中脑多巴胺神经元的产生和分离方法与流程

中脑多巴胺神经元的产生和分离方法
1.相关应用的交叉引用
2.本技术要求于2019年8月29日提交的美国临时专利申请号：62/893674的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文，并且要求其优先权。
技术领域
3.本发明提供产生中脑多巴胺神经元(mda)及其前体的方法、由此方法产生的mda及其前体、以及包含此类细胞的组合物。本发明还提供mda及其组合物用于预防和/或治疗神经系统疾病的用途。本发明还提供使用新型表面标志物从细胞群中分离mda及其前体的方法。


背景技术：

4.以前，胚胎和体细胞干细胞被用作神经退行性疾病的治疗和模型系统。在中枢神经系统(cns)疾病领域，如亨廷顿病、阿尔茨海默症、帕金森病和多发性硬化症，已经出现了与胚胎和体细胞干细胞定向分化相关的研究和技术进展。然而，这些研究的结果表明，在体内几乎没有能力恢复神经元功能，并且常常导致患者体内不想要的肿瘤生长。
5.因此，仍然需要产生中脑多巴胺神经元的适合治疗神经退行性疾病(如帕金森病)的改进方法。


技术实现要素：

6.本发明提供产生中脑多巴胺神经元(mda)及其前体的方法、由此方法产生的mda及其前体，包含此类细胞的组合物，以及此类细胞和组合物用于预防和/或治疗神经疾病的用途。此外，本发明提供使用新型表面标志物从细胞群中分离mda及其前体的方法。
7.在某些实施方式中，本发明提供一种体外诱导干细胞分化的方法，包括：将干细胞与至少一种small mothers against decapentaplegic(smad)信号传导的抑制剂、至少一种音猬因子(shh)信号传导的激活剂、以及至少一种wingless(wnt)信号传导的激活剂接触；以及将所述细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(fgf)信号传导的激活剂接触，以获得表达至少一种指示中脑多巴胺神经元(mda)或其前体的标志物的分化细胞群，其中所述至少一种fgf信号传导激活剂选自fgf18、fgf17、fgf8a、及其组合。
8.在某些实施方式中，本发明提供一种体外诱导干细胞分化的方法，包括：将干细胞与至少一种smad(small mothers against decapentaplegic)信号传导的抑制剂、至少一种音猬因子(shh)信号传导的激活剂、以及至少一种wingless(wnt)信号传导的激活剂接触；以及将所述细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(fgf)信号传导的激活剂接触，以获得表达至少一种指示中脑多巴胺神经元(mda)或其前体的标志物的分化细胞群，其中，所述细胞与至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天。
9.在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂接触至少约1
天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂接触多达约15天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂接触约5天。
10.在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天。
11.在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起约10天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起12天。
12.在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂接触约5天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂接触7天。
13.在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种所述shh信号传导的激活剂接触约5天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种shh信号传导的激活剂接触7天。
14.在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种wnt信号传导的激活剂接触约10天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种wnt信号传导的激活剂接触12天。
15.在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度从其与所述干细胞的初始接触起约4天增加。在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度比所述至少一种wnt信号传导的激活剂的初始浓度增加约300％至约1000％。在某些实施方式中，将所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约3μm到10μm的浓度。在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约3μm的浓度。在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约7.5μm的浓度。
16.在某些实施方式中，所述至少一种fgf信号传导的激活剂包括fgf18。
17.在某些实施方式中，所述至少一种smad信号传导的抑制剂选自tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂、骨形态发生蛋白(bmp)信号传导的抑制剂、及其组合。
18.在某些实施方式中，所述至少一种tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂包含alk5的抑制剂。
19.在某些实施方式中，所述至少一种tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂包含sb431542、或其衍生物、或其混合物。在某些实施方式中，所述sb431542的衍生物为a83-01。在某些实施方式中，所述至少一种tgfβ/activin-nodal信号传导的抑制剂包含sb431542。
20.在某些实施方式中，所述至少一种bmp信号传导的抑制剂包含ldn193189、noggin、多索吗啡(dorsomorphin)、其衍生物、或其混合物。在某些实施方式中，所述bmp的至少一种抑制剂包含ldn-193189。
21.在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号传导的激活剂包含糖原合成酶激酶3β(gsk3β)信号传导的抑制剂。
22.在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号的激活剂选自chir99021、bio、chir98014、锂、3f8、wnt3a、wnt1、wnt5a、其衍生物、及其混合物。在某些实施方式中，所述至少一种wnt信号的激活剂包含chir99021。
23.在某些实施方式中，所述至少一种shh信号的激活剂选自shh蛋白质、平滑激动剂(sag)、其衍生物、及其混合物。在某些实施方式中，所述shh蛋白质包含重组shh、纯化shh、或前述的组合。
24.在某些实施方式中，所述重组shh包含与小鼠音猬因子n端片段具有至少约80％同一性的重组蛋白质。在某些实施方式中，所述重组shh包含shh c25ⅱ。在某些实施方式中，所述sag包含嘌吗啡胺(purmorphamine)。
25.在某些实施方式中，所述至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物选自en1、otx2、th、nurr1、foxa2、pitx3、lmx1a、lmo3、snca、adcap1、chrna4、girk2、及其组合。
26.在某些实施方式中，从所述干细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的起始接触起约10天，所述分化细胞具有可检测水平的至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物表达。
27.在某些实施方式中，从所述干细胞与所述至少一种smad信号传导的抑制剂的起始接触起约30天，所述分化细胞具有可检测水平的en1表达。在某些实施方式中，从所述干细胞与至少一种smad信号传导的抑制剂的起始接触起约40天，所述分化细胞具有可检测水平的en1表达。
28.在某些实施方式中，所述分化细胞不表达选自以下的至少一种标志物：pax6、emx2、lhx2、sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、phox2a、barhl、barhl2、gbx2、hoxa2、hoxb2、pou5f1、nanog、及其组合。
29.在某些实施方式中，所述方法还包括使分化细胞群经受有利于中脑多巴胺神经元前体向中脑多巴胺神经元分化的条件。
30.在某些实施方式中，所述条件包括将细胞暴露于以下中的至少一种：脑源性神经营养因子(bdnf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、环磷酸腺苷(camp)、转化生长因子β3(tgfβ3)、抗坏血酸(aa)和dapt。
31.在某些实施方式中，所述干细胞选自人类、非人灵长类或啮齿类非胚胎干细胞；人类、非人灵长类或啮齿类胚胎干细胞；人类、非人灵长类或啮齿类诱导多潜能干细胞；以及人类、非人灵长类或啮齿类重组多潜能干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是人类干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是多潜能或多能干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是多潜能干细胞。在某些实施方式中，所述多潜能干细胞选自胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、及其组合。
32.在另一方面，本发明提供体外分化细胞的细胞群，其中所述体外分化细胞通过任何前述方法获得。
33.在另一方面，本发明提供体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％的细胞表达至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物，并且不到约50％的分化细胞表达至少一种选自以下的标志物：pax6、emx2、lhx2、sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、phox2a、barhl1、barhl2、gbx2、hoxa2、hoxb2、pou5f1、nanog、及其组合。在某些实施方式中，所述至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物选自en1、otx2、th、nurr1、foxa2、lmx1a、pitx3、lmo3、snca、adcap1、chrna4、girk2。
34.在另一方面，本发明提供一种包含本文所公开的细胞群的组合物。在某些实施方式中，所述组合物是进一步包含药学上可接受载体的药物组合物。
35.在另一方面，本发明提供一种从细胞群中分离中脑多巴胺神经元及其前体的方法，包括分离不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物而表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。
36.在另一方面，本发明提供一种从细胞群中分离中脑多巴胺神经元及其前体的方法，包括分离以下细胞：(a)不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物或表达与细胞群中至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的至少一种阴性表面标志物；而(b)表达与细胞群中至少一种阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的至少一种阳性表面标志物。
37.在某些实施方式中，所述至少一种阳性表面标志物选自cd171、cd184、及其组合。在某些实施方式中，所述至少一种阳性表面标志物包含cd184。在某些实施方式中，所述至少一种阴性表面标志物选自cd49e、cd99、cd340、及其组合。在某些实施方式中，所述至少一种阴性表面标志物包含cd49e。在某些实施方式中，所述方法包括分离不表达可检测水平的cd49e而表达可检测水平的cd184的细胞。
38.在某些实施方式中，所述方法包括分离不表达可检测水平的cd49e或表达与细胞群中cd49e的平均表达水平相比降低水平的cd49e；而表达与细胞群中cd184的平均表达水平相比增加水平的cd184的细胞。
39.在另一方面，本发明提供体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％的细胞表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物，而不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物。
