1.本领域涉及新型疫苗组合物及其方法，其中第一血清型或亚血清型的o-抗原用于产生针对不同血清型或亚血清型的一种或多种o-抗原的免疫应答。
2.背景志贺氏菌感染在全世界流行，但主要的疾病负担在发展中国家。2017年全球疾病负担研究(global burden of disease study 2017)估计，志贺氏菌引起157万由腹泻感染引起的死亡中的15.2%(即238,000)(1)，其中98.5%的志贺氏菌死亡发生在低收入和中等收入国家中。5岁以下的儿童占死亡的33%。与这些全球估计一致，前瞻性全球肠道多中心研究(gems)发现，志贺氏菌病是撒哈拉以南非洲和南亚的7个地点5岁以下儿童中的中度至重度腹泻(msd)的主要原因之一(2)。在分型的1120种分离株中，宋内志贺氏菌是优势物种，但在不同地点发现一系列福氏志贺氏菌血清型。总体而言，主要的福氏志贺氏菌血清型是福氏志贺氏菌2，但血清型和亚型的分布根据位置而不同。例如，在孟加拉国地点中，顺序为福氏志贺氏菌2a、2b、3a、6、1b、4a和y(未检测到x)；在肯尼亚，顺序反而是6、1b、3a、4a、2b和2a(未检测到1a、x和y)。
3.对低收入和中等收入国家中的16,587例报告病例的综合文献调查将gems结果扩展至35个国家(3)。这些数据，甚至在who区域层面汇总，也显示血清型频率的重大差异：福氏志贺氏菌2是非洲(afro)、美洲(amro)、东南亚(searo)和西太平洋(wpro)地区最常见的血清型；但福氏志贺氏菌6在东地中海地区(emro)最常见。第二最常见的血清型变异更大：afro中的福氏志贺氏菌1，emro中的福氏志贺氏菌2，searo中的福氏志贺氏菌3，amro中的福氏志贺氏菌3和福氏志贺氏菌4两者以及wpro中的福氏志贺氏菌4。甚至不考虑不太常见的血清型(其仍然引起疾病负担的很大部分)，这些数据也强调如果基于血清型或亚型特异性免疫原，制备广泛特异性疫苗的困难。
4.开发中的志贺氏菌疫苗涵盖一系列方法和抗原(4,5)。几乎所有志贺氏菌疫苗都包括脂多糖(lps)的o抗原(oag)组分，其被认为是一种保护性抗原(6)，但该抗原会将疫苗效力限制为(i)同源保护或(ii)与仅由oag定义的其他能够提供保护的血清型的那些交叉反应。
5.除了血清型6以外，福氏志贺氏菌的所有血清型和亚血清型均共享共同的oag骨架(7,8)，其具有以下重复：。
6.向骨架糖添加葡糖基或o-乙酰基残基产生对不同血清型特异性的oag结构。负责修饰骨架的酶在可动元件上编码，并且新的福氏志贺氏菌血清型和亚型可能通过细菌噬菌体介导的oag修饰基因的整合而出现(9,10)。血清型福氏志贺氏菌1、2、3、4、5和x由通过糖基化产生的类型特异性(i、ii、iii、iv、v和x)定义(血清型i、ii、iv、v和x)。类型特异性iii(福氏志贺氏菌3)由鼠李糖i上的乙酰化和定义其他类型特异性的葡萄糖基化的缺失定义。福氏志贺氏菌y不含任何这些取代，并且由不存在血清型特异性来定义。血清型y中存在的多糖的特征在于标记的双组o-因子3,4的两种抗原特异性。定义此o-因子的结构域尚未完
全鉴定。在一些情况下，其表现是模棱两可的，因为菌株在o-抗原结构中在其他方面相同，并且其他免疫决定簇的存在可能表达或可能不表达o-因子3,4(例如以前的血清型3b和3c，其已被提出组合成一种血清型3b [10])。3,4因子与该结构有关，因此其可以被其他特异性掩盖。多糖可以通过向不同的糖添加各种化学基团(α-d-吡喃葡萄糖基、o-乙酰基、磷酸乙醇胺)进行修饰，产生非常多样化的o-抗原结构，并且相应地产生血清学异质性，这是对福氏志贺氏菌菌株进行血清分型的基础(11)。福氏志贺氏菌6不共享共同的骨架。相反，其具有两个鼠李糖重复(11)、一个半乳糖醛酸和一个n-乙酰半乳糖胺(8)。。
[0007]
