MEK抑制剂与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂的组合的制作方法

mek抑制剂与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂的组合
技术领域
1.本发明涉及能够显示一种或多种有益治疗效果的mek抑制剂与帽状结构依赖型核酸内切酶(cen)抑制剂(比如baloxavir marboxil)的组合。mek抑制剂可与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂一起用于预防和/或治疗病毒感染。与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂组合的mek抑制剂能够在病毒性疾病的治疗中显示出一种或多种改进的有益治疗效果。


背景技术：

2.rna或dna病毒的感染是对人类和动物健康的重大威胁。例如，流感病毒感染仍然属于人类的大流行病，并且每年造成大量的伤亡。就国民经济而言，例如由于无法胜任工作，它们是巨大的成本因素。主要影响马和羊，但也已经从人中分离并与神经系统疾病相关的博尔纳病病毒(bdv)的感染同样具有巨大的经济重要性。
3.控制特别是rna病毒的难题在于由病毒聚合酶的高错误率引起的病毒适应性，这使得合适疫苗的生产以及抗病毒物质的开发非常困难。此外，已经发现，尽管直接针对病毒功能的抗病毒物质的应用在治疗开始时显示出良好的抗病毒效果，但是这又快速导致基于突变的抗性变体的选择。一个实例是针对病毒跨膜蛋白的抗流感剂金刚烷胺及其衍生物。在应用后的短时间内，产生病毒的抗性变体。其它实例是抑制流感病毒表面蛋白神经氨酸苷酶的流感感染的新疗法，比如relenza。在患者中，已经发现relenza抗性变体(gubareva等，j infect dis 178,1257-1262,1998)。
4.现有技术的抗病毒活性物质的缺点在于它们要么针对病毒组分，因此迅速导致抗性(参见金刚烷胺)，要么以过于广泛和非特异性的方式对细胞因子起作用(例如甲基转移酶抑制剂)，并且预期有显著的副作用。
5.最近已经识别了一类新的抗病毒剂，帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂。这些抑制剂靶向帽状结构依赖型核酸内切酶(cen)，cen位于流感病毒聚合酶的pa亚基中，并在病毒mrna生物合成期间介导“帽抓取(cap-snatching)”过程。s-033188，也称为baloxavir marboxil，是一种有效的、选择性的cen小分子抑制剂，其已经在2018年10月以商品名被fda批准用于治疗流感。然而，已经报道了baloxavir marboxil的病毒抗性的第一类情况，并且预期这类情况适用于其它cen抑制剂。
6.由于非常小的基因组以及由此的复制所必需的功能的有限编码能力，所有病毒高度依赖于它们的宿主细胞的功能。通过对病毒复制所必需的细胞功能施加影响，有可能在感染细胞中负面地影响病毒复制。在这种情况下，病毒不可能通过适应，特别是通过突变来替代缺乏的细胞功能，以便由此摆脱选择压力。这已经在具有相对非特异性的细胞激酶和甲基转移酶抑制剂的甲型流感病毒中得到证实(scholtissek和m
ü
ller,arch virol 119,111-118,1991)。
7.本领域已知细胞具有多个信号传导通路，通过这些通路作用于细胞的信号被传递到细胞核中。因此，细胞能够对外部刺激作出反应，并通过细胞增殖、细胞活化、分化或受控的细胞死亡作出反应。这些信号传导通路的共同点是它们含有至少一种激酶，该激酶通过
磷酸化激活至少一种蛋白质，随后传导信号。当观察病毒感染后诱导的细胞过程时，发现大量dna和rna病毒优选在感染的宿主细胞中激活确定的信号传导通路，即所谓的raf/mek/erk激酶信号传递路径(benn等，j virol 70,4978-4985,1996；bruder和kovesdi,j virol 71,398-404,1997；popik和pitha,virology 252,210-217,1998；rodems和spector,j virol 72,9173-9180,1998)。该信号传导通路是细胞中最重要的信号传导通路之一，并且在增殖和分化过程中起重要作用。生长因子诱导的信号通过连续磷酸化从丝氨酸/苏氨酸激酶raf向双特异性激酶mek(map激酶/erk激酶)传导并最终传递至激酶erk(胞外信号调节激酶)。而作为raf的激酶底物，仅mek是已知的，并且将erk同种型识别为mek的唯一底物，erk能够磷酸化全部底物。这些属于例如转录因子，由此直接影响细胞基因表达(cohen,trends in cell biol 7,353-361,1997；robinson和cobb,curr.opin.cell biol 9,180-186,1997；treisman,curr.opin.cell biol 8,205-215,1996)。
8.鉴于现有技术，显然需要在病毒性疾病、特别是在由流感病毒引起的疾病的治疗中、特别是避免抗性形成有效的其它化合物和组合物。
