用于治疗与DUX4表达相关的疾病诸如肌营养不良症和癌症的酪蛋白激酶1抑制剂的制作方法

用于治疗与dux4表达相关的疾病诸如肌营养不良症和癌症的酪蛋白激酶1抑制剂
发明领域
1.本发明涉及用于治疗与dux4表达相关的诸如肌营养不良症的疾病的化合物组合。本发明还涉及这种组合的用途或这种组合的使用方法。


背景技术：

2.面肩肱型肌营养不良症(fshd)是最普遍的遗传性肌营养不良症之一。在20岁之前开始出现症状，伴随眼睛和嘴周围、肩膀、上臂和小腿肌肉无力和萎缩。之后，无力会扩散到腹部肌肉，有时会扩散到臀部肌肉，大约20％的患者最终会束缚于轮椅。目前，患者依靠疼痛和疲劳等症状的治疗，包括使用止痛药、认知疗法和体育锻炼，有时还需要补充用于维持患者活动能力的医疗设备。此外，通过手术治疗肩胛骨可以增强肩胛功能。充其量，这些干预措施本质上仍是维持症状，不会影响疾病的进展，这说明需要能够改变疾病进展的疗法。
3.近年来，在对fshd的分子基础的理解上取得了重大进展，导致了对引起fshd的基本遗传病灶的鉴定和表征。发病机理模型得到了广泛支持，其中肌细胞中双同源盒4(dux4)转录因子的表观遗传脱阻抑作用通过启动导致肌肉萎缩、炎症和氧化应激(它们可以是该疾病的主要特征)的转录失调级联反应而触发病理(lemmers等人，2010，doi：10.1126/science.1189044；sharma等人，2016，doi:10.4172/2157-7412.1000303，snider等人，2010，doi：10.1371/journal.pgen.1001181；tawil等人，2014，doi：10.1186/2044-5040-4-12)。
4.fshd有时分为两个亚型，即fshd1和fshd2。fshd1与位于染色体4q35的亚端粒区域的dna串联阵列(d4z4)内的大量缺失相关。每个d4z4重复序列均包含一个dux4基因的拷贝。在健康个体中，dux4在种系中表达，但在体细胞组织中表观遗传上沉默。健康的不受遗传影响的个体被定义为在两个4q染色体臂上均具有10至100个d4z4重复单元，而具有fshd1的个体在一个4q染色体臂上具有1至10个d4z4重复单元。表征fshd的d4z4重复序列的缺失从该区域去除了大部分的调节染色质，包括数百个组蛋白和大量富含cpg的dna。这些元素在dna甲基化和异染色质的建立中必不可少，其丢失会显著改变d4z4阵列的表观遗传状态。d4z4的收缩本身不是致病的。仅当d4z4的收缩发生在允许疾病的4qa等位基因(其包含可能影响远端dux4转录物的多腺苷酸化的多态性)上时，改变的表观遗传背景才与fshd1患者骨骼肌中dux4的可变剪接和表达增加相关。在更为罕见的fshd2形式中，原因是表观遗传因子(如smchd1或dnmt3b)的突变形式。同样以这种形式，d4z4区域被低甲基化，并且肌细胞的特征在于脱阻抑的dux4蛋白。有人提出fshd1和fshd2是连续的，而不是分开的(van den boogaard et al.,2016,doi:10.1016/j.ajhg.2016.03.013)。两种形式的fshd都会集于过度的dux4表达。仅在一小部分肌纤维中爆发状的dux4表达导致肌细胞死亡，最终导致肌无力和消瘦(lemmers等人，2010)。
5.用最简单的术语来讲，dux4过表达是fshd的主要病原性侵害，对它的阻抑是fshd的一种有前途的治疗方法。为此，短重复序列通常与严重的fshd表型相关。中等的重复序列
收缩具有较轻且变化较大的临床严重程度。同样在fshd2中，d4z4区域被低甲基化，并且肌细胞的特征在于脱阻抑的dux4蛋白。d4z4重复单元少于10个且在smchd1中也有突变的患者具有非常严重的临床表型，这说明均导致dux4的脱阻抑的重复序列大小和表观遗传修饰子活性的组合决定了fshd的最终疾病严重程度。dux4充当转录因子，其表达启动转录级联反应，导致进行性肌细胞功能障碍和死亡，并最终导致明显的病理(kowaljow等人，2007，doi:10.1016/j.nmd.2007.04.002；vanderplanck等人，2011，doi：10.1371/journal.pone.0026820；geng等人，2012，doi：10.1016/j.devcel.2011.11.013；yao等人，2014，doi:10.1093/hmg/ddu251；wallace等人，2011，doi:10.1002/ana.22275)。
6.由于其在fshd中的致病作用，抑制dux4是阻止疾病进展的主要治疗方法。该方法还可用于治疗其他疾病，如包括急性淋巴细胞白血病(yasuda等人，2016，doi：10.1038/ng.3535)和肉瘤(oyama等人，2017doi：10.1038/s41598-017-04967-0；bergerat等人，2017，doi：10.1016/j.prp.2016.11.015)等在内的癌症。但是，对dux4表达背后的机制了解甚少，相应的药物靶标也知之甚少。因此，目前没有针对fshd的治疗，并且需要可用于抑制dux4表达的化合物和组合物。campbell等人(2017，doi 10.1186/s13395-017-0134-x)筛选了具有已知表观遗传活性的化学化合物以及包括已通过临床测试的化合物组成的pharmakon 1600库，以鉴定降低dux4表达的分子，这由永生化fshd骨骼肌细胞培养物中dux4靶基因mrna的表达水平来监测。他们确定了几类分子，包括布罗莫结构域和末端外(bet)家族蛋白的抑制剂以及β-2肾上腺素能受体的激动剂。他们的研究表明，来自这两类的化合物分别通过阻断含布罗莫结构域的蛋白4(brd4)的活性或增加环状一磷酸腺苷(camp)的水平来抑制dux4的表达。wo2019/071144和wo2019/071147建议在在fshd治疗中使用p38抑制剂如洛吡莫德降低dux4表达。
7.测定fshd的严重程度和进展尤其具有挑战性，因为与大多数以恒定速率对称进展的肌营养不良症不同，fshd的特征在于肌肉萎缩和软弱的逐步、不对称进展。因此，用于对患者进行分层的结果测量和生物标志物对于测量疾病负担和测试干预措施的效果至关重要。与其它肌肉萎缩症一样，在疾病过程中肌肉组织被脂肪取代。通过mri测量的脂肪浸润程度与常用的功能状态测量方法fshd临床严重程度评分相关(mul et al.,2017,doi:10.1212/wnl.0000000000004647)。此外，有人提出肌肉炎症造成fshd的病理生理学，并且其先于肌肉破坏和脂肪替代，从而表现为疾病活动的早期标志物。可以使用具有短ti反转恢复(stir)的mri序列来研究肌肉炎症。stir高信号(stir+)显示水肿。fshd的免疫介导机制与鉴定受影响的fshd肌肉活检的局灶性炎症和cd8+t细胞浸润一致(wang et al.,hum mol genet.2019feb 1；28(3):476-486.doi:10.1093/hmg/ddy364；frisullo et al.,2011,doi:10.1007/s1087 5-010-9474-6)。在stir+肌肉活检中经常观察到明显的炎性细胞浸润，模仿炎性肌病，并且确实有人认为这可以代表活动性疾病的早期标志物(geng et al.2012,doi:10.1016/j.devcel.2011.11.013)。因此，已提出使用stir序列的mri作为预后结果的衡量标准(tasca et al.,2016,doi:10.1002/ana.24640；janssen et al.,2014,doi:10.1371/journ al.pone.00854 16)。研究fshd中肌肉炎症和脂肪替代的研究表明，严重的肌肉炎症预示着肌肉脂肪替代更快(tasca et al.,2016,doi:10.1002/ana.24640；ferguson et al.,2018,doi:10.1002/mus.26038；wang et al.,2019,supra)。已经有提出，一旦肌肉达到中等的脂肪占比，就会加速朝向完全替代脂肪，肌肉炎症可作为这一过程
的触发因素(janssen et al.,2014,doi:10.1371/journal.pone.00854 16)。
8.最近的一项研究通过量化stir高信号、指示大腿肌肉中的炎症和脂肪含量，调研究了45名患者14个月内fshd的病理生理学，并调研了14个月内的肌肉炎症与脂肪含量的关系和进展(dahlqvist et al.,2019,10.1007/s00415-019-09242-y)。43名患者参与了肌肉炎症和脂肪含量分析，并评估了每位患者的9块大腿肌肉。33名患者在基线至少有一块stir+肌肉，在随访时有34名患者均有。在分析的所有370块肌肉中，83块肌肉在基线时为stir+，103块肌肉在随访时为stir+。在14个月内，所有肌肉的脂肪含量都显著增加。与stir-肌肉相比，stir+肌肉中这种脂肪替代进展速度快两倍多，并且随着高强信号的严重程度而增加。这说明活动性炎症患者的肌肉纤维正在经历活动性疾病进展。
9.令人感兴趣的是，最近的一项研究检查了在fshd中mri变化、相应病理变化和dux4靶基因表达之间的相关性。横断面数据表明，stir+的mri测量对于识别具有dux4表达的肌肉和活动性疾病可能具有重要的预测价值。事实上，使用提高的stir等级来选择dux4靶表达增加的肌肉，在约90％的样品中观察到dux4表达(wang et al.,supra)。此外，在stir+肌肉中进行的活检示出基因表达变化，这些变化可归因于炎症、细胞外基质重塑和肌肉再生(tasca et al.,2012,doi:doi.org/10.1371/journal.pone.0038779)。这表明炎症浸润和dux4表达之间存在因果关系。许多被dux4高度上调的基因通常在生殖系和/或早期干细胞中起作用，并且不存在于健康成人骨骼肌中。配子发生程序的激活被认为与有丝分裂后骨骼肌不相容，导致细胞凋亡或细胞功能障碍。
10.虽然导致dux4减少的治疗方法预计会影响fshd的下游炎症、脂肪浸润和纤维化过程，但特征在于dux4表达和炎症的活动性疾病迹象的患者，将受益于影响这两个迹象的治疗。wo2019/071144和wo2019/071147公开了p38抑制剂如洛吡莫德在fshd治疗中降低dux4表达的用途。p38抑制剂已广泛开发用于治疗炎症性疾病，例如慢性阻塞性肺病(copd)和风湿性关节炎。在先天免疫反应中，丝裂原活化蛋白激酶(mapk)和核因子-κb(nf-κb)在与病原体相关分子模式(pamp)结合后被模式识别受体(prr)激活。在哺乳动物细胞中发现的14个mapk对于产生免疫反应至关重要。总之，它们在细胞用来适应炎症和应激条件的mapk信号转导途径中发挥关键作用。病原体或炎症刺激物启动由p38激酶介导的磷酸化级联反应，导致炎症反应相关基因的转录和翻译，这些基因编码蛋白质如tnf-a、il-1b、il-6和il-8(xing 2105,doi：10.4081/mk.2015.5508)。因此，理论上，p38抑制剂可以影响fshd肌肉中dux4的表达以及局部炎症，这是dux4表达增加和激活再生的疾病的标志物(wang et al.,2019,supra；tasca et al.,2012,doi:doi.org/10.1371/journal.pone.0038779)。
11.然而，已知p38αmapk在骨骼肌生物学中发挥关键作用，特别是在消除增殖的成肌细胞分化和随后融合形成多核肌管中，这是在治疗fshd中的不希望的影响。在wo2019/071144和wo2019/071147中，使用永生化成肌细胞产生的数据用于表明p38a和p38b激酶抑制剂不影响肌细胞生成素或其它成肌因子的表达，也不影响在永生化的fshd肌管中由于成肌融合(myogenic fusion)所表现出的成肌细胞的增殖或成肌细胞的分化。然而，本发明人已经发现p38抑制剂确实抑制患者来源的原代fshd肌管的成肌融合。虽然肌细胞生成素或myh2等成肌分化(myogenic differentiation)标志物的表达保持不变，但通过融合原代肌管培养物的高含量图像分析(high content image analysis)检测到成肌融合抑制，其中p38抑制剂削弱了肌管融合。
12.因此，显然需要既抑制fshd中dux4和/或炎症反应又不影响肌管形成的化合物。需要降低对肌管形成的抑制的化合物。
13.本发明基于令人惊讶的发现，即酪蛋白激酶1(ck1，也称为csnk1)的抑制剂可以防止对肌管形成的负面影响。对ck1和p38的组合抑制导致dux4抑制，而不会对肌管形成产生负面影响。这种有益的表型可以通过将ck1抑制剂与p38抑制剂剂组合而观察到。
14.酪蛋白激酶1(ck1，也称为csnk1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族。酪蛋白激酶1(ck1)是哺乳动物中普遍表达的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，已知可磷酸化多种蛋白质。因此，ck1亚型在多种细胞过程中发挥重要的调节作用，所述细胞过程包括增殖、dna修复、细胞凋亡、细胞分化、昼夜节律、wnt信号、转录因子的核与质穿梭和dna转录(eide ej、virshup dm(2001)doi:10.1081/cbi-100103963)。ck1家族由人类的不同亚型(α、γ1、γ2、γ3、δ和ε)及其各种可变剪接变体组成。ck1亚型具有高度保守的激酶结构域，但其n和c末端序列的长度和组成存在显著差异。c末端结构域具有多个自身磷酸化位点，被认为参与调节自溶酶活性。在哺乳动物中，该酶以七种同工型存在：α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε，它们都具有相似的激酶结构域。通过不同底物蛋白的磷酸化，这些同工型能够使这些底物蛋白的功能激活、稳定、失活或去稳定化，从而调节其功能。例如，抑癌因子p53和致癌基因mdm2(两者都是控制异常细胞生长的重要蛋白质)是ck1的底物。
15.酪蛋白激酶如酪蛋白激酶1δ或酪蛋白激酶1ε对p53的磷酸化导致p53和mdm2之间相互作用的改变。还已知酪蛋白激酶1δ和酪蛋白激酶1ε作为与细胞分裂过程中作为中心体的纺锤体形成相关的调节蛋白而参与其中，而酪蛋白激酶1δ和酪蛋白激酶1ε参与trail(肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导因子)和fas介导的细胞凋亡。进一步报道了通过非选择性ck1抑制化合物ic261抑制酪蛋白激酶1δ或酪蛋白激酶1ε降低了胰腺肿瘤细胞在体外和体内的生长(brockschmidt等，2008，doi：10.1136/gut.2007.123695)。因此，已经研究了ck1抑制剂的各种重要的表型效应和治疗作用。
16.wo2011051858公开了可用于治疗和/或预防与中枢神经系统相关的疾病和病症的ck1抑制剂(δ和ε)。这些抑制剂形成一系列取代的咪唑化合物，更具体地说，一系列4-芳基-5-杂芳基-1-杂环烷基咪唑和相关的类似物。ck1δ和ck1ε的合成和ic
50
值均已报道，后者一般都在纳摩尔范围内。wo2012085721中公开了紧密相关的ck1抑制剂家族。
17.wo2015119579公开了也具有唑核的家族，即，用作ck1抑制剂的2,4,5-三取代的唑化合物家族。这些抑制剂用于经由ck1抑制诱导或增强多能干细胞向心肌细胞的分化。公开了获得这些抑制剂的合成途径，并且显示出这些抑制剂通常具有向像ck1δ和ck1ε抑制剂一样在纳摩尔范围内的ic
50
值。
18.ep2949651公开了充当ck1抑制剂的取代的苯并噻唑衍生物的家族，将其用途关联到ck1介导的疾病(尤其是炎性疾病、神经性疾病、精神病、神经退行性疾病和/或眼科疾病)以及某些再生过程的治疗和/或预防。提供了合成方法，并且显示出这些抑制剂对ck1δ和ck1ε具有纳摩尔级的抑制活性。bischof等人,amino acids(2012)43:1577
–
1591doi:10.1007/s00726-012-1234-x、garc
í
a-reyes et al.,j.med.chem.2018,61,4087-4102,doi:10.1021/acs.jmedchem.8b00095和richter et al.,j.med.chem.,doi:10.1021/jm500600b描述了相似的ck1抑制剂。
19.wo2009016286公开了6-环氨基-3-(吡啶-4-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪衍生物，其可
用作蛋白激酶抑制剂，特别是作为ck1δ和ck1ε抑制剂。详细描述了它们的合成，并根据us2005/0131012中描述的方法评估了ck1抑制剂通过酪蛋白激酶ck1δ和ck1ε抑制酪蛋白磷酸化的能力，揭示了ic
50
值在纳摩尔范围内。
[0020]
wo2015195880公开了具有相似核的家族，即取代的双环吡唑，其用作蛋白激酶抑制剂。描述了获得抑制剂的合成策略，并且所得ck1抑制剂显示出对ck1δ和ck1ε有效。这意味着与癌症的治疗特别相关。
[0021]
hirota等人,plos biol 8(12):e1000559.doi:10.1371/journal.pbio.1000559和monastyrskyi et al.,bioorg med chem.2018feb 1；26(3):590-602.doi:10.1016/j.bmc.2017.12.020描述了包含6-氨基嘌呤核的ck1抑制剂，与治疗昼夜节律紊乱或癌症有关。
[0022]
halekotte等人,molecules 2017,doi:10.3390/molecules22040522、luxenburger et al.,molecules 2019,doi:10.3390/molecules24050873和peifer et al.,j.med.chem.2009,52,7618
–
7630doi:10.1021/jm9005127描述具有唑或杂唑核的ck1抑制剂。其用途与治疗癌症、神经退行性疾病、睡眠障碍或炎症有关。
[0023]
由α、β、γ和δ亚型组成p38 mapk家族的成员由不同的基因编码，这些基因在适应应激和生存所需的细胞反应中起关键作用(whitmarsh 2010doi:10.1186/1741-7007-8-47；krementsov et al.,2013,doi:10.1128/mcb.00688-13)。在包括心血管和其它慢性疾病在内的许多炎症性疾病中，这些相同的p38 mapk应激诱导信号可以触发适应不良反应，从而加重而不是减轻疾病(见whitmarsh 2010回顾)。事实上，在骨骼肌中，各种细胞应激，包括慢性运动、胰岛素暴露和内分泌状态改变、成肌细胞分化为肌细胞、活性氧以及细胞凋亡，都已被证明诱导p38激酶途径(keren,et.al.,2006,doi:10.1016/j.mce.2006.03.017；zarubin et al.,2006,doi:10.1038/sj.cr.7290257)。事实上，p38激酶途径可以被许多外部刺激激活，包括促炎细胞因子和细胞应激，导致双重特异性mapk激酶mkk3和mkk6的激活。mkk3和mkk6的激活，进而在其活化环中磷酸化p38，触发下游磷酸化事件。这些包括hsp27、mapkapk2(mk2)和各种转录因子的磷酸化，最终导致细胞核中的转录变化。已经鉴定了一些p38调节转录物和大量p38激酶下游效应子(在cuenda et al.,2007,doi:10.1016/j.bbamcr.2007.03.010和kyriakis et.al.,2001,doi:10.1152/physrev.2001.81.2.807，以及viemann et al.2004,doi:10.1182/blood-2003-09-3296中描述)。
