通过MPC1抑制来激活皮肤干细胞的方法和皮肤干细胞激活剂与流程

通过mpc1抑制来激活皮肤干细胞的方法和皮肤干细胞激活剂
技术领域
1.本发明涉及通过mpc1抑制来激活皮肤干细胞的方法。


背景技术：

2.为了激活皮肤干细胞研究了各种各样的对策。例如，专利文献1公开了含有虾青素的干细胞的细胞老化抑制剂。专利文献2公开了含有羟脯氨酸或其药理学上容许的盐作为有效成分的间充质干细胞的干细胞性维持和活化剂。
3.分化细胞除糖酵解体系以外，还使用电子传递链而产生atp，因此活性氧在细胞内蓄积。另一方面，干细胞仅通过糖酵解体系产生atp，因此不产生活性氧，从而细胞被保护(非专利文献1)。报道了在鼠表皮中，重复处于s期的干细胞在nadh/nad+比高、糖酵解体系优势的夜间增加，而在nadh/nad+比低、电子传递链优势的白天减少的循环(非专利文献2)。另外，在进行了基因操作以使线粒体丙酮酸载体(mitochondrial pyruvate carrier(mpc1))的功能缺失而阻断在电子传递链中的途径的毛囊细胞中，显示干细胞的增殖被激活、毛发周期被促进(非专利文献3)。
4.在专利文献3中公开了含有线粒体转移促进剂的美容组合物，记载了该组合物对皮肤成纤维细胞、表皮角质形成细胞、来自脂肪的间充质干细胞、表皮干细胞和真皮干细胞的应用。专利文献4公开了断定被检测物质是否是改善角质形成细胞代谢的护肤活性剂的方法，包括将角质形成细胞暴露给应激源，然后检测分别与糖酵解和氧化磷酸化相关的代谢指标，从而各自针对应激源的应答等。专利文献5公开了断定或评价用于在化妆品组合物中使用的有效成分的协同作用的组合的方法：包括使细胞与第1和第2被检验物质接触，然后以非致死方式检测分别与糖酵解和氧化磷酸化相关的代谢指标，从而提供代谢途径对被检验物质的应答等。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2018-52879号公报
8.专利文献2：日本特开2019-26617号公报
9.专利文献3：日本特开2018-123130号公报
10.专利文献4：日本特表2015-534644号公报
11.专利文献5：日本特表2015-531881号公报
12.非专利文献
13.非专利文献1：journal of cell science 125(23),5597-5608
14.非专利文献2：stringari et al.,2015,cell reports 10,1-7,january 6,2015,http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.12.007
15.非专利文献3：nat cell biol.2017september；19(9):1017-1026.doi:10.1038/ncb3575.


技术实现要素：

16.发明要解决的课题
17.本发明的课题是提供激活皮肤干细胞的方法、皮肤干细胞激活剂、和皮肤干细胞激活剂的筛选方法。
18.用于解决课题的手段
19.本发明者们深入研究的结果，想到了通过mpc1抑制而阻碍向电子传递链的途径，由此激活皮肤干细胞，从而完成了本发明。
20.本技术包含下述的发明：
21.(1)美容方法，其中，通过应用mpc1抑制剂，从而激活皮肤干细胞。
22.(2)根据(1)所述的美容方法，所述mpc1抑制剂包含木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因的至少任一种作为有效成分。
23.(3)mpc1抑制剂，包含木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因的至少任一种作为有效成分。
24.(4)皮肤干细胞激活剂，包含mpc1抑制剂。
25.(5)根据(4)所述的皮肤干细胞激活剂，所述mpc1抑制剂包含木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因的至少任一种作为有效成分。
26.(6)皮肤干细胞激活剂的筛选方法，其中，以mpc1抑制作用作为指标。
27.(7)根据(6)所述的方法，包括以下工序：
28.使候选药剂接触皮肤试样的工序，
29.测定与候选药剂接触了的皮肤试样中的mpc1的活性、量和/或表达量的工序，