9.在这方面，对mek抑制剂在治疗病毒性疾病、特别是流感中的有用性的持续研究已经揭示，这类化合物避免了标准抗病毒治疗的缺点，因为它针对宿主细胞的细胞组分而不是针对病毒本身。由于这个原因，没有观察到对mek抑制剂的抗性。wo 2001/076570提供了通过mek抑制剂的方式治疗或预防由(-)rna病毒，特别是由流感病毒引起的感染的概念。wo2014/056894提供了用于治疗或预防流感病毒感染的特异性mek抑制剂，比如azd-6244、azd-8330、rdea-119、gsk-1120212(trametinib)、gdc-0973(cobimetinib)、ci-1040、pd-0325901、ro-5126766、msc1936369(as-703026)。在wo 2015/173788a1中，公开了mek抑制剂，其用于治疗流感病毒和细菌共感染的方法中。此外，wo 2019/076947公开了一种新的mek抑制剂pd-0184264(也称为atr-002)，其用于预防和/或治疗病毒感染的方法中。
10.然而，仍然需要提供用于治疗和预防病毒感染的其它组合物和化合物。


技术实现要素：

11.在本发明中，发现在治疗或预防病毒感染中mek抑制剂与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂组合的使用导致了病毒感染的有效治疗。特别地，当将mek抑制剂pd-0184264与baloxavir marboxil一起施用时，观察到了协同效应。
12.在本发明的上下文中，mek抑制剂可以选自ci-1040、pd-0184264、gsk-1120212、gdc-0973、plx-4032、azd6244、azd8330、as-703026、rdea-119、ro-5126766、ro-4987655、pd-0325901、tak-733、as703026、pd98059和pd184352或其药学上可接受的盐或代谢物。在优选的组合中，所述mek抑制剂是ci-1040或pd-0184264，和所述帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂是baloxavir marboxil。
13.优选的用途是治疗或预防由负rna链病毒(比如流感病毒)引起的病毒感染。流感病毒可以是甲型流感病毒或乙型流感病毒。在本发明的上下文中，mek抑制剂可与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂同时、在其之前或之后施用。
14.还公开了一种用作药物，优选用于治疗或预防病毒性疾病(比如流感)的药物组合物，所述药物组合物包含mek抑制剂或其药学上可接受的盐或代谢物以及帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂。
附图说明
15.图1示出了oseltamivir和ci-1040与模拟对照相比针对流感病毒h1n1野生型(白色)和h1n1-h275y(灰色)的抗病毒活性。
16.图2a-b示出了oseltamivir和baloxavir marboxil与模拟对照相比针对流感病毒h1n1 wt(白色)和h11-pa-i38t(灰色)以及h3n2-wt(白色)和h3n2-pa-i38t(灰色)的抗病毒活性。
17.图3a-d示出了atr002和baloxavir marboxil之间的协同效应。在4x4基质(d)中测试mek抑制剂(atr002)与巴洛韦baloxavir marboxil(blxm)的组合，并将所有值标准化为模拟感染对照(dmso)。通过采用三种不同的协同作用模型处理数据的combenefit产生等高线图和曲面图：a)has；b)bliss和c)loewe。标记了协同得分高于25的区域。
18.图4a示出了以log(ci)为y轴对受影响的分数(fa)为x轴作图的协同/拮抗作用。
19.图4b示出了baloxavir marboxil(blxm)和atr002针对流感病毒的药物减低指数(drug reduction index)(dri)。
具体实施方式
20.以下描述包括可用于理解本发明的信息。但这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前请求保护的发明相关，也不是承认任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
21.如本文所用的“mek抑制剂”通过抑制mek(丝裂原活化蛋白激酶)来抑制细胞或受试者中的促有丝分裂的信号级联raf/mek/erk。这种信号级联被许多病毒(特别是流感病毒)劫用(hijacked)，以加强病毒复制。因此，在mek瓶颈处的raf/mek/erk通路的特异性阻断会损害病毒(尤其是流感病毒)的生长。另外，mek抑制剂在人体中显示出低毒性和小的不良副作用。也不存在诱导病毒抗性的倾向(ludwig,2009)。一种特别优选的mek抑制剂是pd-0184264，也称为atr-002。
22.优选地，mek抑制剂选自ci-1040、pd-0184264、gsk-1120212、gdc-0973、plx-4032、azd6244、azd8330、as-703026、rdea-119、ro-5126766、ro-4987655、pd-0325901、tak-733、as703026、pd98059和pd184352或其药学上可接受的盐或代谢物。这些mek抑制剂是本领域已知的，例如，在fremin和meloche(2010),j.hematol.oncol.11；3:8的表1中描述的那些。以下示出了pd-0184264和ci-1040的结构式作为参考：