40.在另一方面，本发明提供体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％的细胞表达与细胞群中至少一种阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的至少一种阳性表面标志物；而不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物或表达与细胞群中至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的至少一种阴性表面标志物。
41.在某些实施方式中，所述至少一种阳性表面标志物选自cd171、cd184、及其组合。在某些实施方式中，所述至少一种阳性表面标志物包含cd184。在某些实施方式中，所述至少一种阴性表面标志物选自cd49e、cd99、cd340、及其组合。在某些实施方式中，所述至少一种阴性表面标志物包含cd49e。在某些实施方式中，所述至少一种阳性表面标志物包含cd184，且所述至少一种阴性表面标志物包含cd49e。
42.在另一方面，本发明提供包含本文所公开的细胞群的组合物。在某些实施方式中，本文公开的组合物是还包含药学上可接受载体的药物组合物。在另一方面，本发明提供用于诱导干细胞向中脑多巴胺神经元或其前体分化的试剂盒，其包括：(a)至少一种smad信号传导的抑制剂；(b)至少一种shh信号传导的激活剂；(c)至少一种wnt信号传导的激活剂；和(d)至少一种fgf信号传导的激活剂。
43.在某些实施方式中，所述试剂盒还包括(f)用于将干细胞诱导分化为表达至少一种中脑da前体标志物的分化细胞群的说明。
44.在另一方面，本发明提供预防和/或治疗受试者中神经退行性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的以下物质之一：(a)本文公开的细胞群；或(b)本文公开的组合物。
45.在某些实施方式中，所述神经退行性疾病是帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症或多发性硬化症。
46.在某些实施方式中，本文公开的细胞群或本文公开的组合物用于预防和/或治疗受试者中的神经退行性疾病。在某些实施方式中，所述神经退行性疾病是帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症或多发性硬化症。
附图说明
47.图1显示使用wnt-boost方案从第3天到第30天在干细胞源性mda和前体中的en1表达。
48.图2描绘结合使用fgf8b和wnt-boost方案的方案。
49.图3显示en1蛋白以fgf8b接触持续时间依赖性方式维持在分化细胞中。表达en1的细胞也表达foxa2和lmx1a。
50.图4a-4b显示在第30天通过qrt-pcr测量的分化细胞的mrna表达水平。图4a显示en1的mrna表达水平以fgf8b的接触持续时间依赖性方式维持，并且foxa2、nurr1和th的表达水平在所有条件下都可比。图4b显示以fgf8b接触持续时间依赖性方式诱导的非mda标志物(例如sma和six1)的mrna表达水平。
51.图5显示fgf8b处理的细胞在分化第30天的six1免疫染色。
52.图6显示分化第16天fgfs处理的细胞中标志物的mrna表达。
53.图7显示分化第16天fgf8b和fgf18处理的细胞中标志物的免疫染色。
54.图8显示在分化的第27天和第40天，fgf8b和fgf18处理的细胞中标志物的rna表达。
55.图9a是显示nurr1::gfp报告子hpsc的供体载体结构的示意图。
56.图9b显示使用wnt-boost方案从hpsc分化的细胞中的nurr1mrna水平。
57.图9c显示分化第25天从h9-hpsc和nurr1::gfp hpsc分化的中脑da神经元的facs结果。
58.图10a显示在分化第25天和第40天分离的nurr1:gfp阳性细胞中的单细胞qrt pcr结果。
59.图10b显示在分化第60天表达th、foxa2和nurr1的nurr1分选的mda的免疫染色。在第25天对细胞进行分选，然后持续培养至第60天。
60.图11提供在细胞注射到免疫缺陷小鼠体内8周后的体内移植的nurr1::gfp阳性中脑da神经元的免疫染色图像。
61.图12提供按照wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18(第12天-第16天)方案培养的nurr1:gfp阳性细胞的免疫染色图像。在第25天对细胞进行分选，然后持续培养至第40天。
62.图13a提供按照wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18(第12天-第16天)方案培养的nurr1:gfp阳性细胞中foxa2、en1和nurr1mrna的表达。对分选细胞和未分选细胞的mrna表达进行比较。
63.图13b显示按照wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18(第12天-第16天)方案培养的分选的nurr1:gfp阳性细胞被移植到免疫缺陷小鼠中。检测磨碎的细胞中的神经突起长出和th和sc121表达。
64.图14显示在使用wnt-boost方案从nurr1::gfp hpsc分化的第25天的mda中筛选出390种表面标志物。抗体与pe、fitc或apc共轭。
65.图15a显示阳性表面标志物cd171和cd184在nurr1
+
细胞中富集。
66.图15b提供使用wnt-boost方案的分化细胞中cd171和cd184的rna表达。
67.图16a显示阴性表面标志物cd49e、cd99和cd340在nurr1
+
细胞中富集。
68.图16b提供使用wnt-boost方案的分化细胞中cd49e、cd99和cd340的rna表达。
69.图17提供按cd49e弱或cd49e高分选的细胞形态。在wnt-boost和wnt-boost+fgf18方案下体外分化的第25天，对细胞进行分选。分选后，细胞再培养15天。
70.图18显示按照wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18方案体外分化第40天分选的cd49e弱细胞的免疫染色图像。
71.图19显示衍生自hpsc细胞系mel1的mda的基于cd49e纯化的facs分选结果。
72.图20显示按cd49e弱或cd49e高分选的mel1-hpsc衍生mda细胞的形态。在wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18方案下体外分化的第25天，对细胞进行分选。分选后，细胞再培养15天。
73.图21显示在wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18方案下体外分化后第40天mel1-hpsc衍生的cd49e弱mda的免疫染色图像。在第25天对cd49e弱细胞进行分选。
74.图22显示在wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18方案下体外分化后第40天mel1-hpsc衍生的cd49e弱mda中的相对mrna表达。在第25天对cd49e弱细胞进行分选。
75.图23显示在wnt boost+fgf18方案下体外分化第40天cd49e、cd99或cd340分选细胞的形态。在体外分化的第25天对细胞进行分选。
76.图24显示在wnt boost+fgf18方案下体外分化第40天cd49e、cd99或cd340分选细胞的相对mrna表达。在体外分化的第25天对细胞进行分选。
77.图25显示在wnt-boost方案下体外分化的第25天，按照49e(pe)和171(apc)分选的nurr1+细胞的facs分选结果。
78.图26显示在wnt-boost方案下体外分化的第25天，按照49e(pe)和184(apc)分选的nurr1+细胞的facs分选结果。
79.图27提供按cd49e、cd171、cd188分选的细胞形态。细胞在wnt-boost方案下体外分化的第25天进行分选。分选后，细胞再培养2天。
80.图28显示按cd49e、cd171、cd188分选的细胞的mrna表达。细胞在wnt-boost方案下体外分化的第25天进行分选。分选后，细胞再培养2天。
81.图29显示在体外分化的第25天，单cd49e弱分选细胞中nurr1::gfp群体的富集。
82.图30显示在体外分化的第25天，cd49e弱cd184高双分选细胞中nurr1:gfp群体的富集。
83.图31显示th
+
中脑da神经元共表达有foxa2和gfp，这暗示在图30中富集的nurr1:gfp群体中的中脑da神经元身份。
84.图32显示在体外分化的第25天，按cd49e和cd184分选的细胞内中脑da标志物mrna的表达。分选后，细胞在体外再培养15天。
85.图33显示在体外分化的第25天，按cd49e和cd184分选的细胞中非中脑da mrna的表达。分选后，细胞在体外再培养10天。
86.图34a-34d显示在wnt-boost方案下体外分化后，用本公开的cd标志物(cd49e缺失和cd184丰富)分选的移植细胞的体内存活率。图34a显示与未分选细胞相比，在移植物中已分选细胞的稳健存活和th
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细胞的富集。图34b显示移植后一个月sox2
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前体和ki67
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分裂细胞的数量减少。图34c显示图34b中sox2
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染色细胞的定量。图34d显示图34b中ki67
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细胞的定量。
87.图35a-35b显示在wnt-boost和wnt-boost+fgf18方案下分化的细胞的体内存活和
en1表达。图35a显示表达en1的细胞的百分比。图35b显示在移植部位纹状体神经支配纤维的出现。
具体实施方式
88.本发明提供用于生成mda及其前体的方法、通过此类方法生成的mda及其前体、包含此类细胞的组合物，以及其用于预防和/或治疗神经疾病的用途。此外，本发明提供使用新型表面标志物从细胞群中分离mda及其前体的方法。
89.本发明至少基于以下发现：由本发明方法产生的干细胞衍生的mda具有en1的持续表达，例如，en1的表达在mda的整个发育和成熟过程中维持。
90.本说明书和示例描述了本公开主题的非限制性实施方式。
91.为了明确披露而非限制，详细说明分为以下小节：
92.5.1.定义；
93.5.2.干细胞的分化方法；
94.5.3.分离中脑da神经元及其前体的方法；
95.5.4.包含中脑da神经元及其前体的组合物；
96.5.5.神经退行性疾病的治疗方法；和
97.5.6.试剂盒
98.5.1.定义
99.本说明书中使用的术语在本领域内、在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有其普通含义。在下文或说明书中的其他地方对某些术语进行讨论，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们时为从业者提供额外的指导。
100.术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以指在3个或3个以上的标准偏差内。或者，“约”可以指高达给定值的20％的范围，例如，高达10％、高达5％、或高达1％。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在一个数量级内，例如，在一个值的5倍或2倍内。
101.如本文所用，术语“信号传导”在关联“信号转导蛋白”时是指被与膜受体蛋白结合的配体或一些其他刺激因子激活或者受到另外的影响的蛋白。信号转导蛋白的实例包括但不限于smad、wingless(wnt)复合蛋白(包括β-连环蛋白)、notch、转化生长因子β(tgfβ)、activin、nodal、糖原合成酶激酶3β(gsk3β)蛋白、骨形态发生蛋白(bmp)和成纤维细胞生长因子(fgf)。对于许多细胞表面受体或内部受体蛋白质，配体-受体相互作用与细胞响应无直接联系。在产生配体对细胞行为的最终生理效应之前，配体激活的受体必须首先与细胞内部的其他蛋白相互作用。通常，若干相互作用的细胞蛋白质的链的行为在受体激活或抑制之后发生变化。受体激活引起的整个细胞变化称为信号传导机制或信号传导通路。
102.如本文所用，术语“信号”指控制细胞结构和功能变化的内部和外部因素。它们的性质可以是化学的或物理的。
103.如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子和蛋白质，例如转化生长因子β(tfgp)、activin、nodal、骨形态发生蛋白(bmp)等。
104.如本文所用的“抑制剂”指干扰(如降低、减少、抑制、消除或阻断)分子或通路信号
传导功能的化合物或分子(如小分子、肽、拟肽、天然化合物、sirna、反义核酸、适配体或抗体)。例如，抑制剂可以是改变指定蛋白质(信号传导分子、与指定的信号传导分子有关的任何分子、指定相关分子，例如糖原合成酶激酶3β(gsk3β))的任何活性的任何化合物或分子(例如，包括但不限于本文所述的信号传导分子)，例如，通过直接接触smad信号传导，接触smad mrna，引起smad构象变化，降低smad蛋白水平，或干扰smad与信号传导伙伴(例如，包括本文所述的那些)的相互作用，和影响smad靶基因(例如，本文所述的那些)的表达。