30.由所测定的mpc1的活性、量和/或表达量确定候选药剂的mpc1抑制作用的工序，和
31.基于所确定的mpc1抑制作用，选择皮肤干细胞激活剂的工序。
32.发明的效果
33.根据本发明，提供对于通过mpc1抑制而激活皮肤干细胞有效的制剂和方法。如果皮肤干细胞被激活，则对皮肤的老化抑制是有效的。
附图说明
34.图1是实验1-1的结果，是将分别添加了对照(cont)、uk5099(10μmuk5099、20μm uk5099)、棘霉素(10nm echinomycin、20nm echinomycin)的情况下的mcsp/b2m值，用以对照(cont)的结果作为1的相对值来表示的图。
35.图2是实验1-2的结果，是显示分别添加了对照(cont)、uk5099(20μmuk5099)的情况下的mcsp和dapi的表达的照片。
36.图3是实验1-2的结果，是显示分别添加了对照(cont)、uk5099(20μmuk5099)的情况下的整联蛋白β1和dapi的表达的照片。
37.图4是实验1-3的结果，显示没有添加抗体的情况下(negative cont)、添加了对照的情况下(cont)、添加了uk5099的情况下(20μm uk5099)的整联蛋白β1阳性细胞数。
38.图5是实验1-4的结果，是显示分别添加了对照(cont)、uk5099(1μmuk5099，10μm uk5099)并培养了4天的三维培养皮肤模型的组织切片中的整联蛋白α6、mcsp、和dapi表达的照片。
39.图6是实验1-5的结果，是显示分别添加了对照(cont)、uk5099(10μmuk5099)并培养了5天的人皮肤器官培养模型组织切片中的整联蛋白α6、mcsp、和dapi表达的照片。
40.图7是实验2-2的第一次筛选的结果，将添加了对照(dmso；control)、各评价对象试样(药剂no.1～124)的情况下的mpc1/b2m值，用以对照的结果作为1.0时的相对值表示。
41.图8是实验2-2的第二次筛选的结果，将添加了经第一次筛选选定的各评价对象试样(药剂no.1～124中的37个样品)的情况下的mpc1/b2m值，用以对照(dmso)的结果作为100.0时的比例(相对于对照的％)表示。
42.图9是实验2-2的第三次筛选的结果，将添加了对照(dmso；cont)、经第二次筛选选定的各评价对象试样(药剂no.1～124中的15个样品)的情况下的mpc1/b2m值，用以对照(dmso)的结果作为100.0时的比例(相对于对照的％)表示。
43.图10显示分别对于经实验2-2的第三次筛选选定的6个样品，将图9的结果通过dunnett检验(dunnett’s test)施以统计处理的图(*p＜0.05，**p＜0.01)。
具体实施方式
44.本发明者们想到了通过mpc1抑制来激活皮肤干细胞，发现了具有mpc1抑制作用的新物质。特别是发现了木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因具有高mpc1抑制作用。
45.本发明基于该认识，提供mpc1抑制剂和皮肤干细胞激活剂(以后有时将这些总称为“本发明的制剂”)、其筛选方法、以及通过应用它们来激活皮肤干细胞的方法。本发明的方法有时是以美容为目的的方法，有时不是由医生和/或医疗从业人员进行的治疗。
46.mpc1与mpc2形成异源二聚体，是形成作为向线粒体内部输送丙酮酸的转运体的线粒体丙酮酸载体的蛋白质。所谓mpc1抑制，是指减低和/或阻碍mpc1的工作、产生、和/或翻译，以及/或者使mpc1的活性、量、和/或表达量减少。作为mpc1的工作，例如可以举出mpc1向线粒体内部输送丙酮酸的功能。在某个实施方式中，mpc1抑制可以是指与不施与本发明的制剂的状态(对照)相比，在施与了本发明的制剂的情况下，mpc1的活性、量、和/或表达量以例如显著性水平为5％的统计学上的显著性差异(例如dunnett检验)减少，或例如减少5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。
47.mpc1的表达量例如可以如实施例那样利用定量pcr法测定基因表达量，也可以通过使用抗体进行染色来测定蛋白质表达量，也可以使用市售的试剂盒测定，或者可以根据专利文献3等文献中记载的方法求得，不限定于此，可以使用任意的公知技术。