[0023][0024]
2-(2-氯-4-碘苯氨基)-n-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺
[0025]
如本文所用的“代谢物”涉及mek抑制剂代谢的中间终产物，其在受试者(如在肝脏中)对mek抑制剂进行降解的过程中出现。在优选的实施方案中，mek抑制剂是ci-1040的代谢物，如pd-0184264是mek抑制剂ci-1040的代谢物。
[0026]“帽状结构依赖型核酸内切酶(cen)抑制剂”抑制位于由亚基pa、pb1和pb2组成的流感病毒异源三聚rna依赖性聚合酶的pa亚基的n-末端结构域中的cen。这对于病毒转录和复制是必需的。在'帽-抓取'过程中，通过pb2结合宿主mrna的帽状结构，然后通过经由cen的短帽寡核苷酸切割来开始病毒mrna合成。有趣的是，cen在流感病毒株中是非常保守的，因此被认为是理想的抗流感病毒药物靶标。
[0027]
在优选的实施方案中，cen抑制剂是baloxavir marboxil(以前也称为s-033188)，其是一种用于治疗流感的第一类抗病毒药物。口服施用后，baloxavir marboxil可以代谢成其与cen结合的活性形式(baloxavir酸)。以下结构式示出了baloxavir marboxil：
[0028][0029]
对于本发明的目的，如上定义的活性化合物(mek抑制剂和/或cen抑制剂)还包括其药学上可接受的盐。如本文所用的短语“药学上或美容上可接受的盐”意指对于所需施用形式而言安全且有效的本发明化合物的那些盐。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些以及与阳离子形成的那些，所述阴离子比如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，所述阳离子比如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
[0030]
如本文已经概述的，流感病毒(iv)感染仍是全世界公众健康问题。目前，所有可用的疫苗以及靶向病毒本身的抗病毒药物都倾向于产生抗性。已经证明，流感病毒能够调节和控制涉及病毒生命周期的细胞通路(如raf/mek/erk信号通路)，其vrnp的核输出强烈依赖于病毒诱导的活化。沿着这一思路，本发明人较早地证明了mek抑制剂pd0184264(atr002)(ci-1040的活性代谢物)在体外和体内水平上抗流感病毒的抗病毒潜力(实施例1，也参见wo 2019/076947)。已经证明，新许可的抗病毒药物(即所谓的baloxavir marboxil(xofluza)，其被设计为用于抑制帽状结构依赖型核酸内切酶蛋白)在包括奥司他韦抗性毒株的广泛的流感病毒中有效。然而，已经报道了针对新许可的药物的抗性变体的出现。
[0031]
如实施例1和图1所示，奥司他韦和ci-1040在对抗野生型(wt)甲型流感病毒株/密西西比/3/2001(h1n1)中是有效的。相反，当研究两种药物针对在神经氨酸酶(na)基因中具有h275y突变的突变流感毒株的抗病毒潜力时，观察到奥司他韦效力的显著降低。相比而言，ci-1040显示出与野生型毒株中观察到的相当的抗病毒效果。为了进一步评估atr002(ci-1040的活性代谢物)的潜在抗病毒活性，本发明人比较了atr002与被设计为抑制帽状结构依赖型核酸内切酶蛋白的新许可的抗流感病毒药物baloxavir marboxil(blxm)的抗病毒活性。如图2a所示，发现blxm对野生型流感rga/吉森(giessen)/6/09(h1n1-wt)非常有效，病毒滴度几乎完全降低，而atr002活性降低至13％。相比而言，当使用突变毒株rga/吉森/6/09(h1n1)-pa-i38t研究时，blxm活性降低至37％，但atr002显示出与野生型中发现的相同的效果。同样，当使用rga/维多利亚/3/75(h3n2-wt)和rga/维多利亚/3/75(h3n2-pa-i38t)研究抗病毒活性时(图2b)，atr002显示了其对两种变体的效力，而blxm在突变变体中丧失了其活性的约41％。
[0032]
鉴于最近许可的抗流感药物baloxavir marboxil和潜在的mek抑制剂(atr002)二者都可以被认为是流感治疗的治疗选择，本发明人在实施例2中研究了这两种药物的组合是否会增强抗病毒活性。当与blxm(0.008和0.04nm)组合时，在不同浓度的atr002(0.4、2和10μm)下抗病毒活性有惊人的增加，这通过与每种药物的单独治疗相比病毒滴度的降低来表明。此外，从chou-talalay模型可以推断，较低浓度的atr002和blxm的组合导致具有低ci值的强协同效应(图4)。这些数据与最广泛使用的模型(has、bliss和loewe)一致，这些模型也揭示了较高剂量的组合导致更强的累加效应而不是协同效应(图3a-c)。
[0033]