[0024]
来自不同化学骨架的几种抑制p38αmapk信号传导途径的化合物已进入多种(非神经肌肉)适应症的临床试验，包括类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、疼痛、心血管疾病和癌症。
[0025]
已知p38αmapk在骨骼肌生物学中发挥关键作用，特别是在消除增殖的成肌细胞分化和随后融合形成多核肌管方面。这个途径的激活被认为是表达myod的肌细胞所固有的，并用于保证肌肉程序的复杂和及时激活(keren et al.,2006)。wo2019103926公开了使用p38抑制剂治疗fshd。wo2019/071144和wo2019/071147公开了用p38α抑制剂治疗组成性地经历退化和再生过程的肌营养不良症患者。p38α的完全敲除(ko)是胚胎致死性的。胚胎拯救允许幼崽存活至出生后几天，并分离卫星细胞以研究缺乏p38α的成肌前体。缺乏p38α的成肌细胞表达的关键分化基因显著减少，并显示出严重的融合缺陷。p2幼崽的组织学显示显著增加的循环的卫星细胞及左移的纤维分布(perdiguero et.al,2007,doi:10.1038/
sj.emboj.7601587)。p38途径激活示出在mdx和sgcd-/-小鼠中增强，分别是duchenne肌营养不良症或limb-girdle肌营养不良症的遗传模型。在mdx小鼠中，成熟肌肉(由myl1启动子驱动的cre)中p38α的敲除(ko)在早期时间点没有显示出缺陷，6个月龄的p38α缺陷小鼠与对照组相比示出明显较大的中央成核现象以及较小的纤维分布。没有观察到其它疾病的病理指标，例如纤维化或血清肌酸激酶的增加，提示p38α从骨骼肌中的丢失对成熟纤维不是病理性的，但是增强野生型卫星细胞的活性或以其它方式影响中央核随着其成熟而运动至肌纤维的外周(wissing et al.,2014,doi:10.1093/hmg/ddu270)。这项研究中用于缺失p38的myl1-cre敲入等位基因在卫星细胞中不是活性的，因此p38丧失不能直接影响骨骼肌的再生，这表明p38丧失所赋予的保护作用应归因于例如在不受卫星细胞影响的情况下减少的肌纤维坏死(wissing et al.,2014)。在原代fshd肌细胞中，与来自健康供体的细胞相比，p38未上调，提示p38抑制剂减少坏死的潜在作用对于所有肌营养不良症包括fshd不能一概而论。考虑到这一点，虽然药物学p38抑制剂可用于减轻其中p38活性增加的肌营养不良症的营养不良病理，但即使在这些疾病中，鉴于p38抑制剂对卫星细胞和肌肉再生的已知拮抗作用，这种应用在机理上也不是直接的。
[0026]
鉴于上述，需要在fshd中抑制dux4和/或炎症反应而不影响肌管形成的化合物或化合物组合。需要降低对肌管形成的抑制的化合物。需要降低p38抑制剂诱导的肌管形成受损的化合物。需要改良的dux4减少，优选不影响肌管形成。需要促进肌管形成，优选是在fshd治疗期间。需要改善p38抑制剂在治疗dux4相关病症中，例如在fshd治疗中的效果。需要改良的对患有dux4相关病症如fshd且也患有炎症的个体的治疗。


技术实现要素：

[0027]
在第一方面，本发明涉及酪蛋白激酶1抑制剂，其用于治疗个体中与dux4表达相关的疾病或病症，其中优选所述个体患有肌肉炎症。优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂用于促进成肌融合和分化中的至少之一，其中优选所述个体患有肌肉炎症。优选地，所述与dux4表达相关的疾病或病症是肌营养不良症或癌症，其中更优选肌营养不良症。最优选地，所述与dux4表达相关的疾病或病症是面肩肱型肌营养不良症(fshd)。优选地，用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂将dux4表达降低至少20％、40％、60％、80％或更多。优选地，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1δ。
[0028]
在第二方面，本发明涉及酪蛋白激酶1抑制剂和p38抑制剂的组合，其用于治疗个体中与dux4表达相关的疾病或病症，其中优选所述个体患有肌肉炎症。优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂用于促进成肌融合和分化中的至少之一，其中优选所述个体患有肌肉炎症。所述酪蛋白激酶1抑制剂和所述p38抑制剂可以是两种不同的物质，或者所述酪蛋白激酶1抑制剂和所述p38抑制剂可以是相同物质。优选地，所述与dux4表达相关的疾病或病症是肌营养不良症或癌症，其中更优选肌营养不良症。最优选地，所述与dux4表达相关的疾病或病症是面肩肱型肌营养不良症(fshd)。优选地，所述p38抑制剂至少抑制p38α。优选地，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1δ。优选地，用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂和p38抑制剂的组合将dux4表达降低至少20％、40％、60％、80％或更多。
[0029]
在第三方面，本发明涉及促进成肌融合和/或分化的体内、体外或离体方法，所述方法包括将细胞与本文定义的酪蛋白激酶1抑制剂或与本文定义的组合接触的步骤。
[0030]
在第四方面，本发明涉及在有需要的个体中降低dux4表达的方法，所述方法包括施用有效量的如本文定义的酪蛋白激酶1抑制剂的步骤，或施用有效量的如本文定义的组合的步骤，其中所述个体患有肌肉炎症。优选地，所述个体患有与dux4表达相关的疾病或病症，即肌营养不良症或癌症，其中更优选肌营养不良症。最优选地，所述与dux4表达相关的肌营养不良症是面肩肱型肌营养不良症(fshd)。
具体实施方式
[0031]
本发明人惊奇地发现ck1抑制剂改善成肌融合。这促进了肌管形成。当施用用于治疗dux4相关病症的其它药物时，例如施用p38抑制剂时，这种效果尤其有用，因为此类药物损害肌管形成。为了克服这种不良的医源性现象，可以共同施用ck1抑制剂。例如，发现ck1抑制剂和p38抑制剂的组合降低dux4表达，同时促进正确的肌管形成。因此，本发明提供了ck1抑制剂在具有医源性肌管形成受损(例如由于施用p38抑制剂所致)的个体中改善成肌融合的用途。
[0032]
本发明人已将针对纤维损伤的炎症反应确定为dux4介导的病症例如fshd恶化的有说服力的候选机制。肌细胞中胚胎转录因子的表达失调诱导了多种分子，这些分子可以作为直接被浸润性t细胞识别的新抗原。事实上，一些受dux4调控的基因如prame家族是已知的睾丸癌症抗原，因此这些基因在骨骼肌中的表达也可以诱导适应性免疫反应。此外，dux4对defb103的诱导影响适应性和先天免疫反应二者。defb103在适应性免疫反应中具有促炎作用，并可作为单核细胞、淋巴细胞和树突细胞的化学引诱剂。在这方面，其可以增强对在fshd肌肉中表达的种系抗原的适应性免疫反应(geng et al.2012,doi:10.1016/j.devcel.2011.11.013)。最后，免疫细胞对肌组织开展的效应子机制，例如但不限于疾病过程中释放的细胞因子和炎症因子，促进直接参与肌纤维死亡的有害信号传导事件，并可以作为dux4表达的触发剂。总之，炎症标志物例如stir mri成像对于鉴别患有炎症和dux4表达的患者具有重要的预测价值，这两种标志物是活动性疾病的特征。根据本发明，提供了用于治疗已被诊断患有活动性fshd的个体的化合物和化合物组合。
[0033]
继dux4在fshd的共识疾病假说中发挥核心作用之后，预期具有改变疾病潜力的治疗方法依赖于dux4的抑制。发明人惊奇地将酪蛋白激酶1(ck1)鉴定为在肌细胞中实现dux4阻抑和促进肌细胞、特别是成肌融合受损的肌细胞中的成肌融合的新型药物靶标。使用fshd患者源性的原代肌细胞完成了本发明。由于fshd基因座的灵长类特异性以及重组、永生化或致瘤细胞或动物模型对研究内源性dux4调节机制的相关性存有疑问，因此患者源性的原代肌细胞是可用的最相关的疾病模型。基于永生细胞的测定法具有改变表观基因组的风险，从而限制了它们在研究dux4表达的内源性调节方面的相关性。特别是，d4z4的亚端粒位置和d4z4表观基因组在dux4阻抑的稳定性中的重要性(stadler等人，2013，doi：10.1038/nsmb.2571)强调了使用原代肌细胞来发现调节dux4的表达的生理学相关药物靶点的必要性。
[0034]
dux4历史上一直被认为很难在fshd肌肉中进行检测。已经证明它在来自fshd患者的原代成肌细胞中的表达是随机的。研究报告，在增殖的fshd成肌细胞中以及在成肌细胞分化过程中，分别在1000个细胞核中只有1个或者在200个细胞核中只有1个是dux4阳性。由于dux4的这种特别低的丰度，检测dux4蛋白被报道为一项技术挑战。尽管fshd文献中已广
泛使用fshd原代肌细胞，但这些报告似乎都没有超出实验室规模的水平的适用范围。使用原代细胞造成的局限性和公认的检测低水平内源性dux4的复杂性说明了与应用原代fshd肌细胞于更高通量格式有关的挑战。虽然在将增殖的fshd成肌细胞体外分化为多核肌管后dux4表达增加，但其水平仍然很低，而且动态可变性已被广泛认为对于强大的大规模筛选方法而言极具挑战性的(campbell等人，2017)。
[0035]
用于用途的化合物
[0036]
在第一方面，本发明提供酪蛋白激酶1(ck1)抑制剂，其用于治疗与(过度的)dux4表达相关的疾病或病症，其中该酪蛋白激酶1抑制剂降低dux4表达。这种ck1抑制剂在本文中称为用于根据本发明用途的ck1抑制剂。ck1抑制剂是本领域已知的，并且在下文中更详细地描述。
[0037]
本文所描述的医学用途被表述为如本文定义的化合物，其用作用于治疗一种或多种所陈述的病症的药物(例如，通过施用有效量的化合物)，但是可以等同地被表述为i)使用如本文定义的化合物治疗一种或多种所陈述的病症的方法，其包括向个体施用有效量的所述化合物的步骤，ii)如本文定义的化合物，其用于制备用于治疗一种或多种所陈述的病症的药物，其中优选地以有效量施用所述化合物，以及iii)本文定义的化合物用于治疗一种或多种所陈述的病症的用途，优选通过施用有效量。此类医学用途都是本发明所设想的。优选的个体是需要治疗的个体。优选地，治疗导致疾病或病症的延迟、改善、减轻、稳定、治愈或预防。换言之，用于根据本发明用途的化合物可以是用于治疗、延迟、改善、减轻、稳定、治愈或预防所陈述的疾病或病症的化合物。特别地，用于根据本发明用途的化合物可用于改善其他药物的有害副作用。
[0038]
用于根据本发明用途的ck1抑制剂降低dux4表达。该dux4表达优选是所治疗的个体的总体dux4表达。dux4表达可以使用本领域已知的方法测定，或在实施例中举例说明。例如，dux4表达可以使用pcr技术(如rt-pcr)，或使用免疫染色、质谱或elisa，例如在含有细胞或细胞提取物的样品(优选从个体获得)上来测定。在这种情况下，优选地，降低是与预定值或参考值相比的降低。优选的参考值是通过测定未处理的含有细胞或细胞提取物的样品中的dux4表达而获得的参考值。该未处理的样品可以来自相同个体或来自不同的健康个体，更优选地，其是以相同方式获得的样品，因此包含相同类型的细胞。方便地，测试样品和参考样品二者都可以是所获得的单个较大样品的一部分。或者，在处理开始之前从个体获得测试样品。非常优选的参考值是在第一次施用根据本发明的酪蛋白激酶1抑制剂之前从个体获得的样品中dux4的表达水平。另一个优选的参考值是代表不存在dux4表达的固定值。
[0039]
优选地，dux4表达的降低是指表达降低了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。如果dux4的表达降低了例如100％，则可能是不能再检测到dux4的表
达。可以在蛋白质水平上对降低进行评估，例如通过免疫染色、elisa或质谱，或者可以在mrna水平上对降低进行评估，例如通过pcr技术，如rt-pcr。在优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂，其中使用pcr或免疫染色测定dux4表达的降低，其中优选的pcr技术是rt-pcr。在优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂，其中dux4表达降低了至少20％、40％、60％、80％或更多，更优选地降低至少30％、40％、60％、80％或更多。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少10％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少20％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少30％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少40％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少50％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少60％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少70％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少80％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少90％。在进一步优选的实施方案中，dux4表达降低了至少95％。在最优选的实施方案中，dux4表达降低了约100％，优选100％。
[0040]
在优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂，其中酪蛋白激酶1抑制剂降低了在肌细胞、免疫细胞或癌细胞中，优选在肌细胞或免疫细胞中，最优选在肌细胞中的dux4表达。优选的肌细胞是成肌细胞、卫星细胞、肌管和肌纤维。优选的免疫细胞是b细胞、t细胞、树突细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、先天淋巴细胞、巨核细胞、骨髓来源的抑制细胞、单核细胞/巨噬细胞和胸腺细胞，以及任选的肥大细胞。其他优选的细胞是血小板和红细胞。在其他实施方案中，在癌细胞中的dux4表达降低。
[0041]
在优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的ck1抑制剂，其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是肌营养不良症或癌症，优选其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是肌营养不良症，最优选地是面肩肱型肌营养不良症(fshd)。
[0042]
在这种情况下，优选的肌营养不良是fshd；优选的癌症是前列腺癌(wo2014081923)、多发性骨髓瘤(us20140221313)、肺癌(lang等人，2014，doi：10.14205/2310-8703.2014.02.01.1)、结肠癌(paz等人，2003，doi：10.1093/hmg/ddg226)、肉瘤或白血病；优选的肉瘤是小圆形细胞肉瘤(oyama等人，2017doi：10.1038/s41598-017-04967-0；bergerat等人，2017，doi：10.1016/j.prp.2016.11.015；chebib和jo，2016，doi：10.1002/cncy.21685)；优选的白血病是急性淋巴细胞白血病(all)，更具体地是b细胞前体all(yasuda等人，2016，doi：10.1038/ng.3535；&fioretos，2017，doi：10.1182/blood-2017-05-742643；zhang等人，2017，doi:10.1038/ng.3691)。
[0043]
因此，在优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的ck1抑制剂，其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是肌营养不良症或癌症，优选地，其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是fshd、前列腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、结肠癌(优选结直肠癌)、肉瘤(优选小圆形细胞肉瘤)、白血病(优选急性淋巴细胞白血病，更优选b细胞前体急性淋巴细胞白血病)，优选地，所述与dux4表达相关的疾病或病症是fshd。在更优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的ck1抑制剂，其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是肌营养不良症或癌症，优选其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是fshd或癌症，其中癌症优选是前列腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、结肠癌(优选结直肠癌)、肉瘤(优选小圆形细胞肉瘤)、白血病(优选急性淋巴细胞白血病，更优选b细胞前体急性淋巴细胞白血病)，其中癌症
更优选是肉瘤，最优选是小圆形细胞肉瘤。
[0044]
在一个优选的实施方案中，本发明提供用于根据本发明用途的ck1抑制剂，其中所述与dux4表达相关的疾病或病症是癌症，其中癌症优选是前列腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、结肠癌(优选结直肠癌)、肉瘤(优选小圆形细胞肉瘤)、白血病(优选急性淋巴细胞白血病，更优选b细胞前体急性淋巴细胞白血病)，其中癌症更优选是肉瘤，最优选是小圆形细胞肉瘤。
[0045]
其他dux4靶标称为“肿瘤睾丸抗原”(cta)，其为通常仅在睾丸中表达的基因，但在某些癌症中会脱阻抑，从而引发免疫反应。这些观察结果表明，癌症中的dux4脱阻抑介导hsatii、cta和/或the1b启动子的激活(young等人，2013，doi：10.1371/journal.pgen.1003947)。与此一致地，dmitriev等人(2014，doi：10.1111/jcmm.12182)证明了fshd与癌细胞表达谱之间的相似性，表明这些疾病的发病机理中具有共同步骤。
[0046]
抑制剂组合
[0047]
一方面，本发明提供ck1抑制剂和已知损害成肌融合和/或分化的药剂的组合。已知损害成肌融合和/或损害成肌分化的药剂通常产生如此作用是作为副作用，例如损害的成肌融合可以是与所述药剂相关的医源性现象。这种组合是有益的，因为本发明人已经发现抑制ck1促进成肌融合和分化，并改善另一药剂具有的对成肌融合或分化的损害作用。这样使得ck1抑制剂和另一药剂有效地用于治疗肌营养不良症，例如优选fshd。这种组合在本文中被称为根据本发明的组合。
[0048]