48.在本说明书中，所谓皮肤干细胞的激活，是指促进角质形成细胞和/或成纤维细胞这样的皮肤的细胞中的干细胞的增殖。干细胞的增殖可以通过干细胞数的计数、整联蛋白β1等干细胞标志物的表达量的测定等确定。如果皮肤干细胞被激活，则可以期待更新的促进、肌肤的在时、肌肤纹理的改善、从粉刺和/或色素沉积这些不优选的肌肤状态的早日恢复等。
49.本发明的mpc1抑制剂可以由木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物、和/或麦角硫因组成，或可以含有木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物、和/或麦角硫因作为有效成分。但是，只要是能够抑制mpc1的物
质，就不限定于此。
50.本发明的制剂可以单独含有上述有效成分的任何一种，也可以以任意的组合及比率含有两种以上。
51.本发明的制剂可以将上述有效成分与一种或两种以上其它成分、例如赋形剂、载体和/或稀释剂组合。
52.木通(akebia quinata)是属于木通科木通属的落叶灌木。有报道木通具有透明质酸生成促进效果、胶原蛋白生成促进效果和mmp抑制效果，具有皱纹形成防止/改善效果、脂肪酶抑制活性、血中中性脂肪浓度升高抑制活性、或抗肥胖活性(日本特开2015-17048号公报、日本特开2010-265182号公报等)。作为本发明中使用的木通提取物，优选木通的茎的提取物，由于在木通的果实、果皮、种子、叶、花、根等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任一种或两种以上的提取物。
53.黑豆(glycine max(l.)merr.)是作为豆科的一年生草本植物的大豆的品种，可以使用“丹波黑”、“和知黑”等的各品种。有关于富含花色素苷等多酚，来自黑豆的成分有抗肥胖作用、抗炎症作用、抗氧化作用、糖耐量改善作用等(日本特开2015-140298号公报等)的报道。黑豆提取物优选黑豆的豆果的提取物，由于在黑豆的鞘、叶、茎、花、根等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任一种或两种以上的提取物。
54.芍药(paeonia lactiflora)是牡丹科的多年生草本植物。有报道芍药有表皮增厚抑制作用、vegf产生促进作用、igf-1产生促进作用、hgf产生促进作用、和bmp-2产生促进作用等(日本特开2019-11252号公报、日本特开2012-121856号公报等)。芍药提取物优选芍药的根的提取物，由于在芍药的叶、茎、花、果实、果皮、种子等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任一种或两种以上的提取物。
55.茶(camellia sinensis)是山茶科山茶属的常绿树，可以使用茶树(camellia sinensis var.sinensis)、普洱茶(camellia sinensis var.assamica)等的各品种。例如可以使用宇治茶等。已知茶中富含儿茶素等多酚，具有脂质代谢改善作用、抗氧化作用、抗癌作用、血压升高抑制作用等。茶提取物优选茶的叶和/或茎的提取物，由于在茶的果实、花、根、种子等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任一种或两种以上的提取物。
56.油蜡树(simmondsia chinensis)是属于石竹目油蜡树科的常绿灌木。已知油蜡树有保湿作用、润肤作用、抗炎症作用、胶原酶抑制效果、弹性蛋白酶抑制效果、透明质酸酶抑制效果等(日本特开2003-48846号公报、日本特开2003-048812号公报、日本特开2003-034644号公报等)。油蜡树叶提取物是油蜡树的叶提取物，由于在油蜡树的种子、果实、花、根等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任一种或两种以上的提取物。
57.麦角硫因(l-ergothioneine)是具有以下结构的分子量为229.3的氨基酸，已知具有抗氧化、抗炎症作用、弹性蛋白酶抑制作用、酪氨酸酶抑制作用等(日本特开2019-149972号公报等)。麦角硫因可以化学合成，或者由于或也包含在担子菌类等微生物和/或动植物等中，因此可以以这样天然物的提取物等形态使用。