因此，本发明人惊奇地发现，mek抑制剂和cen抑制剂的组合施用在预防和/或治疗病毒性疾病中产生了意想不到的协同作用，特别是mek抑制剂和cen抑制剂的组合在抑制甲型流感病毒和/或乙型流感病毒中产生协同作用。实际上，如本文所示，可口服的并且处于i期临床试验的mek抑制剂ci-1040、pd-0184264、gsk-1120212、gdc-0973、plx-4032、azd6244、azd8330、as-703026、rdea-119、ro-5126766、ro-4987655、pd-0325901、tak-733、as703026、pd98059和pd184352(它们中的一些甚至处于ii期临床试验中或甚至被批准上市，例如针对癌症的plx-4032)与cen抑制剂(如baloxavir)组合表现出针对甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗病毒活性。组合治疗显著增加了巴洛沙韦的抗病毒活性，并导致了如通过本文所述的has、bliss和loewe方法所测定的协同抗病毒作用(图3)。总之，结果证明与mek抑制剂，特别是pd-0184264和ci-1040组合后，baloxavir的抗病毒活性增加。这些数据有望用于开发针对流感的新抗病毒方案的道路上的进一步的临床前体外和体内研究。
[0034]
因此，本发明人发现本发明的组合方法在预防和/或治疗病毒性疾病中，特别是在预防和/或治疗由负rna链病毒引起的感染中，更特别是在预防和/或治疗由流感病毒引起的病毒性疾病中提供协同作用。甚至更特别地用于在甲型流感病毒或乙型流感病毒中的预防和/或治疗。
[0035]
如上所述，本发明涉及一种mek抑制剂，其与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂组合用在预防和/或治疗病毒感染的方法中。本发明还涉及一种用作药物的药物组合物，其包含mek抑制剂或其药学上可接受的盐或代谢物和帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂。如实施例中所示，与帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂组合的mek抑制剂显示出令人惊讶的协同抗病毒作用。
[0036]
本发明的药物组合物可以以协同量施用。
[0037]
可以将“协同作用”或“协同效应”定义为一种大于累加的效应(chou,2006,pharmacolog reviews,58:621-681)。药物组合之间的协同相互作用是高度期望的且追求的，因为当临床使用时，它们可以导致增加的功效、降低的剂量、降低的副毒性和最小化的耐药性发展(chou,2006)。两种最常用的评估组合疗法中药物相互作用的方法是等效线图解法(isobologram)和组合指数(ci)(zhao等，2004,clinical cancer res 10:7994-8004)。在将药物组合用于抵抗耐药性的发展和使药物剂量最小化的癌症治疗领域和抗病毒治疗领域中的大量研究使用ci指数来评估协同作用。ci基于chou和talalay 1984(adv.enzyme regul.22:27-55)的方法，并依赖于中值效应原理和多药效应方程。使用程序compusyn(compusyn,paramus,n.j.)可以容易地计算ci。chou本人(chou 2006)定义了如果ci值为0.85-0.9则相互作用为轻微协同作用，如果ci值为0.7-0.85则为中度协同作用，如果ci值为0.3-0.7则为协同作用，如果ci值为0.1-0.3则为强烈协同作用，如果ci值＜0.1则
为非常强烈协同作用。在癌症治疗文献中，定义协同作用的ci值可以变化，例如在lin等，2007,carcinogenesis 28:2521-2529中将药物之间的协同作用定义为ci＜1，在fischel等，2006，preclinical report 17:807-813中将协同作用定义为ci＜0.8。在抗病毒治疗领域使用类似的数字。例如，在wyles等，2008,antimicrob agents chemotherapy 52:1862-1864中将协同作用定义为ci＜0.9，在gantlett等2007，2007,antiviral res 75:188-197中将协同作用定义为ci＜0.9。基于这些参考文献，可以将协同作用定义为ci值≤0.9。如实施例2所示，chou-talalay以及由combenefit软件计算的最高单一药剂(hsa)、bliss和loewe模型显示pd-0184264和baloxavir marboxil的组合的协同作用。最高单一药剂(hsa)、bliss和loewe模型在例如foucquier和guedj 2015(pharmacology research&perspectives 3(3):e00149)中进行了解释和综述。
[0038]
本发明的mek抑制剂和cen抑制剂在病毒性疾病的治疗中可具有协同效应，该协同效应大于单独或组合施用的mek抑制剂和cen抑制剂各自的累加作用，正如由两种药物的简单累加效应所预测的。在这种情况下，mek抑制剂的协同有效量小于如果mek抑制剂不与cen抑制剂一起施用时治疗病毒感染所需的量。类似地，cen抑制剂的协同有效量小于如果cen抑制剂不与mek抑制剂一起施用时治疗病毒感染所需的量。mek抑制剂和cen抑制剂的协同量可由协同因子(ci值)来定义。如果通过协同作用因子(ci值)定义，则ci小于约0.9，或者小于约0.85，或者小于约0.8，或者小于约0.75，或者小于约0.7，或者小于约0.65，或者小于约0.6，或者小于约0.55，或者小于约0.5，或者小于约0.45，或者小于约0.4，或者小于约0.35，或者小于约0.3，或者小于约0.25，或者小于约0.2，或者小于约0.15，或者小于约0.1。