优选地，损害成肌融合和/或分化的药剂选自p38抑制剂、β2肾上腺素能受体激动剂和bet抑制剂。最优选地，损害成肌融合和/或分化的药剂是p38抑制剂；这种抑制剂在下文中定义。在其它优选的实施方案中，损害成肌融合和/或分化的药剂是β2肾上腺素能受体激动剂，更优选地选自阿贝特罗(abediterol)、阿利非君(alifedrine)、阿米贝隆(amibegron)、阿布他明(arbutamine)、阿福特罗(arformoterol)、阿罗洛尔(arotinolol)、baam、班布特罗(bambuterol)、苯呋洛尔(befunolol)、比托特罗(bitolterol)、溴沙特罗(broxaterol)、布酚宁(buphenine)、卡布特罗(carbuterol)、卡莫特罗(carmoterol)、西马特罗(cimaterol)、克仑特罗(clenbuterol)、科尔特罗(colterol)、可巴君(corbadrine)、地诺帕明(denopamine)、地匹福林(dipivefrine)、多巴酚丁胺(dobutamine)、依托帕明(edopamine)、多培沙明(dopexamine)、屈昔多巴(l-dops)、麻黄碱(ephedrine)、肾上腺素、乙非君(etafedrine)、依替福林(etilefrine)、乙左旋多巴(etilevodopa)、乙诺那林(ethylnorepinephrine)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、去甲乌药碱(higenamine)、茚达特罗(indacaterol)、异他林(isoetarine)、异丙肾上腺素、异克舒令(isoxsuprine)、l-dopa(左旋多巴(levodopa))、l-苯丙氨酸、l-酪氨酸、左旋沙丁胺醇(levosalbutamol)、马布特罗(mabuterol)、美左旋多巴(melevodopa)、甲氧那明(methoxyphenamine)、甲基多巴(methyldopa)、米拉贝隆(mirabegron)、去甲肾上腺素、奥西那林(orciprenaline)、奥昔非君(oxyfedrine)、pf-610355、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、吡丁醇(pirbuterol)、普瑞特罗(prenalterol)、莱克多巴胺(ractopamine)、丙卡特罗(procaterol)、伪麻黄碱(pseudoephedrine)、瑞普特罗(reproterol)、利米特罗(rimiterol)、羟苄羟麻黄碱(ritodrine)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗(salmeterol)、索拉格龙(solabegron)、特
布他林(terbutaline)、曲托喹诺(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)、维兰特罗(vilanterol)、伊莫特罗(eamoterol)、xp21279、齐帕特罗(zilpaterol)和净特罗(zinterol)，更优选地选自沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗、妥洛特罗和班布特罗。
[0049]
在优选的实施方案中，根据本发明的组合是包含至少两种不同化合物的组合，第一种化合物是ck1抑制剂，第二种化合物是第二药剂。这种组合的优选实例是包含ck1抑制剂且包含是p38抑制剂的另一种化合物的组合。这种组合的另一个优选实例是包含ck1抑制剂且包含是β2肾上腺素能受体激动剂的另一种化合物的组合。这种组合在下文中被称为根据本发明的双化合物组合。
[0050]
优选的根据本发明的双化合物组合包含如下表中所示的摩尔比的抑制剂，其中“另一种”表示所述第二种化合物。优选的根据本发明的双化合物组合包含如下表中所示的重量比的抑制剂。优选的根据本发明的双化合物组合包含如下表所示的抑制活性比的抑制剂。
[0051]
条目ck1另一种条目ck1另一种条目ck1另一种110％90％660％40％1120-80％80-20％220％80％770％30％1230-70％70-30％330％70％880％20％1340-60％60-40％440％60％990％10％1445-65％65-45％550％50％1095％5％1510-90％90-10％
[0052]
优选的根据本发明的双化合物组合包含一定量的ck1抑制剂，所述量有效抑制个体或样品中至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的ck1活性、更优选至少40％、甚至更优选至少60％、最优选至少80％。优选的根据本发明的双化合物组合包含一定量的p38抑制剂，所述量有效抑制个体或样品中至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的p38活性、更优选至少40％、甚至更优选至少60％、最优选至少80％。在优选的根据本发明的双化合物组合中，所述另一种药剂是p38抑制剂，优选洛吡莫德。
[0053]
在优选的实施方案中，根据本发明的组合包含ck1抑制剂，其具有独立地损害成肌融合和/或分化的额外的激酶抑制功能。其优选实例是也是p38抑制剂的ck1抑制剂。这种组合在下文中被称为根据本发明的功能性组合。
[0054]
优选的根据本发明的组合(双化合物组合或功能性组合)抑制ck1和p38。优选地，ck1的活性被抑制至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％。优选地，p38的活性被至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％。更优选地，ck1和p38二者均被抑制至少5％，更优选至少10％，甚至更优选至少15％，更优选至少20％，更优选至少25％，甚至更优选至少30％，更优选至少35％，更优选至少40％，甚至更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少55％，甚至更优选至少60％，更优选至少65％，甚至更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95、96、97、98、99或100％。
[0055]
成肌融合和/或分化的促进
[0056]
在优选的实施方案中，本文定义的ck1抑制剂或本文定义的组合用于促进成肌融
合和/或促进成肌分化。本发明人已经确定ck1抑制剂促进健康或恢复中的肌肉的这两个重要特征。在促进成肌融合和/或成肌分化中的应用有助于肌肉再生。
[0057]
成肌融合是由多个成肌细胞形成多核肌管。成肌细胞是一种胚胎祖细胞，其分化产生肌细胞。分化受成肌调节因子的调节，包括myod、myf5、肌细胞生成素和mrf4。gata4和gata6也在肌细胞分化中起作用。当成肌细胞融合在一起时，形成骨骼肌纤维；因此，肌纤维是具有称为肌核的多个细胞核的细胞，每个细胞核都起源于单个成肌细胞。成肌细胞的融合是骨骼肌(例如肱二头肌)而非心肌或平滑肌特异性的。骨骼肌中不形成肌纤维的成肌细胞去分化为肌卫星细胞。这些卫星细胞与骨骼肌纤维保持相邻，位于肌膜和肌内膜(将肌束分成单个纤维的结缔组织包膜)的基底膜之间。为了重新激活肌生成，必须刺激卫星细胞以分化成新的纤维。本发明人已经确定ck1抑制剂促进卫星细胞的这种分化，从而最终促进肌管形成和肌生成。
[0058]
已知p38抑制剂损害骨骼肌生物学的正常功能，特别是损害增殖的成肌细胞进行分化及随后融合形成多核肌管。本发明提供了用于治疗个体中与dux4表达相关的疾病或病症的ck1抑制剂，其中所述ck1抑制剂用于促进成肌融合和/或分化。这种促进的融合和分化有助于恢复健康的骨骼肌生物学。优选地，所述个体还患有肌肉炎症；这使得如本文别处描述的改良的应用成为可能。
[0059]
在优选的实施方案中，所述ck1抑制剂用于促进成肌融合。成肌融合是肌肉形成和肌肉再生的精髓，而且可以使用任何已知方法对其进行评估。优选地，使用图像分析，更优选地使用高含量图像分析，最优选如实施例中所述对其进行评估。在优选的实施方案中，用于促进成肌融合的所述ck1抑制剂使成肌融合增加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、90、95、100％或更多，优选至少10％或更多，更优选至少30％或更多，甚至更优选至少50％或更多。在个体或肌肉或样品中可以不存在成肌融合。在这种情况下，用于促进成肌融合的所述ck1抑制剂优选使成肌融合恢复，更优选恢复至健康对照的至少1％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多，甚至更优选恢复至健康对照的至少5％，更优选健康对照的至少15％，最优选健康对照的至少25％。
[0060]
在优选的实施方案中，所述ck1抑制剂用于促进成肌分化。在这些实施方案中，细胞优选地是原代细胞。在这些实施方案中，细胞优选不是永生化细胞。可以使用本领域已知的方法评估成肌分化，例如量化成肌分化标志物，如myh2、myod、myf5、肌细胞生成素和mrf4，优选例如肌细胞生成素或myh2。在优选的实施方案中，用于促进成肌分化的ck1抑制剂使成肌分化增加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、90、95、100％或更多，优选增加至少10％或更多，更优选增加至少30％或更多，甚至更优选增加至少50％或更多。在个体或肌肉或样品中可能不存在成肌分化。在这种情况下，用于促进成肌分化的ck1抑制剂优选使成肌分化恢复，更优选恢复至健康对照的至少1％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多，甚至更优选恢复至健康对照的至少5％，更优选恢复至健康对照的至少15％，最优选恢复至健康对照的至少25％。
[0061]
在优选的实施方案中，根据本发明的组合用于促进成肌融合，其中特征和定义如本文别处所定义。在优选的实施方案中，根据本发明的组合用于促进成肌分化，其中特征和
定义如本文别处所定义。在优选的实施方案中，根据本发明的组合用于促进成肌融合和/或分化，其中特征和定义如本文别处所定义。所述组合的使用是特别有益的，因为所述ck1抑制剂的活性减轻了所述另一种药剂例如p38抑制剂的有害副作用。当如本节所述使用时，根据本发明的组合优选包含p38抑制剂作为所述另一种药剂。已知这种p38抑制剂会损害成肌融合和/或分化。本发明人已发现对减少dux4的惊人的协同作用，并已确定ck1抑制剂适用于减少p38抑制剂对肌细胞的不良副作用。
[0062]
患有肌肉炎症的肌营养不良患者的治疗
[0063]
在优选的实施方案中，本文定义的ck1抑制剂或本文定义的组合用于治疗患有dux4相关病症和肌肉炎症的患者。肌肉炎症导致肌营养不良症例如fshd的病理生理学。其先于肌肉破坏和脂肪替代，因此代表了疾病活动性的早期标志。肌肉炎症可以使用本领域已知的方法来鉴定。优选地，肌肉炎症通过使用活组织检查和使用具有短ti反转恢复(stir)的mri序列中的至少一种来鉴定，优选使用具有stir的mri鉴定。stir高信号(stir+)显示水肿，这与炎症相关。优选的炎症肌肉是stir+肌肉。优选的肌肉活组织检查是来自stir+肌肉的活组织检查。优选的肌肉炎症是mapk相关肌肉炎症，更优选与炎症反应相关基因的转录和翻译相关的肌肉炎症，所述基因编码诸如tnf-a、il-1b、il-6和il-8的蛋白质。肌肉炎症预示着肌肉的更快脂肪替代。p38抑制剂是已知的抗炎剂，但减少成肌融合并损害成肌分化和再生。ck1抑制剂和p38抑制剂的组合克服了这些问题并导致协同降低dux4表达。
[0064]
患有肌肉炎症的优选个体具有至少一块炎症肌肉，更优选至少2块，甚至更优选至少3块，甚至更优选至少4块，甚至更优选至少5块，最优选至少6、7、8、9、10或11块。优选所述炎症肌肉是骨骼肌，更优选是面部、肩胛骨或上臂的骨骼肌。患有肌肉炎症的优选个体是还患有肌营养不良症的患者，更优选还患有fshd的患者。优选地，患有fshd的这种个体具有至少一块炎症肌肉，更优选至少一块stir+肌肉。
[0065]
本发明提供酪蛋白激酶1抑制剂，其用于治疗个体中与dux4表达相关的疾病或病症，其中所述个体患有肌肉炎症。在优选的实施方案中，本发明提供用于治疗fshd的酪蛋白激酶1抑制剂，其中个体患有肌肉炎症。在优选的实施方案中，本发明提供用于治疗fshd的酪蛋白激酶1抑制剂，其中个体具有至少一块炎症肌肉，优选至少一块面部、肩胛骨或上臂的炎症骨骼肌。这种肌肉优选是stir+。已知肌肉炎症先于脂肪浸润。因此，本发明提供酪蛋白激酶1抑制剂，其用于预防或延迟患有fshd的个体肌肉中的脂肪浸润。
[0066]
本发明提供根据本发明的组合，其用于治疗个体中与dux4表达相关的疾病或病症，其中所述个体患有本文定义的肌肉炎症。在优选的实施方案中，本发明提供根据本发明的组合，其用于治疗fshd，其中个体患有肌肉炎症。在优选的实施方案中，本发明提供根据本发明的组合，其用于治疗fshd，其中个体具有至少一块炎症肌肉，优选至少一块面部、肩胛骨或上臂的炎症骨骼肌。该肌肉优选是stir+。已知肌肉炎症先于脂肪浸润。因此，本发明提供根据本发明的组合，其用于预防或延迟患有fshd的个体肌肉中的脂肪浸润。
[0067]
当如本节所述使用时，根据本发明的组合优选包含p38抑制剂作为所述另一种药剂。已知这种p38抑制剂具有抗炎活性。本发明人已发现对减少dux4的惊人的协同作用，并已确定ck1抑制剂适用于减少p38抑制剂对肌细胞的不良副作用。
[0068]
酪蛋白激酶1抑制剂
[0069]
酪蛋白激酶1抑制剂(ck1抑制剂)是本领域已知的。优选的ck1抑制剂是小分子。优选地，在本发明的上下文中，酪蛋白激酶1抑制剂具有结构通式(1a)、(1b)、(2a)、(2b)、(3a)、(3b)或(4)：
[0070][0071][0072]
其中x和y独立地是＝n-、-nr
1-、cr1、-o-或-s-，条件是x和y中的至少之一是cr1，
[0073]
环a不存在(所以实际上它是两个h)或者是4至7元环烷基或杂环烷基或者5至6元杂芳基，其中至多2个碳原子被选自＝n-、-nr
2-、-o-、-s-的杂原子替代，并且在价态允许的情况下，任何剩余的碳原子都可以被r3取代；优选地，环a是4至7元环烷基或杂环烷基或者5
至6元杂芳基，其中至多2个碳原子被选自＝n-、-nr
2-、-o-、-s-的杂原子替代，并且在价态允许的情况下，任何剩余的碳原子都可以被r3取代；
[0074]
每个r1独立地是h、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、-cf3、-(ch2)
1-3
cf3、4至10元芳基、4至10元杂芳基、4至10元杂环烷基，其中所述芳基、杂芳基或杂环烷基可以被独立地选自卤素、oh、氧代、氰基、-so2ch3、任选地与甲醇或乙醇酯化的羧酸、甲酰胺、硝基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷基或c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基的一个、两个或三个取代基取代；优选地，每个r1独立地是h、c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、-cf3、-(ch2)
1-3-cf3、4至10元杂环烷基，其中所述杂环烷基可以被独立地选自卤素、oh、氧代、氰基、c
1-6
烷基或c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基的至多两个取代基取代；其中当x是cr1时，则该cr1部分中的r1也可以是
–
s-(ch2)
0-3
ch3或
–
(s＝o)-(ch2)
0-3
ch3；
[0075]
每个r2独立地是h、c
1-6
烷基、c
4-10-二环烷基、-(ch2)
t-cn、-so
2-c
1-6
烷基、-so2(ch2)
tc3-6
环烷基、-c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基、-c
1-6
烷基-c(o)o-c
1-6
烷基、-c
3-6
环烷基-c(o)o-c
1-6
烷基、-c(o)-(o)
u-c
1-6
烷基、-c(o)-c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基、-c(o)-(o)
u-(ch2)
t-(c
6-10
芳基)、-(ch2)
t-(c
6-10
芳基)、-c(o)-(o)
u-(ch2)
t-(5至10元杂芳基)、-(ch2)
t-c(o)-nr5r6、-(ch2)
t-(5至10元杂芳基)、-c(o)-(o)
u-(ch2)
t-(3至10元杂环烷基)、-(ch2)
t-(4至10元杂环烷基)、-c(o)-(o)
u-(ch2)
t-(3至10元环烷基)或-(ch2)
t-(3至10元环烷基)，
[0076]
其中r2的所述芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基可以被独立地选自卤素、oh、氰基、c
1-6
烷基或c
1-6
烷基-o-c
1-6
烷基的至多两个取代基取代，
[0077]
并且其中r2的任何烷基、环烷基和杂环烷基可以在化合价允许的情况下进一步被氧代取代；
[0078]
每个r3独立地是不存在的、是c
1-3
烷基、卤素、氧代、-nr5r6或-or5；
[0079]
每个r4独立地是卤素、-cf3、c
1-3
烷基、-(ch2)
t-c
3-4
环烷基、-(ch2)
t-o-c
1-3
烷基、-(ch2)
t-氰基或-(ch2)
t-羟基，其中卤素优选是f且优选是在包含x和y的五元环的对位，其中c
1-3
烷基优选是甲基且优选是在包含x和y的五元环的间位；优选地，每个r4独立地是卤素、-cf3、c
1-3
烷基、-(ch2)
t-c
3-4
环烷基、-(ch2)
t-o-c
1-3
烷基、-(ch2)
t-氰基或-(ch2)
t-羟基；
[0080]
每个r5独立地是h或c
1-6
烷基；
[0081]
每个r6独立地是h或c
1-6
烷基；
[0082]
或者当所述化合物具有通式(2a)时，r5和r6可以与它们连接的碳原子一起形成-s-或-o-；
[0083]
r7是h、卤素或c
1-3
烷基，或-nr7r
’7；其中当r7是-nr7r
’7时，其优选在其连接的吡啶基部分中的氮的邻位；
[0084]
n是0、1或2；优选是1；
[0085]
每个t独立地是0、1或2；
[0086]
每个u独立地是0或1；
[0087]
r7和r
’7均独立地是h或
–
(c＝o)
0-1
(nh)
0-1
(ch2)
0-4o0-1
r8；或者r7和r
’7与它们连接的氮一起形成环状结构；优选r7和r
’7至少之一是h；优选所述由r7和r
’7形成的环状结构是5、6或7元的，更优选是哌嗪-1-基或4-(r5)哌嗪-1-基或4-苯基哌嗪-1-基；其中在优选的实施方案中，r7是h，r
’7是r8；
[0088]
r8是h、c
1-6
烷基、取代的c
1-6
烷基、c
1-6
酰基、取代的c
1-6
酰基、环己基、具有1或2个杂原子取代的环己基、苯基、取代的苯基、萘基、吡咯基、取代的吡咯基、吲哚基、取代的吲哚
基、或nr5r6，其中r8中的酰基或烷基部分任选是不饱和的，其中r8中的取代优选选自卤素、三氟甲基、甲基、乙基、苯基、氟苯基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和苯氧基；优选r8是甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、吲哚基、二甲胺、甲苯酰基、氯甲苯酰基、三氟甲基苯基、萘基、1-甲基吡咯-2-基和4-二甲氧基苯基-1-甲基吡咯-2-基；其中更优选r8是c
1-6
烷基例如丁-2-基、氧杂环己烷基例如氧杂环己烷-4-基、1-苯基乙-1-基、乙酰基、对氟苯基乙酰基、2-苯氧基丙酰基或3-(o,p-二甲氧基苯基)-丙烯酰基，其中当r8是取代的吡咯基时，优选是1-(r9)-4-(r