105.抑制剂还包括间接调节生物活性(例如smad生物活性)的分子，通过拦截上游信号传导分子(例如，在胞外结构域内，信号传导分子和效应子的示例包括：隔绝骨形态发生蛋白的noggin，抑制alk受体1、2、3和6的激活，从而阻止下游smad激活。同样，chordin、cerberus、follistatin也类似地隔绝smad信号传导的胞外激活剂。bambi是一种跨膜蛋白，也可以作为一种假受体来隔绝胞外tgfβ信号传导分子)。阻断上游或下游蛋白质的抗体可考虑用于使蛋白质信号传导的胞外激活剂等无效。抑制剂描述为竞争抑制(以排除或减少另一已知结合化合物结合的方式结合活性位点)和变构抑制(以干扰化合物与蛋白质活性部位结合的方式与蛋白质结合，从而改变蛋白质构象)以及通过结合并影响指定信号传导分子上游的分子进而导致对指定分子的抑制而引起的抑制。抑制剂可以是通过实际接触信号传导靶标来抑制信号传导靶标或信号传导靶向通路的“直接抑制剂”。
[0106]“激活剂”，如本文所用，是指增加、诱导、刺激、激活、促进或增强分子或通路(例如wnt信号传导、shh信号传导等)的信号传导功能的化合物。
[0107]
如本文所用，术语“wnt”或“wingless”在关联配体时是指一组能够与wnt受体例如frizzled和lrpderailed/ryk受体家族中的受体相互作用的分泌蛋白(即人中的integration 1)。如本文所用，术语“wnt或wingless信号传导通路”是指由wnt家族配体和wnt家族受体(例如frizzled和lrpderailed/ryk受体)组成的由或不由β-连环蛋白介导的信号传导通路。在某些实施方式中，所述wnt信号传导通路包括由β-连环蛋白(例如wnt/-连环蛋白)介导。
[0108]
如本文所用，术语“衍生物”指具有类似核心结构的化合物。
[0109]
如本文所用，术语“细胞的群体”或“细胞群”指至少两个细胞组成的组。在非限制性示例中，细胞群可包括至少约10个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个细胞。所述群体可以是包含一种细胞类型的纯群体，例如中脑da前体的群体或未分化干细胞群体。或者，群体可以包括一种以上的细胞类型，例如混合细胞群体。
[0110]
如本文所用，术语“干细胞”是指具有在培养中无限期分裂并产生特化细胞的能力的细胞。
[0111]
如本文所用，术语“胚胎干细胞”和“esc”是指源自植入前阶段胚胎的原始(未分化)细胞，其能够在培养中长时间分裂而不分化，并且已知发育为三个初级生殖层的细胞和组织。人类胚胎干细胞是指来自人类胚胎的胚胎干细胞。如本文所用，术语“人类胚胎干细胞”或“hesc”是指从早期人类胚胎(包括胚泡期)衍生的一种多潜能干细胞，其能够在培养过程中无需长时间分化而分裂，并发育成三个初始生殖层的细胞和组织。
[0112]
如本文所用，术语“胚胎干细胞系”指在体外条件下培养的胚胎干细胞群，其允许增殖而不分化达数天、数月至数年。
[0113]
如本文所用，术语“全能性”指产生身体所有细胞类型以及构成胚胎外组织(如胎盘)的所有细胞类型的能力。
[0114]
如本文所用，术语“多能”是指发育成一种以上身体细胞类型的能力。
[0115]
如本文所用，术语“多潜能”是指发育为生物体的三个发育胚层(包括内胚层、中胚层和外胚层)的能力。
[0116]
如本文所用，术语“诱导多潜能干细胞”或“ipsc”是指通过引入某些胚胎基因(例如但不限于oct4、sox2和klf4转基因)到体细胞中而形成的一种多潜能干细胞(例如，参见takahashi和yamanaka cell 126,663-676(2006)，本文通过引用并入本文)。
[0117]
如本文所用，术语“体细胞”指除配子(卵子或精子)以外的身体中的任何细胞；有时被称为“成体”细胞。
[0118]
如本文所用，术语“体细胞(成体)干细胞”是指在许多器官和分化组织中发现的相对罕见的未分化细胞，其自我更新(实验室)和分化能力有限。
[0119]
如本文所用，术语“神经元”指神经细胞，即神经系统的主要功能单元。神经元由一个细胞体及其突起(一个轴突和至少一个树突)组成。神经元通过在突触上释放神经递质将信息传递给其他神经元或细胞。
[0120]
如本文所用，术语“增殖”指细胞数量的增加。
[0121]
如本文所用，术语“未分化”指尚未发育成特殊细胞类型的细胞。
[0122]
如本文所使用的，术语“分化”是指未特化的胚胎细胞获得特化细胞(例如神经元、心脏、肝脏或肌肉细胞)特征的过程。分化由细胞基因与细胞外的物理和化学条件之间的相互作用控制，通常通过涉及嵌在细胞表面中的蛋白质的信号传导通路而控制。
[0123]
如本文所用，术语“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化为特定(例如，所需的)细胞类型，例如神经、神经嵴、颅板和非神经外胚层前体。在干细胞中，“定向分化”指的是利用小分子、生长因子蛋白和其他生长条件，促进干细胞从多能状态过渡到更成熟或更特殊的细胞命运。
[0124]
如本文所用，关于细胞的术语“诱导分化”指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变为非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导干细胞分化”是指诱导干细胞(如人类干细胞)分裂成具有不同于干细胞特征的子代细胞，例如基因型(例如，通过基因分析(例如微阵列)确定的基因表达变化)和/或表型(例如，mda或其前体的蛋白质标志物的表达变化，例如en1、otx2、th、nurr1、foxa2、lmx1a、pitx3、lmo3、snca、adcap1、chrna4和girk2)。
[0125]
如本文所用，术语“细胞培养”指细胞在用于研究或医疗的人工培养基中体外生长。
[0126]
如本文所用，术语“培养基”指覆盖培养容器中的细胞的液体，例如陪替氏平皿、多孔培养皿等，并包含营养物质以滋养和支持细胞。培养基中还可以添加生长因子，以在细胞中产生所需的变化。
[0127]
如本文所用，术语用化合物(例如，至少一种抑制剂、激活剂和/或诱导剂)与一个或多个细胞“接触”是指在允许所述一个或多个细胞接触所述化合物的位置提供所述化合物。可使用任何合适的方法完成接触。例如，可通过将浓缩形式的化合物添加到细胞或细胞群(例如在细胞培养的环境中)以达到所需浓度来实现接触。接触也可以通过将化合物作为配方培养基的成分来实现。
[0128]
如本文所用，术语“体外”指人工环境以及在人工环境中发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养。
[0129]
如本文所用，术语“体内”指的是自然环境(例如动物或细胞)以及在自然环境中发生的过程或反应，如本文所用的胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。
[0130]
如本文所用，关于基因或蛋白质的术语“表达”指制造可以使用诸如微阵列分析、抗体染色分析等分析来观察的mrna或蛋白质。
[0131]
如本文所用，术语“标志物”或“细胞标志物”指识别特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。一个细胞的标志物可以不限于一个标志物，标志物可以指代标志物的“模式”，使得指定的标志物组可以区分一个细胞或细胞类型和另一个细胞或细胞类型。
[0132]
如本文所用，当提及本文所公开的任何细胞时，术语“衍生自”或“建立自”或“分化自”指从细胞系中的(例如，分离的、纯化的等)最终母细胞获得的细胞，组织(例如分离的胚胎，或使用任何操作的液体，例如，但不限于，单细胞分离、体外培养、(使用例如蛋白质、化学物质、辐射、病毒感染、dna序列转染，例如使用形态发生素等的)处理和/或诱变、(例如通过连续培养)筛选包含在培养的母细胞中的任何细胞。衍生的细胞可以通过对生长因子、细胞因子的响应，对细胞因子处理的选择进展，粘着性，缺乏粘着性，分选过程等从混合群体中选择。
[0133]
本文中的“个体”或“主体”是脊椎动物，例如人类或非人类动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、非人灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人类动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；羊；猪；山羊；牛；马；以及非人灵长类动物，如猿类和猴子。
[0134]
如本文所用，术语“疾病”指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何症状或病症。
[0135]
如本文所使用的，术语“治疗”或“医治”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗性效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态、和缓和或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止由于受影响或所诊断的受试者或疑似患有该病症的受试者的病症导致的恶化，而且治疗也可以预防处于病症或疑似患有病症风险的受试者中病症或者病症症状的发作。
[0136]
如本文所用，术语“阴性”、“弱”或
“‑”
关于本文所公开的任何表面标志物使用时，指表面标志物(例如，cd49e)未以可检测水平表达，或与从中选择或分选细胞的细胞群中表面标志物的平均表达相比，在细胞中的表达水平降低。如本文所用，术语“高”、“强”、“+”、“阳性”关于本文所公开的任何表面标志物使用时，指与细胞群中表面标志物的平均表达相比，表面标志物(例如，cd184)以可检测水平表达或以增加的水平表达。
[0137]
在某些实施方式中，如本领域技术人员或普通技术人员所知，根据细胞表面标志物表达水平，基于染色强度中容易识别的差异来区分细胞。在某些实施方式中，可以根据观察到的所有细胞的染色强度分布(例如，荧光强度分布)来设置用于将细胞指定为表面标志物“弱”、“阴性”或
“‑”
细胞的截止线，其中低于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、或约5％的染色强度的细胞被指定为表面标志物“弱”、“阴性”或
“‑”
细胞。在某些实施方式中，
可以根据观察到的所有细胞的染色强度分布(例如，荧光强度分布)来设置用于将细胞指定为表面标志物“强”、“高”、“+”细胞的截止线，其中高于约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的染色强度的细胞被指定为表面标志物“强”、“高”、“+”或“阳性”细胞。在某些实施方式中，获得所有细胞的表面标志物染色的频率分布，并且群体曲线适合较高染色和较低染色的群体，以及根据对各自种群分布的统计分析，分配给它们在统计上最可能属于的种群的细胞。
[0138]
5.2.干细胞的分化方法
[0139]
本发明提供诱导干细胞分化的方法，包括将干细胞与至少一种small mothers against decapentaplegic(smad)信号传导的抑制剂(称为“smad抑制剂”)、至少一种音猬因子(shh)信号传导的激活剂(称为“shh激活剂”)、以及至少一种wingless(wnt)信号传导的激活剂(称为“wnt激活剂”)接触；以及进一步将所述细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(fgf)信号传导的激活剂(称为“fgf激活剂”)接触，以获得包含表达至少一种指示mda或mda前体的标志物的分化细胞的细胞群。
[0140]
在某些实施方式中，所述至少一种fgf激活剂能够促进中脑发育。在某些实施方式中，所述至少一种fgf激活剂选自fgf8a、fgf17、fgf18、fgf2和fgf4。在某些实施方式中，所述至少一种fgf激活剂选自fgf8a、fgf17和fgf18。在某些实施方式中，所述至少一种fgf激活剂包含fgf18。
[0141]
在某些实施方式中，所述细胞与至少一种fgf信号传导的激活剂的初始接触是从所述细胞与至少一种smad信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天。在某些实施方式中，所述细胞对至少一种fgf激活剂的初始暴露是从所述干细胞对至少一种smad抑制剂的初始暴露起至少约10天。在某些实施方式中，所述fgf激活剂选自fgf8a、fgf17、fgf18、fgf8b、fgf2和fgf4。将细胞暴露于至少一种fgf激活剂可延长分化细胞的en1表达。
[0142]
在某些实施方式中，指示mda或mda前体的至少一种标志物选自en1、fox1a、lmx1a、otx2、nurr1、th、pitx3、lmo3、snca、adcap1、chrna4和girk2。
[0143]
在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度在其暴露于细胞期间增加。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂浓度从所述干细胞初始暴露于所述至少一种smad抑制剂约4天开始增加。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度增加约300％至约1000％。在某些实施方式中，将所述细胞暴露于具有增加后浓度的至少一种wnt激活剂至少约7天。在某些实施方式中，添加至少一种额外的wnt激活剂以增加wnt激活剂的总浓度。
[0144]
在某些实施方式中，所述方法进一步包括将所述细胞与中脑da谱系特异性激活剂和抑制剂(例如bdnf、gdnf、camp、tgfβ、抗坏血酸(aa)和/或dapt)接触，以诱导mda前体向mda分化。
[0145]
5.2.1.干细胞
[0146]
本公开主题提供体外诱导干细胞分化以产生mda及其前体的方法。在某些实施方式中，所述干细胞是多潜能干细胞。在某些实施方式中，所述多潜能干细胞选自胚胎干细胞(esc)、诱导多潜能干细胞(ipsc)、及其组合。在某些实施方式中，所述干细胞是多能干细胞。可与本公开方法一起使用的干细胞的非限制性实例包括人类、非人灵长类或啮齿类非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多潜能细胞和工程多潜能细胞。在某些实施方式