[0039]
根据本发明的mek抑制剂和cen抑制剂的组合使用在其中病毒或病毒株显示出或已经发展出抗性、特别是对cen抑制剂的抗性的病毒性疾病的情况下也提供了有益的治疗效果。此外，组合使用可用于随时间推移保持两种药物的功效，因为根本观察不到抗性的发展或抗性的发展将随时间推移被延迟。
[0040]
作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的ci-1040组合用在本发明的方法和/或药物组合物中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的pd-0184264组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的gsk-1120212组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的gdc-0973组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的plx-4032组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的azd6244联合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的azd8330组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的as-703026组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的rdea-119组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的ro-5126766组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的baloxavir marboxil可以与作为mek抑制剂的ro-4987655组合用在本发明的治疗和/或药物组合物中的用途中。作为cen抑制剂的
marboxil或其药学上可接受的盐。
[0049]
在本发明的治疗中的用途的一个实施方案中，化合物mek抑制剂可以以有效治疗剂量口服或通过吸入施用，而(由于协同效应)cen抑制剂可以以批准的处方信息中提供的剂量和给药方案或更低、优选以更低的剂量施用。例如，根据baloxavir marboxil标签，baloxavir marboxil以40mg(40至80kg受试者体重)或80mg(大于80kg受试者体重)的胶囊形式施用。作为单次剂量的40mg或80mg的剂量是成人和青少年的标准剂量。当将baloxavir marboxil与mek抑制剂组合施用时，可以使用较低的剂量。在一个实施方案中，mek抑制剂的治疗有效量是，如0.1mg至2000mg、0.1mg至1000mg、0.1至500mg、0.1至200mg、30至300mg、0.1至75mg、0.1至30mg。
[0050]
在本文讨论的依次组合治疗中，优选地，依次组合的药物根据其药代动力学特性施用，使得第二药物在第一药物的血浆水平显著降低或去除后施用。mek抑制剂和cen抑制剂药物的药代动力学特性通常是本领域已知的。
[0051]
如上所述，本发明还提供了用作药物的药物组合物，其包含mek抑制剂或其药学上可接受的盐或代谢物以及帽状结构依赖型核酸内切酶抑制剂。在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物用于预防和/或治疗病毒感染，优选地由负rna链病毒引起的感染，更优选地由流感病毒引起的感染，和最优选地由甲型流感病毒或乙型流感病毒引起的感染。
[0052]
本发明的药物组合物可以是可口服施用的悬浮液或片剂；鼻腔喷雾剂、无菌注射制剂(静脉内、胸膜内、肌内)形式，例如作为无菌注射水性或油性混悬剂或栓剂。当以悬浮液口服施用时，这些组合物根据药物制剂领域可用的技术制备，并且可以含有用于赋予体积的微晶纤维素、作为悬浮剂的藻酸或藻酸钠、作为粘度增强剂的甲基纤维素和本领域已知的甜味剂/调味剂。作为速释片剂，这些组合物可以含有微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或本领域已知的其它赋形剂、粘合剂、增量剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。注射溶液或混悬液可以根据已知技术使用合适的无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(比如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液)或合适的分散剂或润湿剂和助悬剂(比如无菌、温和、不挥发的油，包括合成的单-或二甘油酯，和脂肪酸，包括油酸)来配制。本发明方法中的药物化合物可以以任何合适的单位剂型施用。在本发明的药物组合物的上下文中，合适的口服制剂也可以是片剂、胶囊、悬浮液、糖浆、口香糖、薄片(wafer)、酏剂等形式。药学上可接受的载体(比如粘合剂、赋形剂、润滑剂和甜味剂或调味剂)可以包括在口服药物组合物中。如果需要，还可以包括用于改变特殊形式的味道、颜色和形状的常规试剂。