10
)-5-(r
11
)-吡咯-2-基；
[0089]
r9是r5或被0、1、2或3个羟基和0或1个r'
11
部分取代的-(ch2)
0-2
吡咯烷基，优选r9是甲基或-ch
2-(3,4-二羟基吡咯烷-2-基)或-ch
2-(3,4-二羟基-5-r’11-吡咯烷-2-基)；
[0090]r10
是h或苯基或甲氧基化苯基，其中甲氧基化苯基优选是对甲氧基苯基或o,p-二甲氧基苯基；
[0091]r11
是h或通过-ch
2-或-ch2ch
2-部分、优选通过-ch
2-部分连接到r’11
；
[0092]
r’11
是h或通过-ch
2-或-ch2ch
2-部分、优选通过-ch
2-部分连接到r
11
；
[0093]
并且其中
[0094]
a’是4至7元环烷基、含氮的4至7元杂环烷基，或者a’可以通过r
’1直接稠合到与其相连的环上；优选地，a’是含氮的4至7元杂环烷基，或者a’可以通过r
’1直接稠合到与其相连的环上；
[0095]
l是c
1-3
烷基；
[0096]r’1是氢、c
1-3
烷基或c
3-4
环烷基；
[0097]
每个r
’2独立地是c
1-3
烷基、氟、羟基、c
1-3
烷氧基或氰基；
[0098]r’3是氢、c
1-3
烷基或c
3-4
环烷基；
[0099]r’4是具有1至3个杂原子的5至10元杂芳基，其任选地被1至3个r4取代基取代；
[0100]r’5是氢或-n(r8)2；
[0101]
z是n或-cr9；
[0102]
每个r8独立地是氢或c
1-3
烷基；
[0103]
r9是氢、c
1-3
烷基或卤素；
[0104]
m是0、1或2；
[0105]
q是1、2或3；
[0106]
并且其中
[0107]
r”2
代表任选地被选自卤素、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷硫基、c
1-6
氟烷基、c
1-6
氟烷氧基和-cn的一个或多个取代基取代的芳基；
[0108]
r”3
代表h、c
1-3
烷基、-nr”4
r”5
、羟基或c
1-4
烷氧基；或r”3
连同其连接的碳是n；优选地，r”3
连同其连接的碳是n；
[0109]
a”代表任选地被一个或两个ra取代的c
1-7-亚烷基；
[0110]
b代表任选地被rb取代的c
1-7-亚烷基；
[0111]
l”代表被rc或rd取代的n，或者被r
e1
和rd或被两个基团r
e2
取代的c；
[0112]
a”和b的碳原子任选地被一个或多个可以彼此相同或不同的基团rf取代；
[0113]
ra、rb和rc的定义如下：
[0114]
两个基团ra可一起形成c
1-6
亚烷基；
[0115]
ra和rb可一起形成键或c
1-6
亚烷基；
[0116]
ra和rc可一起形成键或c
1-6
亚烷基；
[0117]
rb和rc可一起形成键或c
1-6
亚烷基；
[0118]
rd代表选自h、c
1-6
烷基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基-c
1-6
烷基、c
1-6
烷硫基-c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基-c
1-6
烷基、c
1-6
氟烷基、苄基、c
1-6
酰基和羟基-c
1-6
烷基的基团；
[0119]re1
代表-nr”4
r”5
或者任选地包含氧原子的环状单胺，该环状单胺任选地被选自f、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基和羟基的一个或多个取代基取代；
[0120]
两个基团r
e2
与带有它们的碳原子一起形成任选地包含氧原子的环状单胺，该环状单胺任选地被一个或多个可以彼此相同或不同的rf取代；
[0121]
rf代表c
1-6
烷基、c
3-7
环烷基、c
3-7
环烷基c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基-c
1-6
烷基、羟基-c
1-6
烷基、c
1-6
氟烷基或苄基；
[0122]
r”4
和r”5
各自独立地代表h、c
1-4
烷基、c
3-7
环烷基或c
3-7
环烷基-c
1-6
烷基；
[0123]
并且其中
[0124]
x1选自o和nq6；条件是当x1是nq6时，q5和q6以及与它们分别相连的氮原子和相邻的碳原子一起形成杂环，所述杂环包含碳原子和0至3个选自n、nq8、o、s的另外的杂原子并被1-5个q
10
取代；
[0125]
q1是任选地被卤素、oh、cn和nqaqa取代的c
1-4
烷基，或者q1是被0-5个q
11
取代的-(cqdqd)
r-碳环基和包含碳原子以及选自n、nq9、o、s的1至4个杂原子并被0-5个q
11
取代的-(cqdqd)
r-杂环基；
[0126]
q2选自h、c
1-4
烷基、卤素、cn、芳基和杂芳基；
[0127]
q3选自h和c
1-4
烷基；
[0128]
q4选自h、c
1-4
烷基、卤素和cn；
[0129]
q5选自h、被0-4个qe取代的c
1-4
烷基、被0-4个qe取代的-(ch2)
r-c
3-6
碳环基和包含碳原子以及选自n、o、s的1至3个杂原子并被0-4个qe取代的-(ch2)
r-杂环基；
[0130]
q7是被0-3个qe取代的芳基；
[0131]
q8选自h、被0-3个qe取代的c
1-4
烷基、-(ch2)rcn、-(ch2)roqb、-(ch2)rs(o)
p
qc、-(ch2)rc(＝o)qb、-(ch2)rnqaqa、-(ch2)rc(＝o)nqaqa、被0-3个qe取代的-(ch2)rc(＝o)-c
1-4
烷基、-(ch2)rnqac(＝o)qb、-(ch2)rnqac(＝o)oqb、-(ch2)roc(＝o)nqaqa、-(ch2)rnqac(＝o)nqaqa、-(ch2)rc(＝o)oqb、-(ch2)rs(o)2nqaq
a-(ch2)rnqas(o)2nqaqa、-(ch2)rnqas(o)2qc、被0-3个qe取代的-(ch2)
r-碳环基和被0-3个qe取代的-(ch2)
r-杂环基；
[0132]
q9选自h、-c(＝o)qb、被0-5个qe取代的c
1-6
烷基、被0-5个qe取代的-(ch2)
r-c
3-6
碳环基和被0-5个qe取代的-(ch2)
r-杂环基；
[0133]q10
选自h、被0-3个qe取代的c
1-6
烷基、-(ch2)rnqaq
a-(ch2)rc(＝o)qb、-(ch2)rc(＝o)oqb、-(ch2)rc(＝o)nqaqa、-s(o)
p
qc、被0-3个qe取代的-(ch2)c
3-6
碳环基和被0-3个qe取代的-(ch2)
r-杂环基；
[0134]
每个q
11
独立地选自h、卤素、＝o、cn、no2、-oqb、-s(o)
p
qc、-c(＝o)qb、-(cqdqd)rnqaqa、-(cqdqd)rc(＝o)nqaqa、-nqac(＝o)qb、-nqac(＝o)oqb、-oc(＝o)nqaqa、-nqac(＝o)nqaqa、-(cqdqd)rc(＝o)oqb、-s(o)2nqaqa、-nqas(o)2nqaqa、-nqas(o)2qc、被0-5个qe取代的c
1-6
烷基、被0-5个qe取代的-(cqdqd)
r-c
3-6
碳环基和被0-5个qe取代的-(cqdqd)
r-杂环基；
[0135]
每个qa独立地选自h、cn、被0-5个qe取代的c
1-6
烷基、被0-5个qe取代的c
2-6
烯基、被0-5个qe取代的c
2-6
炔基、被0-5个qe取代的-(ch2)
r-c
3-10
碳环基和被0-5个qe取代的-(ch2)
r-杂环基；或者qa的两个实例与它们二者都连接的氮原子一起形成被0-5个qe取代的杂环；
[0136]
每个qb独立地选自h、被0-5个qe取代的c
1-6
烷基、被0-5个qe取代的c
2-6
烯基、被0-5个qe取代的c
2-6
炔基、被0-5个qe取代的-(ch2)
r-c
3-10
碳环基和被0-5个qe取代的-(ch2)
r-杂环基；
[0137]
每个qc独立地选自被0-5个qe取代的c
1-6
烷基、被0-5个qe取代的c
2-6
烯基、被0-5个qe取代的c
2-6
炔基、被0-5个qe取代的c
3-6
碳环基和被0-5个qe取代的杂环基；
[0138]
每个qd独立地选自h和被0-5个qe取代的c
1-4
烷基；
[0139]
每个qe独立地选自被0-5个qf取代的c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、-(ch2)
r-c
3-6
环烷基、卤素、cn、no2、＝o、co2h、-(ch2)roqf、sqf和-(ch2)rnqfqf；
[0140]
每个qf独立地选自h、f、c
1-5
烷基、c
3-6
环烷基和苯基，或者qf的两个实例与它们二者都连接的氮原子一起形成任选地被c
1-4
烷基取代的杂环；
[0141]
每个p独立地是0、1或2；并且
[0142]
每个r独立地是0、1、2、3或4，
[0143]
并且其中
[0144]
x2选自-nh-、-ch
2-、-ch(ph)-、-ch2ch
2-、-ch2ch(ph)-、-ch＝ch-、-ch2och
2-、-ch2nhc(o)-、-ch2nhc(o)ch(ph)-和-ch2nhc(o)ch
2-，
[0145]q’1选自q
’6、卤素、-cf3、-ocf3、-oq
’6、-co2q
’6、-so2n(q
’6)2和-no2；
[0146]q’2、q
’3、q
’4和q
’5独立地选自h、卤素、c
1-6
烷氧基、-nh2、-nhq
’6、-cn、-no2、-ocf3和-co2q
’6；其中
[0147]q’6选自h和c
1-6
烷基；并且其中当x2是-ch(ph)-、-ch2ch(ph)-或-ch2nhc(o)ch(ph)-时，则q
’2、q
’3、q
’4和q
’5是h，
[0148]
e1是s、o或nr5，优选是s、o或nh；
[0149]
e2和e
’2各自独立地是h、卤素、c
1-3
烷基、卤代c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、s(＝o)
0-2c1-3
烷基和[c(＝o)o]c
1-3
烷基，或e2和e
’2一起形成3-6元环状结构；优选地，e2和e
’2中的至少一个不是h；更优选地，e2和e
’2各自独立地是h、三氟甲基、s(o)2ch3、c(＝o)och3、cl、f，或一起形成-o-cf
2-o-；
[0150]
e3是取代的苯基、取代的吡啶基、取代的噻唑基、取代的噁唑基或-ch
2-s-2-((3-(e4)-4-氧代-3,4,6,7-四氢噻吩并[3,2-d])嘧啶-2-基)；其中e3中的取代优选是-or5、卤代-or5、-nh2、-nhr5、n(ch3)r5、四唑基、c(＝o)or5或-nh-c(＝o)-e5；其中-nh-c(＝o)-e5部分优选位于单取代的噻唑基的2-位，更优选所述取代的噻唑基是噻唑-4-基；
[0151]
e4是苯基、取代的苯基、苄基或取代的苄基，其中e4中的取代优选是c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、卤代c
1-3
烷基或卤代c
1-3
烷氧基，更优选甲氧基、三氟甲基或三氟甲氧基；最优选e4是苯基、苄基、对甲氧基苄基、邻间二甲氧基苄基、间三氟甲基苄基、对三氟甲基苄基或对三氟甲氧基苄基；
[0152]
e5是苯基、取代的苯基、嘧啶基或取代的嘧啶基、呋喃基或取代的呋喃基，其中e5中的取代优选是c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、卤代c
1-3
烷基或卤代c
1-3
烷氧基，更优选-ocf3；优选e5是2-三氟甲氧基苯基、吡啶-4-基或呋喃-2-基，最优选2-三氟甲氧基苯基；
[0153]
q1是h或任选被1-5个卤素取代的c
2-8
烃，优选被1-5个卤素任选取代的c
2-8
烃，其中卤素优选是氟，其中所述c
2-8
烃优选是乙基、异丙基、苯基、苯硫基、吡啶基或甲苯酰基，其中甲苯酰基优选是邻甲苯酰基，其中甲苯酰基优选是卤化的，更优选在其甲基部分被三卤化，其中苯基优选被卤化，更优选其是间氟苯基、对氟苯基、间,对-二氟苯基、邻,间-二氟苯基、间,间-二氟苯基、邻,对-二氟苯基或2,5-二氟苯基，其中苯硫基优选3-苯硫基，其中吡啶基优选是卤化或甲基化的，其中卤化吡啶基优选是2-氟吡啶基如2-氟吡啶-4-基、或6-氯吡啶基如6-氯吡啶-3-基；其中甲基化吡啶基优选是2-甲基吡啶基，例如2-甲基吡啶-4-基；最优选q1是异丙基、间氟苯基或吡啶-3-基；
[0154]
q2是h、nh2、nhq3或nq3q4；更优选q2是h、n-吗啉基、4-甲基-1-哌嗪基或1-哌嗪基，最优选h或n-吗啉基；
[0155]
q3是-(ch2)
r-oh、-(ch2)
r-h或-(ch2)
r-nq3’
q4’
；优选q3是-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2nq3’
q4’
、-ch2ch2nq3’
q4’
或-ch2nq3’
q4’
；其中q3’
和q4’
一起形成5-7元环烃，优选6-元环烃，其中所述环烃任选被一个或多个甲氧基、羟甲基、氨基、甲氨基、二甲氨基或氧代部分取代，其中所述环烃可以在其环中包含除了q2的氮之外的杂原子，优选o或s；优选当q4和q3一起形成环烃时，q4和q3代表-ch2ch2och2ch
2-、-ch2ch2sch2ch
2-、-ch2ch2(so2)ch2ch
2-、-ch2ch2(so)ch2ch
2-、-ch2ch2(co)ch2ch
2-、-ch2ch2(c[nhch3])ch2ch
2-、-ch2ch2(c[nh2])ch2ch
2-、-ch2ch2(c[n(ch3)2])ch2ch
2-、-ch2ch2nhch2ch
2-、-ch2ch2(nch3)ch2ch
2-、-ch2ch2(c[ch2oh])ch2ch
2-或-ch2ch2(coch3)ch2ch
2-；
[0156]
或当q4存在时，q3与q4一起形成5-7元环烃，优选6-元环烃，其中所述环烃任选被一个或多个甲氧基、羟甲基、氨基、甲氨基、二甲氨基或氧代部分取代，其中所述环烃可以在其环中包含除了q2的氮之外的杂原子，优选o或s；优选当q4和q3一起形成环烃时，q4和q3代表
–
ch2ch2och2ch
2-、
–
ch2ch2sch2ch
2-、
–
ch2ch2(so2)ch2ch
2-、
–
ch2ch2(so)ch2ch
2-、
–
ch2ch2(co)ch2ch
2-、
–
ch2ch2(c[nhch3])ch2ch
2-、
–
ch2ch2(c[nh2])ch2ch
2-、
–
ch2ch2(c[n(ch3)2])ch2ch
2-、
–
ch2ch2nhch2ch
2-、
–
ch2ch2(nch3)ch2ch
2-、
–
ch2ch2(c[ch2oh])ch2ch
2-或
–
ch2ch2(coch3)ch2ch
2-；
[0157]
c1和c2与它们连接的碳原子一起形成任选取代的5-10元环状结构，其中任选的取代优选是甲基、三氟甲基、卤素、苯基、1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基或甲氧基，更优选三氟甲基、卤素或甲氧基，其中所述5-10元环状结构优选是苯基、吡啶基例如吡啶-2-基或吡啶-3-基、吲哚基例如吲哚-2-基、苯并咪唑基例如苯并咪唑-2-基、苯并噻唑基例如苯并噻唑-2-基、苯并噁唑基例如苯并噁唑-2-基、茚基例如茚-2-基、咪唑基例如咪唑-2-基、噻唑基例如噻唑-2-基、或噁唑基例如噁唑-2-基；更优选所述5-10-元环状结构是苯基、三氟甲基苯-3-基、氟苯-2-基、苯并咪唑-2-基、5-氯苯并咪唑-2-基、5,6-二氯苯并咪唑-2-基、5-氟苯并咪唑-2-基、5,6-二氟苯并咪唑-2-基、5-甲氧基苯并咪唑-2-基、5,6-二甲氧基苯并咪唑-2-基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、6-甲基吡啶-2-基、5-甲基吡啶-2-基、咪唑-2-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、4-苯基咪唑-2-基、4-苯基噁唑-2-基、4-苯基噻唑-2-基、4,5-二氟苯并咪唑-2-基、4,5-二氯苯并咪唑-2-基、4,5-二甲氧基苯并咪唑-2-基、1-(1-甲基哌嗪-4-基)苯-4-基、3-(1-甲基哌嗪-4-基)吡啶-6-基、苯并噻唑-2-基或苯并噁唑-2-基；最优选所述5-10-元环状结构是苯基、间三氟甲基苯基或4,5-二氟苯并咪唑-2-基；
[0158]
或其异构体或药学可接受的盐。
[0159]
2-((3-(e4)-4-氧代-3,4,6,7-四氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)
[0160]
ck1抑制剂可以是sr-3029。
[0161][0162]
在优选的实施方案中，所述ck1抑制剂具有通式(ia)或(ib)，或者其异构体或药学上可接受的盐，其中x、y、a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、n、t、u、a’、l、r
’1、r
’2、r
’3、r
’4、r
’5、z、r8、r9、m和q以及其他变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，其具有通式(ia)，或者其异构体或药学上可接受的盐，其中x、y、a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、n、t、u、a’、l、r
’1、r
’2、r
’3、r
’4、r
’5、z、r8、r9、m和q以及其他变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，其具有通式(ib)，或者其异构体或药学上可接受的盐，其中x、y、a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、n、t、u、a’、l、r
’1、r
’2、r
’3、r
’4、r
’5、z、r8、r9、m和q以及其他变量如上所定义。这类ck1抑制剂本身是本领域已知的，并且其结构和合成在例如wo2011051858，wo2012085721和wo2015119579中，或在halekotte等人,molecules 2017,doi:10.3390/molecules22040522中，或在luxenburger等人,molecules 2019,doi:10.3390/molecules24050873中，或在peifer等人,j.med.chem.2009,52,7618
–
7630doi:10.1021/jm9005127中有更详细的描述。
[0163]
优选地，当r7是-nr7r
’7时，y是nh，x是c(s-ch3)或c([s＝o]-ch3)，r4是f并在对位，n是1，a不存在，且r7和r
’7中之一是h。另外，优选当r7是-nr7r
’7时，x是-o-，y是c(异丙基)，r4是f并在对位，n是1，a不存在，且r7和r
’7中之一是h。
[0164]
这类ck1抑制剂包含唑核。在该方面的优选实施方案中，所述酪蛋白激酶1抑制剂选自包含唑核的类别。更优选地，这些使用的ck1抑制剂包含4-芳基-5-杂芳基-1-杂环烷基-咪唑部分。优选地，对于这些抑制剂，存在单个r4，在唑核的对位；更优选地，该r4为f。因此，在进一步更优选的实施方案中，所述酪蛋白激酶1抑制剂包含与4-卤代苯基部分，优选4-氟苯基部分相连的唑核。如表3所示，非常优选的包含唑核的化合物是化合物d、e、f和g；甚至更优选化合物d。此类中的其他优选化合物包括halekotte等人的表1所示的化合物、luxenburger等人的表1所示的化合物、luxenburger等人的表3所示的化合物、peifer等人的表3所示的化合物以及peifer等人的表4所示的化合物。