中，所述干细胞是人类干细胞。人类干细胞的非限制性示例包括人类胚胎干细胞(hesc)、人类多潜能干细胞(hpsc)、人类诱导多潜能干细胞(hipsc)、人类孤雌生殖干细胞、原始生殖细胞样多潜能干细胞、外胚层干细胞、f-class多潜能干细胞、体细胞干细胞、癌症干细胞、或任何其他能够进行谱系特异性分化的细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是人类胚胎干细胞(hesc)。在某些实施方式中，所述干细胞是人类诱导多潜能干细胞(hipsc)。
[0147]
在某些实施方式中，所述干细胞或其子代细胞包含引入的异源核酸，其中所述核酸可编码所需的核酸或蛋白质产物或具有信息价值(例如，参见美国专利第6,312,911号，其通过引用以其整体并入)。蛋白质产物的非限制性示例包括可通过体内影像研究检测的标志物，例如受体或其他细胞膜蛋白。标志物的非限制性示例包括荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(ebfp、ebfp2、azurite、mkalamal)、青色荧光蛋白(ecfp、cerulean、cypet、mturquooise2)和黄色荧光蛋白衍生物(yfp、citrine、venus、ypet、eyfp))、β-半乳糖苷酶(lacz)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、新霉素磷酸转移酶(neo)、酶(如氧化酶和过氧化物酶)和抗原分子。如本文所用，术语“报告基因”或“报告构建体”是指包含编码易于检测或易于分析的蛋白质的核酸的遗传构建体，例如有色蛋白质、荧光蛋白质(例如gfp)或酶(例如β-半乳糖苷酶(lacz基因))。在某些实施方式中，所述报告子可由早熟有丝分裂后中脑da神经元标志物基因(例如nurr1)的重组启动子驱动。
[0148]
5.2.2.smad抑制剂
[0149]
smad抑制剂的非限制性示例包括转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导的抑制剂(称为“tgfβ/activin-nodal抑制剂”)和骨形态发生蛋白(bmp)信号传导的抑制剂。在某些实施方式中，所述tgfβ/activin-nodal抑制剂可使配体(包括tgfβ、bmp、nodal和activin)失效，和/或通过阻断受体和下游效应器阻断其信号传导通路。tgfβ/activin-nodal抑制剂的非限制性示例包括在wo/2010/096496、wo/2011/149762、wo/2013/067362、wo/2014/176606、wo/2015/077648、chambers等人,nat biotechnol.2009mar；27(3):275-80、kriks等人,nature.2011nov 6；480(7378):547-51,和chambers等人,nat biotechnol.2012jul 1；30(7):715-20(2012)中公开的那些，所有这些均出于所有目的通过引用并入本文。在某些实施方式中，所述至少一种tgfβ/activin-nodal抑制剂选自alk5抑制剂、alk4抑制剂、alk7抑制剂、及其组合。在某些实施方式中，tgfβ/activin-nodal抑制剂包含alk5的抑制剂。在某些实施方式中，tgfβ/activin-nodal抑制剂是选自sb431542、其衍生物、及其混合物的小分子。“sb431542”是指编号为cas 301836-41-9、分子式为c
22h18
n4o3、名称为4-[4-(l,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯酰胺的分子，例如，见以下结构：
[0150]
[0151]
在某些实施方式中，所述tgfβ/activin-nodal抑制剂包含sb431542。在某些实施方式中，所述tgfβ/activin-nodal抑制剂包含sb431542的衍生物。在某些实施方式中，所述sb431542的衍生物为a83-01。
[0152]
在某些实施方式中，所述至少一种smad抑制剂包含bmp信号传导的抑制剂(称为“bmp抑制剂”)。bmp抑制剂的非限制性示例包括wo2011/149762、chambers等人,nat biotechnol.2009 mar；27(3):275-80、kriks等人,nature.2011nov 6；480(7378):547-51、和chambers等人,nat biotechnol.2012jul l；30(7):715-20中公开的那些，所有这些均通过引用以其整体并入。在某些实施方式中，所述bmp抑制剂是选自ldn193189、noggin、多索吗啡、其衍生物、及其混合物的小分子。“ldn193189”指小分子dm-3189，iupac名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为c
25h22
n6，如下式。
[0153][0154]
ldn193189能够作为smad信号传导的抑制剂发挥作用。ldn193189也是alk2、alk3和alk6蛋白酪氨酸激酶(ptk)的高效小分子抑制剂，抑制i型tgfβ受体alk1和alk3家族成员的信号传导，从而抑制多种生物信号的传递，包括骨形态发生蛋白(bmp)bmp2、bmp4、bmp6、bmp7和activin细胞因子信号，以及随后smad1、smad5和smad8的smad磷酸化(yu等人.(2008)nat med 14:1363-1369；cuny等人.(2008)bioorg.med.chem.lett.18:4388-4392，通过引用并入本文)。
[0155]
在某些实施方式中，所述bmp抑制剂包含ldn193189。在某些实施方式中，所述bmp抑制剂包含noggin。
[0156]
在某些实施方式中，所述干细胞暴露于一种smad抑制剂，例如一种tgfβ/activin抑制剂。在某些实施方式中，所述一种tgfβ/activin-nodal抑制剂为sb431542或a83-01。在某些实施方式中，所述干细胞暴露于两种smad抑制剂。在某些实施方式中，所述两种smad抑制剂是tgfβ/activin-nodal抑制剂和bmp抑制剂。在某些实施方式中，所述干细胞暴露于sb431542或a83-01、和ldn193189或noggin。在某些实施方式中，所述干细胞暴露于sb431542和ldn193189。
[0157]
在某些实施方式中，将所述干细胞接触或暴露于至少一种smad抑制剂至少约5天，或至少约10天。在某些实施方式中，将所述干细胞接触或暴露于至少一种smad抑制剂多达约5天或多达约10天。在某些实施方式中，将所述干细胞接触或暴露于至少一种smad抑制剂约5天至约10天。在某些实施方式中，将所述干细胞接触或暴露于至少一种smad抑制剂约5天。在某些实施方式中，将所述干细胞接触或暴露于至少一种smad抑制剂7天。在某些实施方式中，从第0天到第6天，所述细胞接触或暴露于至少一种smad抑制剂。在某些实施方式中，从第0天到第6天，每天或每隔一天将至少一种smad抑制剂添加到包含所述干细胞的细
aug 19；35(33):11462-81中所公开的那些，所有这些均通过引用以其整体并入。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂是选自chir99021、wnt3a、wnt1、wnt5a、bio、chir98014、锂、3f8、其衍生物、及其混合物的小分子。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂包含chir99021或其衍生物。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂包含chir99021。“chir99021”(也称为“氨基嘧啶”或“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基(methylidenyl)]-2-吲哚酮”)指iupac名称6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1h-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙胺基)烟腈，其式如下。
[0164][0165]
chir99021具有高度选择性，对一组相关和不相关的激酶表现出近千倍的选择性，对人类gsk3β的ic50＝6.7nm，对啮齿类gsk3β同系物的纳摩尔级ic50值。
[0166]
在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于至少一种wnt激活剂至少约5天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于至少一种wnt激活剂多达约5天、多达约10天、多达约15天或多达约20天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于至少一种wnt激活剂约5天至约20天、约5天至约15天、约10天至约20天、约5天至约15天、或约10天至约15天。在某些实施方式中，所述细胞与至少一种wnt激活剂接触约10天至约15天。在某些实施方式中，所述细胞与至少一种wnt激活剂接触约10天。在某些实施方式中，所述干细胞与至少一种wnt信号传导的激活剂接触12天。在某些实施方式中，从第0天到第11天，所述细胞与至少一种wnt激活剂接触。在某些实施方式中，从第0天到第11天，每天或每隔一天将至少一种wnt激活剂添加到包含所述细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第0天到第11天，每天(每日)将至少一种wnt激活剂添加到包含所述细胞的细胞培养基中。
[0167]
在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度在其暴露于细胞期间增加(也称为“wnt boost”)。在某些实施方式中，从细胞初始暴露于至少一种wnt激活剂起至少约2天、至少约4天或至少约5天增加或wnt boost。在某些实施方式中，从细胞初始暴露于至少一种wnt激活剂起约4天增加或wnt boost。
[0168]
在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂至少约5天或至少约10天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂至少约5天。在某些实施方式中，所述细胞与增加后浓度的至少一种wnt激活剂接触多达约5天、多达约10天或多达约15天。在某些实施方式中，将所述细胞与增加后浓度的至少一种wnt激活剂接触多达约10天。
[0169]
在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂约5天至约15天之间，或约5天至约10天之间，或约10天至约15天之间。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂约5天至约10天之间。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂约5天、约10天或约15天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂约5天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂6天。在某些实施方式中，从第4天到第9天，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂约10天。在某些实施方式中，将所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂8天。在某些实施方式中，从第4天到第11天，将所述细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种wnt激活剂。
[0170]
在某些实施方式中，在wnt boost之前与所述细胞接触或暴露于所述细胞的至少一种wnt激活剂的初始浓度小于约5μm、小于约3μm或小于约1μm，包括但不限于约0.01μm至约5μm之间、约0.01μm至约3μm之间、约0.05μm至约3μm之间、约0.1μm至约3μm之间、约0.5μm至约3μm之间、约0.5μm至约2μm之间，或约0.5μm至约1μm之间。在某些实施方式中，在wnt boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种wnt激活剂的初始浓度小于约1μm，例如，约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm或约1μm。在某些实施方式中，在wnt boost之前，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种wnt激活剂的初始浓度约为0.5μm。在某些实施方式中，在wnt boost之前，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种wnt激活剂的初始浓度约为0.7μm。
[0171]
