含有乳杆菌属的发酵代谢物的眼外用组合物的制作方法

含有乳杆菌属的发酵代谢物的眼外用组合物
发明领域
1.本发明涉及含有乳杆菌属(lactobacillus)的发酵代谢物的稳定的眼外用(topical)组合物。
2.本发明来源于眼用领域和滴眼液领域。
3.具体地，本发明涉及用于眼施用的外用使用的组合物，该组合物含有后生元(postbiotic)作为活性成分并且具有使水性溶液中的后生元保持稳定的特定配方。
4.背景
5.益生菌是当以生物活性的量施用时，对宿主行使有益作用的活的微生物。后生元是由益生菌进行的发酵过程的子产物。
6.后生元是指由活细菌分泌的或细菌裂解后释放的可溶性因子，即代谢产物或子产物(subproduct)，诸如酶、肽、磷壁酸、胞壁肽(muropeptide)、多糖、细胞表面的蛋白和来源于肽聚糖的有机酸。
7.因为后生元被认为是具有高安全谱的具有生物活性的产物，所以它们在饮食领域和制药领域的使用不断增加。
8.以滴眼液的形式使用益生菌也是已知的，例如来自bonni等人。
9.由于后生元在水性溶液中的低稳定性，其在眼用领域的使用是困难的。
10.因此，存在对含有保持稳定的后生元的可用的眼用制剂的需求。
11.本发明的目的之一在于这样的事实：提供含有后生元作为生物活性组分的用于眼部施用的外用使用的组合物。
12.概述
13.现已鉴定了含有特定后生元作为生物活性组分的具有高稳定性的眼用组合物并形成本发明的主题。
14.这样的组合物具有使眼用溶液中的后生元保持稳定的配方。
15.具体地，本发明的组合物防止并实质上减少引起不稳定性现象，诸如源自蛋白的三级和四级结构的变化的蛋白聚集或其变性的后生元的蛋白组分。
16.根据第一方面，提供了用于眼外用使用的组合物，所述组合物包含
17.后生元，所述后生元是干酪乳杆菌(lactobacillus casei)种或副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)种的发酵产物，
18.缓冲体系，所述缓冲体系包含磷酸二氢钠特别是一水合物，磷酸氢二钠特别是十二水合物，
19.等渗剂，所述等渗剂包含氯化镁或氯化钙及其混合物，
20.生理上可接受的基于水的载体，
21.所述组合物具有包括6.7-6.9，优选地6.8至6.9的ph。
22.根据本发明的组合物还可以包含任何缓冲剂、等渗剂和防腐剂，如下文详细描述的。
23.由此获得的眼用组合物显示出在眼表面水平作用的惊人能力，并因此能够以高效
力和宽安全边际(safety margin)进行适于预防或治疗该眼部部分的疾病的外用疗法。新形式的疗法可以与用于相同疾病的其他已知疗法联合使用。
24.附图描述
25.图1：从对两个批次在25℃的长期稳定性条件下和在40℃加速条件下在t0和t6个月进行的抗粘附测定获得的微生物抑制百分比。数据代表三个重复的平均值
±
sem，并借助于单因素anova然后进行bonferroni检验进行统计分析。
26.图2：(a-b)根据stre方案在洗涤/不洗涤条件下测试的细胞活力百分比随制剂的标量浓度的变化。数据代表三个重复的平均值
±
sem，并通过单样品t检验对比50％截止值进行统计分析：
****
p《0.0001对比截止值洗涤条件；###p《0.001和####p《0.0001对比截止值不洗涤条件。
27.图3：(a-e)在40
±
2℃/75
±
5％rh加速稳定性条件下和25
±
2℃/60
±
5％rh长期稳定条件下，在图上作为研究时间的函数显示的ph、尺寸、重量渗透摩尔浓度、pz和pdi的值。
28.图4：(a-e)在加速稳定性条件40
±
2℃/75
±
5％rh下和长期条件25
±
2℃/60
±
5％rh下，在图上示出了ph、尺寸、重量渗透摩尔浓度、pz和pdi的值随研究时间的变化。
29.图5a：图示了在40℃保持三周的根据实施例2的含有在水和nacl中的后生元的制剂的照片再现，所述后生元是从副干酪乳杆菌cncm i-5220发酵获得的；
30.图5b：图示了在40℃保持一周的根据实施例2的含有在水和nacl中的后生元的制剂的照片再现，所述后生元是从副干酪乳杆菌cncm i-5220发酵获得的。