[0165]
在优选的实施方案中，所述ck1抑制剂具有通式(2a)或(2b)，或者其异构体或药学上可接受的盐，其中r5、r6、r”2
、r”3
、a”、b、l”、ra、rb、rc、rd、r
e1
、r
e2
、rf、r”4
、r”5
、x1、q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8、q9、q
10
、q
11
、qa、qb、qc、qd、qe、qf、r和p如上所定义。在进一步优选的实施方案中，其具有通式(2a)，或者其异构体或药学上可接受的盐，其中r5、r6、r”2
、r”3
、a”、b、l”、ra、
rb、rc、rd、r
e1
、r
e2
、rf、r”4
、r”5
、x1、q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8、q9、q
10
、q
11
、qa、qb、qc、qd、qe、qf、p和r如上所定义。在进一步优选的实施方案中，其具有通式(2b)，或者其异构体或药学上可接受的盐，其中r5、r6、r”2
、r”3
、a”、b、l”、ra、rb、rc、rd、r
e1
、r
e2
、rf、r”4
、r”5
、x1、q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8、q9、q
10
、q
11
、qa、qb、qc、qd、qe、qf、p和r如上所定义。这类ck1抑制剂本身是本领域已知的，并且其结构和合成在例如wo2009016286和wo2015195880以及wo2009037394和wo2010/130934中有更详细的描述。
[0166]
此类ck1抑制剂包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核。在这个方面的优选实施方案中，所述酪蛋白激酶1抑制剂来自包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核的类别。具有咪唑并[1,2-b]哒嗪核的ck1抑制剂更优选具有3-(吡啶-4-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪核，甚至更优选6-环-3-(吡啶-4-基)咪唑并[1,2-b]哒嗪核。在进一步优选的实施方案中，所述酪蛋白激酶1抑制剂包含唑核或包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核。从wo2009037394中已知通式(2a)的ck1抑制剂，其中r”3
与其连接的碳一起形成n。其中这些原子形成n的优选此类化合物如下：
[0167][0168]
如下化合物是优选的化合物：
[0169][0170]
其中所述化合物是通式(2a)的并且r5和r6连同它们连接的碳原子一起形成-s-；这种化合物从wo2010/130934中获知。
[0171]
在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)、(2a)或(2b)，其中x、y、a、r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、n、t、u、a’、l、r
’1、r
’2、r
’3、r
’4、r
’5、z、r8、r9、m、q、r”2
、r”3
、a”、b、l”、ra、rb、rc、rd、r
e1
、r
e2
、rf、r”4
、r”5
、x1、q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8、q9、q
10
、q
11
、qa、qb、qc、qd、qe、qf、r和p如上文定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)、(2a)、(2b)、(3a)或(3b)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)、(2a)、(2b)、(3a)、(3b)或(4)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)、(3a)或(3b)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)、(3a)、(3b)或(4)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(2a)、(2b)、(3a)或(3b)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(2a)、(2b)、(3a)、(3b)或(4)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)或(4)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(2a)、(2b)或(4)，其中变量如上
所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(3a)、(3b)或(4)，其中变量如上所定义。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式(1a)、(1b)、(2a)、(2b)或(4)，其中变量如上所定义。
[0172]
在优选的实施方案中，ck1抑制剂具有通式(3a)或(3b)或其异构体或药学上可接受的盐，其中x2、q
’1、q
’2、q
’3、q
’4、q
’5和q
’6和其它变量如上定义。这种ck1抑制剂本身是本领域已知的并且其结构和合成在例如ep2949651、bischof等人,amino acids(2012)43:1577
–
1591doi:10.1007/s00726-012-1234-x、garc
í
a-reyes等人,j.med.chem.2018,61,4087-4102,doi:10.1021/acs.jmedchem.8b00095和richter等人,j.med.chem.,doi:10.1021/jm500600b中详细描述。当ck1抑制剂具有通式(3a)时，x2优选是-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch(ph)-或-nh-，最优选-ch
2-；q
’1优选是-cf3、卤素或c
1-6
烷基，更优选-cf3；q
’2、q
’3、q
’4和q
’5优选独立地选自h、卤素和c
1-5
烷氧基。更优选地，当ck1抑制剂具有通式(3a)时，x2是-ch
2-，q’1是-cf3。
[0173]
在进一步优选的实施方案中，ck1抑制剂具有通式(3a)。在进一步优选的实施方案中，ck1抑制剂具有通式(3b)。优选的通式(3b)的ck1抑制剂是garc
í
a-reyes等人的路线1中的化合物17-23、bischof等人的表1中的化合物和richter等人的表1中的化合物。特别优选的通式(3b)的ck1抑制剂是garc
í
a-reyes等人的路线1中的化合物17-23。特别优选的通式(3b)的ck1抑制剂是bischof等人的表1中的化合物。特别优选的通式(3b)的ck1抑制剂是richter等人的表1中的化合物。
[0174]
这类ck1抑制剂包含一个3-杂吲哚核。在优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂来自包含3-杂吲哚核的类别。具有3-杂吲哚核的ck1抑制剂更优选具有苯并咪唑核或苯并噻唑核或苯并噁唑核。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂包含唑核或包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核或包含3-杂吲哚核。
[0175]
在优选的实施方案中，ck1抑制剂具有通式(4)或其异构体或药学上可接受的盐，其中q1、q1、q3、q4、q3’
、q4’
、c1和c2如上所定义。这类ck1抑制剂本身是本领域已知的并且其结构和合成在例如hirota等人,plos biol 8(12):e1000559.doi:10.1371/journal.pbio.1000559
–
以及在monastyrskyi等人,bioorg.med.chem.2018 590-602https://doi.org/10.1016/j.bmc.2017.12.020中详细描述。当ck1抑制剂为通式(4)时，优选sr-3029或longdaysin，更优选longdaysin。在其它优选实施方案中，通式(4)的ck1抑制剂不是sr-3029。
[0176]
这类ck1抑制剂包含一个6-氨基嘌呤核。在这方面的优选实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂来自包含6-氨基嘌呤核的类别。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂包含唑核或包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核或包含6-氨基嘌呤核。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂包含唑核或包含6-氨基嘌呤核。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核或包含6-氨基嘌呤核。在进一步优选的实施方案中，酪蛋白激酶1抑制剂包含唑核或包含咪唑并[1,2-b]哒嗪核或包含6-氨基嘌呤核或包含3-杂吲哚核。
[0177]
在优选实施方案中，ck1抑制剂具有通式(1a)、(2a)、(3b)或(4)，其中
[0178]
x是cr1，且该cr1部分中的r1是-s-(ch2)
0-3
ch3或-(s＝o)-(ch2)
0-3
ch3，或其中
[0179]
r”3与其连接的碳一起是n，或其中
[0180]
当化合物具有通式(2a)时，r5和r6可以与它们连接的碳原子一起形成-s-或-o-，优选-s-，或其中
[0181]
r7是-nr7r
’7，或其中
[0182]
x或y是-o-，
[0183]
并且其中其它变量如上所述。
[0184]
表3中显示了示例性ck1抑制剂的结构。在进一步优选的实施方案中，所述酪蛋白激酶1抑制剂选自化合物a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、sr-3029、pf-670462和pf-5006739。化合物o也称为ta-01。更优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂选自化合物a、b、c、d、e、f、g、h、o、sr-3029、pf-670462和pf-5006739。甚至更优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂选自化合物a、d、f、g、h、o、sr-3029、pf-670462和pf-5006739。甚至更优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂选自化合物a、d、f、g、h、sr-3029、pf-670462和pf-5006739。最优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂选自化合物a、d、f、g、h、sr-3029和pf-5006739。同样非常优选的是所述酪蛋白激酶1抑制剂是化合物d。同样非常优选的是所述酪蛋白激酶1抑制剂选自化合物a、b和h，更优选其是化合物h。
[0185]
在其他实施方案中，所述ck1抑制剂是抑制性抗体、反义寡核苷酸或阻止ck1表达的寡核苷酸。
[0186]
已知酪蛋白激酶1的各种同工型具有不同的功能。在该组已知的同工型中，ck1δ和ck1ε是根据本发明的ck1抑制剂的优选靶标。已知这两种同工型彼此密切相关。例如，据认为ck1δ和ck1ε在昼夜节律周期长度和蛋白质稳定性上通常是多余的，但后来揭示其具有稍微不同的功能(etchegaray jp等人，2009，doi：10.1128/mcb.00338-09)。由于它们的生理重要性以及在优选实施方案中所述ck1抑制剂的已知功效，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1δ或酪蛋白激酶1ε。任选地，所述酪蛋白激酶抑制剂对酪蛋白激酶1δ或对酪蛋白激酶1ε具有特异性。此外，在更优选的实施方案中，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1δ，并且任选地对酪蛋白激酶1δ具有特异性。在其他更优选的实施方案中，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1ε，并且任选地对酪蛋白激酶1ε具有特异性。在其他实施方案中，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1α，并且任选地对酪蛋白激酶1α具有特异性。在其他实施方案中，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1β，并且任选地对酪蛋白激酶1β具有特异性。在其他实施方案中，所述酪蛋白激酶抑制剂至少抑制酪蛋白激酶1γ1、1γ2和/或1γ3，并且任选地对酪蛋白激酶1γ1、1γ2和/或1γ3具有特异性。在本文中应理解，当ck1抑制剂至少部分抑制特定同工型时，它对该特定同工型具有特异性。优选地，与其他同工型相比，它更有效地抑制该特定同工型。
[0187]
适于在本发明中使用的ck1抑制剂对酪蛋白激酶的ic
50
优选为至多650nm，优选至多500nm，更优选至多400nm，甚至更优选至多300nm，又更优选至多250nm，又更优选至多200nm，最优选至多100nm。在优选的实施方案中，所述ck1抑制剂至少对酪蛋白激酶1δ或酪蛋白激酶1ε具有至多450nm，更优选至多400nm，甚至更优选至多350nm，又更优选至多200nm，甚至仍更优选至多100nm，最优选至多50nm的ic
50
。在最优选的实施方案中，所述ck1抑制剂对酪蛋白激酶1δ的ic
50
为至多350nm，优选至多100nm，更优选至多35nm，最优选至多25nm。ck1的ic
50
值可以使用本领域已知的任何方法来测定，例如，如在wo2011051858、wo2015119579、ep2949651或us2005/0131012中所描述的。合适的测定法可以使用肽底物和
0)，pg-760564(chembl3545398)，rwj-67657(chembl190333，cas:215303-72-3)，ro-3201195(chembl203567，cas:249937-52-8)，amg-548(chembl585902，cas:864249-60-5)，sd-0006(chembl1090173)，scio-323(chembl1614702，cas:309913-51-7)，r-1487(chembl1766582，cas:449808-64-4)，azd-6703(chembl2031465，cas:1083381-65-0)，sc-80036(chembl3544930)，gsk-610677(chembl3544968，cas:2016840-17-6)，ly-3007113(chembl3544998)，leo-15520(chembl3545074)，ave-9940(chembl3545117，cas:1201685-00-8)，ps-516895(chembl3545139)，ta-5493(chembl3545201，cas:1073666-93-9)，pexmetinib(arry614)(chembl3545297，cas:945614-12-0)和sb-85635(chembl3545384)。
[0193]
在优选的实施方案中，p38抑制剂选自式pi、pii、piii、piv、pv、pvi、pvii、pviii、pix、px、pxi、pxii和pxiii(下文描述的相应类属)中的一种或多种，或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物或其药学上可接受的盐。
[0194]
可以根据us 7,276,527的公开内容制备pi属的化合物。pi属的特征在于式(pi)的任选n-氧化的化合物或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物以及其药学上可接受的盐。
[0195][0196]
其中：
[0197]
r1选自(i)、(ii)、(iii)或(iv)：(i)氢，(ii)选自c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、c
6-14
芳基和c
7-16
芳烷基的基团；其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代，(iii)-(c＝o)-r
5-(c＝o)-0r
5-(c＝o)-nr5r
6-(c＝s)-nhr5，或-so
2-r7，其中：
[0198]
r5是氢、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、c
6-14
芳基或c
7-16
芳烷基。其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基任选地被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；
[0199]
re是氢或c
1-6
烷基；
[0200]
r7是c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、c
6-14
芳基或c
7-16
芳烷基。其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基任选地被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；
[0201]
(iv)任选被选自(a)、(b)或(c)的取代基取代的氨基：(a)c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、c
6-14
芳基或c
7-16
芳烷基。其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；(b)-(c＝o)-r
5-(c＝o)-0r
5-(c＝o)-nr5r
6-(c＝s)-nhr5，或-so
2-r7，和(c)任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代的c
1-6
亚烷基；
[0202]
r2是c
6-14
单环或稠合的多环芳基，任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；
[0203]
r3是氢或c
6-14
芳基，其中所述芳基任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；
[0204]
x是-s-、s(o)-或s(o)
2-；
[0205]
y是键、-o-、-s-s(o)-、s(o)
2-或nre，
[0206]
其中r4是：
[0207]