在某些实施方式中，wnt boost后所述至少一种wnt激活剂的增加后浓度为约3μm或更高、约5μm或更高、约10μm或更高、约15μm或更高、或约20μm或更高。在某些实施方式中，wnt boost后所述至少一种wnt激活剂的增加后浓度在约3μm至约15μm之间、约3μm至约10μm之间或约5μm至约10μm之间。在某些实施方式中，wnt boost后所述至少一种wnt激活剂的增加后浓度为约3μm、约3.5μm、约4μm、约4.5μm、约5μm、约5.5μm、约6μm、约6.5μm、约7μm、约7.5μm、约8μm、约8.5μm、约9μm、约9.5μm、或约10μm。在某些实施方式中，wnt boost后所述至少一种wnt激活剂的增加后浓度约为3μm。在某些实施方式中，wnt boost后所述至少一种wnt激活剂的增加后浓度约为7μm。在某些实施方式中，wnt boost后所述至少一种wnt激活剂的增加后浓度约为7.5μm。
[0172]
的某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约50％至约2000％之间、或约100％至约1500％之间、或约150％至约1500％之间、或约200％至约1500％之间、或约250％至约1500％之间、或约300％至约1500％之间、或约300％至约1000％之间、或约300％至约400％之间、或约500％至约1000％之间、或约800％至约1000％之间、或约900％至约1000％之间、或约950％至约1000之间。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％至约1000％之间。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％至约400％。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约900％至约1000％。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％、约350％、约400％、约450％、约500％、约550％、约600％、约
650％、约700％、约750％、约800％、约850％、约900％、约950％、约1000％、约1050％、或约1100％。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约350％。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约950％。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂的浓度比所述与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约1000％。
[0173]
在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂包含gsk3β抑制剂。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂包含chir99021或其衍生物。在某些实施方式中，所述至少一种wnt激活剂包含chir99021。
[0174]
5.2.4.shh激活剂
[0175]
如本文所用，术语“音猬因子”、“shh”或“shh”指哺乳动物信号传导通路家族中称为刺猬因子的至少三种蛋白质之一的蛋白质，另一种是沙漠刺猬因子(dhh)，第三种是印度刺猬因子(ihh)。shh通过与跨膜分子patched(ptc)和smoothened(smo)相互作用，与至少两种跨膜蛋白相互作用。shh通常与ptc结合，ptc允许smo作为信号传感器激活。在缺乏shh的情况下，ptc通常会抑制smo，smo继而会激活转录抑制因子，因此某些基因不会转录。当shh存在并与ptc结合时，ptc不能干扰smo的功能。在smo不受抑制的情况下，某些蛋白质能够进入细胞核并充当转录因子，从而激活某些基因(见gilbert,2000developmental biology(sunderland,mass.,sinauer associates,inc.,publishers)。在某些实施方式中，所述shh激活剂指能够激活shh信号传导通路的任何分子或化合物，包括能够结合ptc或smo的分子或化合物。在某些实施方式中，shh激活剂选自结合pct的分子、结合smo的分子、及其组合。shh激活剂的非限制性示例包括wo10/096496、wo13/067362、chambers等人,nat biotechnol.2009 mar；27(3):275-80、和kriks等人,nature.2011 nov 6；480(7378):547-51。在某些实施方式中，所述shh激活剂包含shh蛋白、smo激动剂、或其组合。在某些实施方式中，所述shh蛋白质包含重组shh、纯化shh、或其组合。在某些实施方式中，所述重组shh包含与小鼠shh n端片段具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、或约99％同一性的重组蛋白质。在某些实施方式中，所述重组shh包含shh c25ⅱ。在某些实施方式中，所示smo激动剂包含嘌吗啡胺。
[0176]
在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种shh激活剂至少约5天或至少约10天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种shh激活剂多达约5天或多达约10天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于至少一种shh激活剂约5天至约10天之间。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种shh激活剂所述至少一种shh激活剂约5天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种shh激活剂7天。在某些实施方式中，从第0天到第6天，所述细胞接触或暴露于所述至少一种shh激活剂。在某些实施方式中，从第0天到第6天，每天或每隔一天将至少一种shh激活剂添加到包含所述细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第0天到第6天，每天(每日)将所述至少一种shh激活剂添加到包含所述细胞的细胞培养基中。
[0177]
在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种shh激活剂的浓度在约50ng/ml至约1000ng/ml之间、约100ng/ml至约1000ng/ml之间、约20ng/ml至约1000ng/
ml之间、约300ng/ml至约1000ng/ml之间、约400ng/ml至约1000ng/ml之间、约500ng/ml至约1000ng/ml之间、约400ng/ml至约800ng/ml之间、约400ng/ml至约700ng/ml之间、约400ng/ml至约600ng/ml之间、或约500ng/ml至约600ng/ml之间。在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种shh激活剂的浓度在约400ng/ml至约600ng/ml之间。在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种shh激活剂的浓度为约400ng/ml、约450ng/ml、约500ng/ml、约550ng/ml，或约600ng/ml。在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种shh激活剂的浓度约为500ng/ml。
[0178]
在某些实施方式中，所述至少一种shh信号传导的激活剂包含shh c25 ii。
[0179]
5.2.5.fgf激活剂
[0180]
fgf家族包括向受体酪氨酸激酶发出信号的分泌信号传导蛋白(分泌fgf)。系统发育分析表明，22个fgf基因可分为七个亚家族，每个亚家族包含两到四个成员。分支长度与每个基因之间的进化距离成正比。
[0181]
在某些实施方式中，所述fgf激活剂选自fgf8a、fgf17、fgf18、fgf8b、fgf2、fgf4、及其衍生物。在某些实施方式中，所述fgf激活剂选自fgf8a、fgf17、fgf18、fgf2、fgf4、及其衍生物。在某些实施方式中，所述fgf激活剂选自fgf8a、fgf17、fgf18。
[0182]
所述fgf8亚家族由fgf8a、fgf8b、fgf17和fgf18组成。脊椎动物中脑和小脑的早期模式由产生fgf8a、fgf8b、fgf17和fgf18的中脑/后脑组织器调节。研究表明，fgf8b的功能不同于fgf8a、fgf17和fgf18(liu等人,development.2003 dec；130(25):6175-85)。fgf8b是唯一能够诱导rl基因gbx2并强烈激活通路抑制剂spry 1/2，以及抑制中脑基因otx2的蛋白质(liu 2003)。此外，fgf8b沿着中脑中诱导的gbx2结构域和剩余的otx2区之间的连接延伸组织器，与小脑发育相关(liu 2003)。相比之下，fgf8a、fgf17和fgf18会导致中脑扩张并上调中脑基因表达(liu 2003)。
[0183]
在某些实施方式中，所述fgf激活剂能够引起中脑扩张并上调中脑基因表达。在某些实施方式中，所述fgf激活剂选自fgf8a、fgf17、fgf18、fgf2、fgf4、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，所述fgf激活剂包含或为fgf18。
[0184]
在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种fgf激活剂至少约1天、至少约3天、至少约5天、至少约8天、或至少约10天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种fgf激活剂多达约5天，或多达约10天，或多达约15天，或多达约20天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种fgf激活剂约1天至约20天、约1天至约15天、或约5天至约20天、或约5天至约15天、或约5天至约10天、或约10天至约20天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种fgf激活剂约5天至约10天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种fgf激活剂约3天、约5天、或约8天。在某些实施方式中，所述细胞接触或暴露于所述至少一种fgf激活剂约5天。
[0185]
在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起至少约5天或至少约10天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起不迟于约5天、不迟于约10天、或不迟于约15天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约5天至约15天
之间、约5天至约10天之间、或约10天至约15天之间。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约5天至约10天之间。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约10天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约9天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起10天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起12天。
[0186]
在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约5天，且所述细胞与所述至少一种fgf激活剂接触约3天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约5天，且所述细胞与所述至少一种fgf激活剂接触约5天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约10天，且所述细胞与所述至少一种fgf激活剂接触约3天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起约10天，且所述细胞与所述至少一种fgf激活剂接触约5天。在某些实施方式中，所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触或初始暴露是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触或初始暴露起12天，且所述细胞与所述至少一种fgf激活剂接触5天。
[0187]
在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种fgf激活剂的浓度在约10ng/ml至约500ng/ml之间、约50ng/ml至约500ng/ml之间、约100ng/ml至约500ng/ml之间、约100ng/ml至约400ng/ml之间、约100ng/ml至约300ng/ml之间、约100ng/ml至约200ng/ml之间、在约100ng/ml至约250ng/ml之间。在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种fgf激活剂的浓度在约100ng/ml至约200ng/ml之间，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种fgf激活剂的浓度约为100ng/ml。在某些实施方式中，所述与细胞接触或暴露于细胞的至少一种fgf激活剂的浓度约为200ng/ml。
[0188]
在某些实施方式中，所述至少一种fgf激活剂包含fgf18。
[0189]