31.详细描述
32.本发明源自这样的发现：特定条件能够使得本文定义的含有后生元的组合物/水性溶液保持稳定并且防止或实质上减少其蛋白组分变性。
33.这些条件是a)使用合适的缓冲剂或缓冲体系将溶液的ph选择在6.7至6.9，优选地6.8至6.9的范围，和b)溶液中存在二价钙盐和二价镁盐，诸如氯化镁和氯化钙。
34.申请人还已观察到如何使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲剂获得对期望范围的ph的有效调节。
35.本发明的主题是如权利要求1定义的眼用组合物。
36.组合物的另外的实施方案在所附从属权利要求2-9中定义。
37.所述组合物的生物活性组分包括后生元，特别是来自属于干酪乳杆菌种或副干酪乳杆菌种的细菌菌株，优选地副干酪乳杆菌的发酵产物。
38.根据优选的实施方案，益生元是根据布达佩斯条约，于2017年7月26日以cncm(国家微生物保藏中心，巴斯德研究院，巴黎，法国(collection nationale de cultures de microorganismes,institut pasteur,paris,fr))编号i-5220提交的干酪乳杆菌菌株cncmi-1390。
39.根据一些实施方案，组合物含有0.05％至5％、0.1％至1.9％、0.2％至1％重量/体积(g/100ml)的量的后生元。
40.本发明的组合物含有包含磷酸二氢钠特别是一水合物、磷酸氢二钠特别是十二水合物的缓冲剂或缓冲体系。
41.优选地，一水合磷酸二氢钠/十二水合磷酸氢二钠之间的比率16/41＝0.39。
42.根据一些实施方案，组合物包含含有柠檬酸钠的另外的缓冲剂。
43.本发明的组合物包含至少一种选自氯化镁、氯化钙及其混合物的等渗剂。在优选的实施方案中，等渗剂包括氯化镁和氯化钙。优选地，氯化镁为六水合氯化镁，氯化钙为二水合物。优选地，六水合氯化镁/二水合氯化钙之间的比率＝10/7＝1.42。
44.根据一些实施方案，本发明的组合物包含含有甘油的另外的等渗剂。
45.通常，本发明的组合物含有本文描述的后生元被分散于其中的生理上可接受的基于水的载体。优选地，水是纯化的。
46.本发明组合物具有包括6.7至6.9，优选地6.8至6.9的ph。因此，组合物的组分：缓冲剂、等渗剂在本发明组合物中以能够获得6.7至6.9，优选地6.8至6.9的ph的量存在。
47.根据一种实施方案，本发明的组合物具有以下配方：
[0048][0049][0050]
根据优选的形式，组合物具有实施例3的配方。
[0051]
如本文定义的，本发明的组合物是稳定的。
[0052]
此外，在组合物中，以能够提供6.7至6.9的ph的量的磷酸二氢钠缓冲剂(优选地一水合物)和磷酸氢二钠(优选地十二水合物)与基于氯化镁和氯化钙的等渗剂的组合使组合物稳定。
[0053]
在本文件中，术语“稳定的”意指在40℃和25℃6个月，组合物具有的平均颗粒分散度(尺寸)≤200nm，特别是就后生元而言。因此，在测试条件下，没有发生归因于源自后生元的物质聚集物的形成的显著变化，即在25℃或40℃尺寸增加超过200nm。
[0054]
在本发明的范围内，术语后生元意指发酵的物种干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌或其混合物或物种干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌或其混合物的发酵产物，并且特别是副干酪乳杆菌cncm i-5220的发酵的产物。
[0055]
已经观察到，当根据任一种前述实施方案的组合物具有对上皮细胞的屏障作用时，由于存在于后生元中的生物表面活性剂、糖蛋白和有机酸和肽的混合物的存在，后生元的这些组分可以防止病原细菌结合到眼粘膜上。因此，组合物对眼感染进行预防作用或治疗。
[0056]
此外，组合物具有免疫调节活性，并且可用于预防和/或治疗眼过敏和/或炎症。
[0057]
组合物可以是单剂量或多剂量的形式。
[0058]