尽管系统发生不类似(福氏志贺氏菌6在鲍氏志贺氏菌簇中)(12)，但福氏志贺氏菌6与福氏志贺氏菌物种特异性抗血清反应，可能是因为三糖
→
3)-β-d-galpnac-(1
→
2)-a-l-rhap
iii-(1
→
,2)-α-l-rhap
ii-(1
→
的相似性，其穿过其他福氏志贺氏菌血清型中相邻重复序列之间的连接。
[0008]
福氏志贺氏菌的所有血清型(包括福氏志贺氏菌血清型6)都可以具有额外的修饰，涉及用葡萄糖、乙酸酯或磷酸乙醇胺取代，这对于几种血清型是常见的并且生成群特异性6；7,8；9；10；iv-1或具有作为未修饰重复单元的一部分的群特异性3,4。福氏志贺氏菌非6血清型的o抗原高度多样化，这是由于对基础结构的各种化学修饰，产生观察到的血清学异质性。o-抗原簇之外的几种基因参与该修饰，所述修饰发生在o-单元组装之后和成熟o-多糖转移至lps的脂质a-核心区域之前。o-抗原在福氏志贺氏菌的发病机制中发挥重要作用；具体地，其保护细菌免于血清补体的裂解作用，并促进细菌对肠上皮细胞的粘附和内化。通过o-抗原修饰产生抗原多样性被认为是福氏志贺氏菌的重要毒力因子，其增强病原体的存活，因为宿主必须对每种血清型产生特异性免疫应答。此外，在某些位点的修饰诸如糖基化促进由iii型分泌系统介导的福氏志贺氏菌侵入宿主细胞[11]。
[0009]
这些类型和群特异性以各种组合存在(迄今为止已经报道至少31种)(11)，并生成共享的表位，其为由交叉反应疫苗引发的抗体的潜在靶标。
[0010]
这是noriega等人(13)的研究的基础，noriega等人在豚鼠中的攻击研究中测试福氏志贺氏菌2a和福氏志贺氏菌3a的二价疫苗，其被预测经由其群特异性针对大多数分离株进行保护。在结膜炎模型中，这实现了针对血清型1b、2b、5b和y的保护(如基于共享的群特异性所预测)，但对于血清型1a和4b不是如此(与预测相反)。noriega等人预测，该疫苗不会针对福氏志贺氏菌6进行保护。然而，随后的工作已经鉴定了所有已知的福氏志贺氏菌6和一些福氏志贺氏菌2a分离株共有的表位9 (11)。因此，如果保护可以通过群特异性介导，并且如果在noriega等人中使用的福氏志贺氏菌2a分离株具有9特异性，则可以预期其具有保护性。
[0011]
因此，对福氏志贺氏菌6和福氏志贺氏菌2a之间共享群特异性的鉴定表明，群特异性不能预测交叉保护，因为如果是的话，noriega等人就已经通过用福氏志贺氏菌2a o-抗原接种疫苗看到福氏志贺氏菌6的交叉保护。与noriega等人的预测相反，本发明人已经令人惊讶地发现福氏志贺氏菌2a没有针对血清型1b进行保护(本文的表2)。此外，尽管noriega等人的假设是福氏志贺氏菌3a会赋予针对血清型1b、2b、5b和y的交叉保护，但本文的表2令人惊讶地显示不赋予针对福氏志贺氏菌2b的保护。noriega等人不能检测到这些预期的交叉保护的缺乏，因为他们没有进行用单独的血清型2a和单独的血清型3a的对照接种
疫苗。仅进行用组合的血清型2a和3a的接种疫苗，掩盖了预测的交叉保护中的缺口。
[0012]
据我们所知，在noriega等人之外，交叉保护的证据在文献中限于：farzam等人, 2017(31)发现用福氏志贺氏菌2a o-抗原缀合物免疫的小鼠没有引发与福氏志贺氏菌6 o-抗原反应的抗体，而来自用福氏志贺氏菌2a o-抗原缀合物免疫的人的血清确实引发与福氏志贺氏菌6 o-抗原结合的抗体，但得出结论“福氏志贺氏菌2a疫苗本身将不足以针对两种类型进行保护”(参见第4995页，右栏，第二完整段落，第4-5行)。有趣的是，本发明人已经发现用福氏志贺氏菌2a接种疫苗没有在血清杀细菌测定(sba)中诱导杀死福氏志贺氏菌6，表明针对福氏志贺氏菌6感染的保护是通过除了补体介导的血清杀伤以外的方式介导的。
[0013]