在某些非限制性实施方式中，所述干细胞接触或暴露于至少一种tgfβ/activin-nodal抑制剂(例如sb431542，例如浓度约10mm)、至少一种bmp抑制剂(例如ldn193189，例如浓度约250nm)、以及至少一种shh激活剂(例如shh c25 ii，例如浓度约为500ng/ml)约5天(例如7天，例如从第0天到第6天)，并且所述细胞与所述至少一种wnt激活剂(例如，chir99021，例如，以约为0.7μm的浓度接触5天(例如4天，例如从第0天到第3天)、以及以约7.5μm的浓度接触约5天(例如，6天，例如，从第4天到第9天)、以及以约3μm的浓度接触约2天(例如，从第10天到第11天))。所述细胞接触或暴露于至少一种fgf激活剂(例如fgf18，例如浓度约为100ng/ml)，其中所述细胞与所述至少一种fgf激活剂的初始接触是从所述细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触起约10天(例如，10天或12天)，并且所述细胞与所述
至少一种fgf激活剂接触约5天(例如，5天(从第12天到第16天)或7天(例如，从第10天到第16天)。
[0190]
5.2.6.细胞培养基
[0191]
在某些实施方式中，将上述抑制剂和激活剂添加到包含所述细胞的细胞培养基中。合适的细胞培养基包括但不限于serum replacement(“ksr”)培养基、培养基(nb)、n2培养基、b-27培养基和essential /essential(“e8/e6”)培养基、及其组合。ksr培养基、nb培养基、n2培养基、b-27培养基和e8/e6培养基均可是市售的。ksr培养基是优化的用于在培养基中生长和保持未分化的hesc的一种定义确定的无血清配方。
[0192]
在某些实施方式中，所述细胞培养基是ksr培养基。ksr培养基的成分在wo2011/149762中公开。在某些实施方式中，所述ksr培养基包含knockout dmem、knockout serum replacement、l-谷氨酰胺、pen/strep、mem和13-巯基乙醇。在某些实施方式中，1升ksr培养基包含820ml knockout dmem、150ml knockout serum replacement、10ml 200mm l-谷氨酰胺、10ml pen/strep、10ml 10mm mem、和55μm 13-巯基乙醇。
[0193]
在某些实施方式中，所述细胞培养基是e8/e6培养基。e8/e6培养基是一种无饲养层(feeder-free)和无外源物质(xeno-free)的培养基，支持人类多潜能干细胞的生长和扩增。e8/e6培养基已被证明支持体细胞重编程。此外，e8/e6培养基可作为psc培养自定义培养基配方的基础。chen等人,nat methods 2011 may；8(5):424-9中描述了一个示例e8/e6介质9，其通过引用以其整体并入。wo 15/077648中公开了一个示例性e8/e6介质，其通过引用以其整体并入。在某些实施方式中，e8/e6细胞培养基包含dmem/f12、抗坏血酸、硒、胰岛素、nahco3、转铁蛋白、fgf2和tgfβ。e8/e6培养基与ksr培养基的不同之处在于，e8/e6培养基不包含活性bmp或wnt成分。因此，在某些实施方式中，当使用e8/e6培养基培养本公开的干细胞群以分化为本体感受器群时，不需要向e8/e6培养基中添加至少一种smad信号传导的抑制剂(例如，抑制bmp的抑制剂)。
[0194]
5.2.7.分化细胞
[0195]
在某些实施方式中，所述方法包括获得差异细胞的细胞群，其中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％，或者至少约90％的分化细胞表达至少一种指示mda或mda前体的标志物。指示mda或mda前体的标志物的非限制性示例包括engrailed-1(en1)、orthodenticle同源框2(otx2)、酪氨酸羟化酶(th)、核受体相关-1蛋白(nurr1)、叉头框蛋白a2(foxa2)、和lim同源框转录因子1α(lmx1a)、pitx3、lmo3、snca、adcap1、chrna4、和girk2。
[0196]
在某些实施方式中，所述分化细胞表达所述至少一种指示mda或mda前体的标志物是从所述细胞与至少一种smad抑制剂的初始接触起至少约10天(例如，约15天(例如，16天)、约20天、约30天、约40天、或约50天)。
[0197]
用至少一种fgf激活剂处理细胞可导致en1的持续表达。en1在发育过程中是中脑da神经元的存活因子，在成年中脑da神经元中继续发挥神经保护和生理功能。因此，持续表达en1的细胞在进一步发育和成熟后可以发育成功能成熟的mda。在某些实施方式中，在是从所述干细胞与至少一种smad抑制剂的初始接触起至少约10天、至少约15天、至少约16天、至少约20天、至少约25天、至少约27天、至少约30天、至少约35天、至少约40天、至少约45天、
至少约50天、至少约60天、至少约70天、至少约80天，或至少约90天所述分化细胞具有可检测水平的en1表达。在某些实施方式中，是从所述干细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触起约30天，所述分化细胞具有可检测水平的en1表达。在某些实施方式中，是从所述干细胞与所述至少一种smad抑制剂的初始接触起约40天，所述分化细胞具有可检测水平的en1表达。
[0198]
在某些实施方式中，所述衍生自本公开方法的分化细胞不表达或具有低表达的至少一种标志物，所述标志物选自pax6、emx2、lhx2、sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、phox2a、barhl1、barhl2、gbx2、hoxa2、hoxb2、pou5f1、nanog、及其组合。
[0199]
在某些实施方式中，所述细胞以有效增加至少一种da神经元标志物(例如，en1)表达的可检测水平的浓度和时间与本文所述的激活剂和抑制剂接触，例如其中所述细胞为a9型神经元细胞。
[0200]
在某些实施方式中，所述细胞以有效降低sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、和/或phox2a表达的浓度和时间与本文所述的激活剂和抑制剂接触。
[0201]
5.2.8.mda前体分化为mda
[0202]
在某些实施方式中，所述细胞进一步与da神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触，例如，l-谷氨酰胺、脑源性神经营养因子(bdnf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、环磷酸腺苷(camp)、转化生长因子β(tgfβ，例如tgfβ3)、抗坏血酸(aa)，和dapt(也称为n-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-l-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-l、l-二甲基乙酯、ly-374973、n-[n-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰]-s-苯甘氨酸叔丁酯；或n-[n-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰]-s-苯甘氨酸叔丁酯)。在某些实施方式中，所述细胞与前述da神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、或至少约10天或更长时间，例如，在约2天至约20天之间、在约3天至约19天之间、在约4天至约18天之间、在约5天至约17天之间、在约6天至约16天之间、在约7天至约15天之间、在约8天至约15天之间、在约9天至约14天之间、或者约10天至约13天之间。在某些实施方式中，所述细胞与前述da神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触多达约2天、多达约3天、多达约4天、多达约5天、多达约6天、多达约7天、多达约8天、多达约9天、或多达约10天或更长时间。在某些实施方式中，所述细胞与前述da神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触约4天、约5天、约6天、约7天或约8天。
[0203]
在某些实施方式中，所述细胞与浓度在约0.5mm至约5mm之间、或约1mm至约5mm之间、或约1.5mm至约2.5mm之间、或约1mm至约2mm之间的l-谷氨酰胺接触。在某些实施方式中，所述细胞与浓度约2mm的l-谷氨酰胺接触。
[0204]
在某些实施方式中，所述细胞与浓度在约5ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约40ng/ml之间、或约20ng/ml至约50ng/ml之间、或约20ng/ml至约40ng/ml、或约10ng/ml至约30ng/ml之间、或约10ng/ml至约20ng/ml之间、或约20ng/ml至约30ng/ml之间的bdnf接触。在某些实施方式中，所述细胞与浓度约20ng/ml的bdnf接触。
[0205]
在某些实施方式中，所述细胞与浓度在约50nm至约500nm之间、或约100nm至约500nm之间、或约100nm至约400nm之间、或约200nm至约400nm之间、或约200nm至约300nm之间、或约100nm至约300nm之间的抗坏血酸(aa)接触。在某些实施方式中，所述细胞与浓度约
200nm的aa接触。
[0206]
在某些实施方式中，所述细胞与浓度在约5ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约40ng/ml之间、或约20ng/ml至约50ng/ml之间、或约20ng/ml至约40ng/ml之间、或约10ng/ml至约30ng/ml之间、或约10ng/ml至约20ng/ml之间、或约20ng/ml至约30ng/ml之间的gdnf接触。在某些实施方式中，所述细胞与浓度约20ng/ml的gdnf接触。
[0207]
在某些实施方式中，所述细胞与浓度在约200nm至约800nm之间、或约200nm至约700nm之间、或约300nm至约700nm之间、或约300nm至约600nm之间、或约400nm至约600nm之间、或约450nm至约550nm之间的camp接触。在某些实施方式中，所述细胞与浓度约500nm的camp接触。
[0208]
在某些实施方式中，所述细胞与浓度在约0.01ng/ml至约5ng/ml之间、或约0.1ng/ml至约4ng/ml之间、或约0.5ng/ml至约5ng/ml之间、或约1ng/ml至约3ng/ml之间、或约1ng/ml至约2ng/ml之间的tgfβ3接触。在某些实施方式中，所述细胞与浓度约1ng/ml的tgfβ3接触。
[0209]
在某些实施方式中，如美国公开第2015/0010514号(其通过引用以其整体并入)所述，进一步培养分化的中脑da前体。
[0210]
5.3.分离中脑da神经元及其前体的方法
[0211]
本发明提供基于至少一种或至少两种表面标志物分离mda及其前体的方法。在某些实施方式中，所述表面标志物是阴性表面标志物，其中所述细胞不表达可检测水平的阴性表面标志物。在某些实施方式中，与分离出所述细胞的细胞群的阴性表面标志物的平均表达水平相比，所述细胞表达阴性表面标志物的水平降低。
[0212]
在某些实施方式中，所述表面标志物是阳性表面标志物，其中所述细胞表达可检测水平的阳性表面标志物。在某些实施方式中，与分离出所述细胞的细胞群的阳性表面标志物的平均表达水平相比，所述细胞表达的阳性表面标志物的水平增加。
[0213]
在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物的细胞。在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离以下细胞：不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物或表达与至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的至少一种阴性表面标志物。在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离表达与细胞群中至少一种阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。
[0214]
在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物而表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离以下细胞：(a)不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物或表达与细胞群中至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的至少一种阴性表面标志物；而(b)表达与细胞群中至少一个阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的至少一种阳性表面标志物。
[0215]
在某些实施方式中，所述阴性表面标志物选自cd49e(也称为整合素α5)、cd99、cd340、及其组合。在某些实施方式中，所述阳性表面标志物选自cd171、cd184、及其组合。
[0216]
在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离不表达可检测水平的cd49e而表达可检测水平的cd184的细胞。在某些实施方式中，本公开的用于从细胞群中分离mda及其前体的方法包括分离以下细胞：不表达可检测水平的cd49e或表达与细胞群中cd49e的平均表达水平相比降低水平的cd49e；而表达与细胞群中cd184的平均表达水平相比增加水平的cd184。
