药效学作用
[0442]
图13描绘了前两个周期的iv seq id no:1治疗后，外周血中总nk细胞、总cd8+t细胞和调节性t细胞(t
reg
)的细胞群的时程。周期1第8天(c1d8)和周期2第8天(c2d8)的总nk细胞、总cd8+t细胞和t
reg
相对于基线的倍数变化(fcb)在该期评估的整个剂量范围内描绘于图14中。
[0443]
seq id no:1诱导循环nk和cd8+t细胞的剂量依赖性增加，对t
reg
细胞具有最小的非剂量依赖性作用，并且6和8μg/kg剂量水平具有nk细胞和cd8+t细胞的最强的升高，而t
reg
分布没有显著变化。
[0444]
此外，在评估以不同剂量水平的seq id no:1治疗的患者中的血清细胞因子浓度时，在接受较高剂量(》1μg/kg)的seq id no:1的患者中观察到干扰素γ(ifn)和il-6的血清浓度的瞬时升高(图15)。有趣的是，在3μg/kg剂量水平下观察到峰值il-6反应，而在高于3μg/kg(包括6和8μg/kg)的剂量下血清il-6水平降低。
[0445]
il-6是不被认为有助于抗肿瘤反应的促炎性细胞因子，但可能与一般炎症和治疗的副作用(包括发烧)相关。已经在几种癌症中证实了血清和肿瘤部位中il-6水平的提高。这种提高通常伴随着较差的预后和较低的存活率。il-6的下调与对癌症治疗的较好反应相关。
[0446]
ifnγ是细胞毒性效应细胞功能的非常重要的标志物，且cd8+t细胞和nk细胞在活化后产生ifnγ。ifnγ与抗肿瘤免疫反应相关，并且在3、6和8μg/kg的seq id no:1剂量水平下观察到显著升高。值得注意的是，在6和8μg/kg剂量水平下观察到ifnγ升高，而此时il-6水平比在3μg/kg下观察到的峰值水平低得多。在用8μg/kg seq id no:1治疗后观察到的ifnγ水平甚至比在3和6μg/kg下观察到的ifnγ水平高约4至5倍。这表明6和8μg/kg剂量水平和潜在的10、12、15μg/kg或更高的较高剂量水平与seq id no:1的较低剂量水平相比，相对于炎性活性在抗肿瘤免疫活性方面可能具有特别的优势。
[0447]
本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和公布或未公布的美国专利申请均以引用方式并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引用方式并入本文。本文引用的所有其它公开的参考文献，文献、手稿和科学文献在此通过引用方式并入本文。
[0448]
虽然已经参考本发明的优选实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所包含的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。还应当理解，这里所描述的实施方案并不是相互排斥的，并且根据本发明，各个实施方案的特征可以全部或部分地组合。