(a)氢；(b)c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、c
6-14
芳基或c
7-16
芳烷基。其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；(c)-(c＝o)-r
5-(c＝o)-0r
5-(c＝o)-nr5r
6-(c＝s)-nhr5，或-so
2-r7；
[0208]
z是键、c
1-15
亚烷基、c
2-16
亚烯基或c
2-16
亚炔基；其中所述亚烷基、亚烯基或亚炔基任选被一个或多个选自取代基组a的取代基取代；
[0209]
以及取代基组a的取代基选自：氧代、卤素、c
1-3
亚烷基二氧基、硝基、氰基、任选卤代的c
1-3
烷基、任选卤代的c
2-6
烯基、羧基c
2-6
烯基、任选卤代的c
2-6
炔基、任选卤代的c
3-6
环烷基、c
6-14
芳基、任选卤代的c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷氧基-羰基-c
1-6
烷氧基、羟基、c
6-14
芳氧基、c
7-16
芳烷氧基、巯基、任选卤代的c
1-3
烷硫基、c
6-14
芳硫基、c
7-16
芳烷硫基、氨基、单-c
1-3
烷氨基、单-c
6-14
芳基氨基、二-c
1-3
烷氨基、二-c
6-14
芳基氨基、甲酰基、羧基、c
1-3
烷基-羰基、c
3-6
环烷基-羰基、c
1-3
烷氧基羰基；
[0210]c7-14
芳基-羰基、c
7-16
芳烷基-羰基、c
6-14
芳氧基-羰基、c
7-16
芳烷氧基羰基、氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、单-c
1-3
烷基-氨基甲酰基、二-c
1-3
烷基-氨基甲酰基、c
6-14
芳基-氨基甲酰基、c
1-3
烷基磺酰基、c
6-14
芳基磺酰基、c
1-3
烷基亚磺酰基、c
6-14
芳基亚磺酰基、甲酰基氨基、c
1-3
烷基羰基氨基、c
6-14
芳基羰基氨基、c
1-3
烷氧基羰基氨基、c
1-3
烷基磺酰基氨基、c
6-14
芳基磺酰氨基、c
1-3
烷基-羰基氧基、c
6-14
芳基-羰基氧基、c
1-6
烷氧基-羰基氧基、单-c
1-3
烷基-氨基甲酰氧基、二-c
1-3
烷基氨基甲酰氧基、c
6-14
芳基-氨基甲酰氧基、磺基、氨磺酰基、亚磺酰基和次磺酰基。
[0211]
可以根据us 7,115,746的公开内容制备pii属的化合物。pii属的特征在于式(pii)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物以及其药学上可接受的盐。
[0212][0213]
其中：
[0214]
变量的定义如wo 2019/071147的[00397]中所提供的。
[0215]
可以根据us 6,696,566的公开内容制备piii属化合物。piii属的特征在于式(piii)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0216][0217]
其中：
[0218]
变量的定义如wo 2019/071147的[00397]中所提供的。
[0219]
piv属的化合物可以根据us 2009/0042856的公开内容制备。piv属的特征在于式
(piv)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0220][0221]
其中：
[0222]
变量的定义如wo 2019/071147的[00530]中所提供的。
[0223]
pv属化合物可以根据us 7,125,898的公开内容制备。pv属的特征在于式(pv)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0224][0225]
其中：
[0226]
变量的定义如wo 2019/071147的[00719]中所提供的。
[0227]
pvi属化合物可以根据us 7,582,652的公开内容制备。pvi属的特征在于式(pvi)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0228][0229]
其中：
[0230]
变量的定义如wo 2019/071147的[00769]中所提供的。
[0231]
pvii属化合物可以根据us 6,867,209的公开内容制备。pvii属的特征在于式(pvii)或其立体异构体、其富含同位素的化合物、其前药、其溶剂化物以及其药学上可接受的盐。
[0232][0233]
其中：
[0234]
变量的定义如wo 2019/071147的[00891]中所提供的。
[0235]
pviii属的化合物可以根据us 6,319,921的公开内容制备。pviii属的特征在于式(pviii)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物以及其药学上可接受的盐。
[0236][0237]
其中：
[0238]
变量的定义如wo 2019/071147的[00908]中所提供的。
[0239]
pix属的化合物可以根据us 7,160,883、us 7,462,616和us 7,759,343的公开内容制备。pix属的特征在于式(pix)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0240][0241]
其中：
[0242]
变量的定义如wo 2019/071147的[001071]中所提供的。
[0243]
可以根据us 20050176775的公开内容制备px属的化合物。px属的特征在于式(px)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物以及其药学上可接受的盐。
[0244][0245]
其中：
[0246]
变量的定义如wo 2019/071147的[001104]中所提供的。
[0247]
pxi属的化合物可以根据us 7,314,881、us 7,323,472和us 8,058,282的公开内容制备。pxi属的特征在于式(pxi)或其立体异构体、其富含同位素的化合物、其前药、其溶剂化物以及其药学上可接受的盐。
[0248][0249]
其中：
[0250]
变量的定义如wo 2019/071147的[001608]中所提供的。
[0251]
pxii属的化合物可以根据us 7,521,447的公开内容制备。pxii属的特征在于式(pxii)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0252][0253]
其中：
[0254]
变量的定义如wo 2019/071147的[001661]中所提供的。
[0255]
pxiii属的化合物可以根据us 7,521,447的公开内容制备。pxiii属的特征在于式(pxiii)或其立体异构体、其同位素富集的化合物、其前药、其溶剂化物及其药学上可接受的盐。
[0256][0257]
其中：
[0258]
变量的定义如wo 2019/071147的[001665]中所提供的。
[0259]
以下是优选的p38抑制剂：
[0260]
1.wo2019/071147的第[00246]至[00294]段中列出的通式pi的p38抑制剂。
[0261]
2.通式pii的p38抑制剂，其是2-(2,4-二氟苯基)-6-(1-(2,6-二氟苯基)脲基)烟酰胺(“vx-702”)。
[0262]
3.wo2019/071147的第[00399]至[00496]段中列出的通式piii的p38抑制剂。
[0263]
4.wo2019/071147的第[00532]至[00618]段中列出的通式piv的p38抑制剂。
[0264]
5.wo2019/071147的第[00721]至[00758]段中列出的通式pv的p38抑制剂。
[0265]
6.wo2019/071147的第[00771]至[00885]段中列出的通式pvi的p38抑制剂。
[0266]
7.wo2019/071147的第[00893]至[00902]段，优选第[00893]至[00900]和[00902]段列出的通式pvii的p38抑制剂。
[0267]
8.wo2019/071147的第[00910]至[001068]段，优选第[001068]段列出的通式pviii的p38抑制剂。
[0268]
9.wo2019/071147的第[001072]至[001074]段，优选第[001074]段列出的通式pix的p38抑制剂。
[0269]
10.wo2019/071147的第[001106]至[001409]或[001412]至[001588]段中列出的通式px的p38抑制剂。
[0270]
11.wo2019/071147的第[001610]至[001644]段中列出的通式pxi的p38抑制剂。
[0271]
12.wo2019/071147的第[001662]和[001663]段，优选[001663]列出的通式pxii的p38抑制剂。
[0272]
13.wo2019/071147的第[001667]至[001698]段中列出的通式pxiii的p38抑制剂。
[0273]
14.洛吡莫德是高度优选的p38抑制剂。
[0274]
15.上述1至14列出的任何p38抑制剂。
[0275]
其它ck1抑制剂和p38抑制剂
[0276]
在某些实施方案中，所述抑制剂诱导靶多肽例如p38蛋白或ck1蛋白的降解。例如，抑制剂包括蛋白酶解靶向嵌合体(protac)，其诱导靶蛋白的选择性细胞内蛋白酶解。protac包括功能域，这些功能域可以是共价连接的蛋白质结合分子：一个能与e3泛素连接酶结合，另一个与待降解的靶蛋白结合。将e3连接酶募集到靶蛋白导致泛素化和随后的蛋白酶体降解靶蛋白。在特别优选的实施方案中，p38抑制剂是靶向p38蛋白(例如p38-α和/或p38-β)的protac。在特别优选的实施方案中，ck1抑制剂是靶向ck1蛋白(例如ck1δ和/或ck1ε)的protac。在特别优选的实施方案中，ck1抑制剂是靶向ck1蛋白(例如ck1δ和/或ck1ε)的protac，而且p38抑制剂是靶向p38蛋白(例如p38-α和/或p38-β)的protac。
[0277]
组合物
[0278]
在另一方面，本发明提供用于根据本发明用途的包含至少一种ck1抑制剂和药学上可接受的赋形剂的组合物。这样的组合物在本文中称为用于根据本发明用途的组合物。优选的用于根据本发明用途的组合物是药物组合物。在优选的实施方案中，将用于根据本发明用途的组合物配制成用于口服、舌下、肠胃外、血管内、静脉内、皮下或经皮施用，任选通过吸入施用；优选用于口服施用。在制剂和施用部分提供了施用方法的更多特征和定义。
[0279]
优选的组合物包含至少两种不同的抑制剂，其中一种是ck1抑制剂，另一种是抑制成肌融合和/或分化的药剂。优选的这种药剂是在本文别处所定义的。
[0280]
其它优选的组合物包含至少一种单一药剂，其是ck1抑制剂并且其也是p38抑制剂。优选的这种抑制剂是在本文别处所描述的。
[0281]
制剂和施用
[0282]
包含上述化合物的组合物可以制备为药物或化妆品制剂，也可以在各种其他介质，如用于人类或动物的食物，包括医疗食品和膳食补充剂中。“医疗食品”是旨在用于存在
独特营养需求的疾病或病症的特定饮食管理的产品。非限制性地举例而言，医疗食品可包括通过饲管饲喂的维生素和矿物质制剂(称为肠内施用)。“膳食补充剂”应意指旨在补充人类膳食的产品，并且通常以丸剂、胶囊、片剂等制剂的形式提供。非限制性地举例而言，膳食补充剂可包含以下一种或多种成分：维生素、矿物质、草药、植物药；氨基酸、旨在通过增加总膳食摄入量来补充膳食的膳食物质，以及前述任何一种的浓缩物、代谢物、成分、提取物或组合。膳食补充剂也可以掺入食品中，包括但不限于食品棒、饮料、粉剂、谷物、熟食、食品添加剂和糖果；或其他旨在促进健康或者预防或阻止与dux4表达或活性相关的退行性疾病进展的功能性食品。
[0283]
因此，本发明的组合物可以与其他可以摄入的生理学上可接受的物质混合，这些物质包括但不限于食物。另外或可替代地，如本文描述使用的组合物可以口服施用，与食物的(单独的)施用组合。
[0284]
所述组合物可以单独施用或与其他药剂或美容剂组合施用，并且可以与其生理学上可接受的载体组合。特别地，本文所描述的化合物可通过与诸如药学或生理学上可接受的赋形剂、载体和媒介物等添加剂一起配制而配制成药物或化妆品组合物。合适的药学或生理学上可接受的赋形剂、载体和媒介物包括加工剂和药物递送改性剂和增强剂，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、羟丙基-p-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，及其任意两种或更多种的组合。在通过援引加入本文的“remington's pharmaceutical sciences”，mack pub.co.，new jersey(1991)和“remington:the science and practice of pharmacy”，lippincott williams&wilkins,philadelphia，第20版(2003)，第21版(2005)和第22版(2012)中描述了其他合适的药学上可接受的赋形剂。
[0285]
已知许多抑制ck1的分子也可以抑制p38。p38丝裂原活化蛋白激酶是一类丝裂原活化蛋白激酶(mapk)，其响应应激刺激，如细胞因子、紫外线照射、热休克和渗透压休克，并参与细胞分化、细胞因子分泌、细胞凋亡和自噬。已知由于衰老导致的肌肉卫星细胞(肌肉干细胞)中p38 mapk通路的持续激活损害肌肉再生。在优选的实施方案中，所述ck1抑制剂也是p38抑制剂。
[0286]
用于根据本发明用途的组合物可以通过本领域熟知的方法来制备；例如，通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣制造、磨粉、乳化、包囊、包埋或冻干方法，这可能产生脂质体制剂、凝聚层、水包油型乳剂、纳米颗粒/微粒粉末或任何其他形状或形式。因此，用于根据本发明用途的组合物可以使用包括赋形剂和辅剂在内的一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述赋形剂和辅剂有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。适合的制剂取决于所选的施用途径。
[0287]
为了注射，可以将用于根据本发明用途的ck1抑制剂以及组合和组合物配制在水溶液中，优选配制在生理学相容的缓冲液，如hanks溶液、ringer溶液或生理盐水中。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂是本领域公知的。
[0288]
在通过将供使用的ck1抑制剂以及组合和组合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合或通过将它们用作食品添加剂来配制的情况下，可以使用口服和肠胃外施用。这样的策略能使用于根据本发明用途的ck1抑制剂以及组合和组合物被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以被待治疗的个体口服摄取。口服使用的制
剂或药理学制剂可以通过使用固体赋形剂，任选地将所得混合物研磨，并且如果需要，在加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯来制备。合适的赋形剂尤其是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐，如海藻酸钠。另外，可以用本领域已知的吸收摄取增强剂制备联合制剂(coformulation)。
[0289]
糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩糖溶液，其可任选地包含阿拉伯胶、滑石粉、pvp、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、清漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。聚甲基丙烯酸酯可用于提供ph响应释放特征以通过胃。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以鉴定或表征活性ck1抑制剂剂量的不同组合。
[0290]
可以口服施用的ck1抑制剂和组合物包括由明胶制成的推合胶囊，以及由明胶和如甘油或山梨糖醇的增塑剂制成的密封软胶囊。推合胶囊可以包含与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选存在的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体(如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。另外，可以添加稳定剂。所有口服施用的制剂的剂量应适合于这种施用。
[0291]
对于含服施用，用于根据本发明用途的ck1抑制剂以及组合和组合物可以以常规方式配制的片剂或锭剂形式施用。
[0292]
可将用于根据本发明用途的ck1抑制剂以及组合和组合物配制成通过注射(例如通过推注或持续输注)进行肠胃外施用。以这种方式，也有可能靶向特定的器官、组织、肿瘤部位、炎症部位等。用于感染的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，并添加防腐剂。所述组合物可以采取如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。该制剂是优选的，因为它能够特异性靶向肌肉组织。
[0293]
肠胃外施用的组合物包括水溶性形式的组合物的水溶液。另外，可以将悬浮液制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或者合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加所述组合物溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。
[0294]
或者，所述组合物的一种或多种组分可以是粉末形式，以便在使用前与合适的媒介物例如无菌的无热原水一起配制。
[0295]
用于根据本发明用途的组合物或组合也可以配制成直肠给药组合物，如栓剂或保留灌肠剂，例如，其含有常规的栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯。
[0296]
除了先前描述的制剂之外，用于根据本发明用途的ck1抑制剂以及组合和组合物也可以被配制成贮库制剂。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，它们可以用合适的聚合物材料或疏水材料配制(例如制成在可接受的油中的乳剂)，或者配制成可以或不可以在体内自动降解的固体或半固体植入物的一部分，或离子交换树脂，或者，所述组合物的一种或多种组分可以配制成微溶性衍生物，例如配制成微溶盐。合适的聚合物材料的实例是本领域技术人员已知的，并且包括plga和聚内
酯，如聚己酸。
[0297]
用于根据本发明用途的组合物或组合还可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇的聚合物。
[0298]
用于根据本发明用途的组合物或组合还可以包含在透皮贴剂中。优选的用于根据本发明用途的透皮贴剂选自单层黏胶分散型贴剂、多层黏胶分散型贴剂、储库型贴剂、基质贴剂或蒸气贴剂。