[0217]
本领域已知的任何基于表面标志物的细胞分离技术均可用于本公开的方法中。在某些实施方式中，流式细胞术用于本公开的分离方法。
[0218]
5.4.细胞群和组合物
[0219]
本发明提供体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)的细胞表达指示mda或mda前体的至少一种标志物。指示mda或mda前体的标志物的非限制性示例包括en1、otx2、th、nurr1、foxa2、lmx1a、pitx3、lmo3、snca、adcap1、chrna4和girk2。本发明还提供包含此类细胞群的组合物。在某些实施方式中，所述体外分化细胞通过本文(例如，在第5.2节中)所述的分化方法获得。
[0220]
在某些实施方式中，小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、或小于约0.1％)的分化细胞表达选自pax6、emx2、lhx2、sma、six1、pitx2、sim1、pou4f1、phox2a、barhl1、barhl2、gbx2、hoxa2、hoxb2、pou5f1、nanog、及其组合的至少一种标志物。
[0221]
本发明还提供体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)的细胞表达至少一种本文(例如，在第5.3节中)公开的阳性表面标志物，而不表达至少一种本文(例如，在第5.3节中)公开的阴性表面标志物。本发明还提供体外分化细胞的细胞群，其中至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)的细胞表达与细胞群中至少一种阳性标志物的平均表达水平相比增加水平的本文(例如，在第5.3节中)公开的至少一种阳性表面标志物；而不表达可检测水平的本文(例如，在第5.3节中)公开的至少一种阴性表面标志物或表达与细胞群中至少一种阴性表面标志物的平均表达水平相比降低水平的本文(例如，在第5.3节中)公开的至少一种阴性表面标志物。
[0222]
在某些实施方式中，至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)的细胞不表达可检测水平的cd49e，而表达可检测水平的cd184。在某些实施方式中，至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)的细胞不表达可检测水平的cd49e或表达与细胞群中cd49e的平均表达水平相比降低水平的cd49e；而表达与细胞群中cd184的平均表达水平相比增加水平的cd184。此外，本发明提供包含此类细胞群的组合物。
[0223]
在某些实施方式中，所述细胞包含在组合物中，所述组合物还包含生物相容性支
架或基质，例如，当所述细胞被植入或移植到受试者中时促进组织再生的生物相容性三维支架。在某些实施方式中，所述生物相容性支架包括胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原蛋白、多肽或蛋白质、多糖，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶和/或水凝胶。(例如，参见美国公开第2015/0159135、2011/0296542、2009/0123433和2008/0268019号，其中每一个内容均通过引用以其整体并入)。在某些实施方式中，所述组合物还包含用于促进植入/移植细胞成熟为中脑da细胞的生长因子。
[0224]
在某些实施方式中，向受试者施用的所述组合物包含约1
×
104至约1
×
10
10
、约1
×
104至约1
×
105、约1
×
105至约1
×
109、约1
×
105至约1
×
106、约1
×
105至约1
×
107、约1
×
106至约1
×
107、约1
×
106至约1
×
108、约1
×
107至约1
×
108、约1
×
108至约1
×
109、约1
×
108至约1
×
10
10
、或约1
×
109至约1
×
10
10
细胞的细胞群。在某些实施方式中，向受试者施用约1
×
105至约1
×
107个其细胞。
[0225]
在某些实施方式中，所述组合物是冷冻的。在某些实施方式中，所述组合物还包含至少一种冷冻保护剂，例如但不限于二甲基亚砜(dmso)、甘油、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、或其组合。
[0226]
在某些实施方式中，所述组合物还包含生物相容性支架或基质，例如，当细胞被植入或移植到受试者时促进组织再生的生物相容性三维支架。在某些实施方式中，生物相容性支架包括胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原蛋白、多肽或蛋白质、多糖，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶、和/或水凝胶。(例如，参见美国公开第2015/0159135号、2011/0296542、2009/0123433、和2008/0268019号，其中每一个内容均通过引用以其整体并入)。
[0227]
在某些实施方式中，所述组合物是包含药学上可接受载体的药物组合物。所述组合物可用于预防和/或治疗神经退行性疾病，包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症和多发性硬化症。
[0228]
本公开主题还提供一种包含分化细胞的装置或包含分化细胞的组合物，如本文所公开。装置的非限制性示例包括注射器、细玻璃管、立体定向针和套管。
[0229]
5.5.神经退行性疾病的治疗方法
[0230]
本文公开的细胞群和组合物(例如，第5.4节中公开的那些)可用于治疗神经退行性疾病。本公开的主题提供治疗神经退行性疾病的方法。在某些实施方式中，所述方法包括向患有神经退行性疾病的受试者施用有效量的本公开的干细胞衍生mda或包含其的组合物。在某些实施方式中，所述方法包括向患有神经退行性疾病的受试者施用有效量的不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物(例如，cd49e)而表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物(例如，cd184)的体外分化细胞或包含此类细胞的组合物。在某些实施方式中，所述方法包括向患有神经退行性疾病的受试者体内施用有效量的不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物(例如cd49e)或表达与从中分离出细胞的细胞群的至少一种阴性表面标志物的平均表达相比降低水平的至少一种阴性表面标志物(例如cd49e)，而表达与从中分离出细胞的细胞群的至少一种阳性表面标志物的平均表达相比增加水平的至少一种阳性表面标志物(例如cd184)的体外分化细胞；或包含这些细胞的组合物。在某些实施方式中，所述组合物是还包含药学上可接受载体的药物组合物。
[0231]
神经退行性疾病的非限制性示例包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症和多发性硬化症。
[0232]
在某些实施方式中，所述神经退行性疾病是帕金森病。帕金森病的主要运动症状包括但不限于手、臂、腿、下巴和脸的震颤、运动迟缓或缓慢、四肢和躯干僵硬或酸痛、姿势不稳或平衡与协调受损。
[0233]
在某些实施方式中，所述神经退行性疾病是帕金森病，其指与基底神经节多巴胺不足相关的疾病，基底神经节是大脑控制运动的一部分。症状包括震颤、运动迟缓(运动极度缓慢)、弯曲姿势、姿势不稳和僵硬。帕金森病的非限制性示例包括皮质基底节变性、路易体痴呆、多系统性萎缩、和进行性核上性麻痹。
[0234]
可以系统地或直接地向受试者施用或提供所述细胞或组合物以治疗或预防神经退行性疾病。在某些实施方式中，将所述细胞或组合物直接注射到目标器官(例如，中枢神经系统(cns)或周围神经系统(pns))。在某些实施方式中，将所述细胞或组合物直接注入纹状体。
[0235]
所述细胞或组合物可在任何生理上可接受的载体中施用。所述细胞或组合物可通过局部注射、原位(ot)注射、全身注射、静脉注射或肠外给药进行施用。在某些实施方式中，通过原位(ot)注射将所述细胞或组合物施用于患有神经退行性疾病的受试者。
[0236]
所述细胞或组合物可方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，其可缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适当混合物。根据需要，可通过将本公开主题的组合物(例如，包含本公开的干细胞衍生前体的组合物)加入所需量的含有不同量其他成分的适当溶剂来制备无菌可注射溶液。此类组合物可与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物也可以冻干。所述组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，具体取决于给药途径和所需制剂。可参考标准文本，如1985年第17版“remington’s pharmaceutical science”，通过引用并入本文，以制备合适的制剂，而无需过度实验。
[0237]
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)确保对微生物作用的预防。可注射药物形式的延长吸收可通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸明矾和明胶)来实现。
[0238]
如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将所述组合物的粘度维持在所选水平。可以使用甲基纤维素，因为它容易获得且经济，并且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度取决于所选的药剂。重要的一点是，使用能达到选定粘度的量。合适载体和其他添加剂的选择将取决于具体的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，所述组合物是否将被配制成溶液、悬浮液、凝胶或其他液体形式，例如时间释放形式或充液形式)。
[0239]
本领域技术人员将认识到，所述组合物的组分应选择为化学惰性，且不会影响本公开的干细胞衍生前体的活性或功效。这不会给化学和药学原理方面的技术人员带来任何问题，或者可以通过参考标准文本或通过简单实验(不涉及多度实验)从本公开和本文引用的文件中轻松避免问题。
[0240]
关于所述细胞治疗用途的一个考虑因素是达到最佳效果所需的细胞数量。最佳效果包括但不限于患有神经退行性疾病的受试者的cns和/或pns区的再增殖，和/或受试者的cns和/或pns功能的改善。
[0241]“有效量”(或“治疗有效量”)是指足以影响治疗后有益或预期临床结果的量。有效量可以一次或多次剂量施用于受试者。就治疗而言，有效量是指足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓神经退行性疾病或垂体疾病的进展，或以其他方式减少神经退行性疾病的病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。在确定达到有效量的适当剂量时，通常会考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用细胞的形式和有效浓度。
[0242]
在某些实施方式中，所述细胞的有效量是足以再增殖患有神经退行性疾病的受试者的cns和/或pns区的量。在某些实施方式中，所述细胞的有效量是足以改善患有神经退行性疾病的受试者的cns和/或pns的功能的量，例如，所述改善的功能可以是正常人cns和/或pns功能的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、或约100％。
[0243]
待施用的细胞数量因所治疗的受试者而异。在某些实施方式中，向受试者施用从约1
×
104至约1
×
10
10
、从约1
×
104至约1
×
105、从约1
×
105至约1
×
109、从约1
×
105至约1
×
106、从约1
×
105至约1
×
107、从约1
×
106至约1
×
107、从约1
×
106至约1
×
108、从约1
×
107至约1
×
108、从约1
×
108至约1
×
109、从约1
×
108至约1
×
10
10
、或从约1
×
109至约1
×
10
10
个所述细胞。在某些实施方式中，将约1
×
105至约1
×
107个所述细胞施用于患有神经退行性疾病的受试者。在某些实施方式中，将约1
×
106至约1
×
107个所述细胞施用于患有神经退行性疾病的受试者。在某些实施方式中，将约1
×
106至约4
×
106个所述细胞施用于患有神经退行性疾病的受试者。有效剂量的精确确定可能根据每个受试者的个体因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员可以根据本发明和本领域知识轻松确定剂量。
[0244]
5.6.试剂盒
[0245]
本公开的主题提供用于诱导干细胞分化为mda或其前体的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包含(a)至少一种smad信号传导的抑制剂，(b)至少一种wnt信号传导的激活剂，(c)至少一种shh信号传导的激活剂，以及(d)至少一种fgf信号传导的激活剂。在某些实施方式中，所述试剂盒还包括(e)用于将干细胞诱导分化为表达至少一种指示mda或其前体的标志物的分化细胞群的说明。
[0246]
在某些实施方式中，所述说明包括以特定顺序将干细胞与抑制剂、激活剂和分子接触。通过用于培养所述干细胞的细胞培养基可确定接触抑制剂、激活剂和分子的顺序。