[0053]
对于注射制剂，药物组合物可以是在合适的小瓶或管中的与合适的赋形剂混合的冻干粉末。在临床使用前，可通过将冻干粉末溶解在合适的溶剂系统中将药物重构以形成适于静脉内或肌内注射的组合物。
[0054]
在一个实施方案中，药物组合物可以是具有治疗有效量(如0.1mg至2000mg、0.1mg至1000mg、0.1至500mg、0.1至200mg、30至300mg、0.1至75mg、0.1至30mg)的mek抑制剂和治疗有效量的上述cen抑制剂的可口服施用的形式(如片剂或胶囊或糖浆等)。例如，根据baloxavir marboxil标签，baloxavir marboxil以40mg(40至80kg受试者体重)或80mg(大于80kg受试者体重)的胶囊形式施用。作为单次剂量的40mg或80mg的剂量是成人和青少年的标准剂量。当将baloxavir marboxil与mek抑制剂组合施用时，可以使用较低的剂量。
[0055]
每种活性化合物的治疗有效量可随包括但不限于以下的因素而变化：所用化合物的活性、活性化合物在患者体内的稳定性、待减轻病症的严重性、待治疗患者的总重量、施用途径、身体对活性化合物的吸收、分布和排泄的容易性、待治疗患者的年龄和敏感性、不良事件等，这些对本领域技术人员而言是显而易见的。所施用的量可以根据随时间推移的各种因素变化而调节。
[0056]
根据本发明的另一方面，提供了一种药物试剂盒，其在分隔的容器中包含(1)单剂量形式的mek抑制剂，比如pd-0184264、plx-4032、azd6244、azd8330、as-703026、gsk-1120212、rdea-119、ro-5126766、ro-4987655、ci-1040、pd-0325901、gdc-0973、tak-733、pd98059和pd184352，和(2)单剂量形式的cen抑制剂，比如baloxavir。任选地，该试剂盒还包括在根据本发明的组合治疗方法中使用该试剂盒的说明书。
[0057]
定义
[0058]
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括(comprise)”及其变体如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应理解为意指包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包括(comprising)”可以用术语“含有(containing)”替换，或者有时当在本文中使用时用术语“具有(having)”替换。
[0059]
当在本文中使用时，“由
…
组成”排除了未在在权利要求部分(claim element)中指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由
…
组成”未排除对权利要求的基本特征和新颖性特征没有实质影响的材料或步骤。在本文的各实施方式中，“包括(comprising)”、“基本上由
…
组成”和“由
…
组成”中的任何一个可用另外两个术语中的一个替换。
[0060]
如本文所用，将多个列举的元素(elements)之间的连词“和/或”理解为既包含个体也包含组合选项。例如，如果用“和/或”连接两个元素，第一种选项是指仅第一个元素适用而第二个元素不适用；第二种选项是指仅第二个元素适用而第一个元素不适用；第三种选项是指第一个元素和第二个元素一起适用。这些选项中的任一情况都可以理解为落入该含义中，因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。同时适用多个选项也可以理解为落入该含义中，因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。
[0061]
实施例
[0062]
实施例1：mek抑制剂与其它治疗(care)标准之间的比较
[0063]
试剂
[0064]
a549细胞(ccl-185
tm
)、0.3％triton-x-100、mdck ii细胞(crl-2936
tm
)、0.1％吐温20、磷酸缓冲盐水(pbs,gibco cat.no.:14190144)、pbs+10％fcs+0.1％吐温20、感染(infection)pbs、10％(roth,cat.no.:a146.1)
→
制备工作溶液4％、tpck-胰蛋白酶、第一抗体(抗-np；aa5h,cat.no.:mca400)、2x mem、第二抗体(过氧化物酶标记的抗小鼠抗体，cat.no.:115-035-003)、白蛋白级分v溶液、kpl true blue
tm
(cat.no.:5510-0049)、avicel 2.5％(rc-581,fmc biopolymer)。
[0065]
方法
[0066]
第1天
[0067]
1-平板接种两块24孔板
[0068]
a.细胞类型：a549
[0069]
b.接种密度：0.5
×
105细胞/ml
[0070]
2-温育24小时
[0071]
第2天
[0072]
3-检查所制备的24孔板的汇合
[0073]
4-移除培养基并用pbs洗涤2次
[0074]
病毒稀释
[0075]
5-进行病毒的十倍连续稀释(滴度：6.0
×
107pfu/ml)
[0076]
6-用0.001moi接种每孔