[0299]
用于根据本发明用途的组合物包含ck1抑制剂以及组合和组合物，其中活性成分以有效量被包含以实现其预期目的。更具体地，治疗有效量是指有效预防、稳定、减轻、逆转或改善疾病的原因或症状，或者延长所治疗的个体的存活、活动或独立性的化合物的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。对于在本发明中使用的任何ck1抑制剂以及组合和组合物，治疗有效量或剂量可以首先从细胞培养测定估算，例如本文所示例的。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。精确的制剂、施用途径和剂量可以由个别医师根据患者的病症来选择。(参见例如，fingl等人，1975，“the pharmacological basis of therapeutics”ch.1p.1)。当然，ck1抑制剂和组合物的施用量取决于所治疗的个体、个体的体重、患病的严重程度、施用方式和处方医师的判断。
[0300]
可以提供用于根据本发明用途的组合物或组合，使得用于根据本发明用途的ck1抑制剂和本文定义的一种或多种其他成分以溶液、悬浮液或粉末形式存在于同一容器中。还可以提供用于根据本发明用途的组合物，其中所有组分彼此分开提供，例如在施用前彼此混合，或者分开或顺序施用。例如，组合物可以包含包括ck1抑制剂的容器和包括p38抑制剂的单独容器。相反，组合物还可以包含容器，其在同一容器中包括ck1抑制剂和p38抑制剂二者。各种包装选择是可能的并且是本领域技术人员已知的，尤其取决于施用途径和机制。根据上述施用方法，本发明提供用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂，或用于根据本发明用途的组合，或用于根据本发明用途的组合物，其特征在于其是口服、舌下、血管内、静脉内、皮下、经皮施用的，或任选地通过吸入施用，最优选口服施用。
[0301]
ck1抑制剂或组合或组合物的“有效量”是这样的量，其在被施用于个体时，足以减少或消除一种或多种疾病症状，或者延迟一种或多种疾病症状进展，或者减轻一种或多种疾病症状的严重程度，或者抑制疾病的表现，或者抑制疾病的不良症状的表现。有效量可以一次或多次施用给予。
[0302]
可以与载体材料组合以制备单一剂型的“有效量”可以变化，取决于被施用活性成分的宿主以及特定的施用方式。通常制备并施用所选择的单位剂量，以提供化合物在血液中所需的最终浓度。
[0303]
有效量(即有效总日剂量)，优选对于成年人而言，在本文中定义为总日计量为约0.01至2000mg、或约0.01至1000mg、或约0.01至500mg、或约5至1000mg、或约20至800mg、或约30至800mg或约30至700mg、或约20至700mg、或约20至600mg、或约30至600mg、或约30至500mg、约30至450mg、或约30至400mg、或约30至350mg、或约30至300mg或约50至600mg、或约50至500mg、或约50至450mg、或约50至400mg或约50至300mg、或约50至250mg、或约100至250mg或约150至250mg。在最优选的实施方案中，所述有效量为约200mg。在优选的实施方案
中，本发明提供用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂或用于根据本发明用途的组合物，其特征在于，其以0.1至1500mg/天的量施用于个体，优选0.1至1000mg/天，更优选0.1至400mg/天，还更优选0.25至150mg/天，如约100mg/天。
[0304]
或者，所述化合物的有效量，优选对于成年人而言，优选以每公斤体重施用。因此，总日剂量，优选对于成年人而言，为约0.05至约40mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.2mg/kg至约15mg/kg、或约0.3mg/kg至约15mg/kg、或约0.4mg/kg至约15mg/kg、或约0.5mg/kg至约14mg/kg、或约0.3mg/kg至约14mg/kg、或约0.3mg/kg至约13mg/kg、或约0.5mg/kg至约13mg/kg、或约0.5mg/kg至约11mg/kg。
[0305]
对于儿童的总日剂量优选至多200mg。更优选地，该总日剂量为约0.1至200mg、约1至200mg、约5至200mg、约20至200mg、约40至200mg、或约50至200mg。优选地，对于儿童的总日剂量为约0.1至150mg、约1至150mg、约5至150mg、约10至150mg、约40至150mg、或约50至150mg。更优选地，该总日剂量为约5至100mg、约10至100mg、约20至100mg、约30至100mg、约40至100mg、或约50至100mg。甚至更优选地，该总日剂量为约5至75mg、约10至75mg、约20至75mg、约30至75mg、约40至75mg、或约50至75mg。
[0306]
可以使用的剂量的可替代实例是用于根据本发明用途的化合物的在以下剂量范围内的有效量：约0.1μg/kg至约300mg/kg、或约1.0μg/kg至约40mg/kg体重、或约1.0μg/kg至约20mg/kg体重、或约1.0μg/kg至约10mg/kg体重、或约10.0μg/kg至约10mg/kg体重、或约100μg/kg至约10mg/kg体重、或约1.0mg/kg至约10mg/kg体重、或约10mg/kg至约100mg/kg体重、或约50mg/kg至约150mg/kg体重、或约100mg/kg至约200mg/kg体重、或约150mg/kg至约250mg/kg体重、或约200mg/kg至约300mg/kg体重、或约250mg/kg至约300mg/kg体重。可以使用的其他剂量是约0.01mg/kg体重、约0.1mg/kg体重、约1mg/kg体重、约10mg/kg体重、约20mg/kg体重、约30mg/kg体重、约40mg/kg体重、约50mg/kg体重、约75mg/kg体重、约100mg/kg体重、约125mg/kg体重、约150mg/kg体重、约175mg/kg体重、约200mg/kg体重、约225mg/kg体重、约250mg/kg体重、约275mg/kg体重、或约300mg/kg体重。
[0307]
用于根据本发明用途的化合物或组合物可以单个日剂量施用，或者，总日剂量可以每天两次、三次或四次的分剂量施用。
[0308]
在本发明的优选实施方案中，“个体”、“个体”或“患者”被理解为是个体生物，优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物，甚至更优选为灵长类动物，最优选为人类。
[0309]
在本发明的进一步优选实施方案中，所述人是成年人，例如18岁或更大的人。另外，在本文中应理解，成年人的平均重量是62kg，然而已知平均重量在国家之间是不同的。因此，在本发明的另一实施方案中，成年人的平均重量在约50-90kg之间。在本文中应理解，本文所定义的有效剂量不限于具有平均体重的个体。优选地，所述个体具有18.0至40.0kg/m2的bmi(身体质量指数)，并且更优选地具有18.0至30.0kg/m2的bmi。
[0310]
或者，待治疗的个体是儿童，例如，17岁或更年轻的人。另外，待治疗的个体可以是出生至青春期或青春期至成年的人。在本文中应理解，女性的青春期始于10-11岁的年龄，男性的青春期始于11-12岁的年龄。此外，待治疗的个体可以是新生儿(出生后第一个28天)、婴儿(0-1岁)、幼儿(1-3岁)、学龄前儿童(3-5岁)；学龄儿童(5至12岁)或青少年(13至18岁)。
[0311]
为了在治疗期间维持有效范围，可以每天一次或者每二、三、四或五天一次施用所
述ck1抑制剂或组合物。然而，优选地，所述化合物可以每天至少施用一次。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于根据本发明用途的酪蛋白激酶1抑制剂或用于根据本发明用途的组合物，其特征在于，将其每天4、3、2或1次或更少，优选每天1次施用至个体。总日剂量可以单个日剂量施用。或者，所述化合物每天至少施用两次。因此，本文定义的化合物可以每天施用一次、两次、三次、四次或五次。这样，可将总日剂量分成几个剂量(单位)，以达到如本文定义的总日剂量的施用。在优选的实施方案中，所述化合物每天施用两次。还应理解的是，术语“每天两次”、“bid”和“每日两次”可以在本文中互换使用。
[0312]
在一个优选的实施方案中，将总日剂量分成每天几个剂量。这些分开的剂量在量上可以不同。例如，对于每个总日剂量，第一剂量可具有比第二剂量更大的化合物量，反之亦然。但是优选地，以相似或相等的剂量施用所述化合物。因此，在最优选的实施方案中，以两个相似或相等的剂量每天两次施用所述化合物。
[0313]
在本发明的进一步优选的实施方案中，如上定义的化合物的总日剂量以至少两个分开的剂量施用。所述至少两个分开的剂量的施用之间的间隔为至少约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，优选地，所述至少两个分开的剂量之间的间隔为至少约4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，更优选地，所述至少两个分开的剂量之间的间隔为至少约8、9、10、11或12小时。
[0314]
用途
[0315]
在本发明的一个方面，提供根据本发明的ck1抑制剂的用途，或根据本发明的组合物的用途，或根据本发明的组合的用途。所述用途用于治疗有此需要的个体的与dux4表达相关的疾病或病症，并且包括向所述个体施用有效剂量的根据本发明的ck1抑制剂或组合或组合物，其中所述ck1抑制剂或组合或组合物如本文前面所定义。
[0316]
在该方面的一个实施方案中，提供根据本发明的ck1抑制剂的用途，或根据本发明的组合物的用途，或根据本发明的组合的用途。所述用途用于治疗有此需要的个体的肌营养不良症或癌症，并且包括向所述个体施用有效剂量的根据本发明的ck1抑制剂或组合物或组合，其中所述ck1抑制剂或组合物或组合如本文先前所定义。其他特征和定义优选如本文别处所定义，特别是对于待治疗的疾病或病症。
[0317]
方法
[0318]
本发明的一个方面提供用于降低dux4表达的体内、体外或离体方法，所述方法包括使细胞与如本文先前定义的ck1抑制剂或如本文先前定义的组合物或组合接触的步骤。本发明的一个相关方面提供了用于促进成肌融合和/或分化的体内、体外或离体方法，所述方法包括使细胞与如本文先前定义的ck1抑制剂或如本文先前定义的组合物或组合接触的步骤。优选地，所述方法用于治疗与dux4表达相关的疾病或病症，如肌营养不良症或癌症，最优选地，所述疾病或病症是面肩肱型肌营养不良症(fshd)。所述方法优选地包括如本文先前定义的用途。优选的方法包括使细胞与如本文先前定义的ck1抑制剂组合物接触。在本发明的上下文中，使细胞与ck1抑制剂或组合或组合物接触可以包括将此类ck1抑制剂或组合或组合物添加到其中培养了细胞的培养基中。使细胞与ck1抑制剂或组合或组合物接触也可以包括将此类ck1抑制剂或组合或组合物添加到其中悬浮有细胞或覆盖细胞的培养基、缓冲液或溶液中。接触细胞的其他优选方法包括用ck1抑制剂或组合或组合物注射细胞，或将细胞暴露于包含根据本发明的ck1抑制剂或组合或组合物的材料。用于施用的其他
方法在本文别处定义。优选的细胞是已知表达dux4的细胞、疑似表达dux4的细胞或者已知受到本文先前定义的疾病或病症影响的细胞。
[0319]
在该方面的一个实施方案中，所述方法是体外方法。在该方面的进一步的实施方案中，所述方法是离体方法。在该方面的进一步的实施方案中，所述方法是体内方法。在该方面的优选实施方案中，所述方法是体外或离体方法。
[0320]
在该方面的实施方案中，所述细胞可以是得自个体的样品的细胞。这样的样品可以是先前已经从个体获得的样品。在该方面的实施方案中，样品可以先前已经从人类个体获得。在该方面的实施方案中，样品可以已经从非人类个体获得。在该方面的优选实施方案中，获得所述样品不是根据本发明的方法的一部分。
[0321]
在优选的实施方案中，根据本发明的方法是用于降低有此需要的个体中dux4表达的方法，所述方法包括施用有效量的本文先前定义的ck1抑制剂、或本文先前定义的组合物、或本文先前定义的组合的步骤。在更优选的实施方案中，所述方法用于治疗与dux4表达相关的疾病或病症，优选肌营养不良症或癌症，最优选地，所述疾病或病状是面肩肱型肌营养不良症(fshd)。其他特征和定义优选地如本文别处所定义。
[0322]
一般定义
[0323]
在该文件及其权利要求中，动词“包含”及其变化形式以其非限制性意义使用，以表示包含该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。另外，动词“由
……
组成”可以被“基本上由
……
组成”代替，意指本文所定义的组合或组合物可以包含除具体确定的组分之外的一种或多种另外的成分，所述另外的成分不改变本发明的独特特征。另外，英文不定冠词“a”或“an”所指的要素不排除存在大于一个所述要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素。因此，英文不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。
[0324]
当本领域技术人员将结构式或化学名称理解为具有手性中心，但未指示手性时，则对于每个手性中心，单独提及外消旋混合物、纯r对映异构体和纯s对映异构体中的全部三种。优选的异构体是互变异构体和立体异构体。
[0325]
每当在本发明的上下文中讨论物质的参数时，都假定除非另有说明，否则该参数是在生理条件下测定、测量或显示的。生理条件是本领域技术人员已知的，并且包括水溶剂体系、大气压、6至8的ph值、室温至约37℃(约20℃至约40℃)的温度范围以及适当浓度的缓冲盐或其他成分。
[0326]
如该文件中描述的物质作为药物的用途也可以解释为所述物质在药物制备中的用途。类似地，每当物质用于治疗或用作药物时，它也可以用于制备用于治疗的药物。本文中描述用作药物的产品可以用于治疗方法，其中这类治疗方法包括施用使用的产品。根据本发明的ck1抑制剂或组合物优选用于根据本发明的方法或用途。
[0327]
在整个本技术中，表达被认为是基因转录成功能性mrna，从而形成多肽，如酶或转录因子或例如dux4多肽。多肽可以发挥作用或具有活性。在这种情况下，多肽表达的增加或减少可以被认为是编码所述多肽的mrna的水平的增加或减少，多肽分子的水平或量的增加或减少，或所述多肽分子的总活性的增加或减少。优选地，多肽表达的增加或减少分别导致所述多肽活性的增加或减少，这可以由多肽分子的水平或量的增加或减少引起。更优选地，dux4表达的降低是dux4基因的转录的降低、dux4 mrna的去稳定化或降解、dux4多肽分子的量的减少、dux4多肽分子活性的降低、dux4多肽的去稳定化或降解，或其组合。去稳定化的
mrna导致其编码的多肽的表达降低，可能其不能导致这种表达。降解的mrna被破坏并且不能导致其编码的多肽的表达。与未被去稳定化的相同多肽相比，去稳定化的多肽发挥较小的作用或具有较低的活性，可能它不发挥作用或没有活性。去稳定化的多肽可以被变性或错误折叠。降解的多肽被破坏并且不发挥作用或没有活性。
[0328]
在本发明的上下文中，待评估参数的减少或增加是指对应于该参数的值的至少5％的变化。更优选地，所述值的减小或增大是指至少10％、甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％或100％的变化。在后一种情况下，情况可以是不再有与该参数相关的可检测值。
[0329]
词语“约”或“大约”在与数值关联使用(例如，约10)时优选地是指该值可以是比该值多或少1％的(10的)给定值。
[0330]
除非另外指出，否则本文中标识的每个实施方案可以组合在一起。以上已经参考多个实施方案描述了本发明。本领域技术人员可以想到所述实施方案的一些元素的轻微变化。这些包括在所附权利要求书定义的保护范围内。所引用的所有专利和文献均以其整体通过援引加入本文。
[0331]
附图简要说明
[0332]
图1
–
(a)：分化3天后，来自2个不同供体的fshd肌管中dux4免疫细胞化学染色的图示。dux4阳性细胞核簇明显染色，而dux4阴性细胞核未染色。直方图显示了在用dux4和二抗(顶部)或者单独的二抗(底部)染色后免疫荧光信号的强度(x轴上的强度增加)；顶部的箭头显示背景信号(向左箭头)或特异性的dux4信号(向右箭头)；(b)：分化3天后dux4染色的fshd肌管的图示。虚线图案来自所应用的过滤器设置，以排除二抗对照的背景。注意，阈值设置禁止在更远离前哨核的细胞核中检测到较弱的dux4信号。
[0333]
图2
–
基于脚本的图像分析包括细胞核识别、肌管识别、肌管边界内外的细胞核的检测(用于计算融合指数)、dux4阳性细胞核和簇、肌管面积、肌管宽度和肌管骨架长度。
[0334]
图3
–
384孔形式的初步筛选测定形式的验证。显示了三个独立的实验，说明了在分化培养基中3天后，使用对分化的原代肌管中表达dux4的细胞核数目的基于脚本的定量而获得的测定窗口。所述测定窗口由dux4信号和二抗的背景信号(代表在完全不存在dux4情况下的信号)定义。
[0335]
图4
–
(a)：筛选测定方案的示意图。在第-1天接种成肌细胞，在第0天将培养基换成分化培养基。使细胞分化3天。在固定之前15小时加入化合物。(b)：使用2种不同的dux4表达读数(dux4阳性细胞核的数量和dux4强度)和2种不同的监测潜在毒性的读数(融合指数、细胞核计数)对被注释的化合物库进行初步筛选的重复结果之间的相关性。匹配呼叫阈值(hit calling threshold)(高严格性)用虚线表示，右上象限包含不同读数的匹配化合物(hit compound)。散点图的轴是对称的。
[0336]
图5
–
不同读数的各种ck1抑制剂的浓度-响应曲线。化合物暴露15小时后，测量dux4细胞核计数、dux4强度、融合指数和总细胞核计数。(a)：pf-670462的结果；(b)：pf-5006739的结果；(c)：化合物3的结果；(d)：化合物4的结果；(e)：化合物5的结果；(f)：化合物6的结果；(g)：化合物7的结果；结构式在实施例5中示出。
[0337]
图6：读数dux4核计数(左)、dux4强度(中)和融合指数(右)的一项测定验证实验的散点图。将原代fshd肌管在增殖培养基中生长，之后将培养基用分化培养基替代，使细胞分
化3天。如实施例2中所述评估读数。最外侧孔用白色菱形表示，次外侧孔用灰色圆圈表示，所有内侧孔用黑色星号表示。从图中可以清楚地看出，与内侧孔相比，最外侧孔的融合指数较低。此外，外侧孔中的dux4读数较低，说明融合指数的降低意味着获得假阳性读数的风险。
[0338]
图7
–
(a)：测定方案的示意图。在第-1天接种成肌细胞，在第0天将培养基换成分化培养基。使细胞分化3天。在固定之前15小时或72小时，将化合物加入。对于15小时的处理，当分化已经明显进展时施用化合物。在72小时处理的情况下，在完全分化阶段期间温育化合物。其他面板显示了针对不同读数的bet抑制剂(b)或β2肾上腺素能受体激动剂(c、d、e、f)的浓度-响应曲线。处理15小时或72小时后评估dux4细胞核计数、dux4强度、融合指数和总细胞核计数。(b)：(+)jq1；(c)：福莫特罗；(d)：沙丁胺醇；(e)：沙美特罗；(f)：当暴露于β2肾上腺素能受体激动剂(福莫特罗)时在分化培养基中72小时后肌管的显微照片；(g)：暴露于ck1抑制剂(pf-670462)15小时和72小时后的结果。
[0339]