58.59.上述各种提取物可以使用作为化妆品原料和/或健康食品材料的市售品，也可以根据常规方法获得。提取方法没有特别限定，可以举出使用溶剂的提取法、利用水解的提取法。在进行使用溶剂的提取时，将原料与提取溶剂一起常温或加热地进行浸渍或加热回流后，在进行利用水解的提取时，例如可以进行了利用碱、酸等的化学处理、利用热、压力等到物理处理、利用酶等的生物处理等任意的水解处理后，过滤、浓缩而获得。也可以直接使用原料，但粉碎成颗粒状和/或粉末状供与提取可以在温和的条件下在短时间以高提取效率进行有效成分的提取。提取温度没有特别限定，可以根据粉碎物的粒径和/或溶剂的种类等适当设定。通常设定在室温至溶剂的沸点的范围内。此外，提取时间也没有特别限定，可以根据粉碎物的粒径、溶剂的种类、提取温度等适当设定。并且在提取时可以进行搅拌，也可以不搅拌进行静置，也可以施加超声波。
60.作为提取溶剂，只要是通常提取使用的溶剂，就可以任意使用，例如可以分别单独或组合使用水性溶剂，例如水、生理盐水、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液，或有机溶剂，例如乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等醇类、水合醇类、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等。
61.通过这样的提取操作，有效成分被提取，溶解进溶剂中或被水解。包含提取物的溶剂或水解物可以直接使用，也可以施加灭菌、洗涤、过滤、脱色、除臭等惯用的纯化处理后使用。此外，也可以根据需要通过冷冻干燥等浓缩或用任意溶剂稀释后使用。并且，还可以全部使溶剂或水解物挥发制成固体状(干燥物)之后使用，也可以将该干燥物再溶解在任意溶剂中之后使用。
62.此外，由于在通过压榨原料而得的压榨液中也包含与提取物同样的有效成分，因此也可以使用压榨液来代替提取物。
63.此外，本技术也提供包含本发明的制剂的组合物。本发明的组合物可以是化妆品组合物或食品组合物。本发明的组合物例如可以是介由mpc1抑制作用而激活皮肤干细胞的组合物。
64.应用本发明的制剂或组合物的对象例如可以是肌肤的更新停滞、皮肤老化、色素沉积这样的从客观或主观上的观点考虑需要皮肤干细胞激活的对象，也可以是在预防上希望皮肤干细胞激活的对象。
65.本发明的制剂或组合物可以通过外用施与或口服施与等任意途径应用，优选与能够直接应用于皮肤的皮肤外用剂混配。作为外用施与的形态，例如可以任意选择液状、乳液状、乳膏状、固体状、片状、喷雾状、凝胶状、泡状、粉末状等。可以是乳液、乳膏、美容液、化妆水、面膜、洗面奶等化妆品组合物。作为口服施与的形态，例如可以任意选择片剂、补充剂、饮料、粉末等。本发明的制剂或组合物可以在不损害其效果的范围根据需要适当混配在化妆品和/或药品等组合物中使用的任意混配成分。作为所述任意混配成分，例如可以举出赋形剂、载体、稀释剂、油分、表面活性剂、粉末、色素、水、醇类、增稠剂、螯合剂、有机硅类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、ph调节剂、中和剂等。还可以包含例如促进皮肤干细胞激活的其它药效成分等。
66.另外，施与频率可以任意选择4周1次、2周1次、1周1次、3天1次、2天1次、1天1次、1天2次、1天3次、1天4次、1天5次、按需施与等，但不限定于此。
67.但是，本发明的制剂和/或组合物可以采取的形态不限定于上述剂型和/或形态。
68.本发明的制剂或组合物中的木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因等有效成分的混配量可以根据种类、目的、形态、利用方法等适当确定。例如木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物、和/或麦角硫因的混配量相对于本发明剂或组合物的总重量可以为0.0001～100重量％、0.0001～90重量％、0.001～50重量％、0.01～5重量％、0.01～1重量％、0.1～0.5重量％等，只要发挥本发明的效果，就没有限定。