[0247]
在某些实施方式中，所述说明包括将所述干细胞与本公开方法所述的抑制剂、激活剂和分子接触(参见第5.2节)。
[0248]
在某些实施方式中，本公开提供包含有效量的单位剂型的本文公开的细胞群或组
合物的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包含含有治疗组合物的无菌容器；这些容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、包、袋、泡罩包装、或本领域已知的其他合适的容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合盛放药物的材料制成。
[0249]
在某些实施方式中，所述试剂盒包含用于向患有神经退行性疾病的受试者施用所述细胞群或组合物的说明。所述说明可以包括关于使用细胞或组合物治疗或预防神经退行性疾病的信息。在某些实施方式中，所述说明包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防神经退行性疾病或其症状的剂量表和给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考资料。所述说明可以直接打印在容器上(如果有)，或作为标签应用于容器，或作为单独的纸张、小册子、卡片或随容器提供的文件夹。
[0250]
6.实施例
[0251]
通过参考下文实施例将更好地理解本公开主题，所述实施例作为本公开主题的范例而非作为限制提供。
[0252]
实施例1：中脑da神经元分化方案的优化
[0253]
中脑da神经元及其前体在之前公开的wnt-boost方案(国际公开第wo 2016/196661号中公开的“7.5μmbump方案(gmp v2b的修改)”方案，其通过引用以其整体并入)(以下称为“wnt-boost方案”或“boost方案”)下从干细胞中衍生而来。研究发现，从使用wnt-boost方案进行分化的第11天开始，en1表达降低(见图1)。维持en1在分化细胞中的表达对于生成成熟且有功能的中脑da神经元非常重要。因此，为了维持en1的表达，本实施例对在分化后期将fgf8b处理添加到wnt-boost方案中进行了测试(见图2)。对除wnt-boost方案之外，还测试了从第9天到第16天、从第10天到第16天、从第11天到第16天、从第12天到第16天、从第13天到第16天、从第14天到第16天、或从第15天到第16天使用fgf8b接触的细胞。分化第16天的细胞免疫染色显示，en1蛋白表达以fgf8b接触持续时间依赖的方式维持(见图3)。en1阳性细胞也表达foxa2和lmx1a。分化第30天在细胞中测量的rna表达表明，mda或mda前体标志物foxa2、nurr1、lmx1a、oxt2和th的表达水平在所有条件下都是可比的，并且en1的mrna表达以fgf8b接触持续时间依赖的方式维持(见图4a-4b)。然而，污染标志物(非mda或非mda前体标志物)(例如sma和six1)的mrna水平，也以fgf8b接触持续时间依赖的方式诱导(见图4b)。在分化第30天，细胞的six1免疫染色证实了mrna结果(见图5)。
[0254]
fgf8b已被用于从多潜能干细胞中衍生中脑da神经元。fgf8、fgf17和fgf18是fgf的亚家族，已经证明fgf17b、fgf18在中脑发育中与fgf8b具有不同的作用(liu等人,development.2003 dec；130(25):6175-85)。研究还表明，fgf18可以防止6-ohda引起的中脑多巴胺神经元损伤(guo等人,neuroscience,2017 jul 25；356:229-241)。此外，fgf8b(峡部和菱脑原节1)沿着诱导的gbx2结构域和中脑中剩余的otx2区之间的连接延伸组织器。fgf8a、fgf17和fgf18负责中脑的扩张和中脑基因的上调。fgf8b、fgf17和fgf18都是旁分泌fgf到fgf8b的相同fgf亚群。
[0255]
在wnt-boost方案下，从第12天到第16天通过将fgf8b、fgf17和fgf18以100ng/ml的浓度添加到细胞培养物中对它们进行了测试。研究发现，在分化第16天的细胞中，fgf18诱导与fgf8b相似的en1的mrna表达水平，但sma的mrna表达水平降低(见图6和图7)。与fgf8b一样，en1蛋白的表达也以fgf18接触持续时间依赖的方式高度维持。
[0256]
在分化的成熟阶段，en1在fgf8b和fgf18处理的条件下仍然高度维持(见图8)。此外，与通过wnt-boost方案分化的细胞相比，fgf18和fgf8b处理的细胞的pitx2表达水平均降低，而fgf18处理的细胞的sma1和six1表达水平低于fgf8b处理的细胞(见图8)。这些结果表明，与fgf8b处理相比，fgf18处理导致en1持续表达，同时最小化或降低非mda标志物的表达水平。
[0257]
检测wnt-boost+fgf18方案产生的分化细胞的体内存活率。将wnt-boost和wnt-boost+fgf18方案产生的细胞移植到完整的小鼠蛋白中。与wnt-boost方案产生的细胞相比，wnt-boost+fgf18方案产生的细胞在体内具有改善的en1表达的维持(图35a)。wnt boost+fgf18方案产生的细胞在移植后1个月也有更好的纹状体神经支配，纤维已经从移植物核心向周围伸出(图35b)。
[0258]
实施例2：使用报告子纯化mda
[0259]
nurr1是有丝分裂后和未成熟中脑da神经元的标志物，也在成熟中脑da神经元中表达。它是一种转录因子，有助于da的分化和维持。
[0260]
为了从细胞群中纯化mda，本实施例使用内源性nurr1::gfp报告子hpsc(见图9a)。从报告细胞系中分化mda。在从分化的第20天murr1 mrna表达高度诱导的基础上，在分化的第25天基于fasc分离gfp阳性细胞(参见图9b-9c)。
[0261]
在分化的第25天和第40天分离的nurr1:gfp阳性细胞中进行单细胞qrt-pcr。发现在分化的第40天，近约100％的nurr1:gfp阳性细胞表达th(一种成熟的mda标志物)、foxa2和lmx1a，表明mda命运(参见，图10a)。将分离的nurr1:gfp阳性细胞持续培养至第60天，结果显示这些细胞表达高水平的th，表明这些细胞是高纯度的mda(见图10b)。
[0262]
分化的第25天，将nurr1::gfp阳性中脑da神经元移植至裸鼠。图11显示移植细胞在体内存活，并表达th、人类标志物sc121和gfp。在细胞移植区发现神经突起长出(见图11)。
[0263]
在wnt-boost和wnt-boost+fgf18方案(第12天至第16天)下培养nurr1:gfp hpsc。在分化的第25天，分离nurr1:gfp阳性细胞，然后持续培养直到第40天。在分化的第40天，这些中脑da神经元表达高th和foxa2(参见，图12)。
[0264]
mrna表达分析显示，衍生自wnt-boost+fgf18(第12天-第16天)方案并按nurr1:gfp分选的mda比衍生自wnt-boost并按nurr1:gfp分选的mda的en1表达水平高(见图13a)。将这些分选后的细胞移植到免疫缺陷小鼠体内。衍生自wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18(第12天至第16天)方案的两种mda均显示出优异的细胞存活率，并表达标志物sc121和th。然而，经fgf18处理的细胞(wnt-boost+fgf18方案)显示移植区域有更好的神经突起长出(见图13b)。
[0265]
实施例3：在纯化的da神经元中发现表面标志物
[0266]
已发表的论文表明，每株ipsc系因特定细胞类型的诱导而存在差异。很难为每个ipsc系生成用于纯化中脑da细胞的报告系。此外，基因工程细胞不适合临床使用。本实施例使用nurr1::gfp报告子细胞系识别候选表面标志物，尤其是在nurr1::gfp阳性细胞中富集但不在nurr1::gfp阴性细胞中富集的表面标志物，反之亦然。
[0267]
本实施例在分化的第25天测试了衍生自nurr1:gfp hpsc的mda分化细胞中的387个表面标志物(见图14)。
[0268]
两个阳性cd标志物cd171和cd184在nurr1::gfp阳性群体中富集(见图15a-15b)，3个阴性cd标志物cd49e、99和340在nurr1::gfp阴性群体中富集(见图16a-16b)。
[0269]
在wnt-boost方案或wnt-boost+fgf18(第12天-第16天)方案下，细胞在分化的第25天按cd49e(阴性和/或弱表达)分选，并再培养10天。细胞形态学显示，这些细胞基本上是纯mda(见图17)。分化的第40天(第25天分选，并进一步培养15天)分选的mda具有高th免疫染色(图18)。
[0270]
在另一株hpsc系mel1中测试cd49e标志物，以纯化中脑da神经元。在分化的第25天，在用cd49e(阴性和/或弱表达)分选的细胞中发现了基本纯的mda形态，并在wnt-boost方案和wnt-boost+fgf18(第12天-第16天)方案下继续培养15天(分化的第40天)(见图19-20)。这些分选的mda具有高th免疫染色(见图21)。
[0271]
mrna表达显示，在wnt-boost+fgf18(第12天至第16天)方案下分化的cd49e分选细胞与在wnt-boost方案下分化的cd49e分选细胞相比，en1表达水平更高，而pitx2(一种谷氨酸能神经元(丘脑下核标志物))的表达水平更低。在两种方案下分化的分选细胞几乎没有或没有非中脑da标志物(hoxa2、sma1和six1)的表达水平(见图22)。
[0272]
检测所有三种阴性cd标志物cd49e、cd99和cd340。在分化的第25天以及继续培养另外的15天(分化的第40天)，在用cd49e、cd99或cd340(阴性和/或弱表达细胞)分选的细胞中观察到基本上纯的神经元形状(见图23)。然而，分选细胞的mrna表达显示非da神经元标志物(包括phox2a、pitx2、pou4f1和sim1)的表达增加，这表明基于cd49e、cd99或cd340的分离并不排除非da神经元(图24)。
[0273]
据认为，使用cd184的双重分选策略可以解决阴性cd标志物的缺陷。cxcr4(cd184)在小鼠中脑发育过程中对中脑da神经元的迁移和定向起重要作用。经fgf18处理的mda经cd184
+
/cd49e-分选后，可富集a9中脑da亚型。
[0274]
在分化的第25天，使用cd49e(pe)和cd171(apc)对衍生自nurr1::gfp hpsc的中脑da进行facs分选。结果发现，单个cd49e阴性分选细胞约有63％的nurr1::gfp部分。cd171阳性分选不能使与cd49e结合的nurr1:gfp群体富集(见图25)。
[0275]
然而，比单一分选细胞(cd49e；63％)相比，用cd49e和cd184(阳性表达细胞)进行的分选可以使nurr1:gfp部分富集至约80％(见图26)。
[0276]
然后在分化的第25天，通过cd49e和cd171或cd49e和cd184在细胞中进行facs分选。分选后第2天培养的细胞形态显示纯神经元形状，但基于较高cd49e的分选细胞除外(见图27)。
[0277]
mrna表达显示，与其他方式分选的细胞相比，cd49e-/cd184
+
(cd49e阴性/cd184阳性)细胞具有较高的mda标志物(nurr1、en1、pitx3)表达水平，而具有较低的非mda标志物(pitx2、sim1和pou4f1)表达水平(见图28)。
[0278]
接下来，研究了cd49e和cd184是否能可靠地分选mda。如图29所示，在体外分化细胞中，单cd49e-分选使nurr1:gfp阳性细胞群从～20％富集到高达43％。如图30所示，在体外分化细胞中，双cd49e-和cd184
+
分选将nurr1::gfp阳性部分富集到74％和85％。
[0279]
在体外培养2周后，分选细胞显示出共表达foxa2和gfp的高th
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mda，这证实mda的特性(见图31)。
[0280]
mrna表达显示，与其他cd分选的细胞相比，双cd标志物介导的分选细胞(cd49e-和
cd184
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)在分化的第40天的mda标志物表达水平通常较高(见图32)，而非mda标志物的表达水平较低(见图33)。
[0281]
用本公开的新型表面标志物分选的分化细胞的体内存活率进行了检测。根据wnt-boost方案产生分化细胞，分选出cd49e弱cd184高的细胞，并将其移植到完整的小鼠大脑中。与未分选的细胞相比，用分选细胞移植的组织富含th+细胞(图34a)，移植后一个月sox2+前体和ki67+分裂细胞的数量减少(图34b-34d)。
[0282]
尽管已经详细描述了本公开的主题及其优点，但是应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和修改。此外，本技术的范围不限于说明书中描述的工艺、机器、制造、和物质组合物、手段、方法和步骤的特定实施方式。本领域的普通技术人员将轻松地从本发明中了解到本公开的主题、工艺、机器、制造、物质组合物、手段、方法、或步骤(本存在的或之后要开发的可以根据本公开的主题利用的与本文描述的相应实施方式执行基本相同的功能或实现基本相同的结果的)。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这些工艺、机器、制造、物质组合物、手段、方法或步骤。
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在本技术中引用了各种专利、专利公开、出版物、产品描述、方案和序列号，出于所有目的，本发明通过引用将其全部内容并入本文。