特别地，缓冲组分在组合物中以能够获得/保持包括5与8之间的ph的浓度存在，该
ph与眼组织和所携带的活性成分相容。
[0059]
优选地，组合物与泪液等渗，并且具有包括270mosm/kg-310mosm/kg的值。
[0060]
优选地，本发明的组合物是洗眼液或眼用凝胶。
[0061]
以多剂量配制的根据本发明的组合物还可以含有抗微生物防腐剂诸如，例如：对羟基苯甲酸酯、季铵盐、聚六亚甲基双胍(phmb)和其他可能包含在可用于眼用使用的组合物中的抗微生物防腐剂。组合物中使用的溶剂优选地是水或一种或更多种与外用眼用使用相容的组分的水性溶液。
[0062]
为了施用目的，上述组合物可以呈现为滴眼液或者液体或凝胶的形式。
[0063]
本发明的另一主题是如上文定义的组合物在制备用于治疗或预防眼炎症和/或过敏的药物中的外用眼用用途。
[0064]
本发明的组合物可用于治疗眼过敏、春季角膜结膜炎和干燥性角膜结膜炎和睑缘炎。
[0065]
本发明的组合物还可以应用于防止异物或微生物粘附到眼的表面，如下面的实施例1中实验展示的。
[0066]
以下实施例进一步说明了本发明，而不构成本发明的任何限制。
[0067]
实施例1
[0068]
在本实验研究中，使用了实施例3的配方，该配方含有来源于来自副干酪乳杆菌cncm i-5220的发酵过程的后生元，下文称为已开发不同测定用于评价两个批次的(r&d1907、r&d1908)组合物的抗粘附作用、安全性和稳定性。
[0069]
方法：
[0070]
使用抗粘附测定评价了制剂r&d1907和r&d1908相对于载体(vhc)对金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(s.a.)菌株atcc 43300的抗粘附特性。具体地，向每个孔添加200μl的每种制剂，并将板在4℃孵育18h。在这段时间后，测试品被取出并用相同体积的3
×
108ufc/ml的密度的s.a.atcc 43300的细菌悬浮液替换，并且将板在4℃孵育4h以促进微生物的粘附。4h后，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中进行两次洗涤以去除未粘附至孔的任何细菌悬浮液，而已粘附的微生物通过添加200μl的99％甲醇/孔并将板在室温(rt)孵育15分钟来固定。然后，去除甲醇并将板在37℃孵育5分钟，以使任何残留的甲醇蒸发。最后，通过向每个孔添加200μl的2％结晶紫，在室温持续5分钟，对粘附的微生物进行着色。然后，去除多余的染料，并通过添加200μl的33％冰乙酸/孔溶解与粘附的微生物结合的染料。通过在分光光度计上在595nm读取测量每孔的光密度。对所有批次在零时(t0)和6个月(t6)两个时间在25℃和40℃进行抗粘附测定。数据代表三个重复的平均值
±
sem，并通过单因素anova然后进行bonferroni检验进行统计分析。
[0071]
制剂的安全性谱在人类角膜上皮细胞系hce上借助于对标准方案进行修改的细胞毒性方案进行评估，该方案设想重复暴露于测试品持续短治疗时间(stre)。用r&d1907和r&d1908两个制剂以不同浓度(2.5％、5％、10％、20％、100％)重复(6x)处理细胞5分钟。每次处理后，该方案遵循两种不同的条件：
[0072]
洗涤：在hce上接触5分钟后，通过用pbs洗涤移除处理。该条件代表当眼睑闭合时在体内发生的情况，其中洗眼液的一部分被泪膜洗去。
[0073]
不洗涤：在hce上处理5分钟后，移除洗眼液而不进行任何洗涤。该条件代表先前
(洗涤)的“加剧(exasperated)”情况，并且可以与存在泪膜体积改变的情况相比。
[0074]
在所描述的两种方案中，在一次处理和下一次处理之间，存在在37℃在完全培养基中90分钟的“恢复”期。在经过所指示的时间后，通过mtt测定评价细胞活力。
[0075]
细胞活力值小于50％指示细胞毒性(db-alm：第17号方案)。
[0076]
为了评价制剂的稳定性谱，考虑了两种不同的温度条件：长期稳定性研究25
±
2℃/60
±