[0077]
7-温育45分钟
[0078]
测试物质的浓度的制备
[0079]
8-将tpck-胰蛋白酶以2μg/ml的终浓度添加至感染培养基
[0080]
atr002
[0081]-测试化合物：atr002
[0082]-溶剂：dmso
[0083]-浓度：储备溶液10mm，工作溶液：1mm
[0084]-制备以下浓度：感染培养基中50、10、2和0.4μm
[0085]
baloxavir marboxil
[0086]-测试化合物：baloxavir marboxil(blxm)
[0087]-浓度：储备溶液1mm，溶剂：dmso
[0088]-工作溶液：100nm
[0089]-制备以下浓度：感染培养基中1、0.2、0.04和0.008nm
[0090]
9-在4
×
4基质中制备组合
[0091]
10-在感染培养基中制备终浓度为1％的dmso对照品
[0092]
24孔板和测试物质
[0093]
11-温育后检查平板的汇合
[0094]
12-移除接种物
[0095]
13-将1ml每种浓度添加至各孔
[0096]
14-温育22小时
[0097]
制备96孔板
[0098]
15-制备十三块96孔板
[0099]
a.细胞类型：mdck ii
[0100]
b.接种密度：3
×
105细胞/孔
[0101]
16-温育24小时
[0102]
第3天
[0103]
24孔板和测试物质
[0104]
17-在eppendorf 1.5ml中，每个管中300μl，制备每种浓度的两份等分试样。将一份储存在-80℃
[0105]
制备96孔板(u型)
[0106]
18-通过在u形的每个孔中加入100μl感染pbs制备相同数量的预先制备的96孔板
[0107]
19-向每列的第一孔中加入50μl其相应的浓度。
[0108]-每个板具有与-ve和+ve对照相对应的两列
[0109]
20-向每个第一孔加入浓度后，通过从第一孔移出50μl到下一孔进行连续稀释。最后，弃去最后的50μl
[0110]
mdck ii 96孔板
[0111]
21-检查汇合
[0112]
22-移除生长培养基并用pbs洗涤2次
[0113]
23-将在u形96孔板中制备的稀释液转移到mdck ii板中
[0114]
24-温育1小时
[0115]
avicel覆盖物的制备
[0116]
25-mix 1:1 2x mem培养基和2x avicel
[0117]
26-以2μg/ml的终浓度加入tpck-胰蛋白酶
[0118]
27-在温育期之后，弃去接种物，并施加100μl/孔的avicel覆盖物
[0119]
28-温育22小时
[0120]
第4天
[0121]
固定和染色
[0122]
29-22小时后，在4℃下用4％多聚甲醛溶液固定30分钟，然后用pbs洗涤2次
[0123]
30-每孔加入100μl在pbs中制备的0.3％triton-x-100，并温育10分钟
[0124]
31-弃去它，然后加入100μl/孔的10％fcs(在pbs中新鲜制备的)
[0125]
32-在振荡器上温育10分钟
[0126]
33-将其弃去，然后加入50μl第一抗体(抗np；aa5h)
[0127]
34-在振荡器上温育60分钟
[0128]
35-用(pbs+0.1％吐温20)洗涤(3x)5分钟
[0129]
36-加入50μl第二抗体(过氧化物酶标记的抗小鼠抗体)
[0130]
37-在振荡器上温育30-60分钟
[0131]
38-用(pbs+0.1％吐温20)洗涤(3x)5分钟
[0132]
39-加入50μl true blue
tm
达10分钟
[0133]
40-用水洗涤，然后使其干燥
[0134]
41-进行数据分析
[0135]
结果
[0136]
如图1所示，奥司他韦和ci-1040都非常有效地对抗了野生型(wt)毒株a/密西西比/3/2001(h1n1)。相比而言，尽管证明了两种药物对在na基因中具有h275y突变的突变毒株的抗病毒潜力，但观察到奥司他韦效力显著降低，而ci-1040显示出与在野生型毒株中非常相似的相当的抗病毒效果。
[0137]
为了进一步评估atr002(ci-1040的活性代谢物)的潜在抗病毒活性，本发明人比较了atr002与被设计为抑制帽状结构依赖型核酸内切酶蛋白的新许可的抗流感病毒药物baloxavir marboxil(blxm)的抗病毒活性。如图2a所示，blxm对野生型rga/吉森/6/09
(h1n1-wt)非常有效，病毒滴度几乎完全降低，而atr002活性降低至13％。相比而言，当使用突变毒株rga/吉森/6/09(h1n1)-pa-i38t研究时，blxm活性降低至37％，但atr002显示出与在野生型中所发现的稳定的效果。同样，尽管使用rga/维多利亚/3/75(h3n2-wt)和rga/victoria/3/75(h3n2-pa-i38t)证明了抗病毒活性(图2b)，atr002显示了其针对两种变体的效力，而blxm丧失了其活性的约41％。
[0138]
实施例2：atr002和baloxavir marboxil之间的协同作用
[0139]
材料和方法
[0140]
药物
[0141]
在chemcon gmbh(德国，弗莱堡)合成了mek抑制剂atr-002(pd0184264)[2-(2-氯-4-碘苯氨基)-n-3,4-二氟苯甲酸，ci-1040的活性代谢物。
[0142]