69.并且，本技术也提供以mpc1抑制作用作为指标的皮肤干细胞激活剂的筛选方法。本发明的筛选方法可以包括：使候选药剂接触皮肤试样的工序；测定与候选药剂接触了的皮肤试样中的mpc1的活性、量、和/或表达量的工序；由所测定的mpc1的活性、量、和/或表达量确定候选药剂的mpc1抑制作用的工序；基于所确定的mpc1抑制作用，选择皮肤干细胞激活剂的工序。根据本发明的方法，能够对于候选药剂是否具有皮肤干细胞激活作用进行筛选，能够进行制品开发和/或提出新的皮肤护理方案。
70.皮肤试样可以是采取后的皮肤试样，例如从人等动物采取后离体(ex vivo)状态的皮肤试样，也可以是培养皮肤细胞，例如培养角质形成细胞或培养成纤维细胞这样的体外(in vitro)的状态。或者也可以是三维皮肤模型等人工皮肤试样。皮肤试样只要能够测定mpc1抑制作用，就没有限定。
71.此外，本技术也提供介由mpc1抑制而激活皮肤干细胞的木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物、和/或麦角硫因。
72.实施例
73.接着通过实施例进一步详细地说明本发明。另外，本发明不限定于此。
74.实验1：mpc1抑制对干细胞的影响
75.实验1-1：利用pcr法的mcsp的基因表达分析
76.为了调查由抑制mpc1带来的对干细胞的影响，使用公知的uk5099作为mpc1抑制剂，分析作为表皮干细胞标志物的黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，mcsp)的表达。
77.细胞培养
78.将来自正常人胎儿的表皮角质形成细胞(sciencell社，cat no.2120)在表皮角质形成细胞培养培养基(
クラボウ
社，kk-2150s)中培养。在传代后以2.5
×
105个细胞/孔/2ml接种于六孔板(6well plate)中，在24小时后分别添加uk5099、对照、棘霉素。棘霉素与mpc1同样地是控制线粒体活性的hif-1α的抑制剂，但在是进行线粒体内的由丙酮酸向乙酰辅酶a的转换抑制阻碍的物质这点是不同的。为了研究激活表皮角质形成细胞的干细胞的，是阻碍向线粒体内的丙酮酸输送的途径、还是阻碍线粒体内的由丙酮酸向乙酰辅酶a的转换的途径，使用了棘霉素。uk5099(
メルク
社制造：商品目录号504817)预先用dmso稀释成10mm和20mm的浓度而制成储备溶液，以1000倍稀释添加到培养基中，由此使得终浓度为10μm和20μm。对照以1000倍稀释添加dmso。棘霉素(abcam公司制造echinomycin：制品号ab144247)预先用dmso稀释成10μm和20μm的浓度而制成储备溶液，以1000倍稀释添加到培养基中，由此使得终浓度为10nm和20nm。添加这些物质24小时后，回收mrna。
79.利用定量pcr法的基因表达分析
80.由药剂添加24小时后的细胞的rna回收使用quiagen rneasy mini kit(quiagen
社)，cdna的合成使用superscript vilo cdna synthesis kit(thermo fisher scientific社)进行。mcsp和b2m的基因表达量使用platinum sybr green qpcr supermix-udg(invitrogen japan,tokyo,japan)通过syber green法进行。所使用的底物如下。
81.b2m正向引物:5
’‑
gtgggatcgagacatgtaagca-3’(序列号1)
82.b2m反向引物:5
’‑
caatccaaatgcggcatct-3’(序列号2)
83.mcsp正向引物:5
’‑
cacggctctgaccgacatag-3’(序列号3)
84.mcsp反向引物:5
’‑
cccagccctctacgacagt-3’(序列号4)
85.将结果示于图1。如果添加uk5099，则mcsp的表达浓度依赖性地增加。另一方面，如果添加棘霉素，则mcsp的表达减少。由这些结果提示，通过mcp1抑制而干细胞被激活。
86.实验1-2：利用细胞染色的mcsp和整联蛋白β1的蛋白质表达分析
87.进而，不仅mcsp，对于作为其它干细胞标志物的整联蛋白β1进行细胞染色并分析。