图8：各种p38抑制剂在原代fshd细胞系中不同读数的浓度-反应曲线(n＝3)。在化合物暴露72小时后测量dux4核计数、dux4强度、融合指数和总核计数。(a)：acumapimod的结果；(b)：amg548的结果；(c)：birb795的结果；(d)：bms-582949的结果；(e)：洛吡莫德的结果；(f)：ly2228820的结果；(g)：帕吡莫德的结果；(h)：pexmetinib的结果；(i)：ph797804的结果；(j)：r1487的结果；(k)：sb-681323的结果；(l)：scio469的结果；(m)：vx702的结果；(n)：vx745的结果。
[0340]
图9：p38抑制剂洛吡莫德在健康供体的原代细胞中的融合和细胞计数读数的浓度-反应曲线。所述融合指数被洛吡莫德强力抑制。
[0341]
图10：实验已在72小时的化合物处理下，在原代fshd细胞的标准测定中进行。(a)：增加p38抑制剂洛吡莫德或ck1抑制剂nr4、nr5或nr8的浓度对融合指数的浓度依赖性影响；(b)：在用溶剂或ck1抑制剂nr.4处理72小时后，在标准测定中原代fshd细胞的显微图像；(c)：在不存在(上)或存在(下)ck1抑制剂nr.4的条件下用不同浓度的洛吡莫德处理72小时后，在标准测定中原代fshd细胞的显微图像；(d)：在不存在或存在ck1抑制剂nr.4的条件下，增加p38抑制剂洛吡莫德浓度对融合指数的浓度依赖性影响。示出了单独的ck1抑制剂的效果以进行对比；(e)：在用溶剂或ck1抑制剂nr.5处理72小时后在标准测定中原代fshd细胞的显微图像；(f)：在不存在(上)或存在(下)ck1抑制剂nr.5的条件下用不同浓度的洛吡莫德处理72小时后，在标准测定中原代fshd细胞的显微图像；(g)：在不存在或存在ck1抑制剂nr.5条件下，增加p38抑制剂洛吡莫德浓度对融合指数的浓度依赖性影响。示出了单独的ck1抑制剂的效果以进行对比；(h)：在用溶剂或ck1抑制剂nr.8处理72小时后，在标准测定中原代fshd细胞的显微图像；(i)：在不存在(上)或存在(下)ck1抑制剂nr.8的条件下用不同浓度的洛吡莫德处理72小时后，在标准测定中原代fshd细胞的显微图像；(j)：在不存在或存在ck1抑制剂nr.8条件下，增加p38抑制剂洛吡莫德的浓度对融合指数的浓度依赖性影响。示出了单独的ck1抑制剂的效果以进行对比；(k)：在不存在或存在增加ck1抑制剂nr.4的浓度的条件下，固定浓度的洛吡莫德(1.25m)的效果；(l)：在不存在或存在增加ck1抑制剂nr.5的浓度的条件下，固定浓度的洛吡莫德(1.25um)的效果；(m)：在不存在或存在增加ck1抑制剂nr.8的浓度的条件下，固定浓度的洛吡莫德(1.25um)的效果。
[0342]
图11：实验已在72小时的化合物处理下在原代fshd细胞中的标准测定中进行。
(a)：在不存在或存在ck1抑制剂nr.4的条件下，增加p38抑制剂洛吡莫德的浓度对dux4读数的浓度依赖性影响；(b)：在不存在或存在ck1抑制剂nr.5的条件下，增加p38抑制剂洛吡莫德的浓度对dux4读数的浓度依赖性影响；(c)：在不存在或存在ck1抑制剂nr.8的条件下，增加p38抑制剂洛吡莫德的浓度对dux4读数的浓度依赖性影响。
[0343]
实施例
[0344]
实施例1
–
原代fshd肌细胞在一小部分肌细胞核中表达dux4
[0345]
发明人成功地在原代肌管中建立了灵敏的dux4检测方法，并将其用于建立用于定量评估内源性dux4表达的高含量测定方法。该方法已发展成为经过验证的表型筛选平台，用于自动检测和定量内源性dux4表达。dux4阻抑的潜在机制可能涉及许多相互作用的蛋白质，从而支持这种表型方法。此外，它是途径/靶标非依赖性的(因此不是假说驱动的)，并提供有关细胞毒性或干扰肌肉分化的其他信息。
[0346]
以经报道了从不同的供体获得的细胞之间在dux4表达水平方面的显著差异。因此，对来自不同供体的肌细胞系进行了彻底表征，并选择最佳细胞系进行初步筛选。成肌细胞的myod染色证实了所有细胞系的坚实肌原性(myogenicity)(rudnicki等人，1993；cell 75(7)：1351-9)。优化参数后，建立了可用于筛选测定的dux4检测程序，该程序在fshd细胞中产生预期的dux4模式，但在来自健康供体的肌管中不会产生。如图1所示，这包括细胞核dux4定位(只有少量阳性细胞)，以及通过dux4阳性细胞核簇的强度梯度，如rickard等人(2015，doi：10.1093/hmg/ddv315)所描述的。
[0347]
实施例2-筛选测定以鉴定dux4阻抑
[0348]
在基于脚本的图像分析的基础上开发了定量测定读数。根据实施例1将细胞染色，也使用dapi检测肌细胞核和针对肌球蛋白重链(mhc)的抗体以可视化肌管的形成。为了分析图像，开发了一种自动脚本，能够检测细胞核、肌管边界和dux4信号，并且该脚本还可以检测伪迹以减少假阳性信号。该脚本能够进行多个经验证的读数，包括dux4阳性细胞核和细胞核簇的数量、融合指数、肌管面积、肌管宽度和肌管骨架长度(参见图2)。另外，包括总细胞核计数，作为细胞损失或化合物毒性的量度。通过评估原代肌管中内源性dux4的表达来验证脚本，结果与文献值一致，dux4表达细胞核的数量《0.5％。
[0349]
该测定法已经进一步成熟，使其适合于筛选目的。测定质量取决于供体细胞系。dux4阳性细胞核的数量是每个供体细胞系的特征，并且在各实验之间是一致的。就表达dux4的细胞核数量、再现性和z因子而言，选择了性能最佳的细胞系以将测定小型化为384孔形式，从而允许自动筛选大型化合物库。选择具有2个d4z4重复序列的细胞系进行初步筛选，同时选择具有6个d4z4重复序列的细胞系进行以后的验证。初步筛选测定的z因子为0.6，这代表出色的测定方法(zhang等人，1999，doi：10.1177/108705719900400206；参见图3)。
[0350]
在高含量测定中筛选了包含约5000种被注释的化合物的化合物库。为此，将原代成肌细胞接种在384孔板中，然后将生长培养基替换为分化培养基。分化3天后，将细胞用库化合物处理(在不同的筛选板上重复两次)15小时，然后将其固定并用抗dux4抗体、抗肌球蛋白重链(mhc)抗体和dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色。基于脚本的分析提供了dux4表达(dux4阳性细胞核计数或dux4强度)和潜在毒性(融合指数和细胞核计数)的读数。结果显示在图4中。使用相同的测定法和5次重复在实验中确认了大约200个匹配物中的大多数。
选择这些化合物用于进一步的浓度-响应分析。
[0351]
使用rt-pcr验证这些匹配物中一半。基于dux4以及下游靶基因trim43和zscan4的mrna表达，使用管家基因hgusb、gapdh、hrpl27作为参考，观察到免疫细胞化学测定(蛋白质水平)和rt-pcr测定(mrna水平)中dux4阻抑之间有很好的相关性。这表明绝大多数的匹配物具有上游作用模式，即，它们通过抑制dux4的表达起作用(与加快dux4的降解相反)。
[0352]
如lemmers等人(2010，doi：10.1126/science.1189044)所描述的，使用从applied biosystems(foster city，usa)订购的寡核苷酸进行rt-pcr，所述寡核苷酸可能作为测定试剂盒的一部分(对于hgapdh(app)：assayid hs02758991_g1；对于htrim43(app)：assay id hs00299174_m1；对于hmyh2_tv1-2(app)：assayid hs00430042_m1)。其他寡核苷酸示于表1。
[0353]
表1-用于pcr的引物和探针
[0354][0355]
实施例3-ck1抑制剂作为dux4阻抑物
[0356]
经过验证的测定用于筛选包含大约5000种化合物的被注释的化合物库，以鉴定dux4阻抑的新作用机制。该库包含具有注释的药理学的化合物，不仅要求化合物的主要药理学，而且还要求潜在的已知多元药理学。初步筛选获得了多个匹配物，确定了减少dux4阳性细胞核数量的化合物。通过建立浓度-响应曲线进一步分析匹配物。通过对筛选和分析数据集应用生物信息学方法，发明人惊奇地发现，具有ck1注释的化合物在表型活性化合物群体中(即，在诱导dux 4阻抑的化合物组中)显著富集。有趣的是，具有ck1注释的原始化合物中没有一个以ck1作为其主要药理靶标，而每个都具有其他蛋白质家族的其他高效靶标。因此，生物信息学分析对于确定ck1和dux4阻抑之间的关联至关重要。
[0357]
当被分析的化合物(profiled compound)对dux4表现出浓度依赖性的作用(抑制或激活)时，被注释为具有表型活性。在这些化合物中，排除了对融合指数或细胞核总数的抑制作用超过10％的化合物，除非对这些读数的影响比对dux4的影响至少低5倍效价。因
此，在4790种独特的化合物中，有188种化合物被分类为具有表型活性，其中162种是dux4抑制剂。
[0358]
对于表型活性化合物，使用公开可获得的其他信息(文献、专利申请、供应商数据库等)补充了原始靶标注释。考虑了所有人类蛋白质以及可以建立对人类蛋白质组的映射的非人类直系同源物。然后针对这些靶标注释对4790种化合物中的每一种进行评估，将靶标分类为对给定化合物有活性或无活性。对于表型活性化合物，如果化合物对靶标的效价≤表型效价的10倍，则被注释的靶标被分类为有活性，否则，该靶标被分类为无活性。该分析表明，大约201个靶标与表型活性相关，错误发现率为0.05。在表型活性化合物组中检测到被注释为ck1抑制剂的化合物的富集。
[0359]
实施例4-ck1同工型在fshd原代肌细胞中表达
[0360]
为了确认靶标在健康肌细胞和fshd肌细胞中表达，采用rna测序方法测定来自4个不同fshd供体和4个不同健康供体的原代肌管中不同ck1同工型的表达。结果显示，所有ck1同工型均在fshd肌细胞和健康肌细胞中表达。最高的表达是ck1α、ck1δ和ck1ε(参见表2)。
[0361]
表2-通过分化的肌管的rna测序测定的酪蛋白激酶1同工型在4种健康原代细胞系和4种fshd原代细胞系中的表达
[0362][0363]
实施例5-ck1的抑制阻抑dux4
[0364]
按照实施例2的方案测定ck1抑制剂的dux4阻抑，示于图4a中。表3显示了图5中使用的ck1抑制剂的结构。将化合物与原代fshd细胞温育15小时，如图4a中的箭头所示。结果显示在图5中，而表3显示了半数最大有效浓度(ec
50
)值。表3还示出了ck1α、ck1δ、ck1ε和p38α的测定的ic
50
值，单位为nm，分别表示为ck1 a、d、e和p38a。
[0365]
表3-用于根据本发明用途的示例性ck1抑制剂以及在15h治疗方案中获得的对于dux4阻抑的半数最大有效浓度(ec
50
)。
[0366]
[0367][0368]
还在异种移植小鼠模型中体内测试了所选的先导化合物。为此，将人类原代fshd成肌细胞注射到小鼠胫骨前肌中。然后这些人类细胞分化为肌管，在此期间dux4被脱阻抑。如通过rt-pcr和组织学检查所建立的，具有良好药代动力学性质的所选化合物(确保暴露高于体外观察到的ec
50
)导致该异种移植动物模型中dux4 mrna表达的阻抑。
[0369]
实施例6：减少的肌管融合指数与减少的dux4信号相关
[0370]
在测定验证实验中，本发明人发现有趣的是，这直接反映了来自该测定的dux4计
数读数，说明对融合的小影响可以对在该测定中检测的dux4的量产生直接影响(图6)。
[0371]
实施例7-ck1抑制剂不抑制肌管融合
[0372]
由于在增殖的fshd成肌细胞体外分化为多核肌管后dux4表达增加(balog等人，2015epigenetics。2015；10(12):1133-42)，分化的抑制可能导致对dux4阻抑的假阳性影响。
[0373]
布罗莫结构域和末端外结构域(bet)抑制剂，如非选择性抑制剂(+)jq1或brd4选择性抑制剂rvx-208，可以抑制dux4在永生化分化的肌管培养物中的表达(参见us2015087636a1)。其中表明，当将分化的肌管在分化过程开始时(即，从将生长培养基变为分化培养基的那一刻起—)暴露于(+)jq1时，肌球蛋白重链(myh2，一种分化标记)的表达降低，表明该抑制剂也影响了分化过程。(+)jq1和rvx-208二者都在本技术所描述的表型测定中进行了评估。β2肾上腺素能受体激动剂已被报道抑制在分化的肌管中的dux4表达(campbell等人，2017)，而且最近已被表明抑制肌管融合(chen等人,2019,doi.org/10.1186/s13287-019-1160-x；kim等人,2019,doi.org/10.1080/19768354.2018.1561516)。我们评估了bet抑制剂和β2肾上腺素能受体激动剂二者对融合过程的影响，并与ck1抑制剂的影响进行了比较。
[0374]
图7a显示了实施例2的实验设置。化合物在固定之前15小时施用(类似于最初的筛选方案)，或者在固定之前72小时施用(灰色箭头)。在后一种情况下，化合物存在于整个分化过程中。发明人发现，早期施用bet抑制剂(+)jq1(图7b)和β2肾上腺素能受体激动剂(图7c、d、e)抑制融合过程和成肌细胞分化为肌管。图7f显示，在用β2肾上腺素能受体激动剂(福莫特罗)处理后未观察到肌管形成。这可导致在评估dux4信号时的假阳性读数。bet抑制剂rvx-208对dux4表达没有显示任何作用，与处理时间无关(未显示)。尽管在15小时的时间点融合指数似乎没有受到影响，但在该处理时间，肌管融合过程也受到了这些化合物的影响，如rt-pcr所测定的，显示了对晚期分化标记肌球蛋白重链的表达的抑制(myh；未显示；引物来自上述hmyh2试剂盒)。
[0375]
如实施例5所示，对ck1的抑制作用抑制了dux4。该作用出现，而且在化合物处理后15小时或72小时后都不抑制肌管融合(图7g)。表4示出在72小时化合物治疗方案中，多种ck1抑制剂对dux4抑制的半数最大有效浓度(ec
50
)值。表4还示出了ck1α、ck1δ、ck1ε和p38α(分别标示为ck1a、d、e和p38a)的测定的ic
50
值，以nm为单位。
[0376]
表4-用于根据本发明用途的示例性ck1抑制剂以及半数最大有效浓度(ec
50
)。dux4ec
50
值在72小时治疗方案中获得。
[0377]
[0378]
[0379][0380]
实施例8
–
ck1抑制剂的抑制曲线
[0381]
测定化合物pf-670462、pf-5006739、化合物e、化合物f、化合物d、化合物h、化合物a和sr3029对ck1α、ck1δ、ck1ε和p38的抑制以及对dux4的同时阻抑。表5和6显示抑制结果。
[0382]
表5
–
ck1抑制剂对ck1和p38的抑制作用，单位为nm。dux4 ec
50
值在15h治疗方案中获得。
[0383][0384]
表6
–
ck1抑制剂对ck1和p38的抑制作用，单位为nm。dux4 ec
50
值在72h治疗方案中获得。
[0385][0386]
实施例9：p38抑制剂抑制来自fshd供体的原代成肌细胞的融合
[0387]
由于增殖的fshd成肌细胞在体外分化为多核肌管时dux4表达增加(balog et al.,2015epigenetics.2015；10(12):1133-42)，所以抑制分化可能导致对dux4抑制的假阳性作用。最近，p38被描述为抑制dux4 mrna表达而不影响成肌分化标志物myog和myh2(wo2019/071144和wo2019/071147)。由于这些标志物的表达未必与融合相关，我们在高含量测定中分析了一系列p38抑制剂并量化了其对dux4表达和肌管融合的作用。由于当在固定前的最后15小时分化期间加入洛吡莫德时其对dux4和融合指数未显示任何影响(未显示)，所有实验都是在细胞固定前72小时用分化培养基替换生长培养基时施用化合物来进行的。如图8所示，所有测试的p38抑制剂(洛吡莫德、bms-582949、pexmetinib或arry-614、birb796、scio469、ph797804、帕吡莫德、ly2228820、r1487、sb-681323、vx-745、acumapimod、vx702)均抑制融合指数，很大程度上掩盖了对dux4的影响(如果有的话)。使用洛吡莫德，在来自不同供体的原代fshd肌细胞中证实了这种对融合指数的抑制作用(未显示)。
[0388]
表7：不同p38化合物对p38a、ck1a和ck1d的ic
50
值
[0389]
化合物p38(nm)ck1a/ck1d(nm)acumapimod22》10,000/》10,0000amg5487》10,000/452birb79599》10,000/》10,0000bms-58294965》10,000/》10,0000洛吡莫德26》10,000/》10,0000ly222882014》10,000/2780帕吡莫德16》10,000/》10,0000pexmetinib17》10,000/》10,0000ph7978047》10,000/》10,0000r148713》10,000/9430sb-68132311》10,000/》10,0000scio46916》10,000/》10,0000vx70225》10,000/》10,0000vx74529》10,000/》10,0000
[0390]
实施例10：p38抑制剂抑制来自健康供体的原代成肌细胞的融合
[0391]
如图9所示，p38抑制剂的抑制作用不限于fshd细胞系。来自健康供体的原代肌细胞按照实施例2中的描述进行处理，不同之处在于允许分化5天而不是3天以解释较慢的分化时间(达到最大融合指数的时间)。当生长培养基改变为分化培养基时加入洛吡莫德。在这些条件下，洛吡莫德明显抑制融合指数，反映了多核肌管的形成受到抑制。
[0392]
实施例11：ck1抑制剂在原代肌管中防止由p38抑制剂导致的融合抑制
[0393]
如实施例9和10以及图10a所示，用p38抑制剂处理分化的原代肌管(72小时方案)防止其形成多核融合肌管。本发明人已经发现，当在存在本身不抑制肌管融合的ck1抑制剂的条件下用p38抑制剂处理细胞(图10a、b、d、f)时，对融合的不利影响可以至少部分被阻止。图10a示出洛吡莫德和不同的ck1抑制剂在不同浓度下对融合的影响的比较。当肌管在增加浓度的洛吡莫德的条件下(单独的，或在存在化合物nr.4、nr.5或nr.8的条件下)分化时，从显微图像中清楚地看出，在存在化合物nr.4、nr.5或nr.8条件下，肌管形成仍然完整，在较高洛吡莫德浓度下也如此(图10c、f、i)。类似地，图10(d、g、j)示出洛吡莫德对肌管融合具有浓度依赖性抑制作用。然而，在存在ck1抑制剂的条件下，洛吡莫德对肌管融合的抑制至少被部分阻止。这在其中p38抑制剂洛吡莫德的单一组合与浓度增加的ck1抑制剂组合的实验中也很明显(图10k、l、m)。洛吡莫德的融合抑制作用受ck1抑制剂的浓度依赖性抑制。
[0394]
实施例12：在存在p38抑制剂的条件下ck1抑制剂对dux4的抑制潜力保留
[0395]
当ck1抑制剂与浓度增加的洛吡莫德组合时，其不仅防止肌管融合受到抑制，而且还保留其抑制dux4的能力(图11a、b、c)。更重要的是，与单独的ck1抑制剂相比，用ck1抑制剂和p38抑制剂的组合处理原代fshd肌管诱导更强的dux4减少(图11a、b)。这对于化合物nr.8而言不太明显，因为其在没有p38抑制剂的情况下已经诱导了接近最大的dux4抑制(图11c)。
[0396]
实施例13：双重ck1/p38抑制剂抑制dux4表达而不影响肌管形成
[0397]
ck1抑制对肌管融合的保护作用从同样抑制p38的ck1抑制剂的概况中也清晰可见(表6)。如在图7g2中对于pf-670462所示的，这些双重抑制剂阻抑dux4而不抑制融合指数，说明它们不影响肌管形成。
[0398]
参考文献
[0399]
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