5％rh和加速条件40
±
2℃/75
±
5％rh。在稳定性研究期间，评价了以下化学/物理参数：不同时间区间(0、1、2、3和6个月)的ph值、重量渗透摩尔浓度和平均颗粒分布(尺寸)、ζ电位(pz)和多分散指数(pdi)。
[0077]
结果：
[0078]
抗粘附测试：被研究的所有批次的制剂都在两个测试温度展示出对s.a.atcc 43300的抗粘附活性，相对于vhc的微生物抑制值高达32.3％(图1)。此外，抗粘附效果作用表现为保持不变长达6个月。事实上，在任一制剂的时间t0和t6个月之间，或制剂本身(r&d1907、r&d1908)之间没有统计学显著差异。
[0079]
安全性评价：在hce上进行的关于细胞活力测定的结果已展示，批次r&d1907和r&d1908在根据stre方案进行处理后，在洗涤条件下或在不洗涤条件下在任何测试浓度均不是细胞毒性的(图2a-图2b)。
[0080]
稳定性研究：两批次的制剂的稳定性研究数据分别在图3(a-e)和图4(a-e)中作为随研究时间变化的图上提供。在稳定性研究期间，无论是加速稳定性条件下还是长期稳定性条件下，化学-物理参数(ph、尺寸、pdi、pz和重量渗透摩尔浓度)都没有突显的显著差异。产物可以被认为是稳定的。
[0081]
结论：
[0082]
结果表明，由于存在生物表面活性剂、蛋白和有机酸的混合物，眼外用制剂安全、稳定并且特征在于抗粘附活性。这些结果显示，这样的制剂对预防其中结膜上皮屏障功能受损的疾病，诸如眼感染、过敏和角膜结膜炎可以是有用的。
[0083]
实施例2
[0084]
为了验证在6.7至6.9特别是6.8至6.9的区间选择ph如何对于保持组合物稳定和防止来自生物活性后生元组分的蛋白级分的沉淀是非常重要的，进行了测试。
[0085]
测试的制剂的优选ph等于6.8-6.9(实施例3的制剂1)，而在不存在任何缓冲剂的含有从副干酪乳杆菌cncm i-5220的发酵获得的后生元——以下称为后生元——的溶液的ph等于6.3。
[0086]
本发明的组合物具有有助于维持后生元的蛋白的三级和四级三维结构使得它们不变性并且不形成聚集体的ph。批次r&d 1907和r&d 1908的平均颗粒分散(尺寸)数据是最佳的，因为它们具有≤200nm的尺寸，并且在40℃和在25℃二者直至6个月的稳定性研究期间，没有突显出任何显著变化，即没有由于形成聚集物的尺寸增加。
[0087]
钙盐、镁盐在制剂中的存在有助于稳定化，并且甘油除了具有等渗功能外，还具有增粘剂/悬浮剂功能。二价钙盐和镁盐的存在是非常重要的，因为它们可以引起与蛋白中存在的(-coo-)基团形成弱相互作用，稳定蛋白结构。
[0088]
对不存在磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(任选地水合物形式(例如第一种为一水合物且第二种为十二水合物)的缓冲体系但存在等渗剂的制剂的测试并没有导致稳定的制剂，
因为在40℃在1周的研究后已经在制剂中观察到沉淀的形成，如图5b中所示。
[0089]
制剂2
[0090]
组分功能％w/v后生元主要成分0.280nacl等渗剂0.720纯化水溶剂补足至100
[0091]
在以下具有等于5.6-5.8的ph值的缓冲剂(制剂3和制剂4)上进行了其他测试，但没有获得令人满意的结果，因为在两种情况下，在较低的后生元浓度(0.1％)，获得的平均颗粒分散度(尺寸)值都大于尺寸》200nm。样本尺寸高且不很均匀。这些因素是蛋白聚集和制剂不稳定性的指示。
[0092]
制剂3
[0093][0094]
表1.制剂3，在t＝1周时研究
[0095][0096]
制剂4
[0097]
组分功能％w/v后生元主要成分0.100na2hpo
4 12h2o缓冲剂0.415柠檬酸缓冲剂0.880纯化水溶剂补足至100ml
[0098]
表2.制剂4，在t＝1周时研究
[0099]
ph
1-5.78重量渗透摩尔浓度1osmol/kg0.239尺寸nm745.60pdi-0.689
[0100]
实施例3
[0101]
用于眼用使用的溶液的制剂
[0102]