自hyculec gmbh(cat:hy-109025)购买了baloxavir marboxil，其是流感病毒的帽状结构依赖型核酸内切酶，并根据制造商说明书将其制备为1mm的工作溶液。
[0143]
细胞和病毒
[0144]
人肺腺癌细胞(a549,ccl185
tm
)和madin-darby犬肾细胞(mdck ii,crl2936
tm
)购自atcc，并在补充了10％fbs和100u/ml青霉素-链霉素的iscove’s改良dulbecco’s培养基(imdm)中培养。
[0145]
将流感病毒h1n1用于0.001moi的病毒抑制实验
[0146]
病毒抑制测定
[0147]
通过在药物存在下测量ffu的减少来确定流感病毒对atr-002或其它药物(比如baloxavir marboxil)的敏感性。通过在补充有1μg/ml l-甲苯磺酰氨2-苯乙基氯甲基酮(tpck)-处理的胰蛋白酶的流感病毒感染培养基(补充有0.2％bsa、1mm mgcl2、0.5mm cacl2、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和2μg/ml tpck-处理的胰蛋白酶的dmem培养基)中进行5倍连续稀释，制备不同浓度(0.4-50μm)的atr-002和(0.008-1nm)的baloxavir marboxil。a549细胞(人肺腺癌细胞系(a549,ccl185
tm
))购自atcc，并在补充有10％fbs和100u/ml青霉素-链霉素的iscove’s改良dulbecco’培养基(imdm)中培养。将细胞保持在37℃和5％co2气氛中，并在24孔板中用h1n1感染，并温育45分钟。温育后，取出接种物，用pbs洗涤汇合单层，并补充含有测试药物的感染培养基。24小时后收集对应于每种处理的细胞培养物上清液，并使用mdck ii(madin-darby犬肾细胞(mdck ii,crl2936
tm
)，购自atcc并在补充有10％fbs和100u/ml青霉素-链霉素的iscove’s改良dulbecco’培养基(imdm)中培养的)进行焦点还原分析(focus reduction assay)。如前所述(matrosovich等，2006,virol j.31(3):63)将细胞保持在37℃和5％co2气氛中。
[0148]
来自组合研究的协同/拮抗作用的分析
[0149]
为了确定当使用pd0184264与baloxavir marboxil的组合时可能的累加和协同效应，首先使用combenefit软件(di veroli等，2016,bioinformatics32(18):2866-2868)分析了来自病毒抑制试验的数据，该combenefit软件使用三个已发布的模型(最高单一药剂(hsa)、bliss和loewe)同时评估协同/拮抗作用。
[0150]
还包括了每个单独化合物的剂量响应曲线，以产生参考模型的剂量响应曲面，然后将实验曲面与建模曲面进行比较。在每种组合下，将实验曲面与建模曲面的偏差归于百
分比得分，其指示协同(增加的效应)或拮抗(减少的效应)的程度。选择“等高线”和曲面”图作为协同分布的图形输出。
[0151]
还使用compusyn软件(chou,2010,cancer res 70(2):440-446)根据chou
–
talalay模型分析数据。软件计算每种药物组合的组合指数(ci)，其中ci值《1指示协同作用，ci＝1是累加性的，和ci》1指示拮抗作用。
[0152]
结果
[0153]
流感病毒(iv)感染是全世界公共卫生问题。目前，所有可用的疫苗以及靶向病毒本身的抗病毒药物都倾向于产生抗性。已经证明，流感病毒能够调节和控制涉及病毒生命周期的细胞通路(如raf/mek/erk信号通路)，其vrnp的核输出强烈依赖于病毒诱导的活化。沿着这一思路，本发明人更早地证明了mek抑制剂pd0184264(atr002)(ci-1040的活性代谢物)在体外和体内水平上抗流感病毒的抗病毒潜力(实施例1，也参见wo2019/076947)。近来，已经证明，新许可的抗病毒药物(即所谓的baloxavir marboxil(xofluza)，其被设计为用于抑制帽状结构依赖型核酸内切酶蛋白)在包括奥司他韦抗性毒株的广泛的流感病毒中有效。然而，已经报道了针对新许可的药物的抗性变体的出现。
[0154]
鉴于最近许可的抗流感药物baloxavir marboxil和潜在mek抑制剂(atr002)两者均作为治疗选择，本发明人研究了这两种药物的组合是否会增强抗病毒活性。令人惊讶地，当与blxm(0.008和0.04nm)组合时，在不同浓度的atr002(0.4、2和10μm)下的抗病毒活性增加，这通过与每种药物的单独治疗相比病毒滴度的降低来表明。此外，从chou-talalay模型可以推断，较低浓度的atr002和blxm的组合导致具有低ci值的强协同效应(参见图4a和表1)。如在药物剂量减少指数(dri)中所示的，表2和图4b也显示了强的协同效应。这些数据与最广泛使用的模型(has、bliss和loewe)一致，这些模型也揭示了较高剂量的组合产生更强的累加效应而不是协同效应(图3)。
[0155]
表1：药物组合的组合指数(ci)值
[0156][0157]
表2 blxm和atr002预测组合的药物剂量(dri)减少数据示例
[0158][0159]a与其经验估算不同的预测剂量
[0160]b未感染的感染细胞的分数或抑制效应