88.与实验1-1同样地添加传代的表皮角质形成细胞并使uk5099为20μm，作为对照，不用uk5099处理地添加等量的dmso，以1.0
×
104个细胞/孔/0.5ml接种于四孔腔式载玻片(4well chamber slide，falcon社，354114)中培养48小时。在添加48小时后使细胞在4％pfa中反应10分钟，进行固定。其后使其在0.01％triton-x100/pbs中反应15分钟，使细胞膜部分溶解。用12％bsa/pbs封闭后，使其在作为一抗的抗mcsp抗体(millipore,mab2029,小鼠mab)、抗β1整联蛋白抗体(santa cruz,sc-13590,小鼠mab)中4℃下反应一夜。第二天，用pbs洗涤3次，每次5分钟，然后，使其在作为二抗的alexa488抗小鼠igg抗体中室温反应1小时。，用pbs洗涤3次，每次5分钟，然后，用包含dapi的封闭剂(vectashield,h-1200)封闭，进行显微镜观察。
89.将分别添加了20μm的uk5099、对照的结果示于图2、3。如果添加uk5099，则mcsp和整联蛋白β1的表达量均增加，形成与实验1-1的结果一致的结果。
90.实验1-3：整联蛋白β1阳性细胞的facs分析
91.接着，进行整联蛋白β1阳性细胞数的facs分析。与实验1-1同样地添加传代的表皮角质形成细胞并使uk5099为20μm，作为对照，不用uk5099处理地添加等量的dmso，培养48小时。用trypsin剥离这些细胞，以1.0
×
106个细胞/500ul的浓度制备细胞悬浮液。在经离心除去上清后，用在冰上的0.5％bsa/pbs封闭10分钟。经离心除去上清后，将igg抗体、pacific blue标记抗β1整联蛋白抗体(biolegend,313620)加入到细胞悬浮液中使其在冰上反应1小时，用0.1％bsa/pbs离心洗涤3次，用细胞分选仪sh800进行facs分析。此外，作为阴性对照(negative cont)，不添加抗体进行同样的处理。
92.将结果示于图4。如果添加uk5099，则整联蛋白β1阳性细胞数增加，形成与实验1-1及实验1-2的结果一致的结果。
93.实验1-4：利用组织染色的mcsp和整联蛋白β1的蛋白质表达分析
94.接着，使用mattek社制皮肤模型eft-400，在培养基中添加uk5099使其为1μm和5μm，作为对照，不经uk5099处理地添加等量的dmso以2.5ml/孔培养皮肤模型。在两天后交换培养基，从培养开始起4天后使其浸渍在冷藏丙酮中脱水固定。其后，用室温丙酮、室温的苯甲酸甲酯进行两次溶剂置换、用室温的二甲苯进行两次溶剂置换，进行石蜡包埋，由此制作成石蜡块。用切片机以3μm的厚度制作成切片。用二甲苯进行脱石蜡，用12％bsa/pbs封闭后，使其在作为一抗的抗mcsp抗体(millipore,mab2029,小鼠mab)、抗α6整联蛋白抗体
(santa cruz,sc-19622,大鼠mab)中4℃反应一夜。第二天，用pbs洗涤3次，每次5分钟，然后，使其在作为二抗的alexa488抗小鼠igg抗体和alexa594抗大鼠igg抗体中室温反应1小时。用pbs洗涤3次，每次5分钟，然后，用包含dapi的封闭剂(vectashield,h-1200)封闭，进行显微镜观察。
95.将分别添加了1μm和5μm的uk5099、对照的结果示于图5。如果添加uk5099，则mcsp和整联蛋白β1表达细胞增加，即使使用三维皮肤模型也会形成与实验1-1、1-2、1-3的结果一致的结果。
96.实验1-5：利用组织染色的mcsp和整联蛋白β1的蛋白质表达分析
97.接着，使用从biopredic社购买的新鲜人腹部皮肤，在培养基中添加uk5099使其为10μm，作为对照，不经uk5099处理地添加等量的dmso，以3ml/孔培养。在2天后、4天后交换培养基，从培养开始在5天后使其浸渍在冷藏丙酮中脱水固定。其后，用室温丙酮、室温的苯甲酸甲酯进行两次溶剂置换、用室温的二甲苯进行两次溶剂置换，进行石蜡包埋，由此制作成石蜡块。用切片机以3μm的厚度制作成切片。用二甲苯进行脱石蜡，用12％bsa/pbs封闭后，使其在作为一抗的抗mcsp抗体(millipore,mab2029,小鼠mab)、抗α6整联蛋白抗体(santa cruz,sc-19622,大鼠mab)中4℃反应一夜。第二天，用pbs洗涤3次，每次5分钟，然后，使其在作为二抗的alexa488抗小鼠igg抗体和alexa594抗大鼠igg抗体中室温反应1小时。用pbs洗涤3次，每次5分钟，然后，用包含dapi的封闭剂(vectashield,h-1200)封闭，进行显微镜观察。
98.将分别添加了10μm的uk5099、对照的结果示于图6。如果添加uk5099，则mcsp和整联蛋白β1表达细胞增加，即使使用离体(ex vivo)的人皮肤试样，也会形成与实验1-1、1-2、1-3、1-4的结果一致的结果。
99.实验2：具有mcp1抑制作用的物质的筛选
100.由实验1提示，如果抑制mcp1，则干细胞被激活。于是，进行具有mcp1抑制作用的物质的筛选。
101.实验2-1：试样的调制
102.作为mpc1抑制作用的评价对象试样使用以下物质。
103.表1
[0104][0105]
包括其它动植物的提取物这样的来自天然的成分、合成成分在内，总计制备124种候选试样。
[0106]
实验2-2:mcp1抑制作用的评价
[0107]
与实验1-1同样地培养来自正常人胎儿的表皮角质形成细胞，在接种24小时后添加各药剂。候选试样预先用dmso将其制成为10％进行第一次筛选，第二次筛选中以1000倍稀释加入到培养基中使其终浓度为0.01％，第三次筛选中以10000倍、1000倍、100倍稀释加入到培养基中使其终浓度为0.001％、0.01％、0.1％。用与实验1同样的方法添加uk5099使其为20μm作为阳性对照。以1000倍稀释添加dmso作为阴性对照。在添加各药剂24小时后回收mrna。
[0108]
利用定量pcr法的基因表达分析
[0109]
由药剂添加24小时后的细胞rna回收使用quiagen rneasy mini kit(quiagen社)，cdna的合成使用superscript vilo cdna synthesis kit(thermo fisher scientific社)进行。mpc1和b2m的基因表达量使用platinum sybr green qpcr supermix-udg(invitrogen japan,tokyo,japan)通过syber green法进行。使用的底物如下。
[0110]
b2m正向引物:5
’‑
gtgggatcgagacatgtaagca-3’(序列号1)
[0111]
b2m反向引物:5
’‑
caatccaaatgcggcatct-3’(序列号2)
[0112]
mpc1正向引物:5
’‑
gtgcggaaagcggcggacta-3’(序列号5)
[0113]
mpc1反向引物:5
’‑
ggcagcaatgggaagacccca-3’(序列号6)
[0114]
第一次筛选在n＝1、药剂浓度0.01％下进行。将第一次筛选的结果示于图7。从124个样品选定37个样品(图7中所示的线以下的物质)作为具有mpc1抑制作用的物质的候选。
[0115]
对于第一次筛选中选定的37个样品，以药剂浓度0.01％在n＝3下进行第二次筛选。将第二次筛选的结果示于图8。从37个样品选定15个样品(图8中所示的深灰色的物质)作为浓度依赖性地具有mpc1抑制作用的物质的候选。
[0116]
对于第二次筛选中选定的15个样品，在药剂浓度0.001％、0.01％、0.1％、各n＝3
下进行第三次筛选。将第三次筛选的结果示于图9。从15个样品中选定木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因6个样品(图9中所示的的深灰色的物质)作为具有重现性且浓度依赖性地具有mpc1抑制作用的物质的候选。
[0117]
对于选定的6个样品，分别将通过dunnett检验(dunnett’s test)对图9的结果实施统计处理而得的图示于图10。如图10所示，全部物质浓度依赖性且具有统计学的显著性差异地发挥mpc1抑制作用。
[0118]
由以上结果可知，通过mcp1抑制而皮肤干细胞被激活，以及木通提取物、黑豆提取物、芍药提取物、茶提取物、油蜡树叶提取物和麦角硫因具有mcp1抑制作用。如果通过本发明的mcp1抑制剂而皮肤干细胞被激活，则对皮肤的老化抑制是有效的。