ferrecio等人，1991 (37)在覆盖8609个儿童观察月的初始阶段期间追踪了一组年幼儿童，其中87个儿童具有宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌2a或福氏志贺氏菌6感染的首次经历。在对这87个的1200个儿童月的随访中记录新的感染。作者得出结论，存在针对宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌2a和福氏志贺氏菌6的菌株特异性保护，但在自然感染后没有对其他血清型的交叉保护。研究中出现任何福氏志贺氏菌血清型的感染数量不足，无法提供保护水平的统计学有效的指示。福氏志贺氏菌6感染水平最接近于统计学意义，但表明福氏志贺氏菌2a没有针对福氏志贺氏菌6进行保护。其他血清型的福氏志贺氏菌感染如此之少，使得不可能得出福氏志贺氏菌2a是否可能对其他福氏志贺氏菌血清型具有任何影响的结论。
[0014]
mel等人, 1971 (38)是对两种二价口服活疫苗的现场试验。疫苗a组合福氏志贺氏菌1与福氏志贺氏菌2a。疫苗b组合福氏志贺氏菌3与宋内志贺氏菌。没有对照。疫苗试验设计中的隐含假设是免疫是血清型特异性的，因为效力是通过两种疫苗中每种检测到的血清型的情况的差异来判断的。数据表明疫苗a针对福氏志贺氏菌1与福氏志贺氏菌2a是有效的(如所预期)，但疫苗b仅可以针对宋内志贺氏菌得到证实。由于在疫苗a组中仅检测到1例福氏志贺氏菌3，但在疫苗b组中检测到3例，所以福氏志贺氏菌3的结果是不确定的。
[0015]
karnell等人, 1992 (39)通过用减毒y菌株感染给恒河猴接种疫苗，并报道它们针对随后用毒性福氏志贺氏菌1b、2a和y (注意，福氏志贺氏菌y包含除了血清型6以外的所有福氏志贺氏菌的基础o-抗原结构)的攻击受到保护。然而，所有猴都对福氏志贺氏菌1、2a和y lps具有显著的接种疫苗前滴度，提高了保护是由于研究前感染引起的非特异性因素的可能性。由于他们在保护中没有看到血清型特异性，所以由他们的疫苗引发的任何保护似乎是由o-抗原以外的东西介导的。一种可能性是在血清型之间保守的外膜蛋白。
[0016]
尽管在noriega等人中看到一些交叉保护是令人鼓舞的，但即使如此，其结果表明，这种二元组合在现场的预期覆盖范围是有限的，因为在全球，福氏志贺氏菌1b、4b和6负责近似相等的疾病负担，排在福氏志贺氏菌2a和3a之后。为了解决这一点，livio等人提出在组合疫苗中包括福氏志贺氏菌6 (14)。然而，这仍然会使人们无法针对福氏志贺氏菌4 (美洲和西太平洋地区第二常见的福氏志贺氏菌血清型)受保护(3)。基于noriega等人的数据，福氏志贺氏菌4b在豚鼠中不受福氏志贺氏菌2a/3a组合的保护，并且这些作者假设福氏志贺氏菌6不会针对福氏志贺氏菌4b进行交叉保护。
[0017]
由于发现共享的群特异性不能预测交叉保护，因此不清楚哪些交叉反应会导致交叉保护，以及因此，疫苗中必须呈现多少菌株以获得足够的菌株覆盖范围才能存活。这是一个关键问题，因为疫苗成本随着复杂性而增加，而且由于福氏志贺氏菌主要是发展中国家
mfi)生成的热图，以可视化交叉反应模式。
[0028]
图1b是含有合并血清对福氏志贺氏菌细菌细胞系的log
10 ic50的血清杀细菌活性数据的热图，以可视化交叉保护模式。
[0029]
图1c是血清杀细菌活性数据的热图，其显示与从由血清型和群抗原预期的反应性预测的热图的相关性差。
[0030]
描述本发明人(a)使用荧光活化细胞分选(facs)检查针对14种福氏志贺氏菌亚型产生的血清结合来自所有血清型的一组11种福氏志贺氏菌亚型的能力；(b)针对14种福氏志贺氏菌亚型产生的血清在补体介导的血清杀细菌测定(sba)中杀死这些细菌的能力。抗原作为膜抗原的通用模块(gmma)(意大利语gemma = 芽)递送，所述膜抗原的通用模块(gmma)是近似50-200 nm的外膜泡，其从经基因修饰以诱导过度起泡(15)的革兰氏阴性细菌出芽，这是目前在人疫苗试验中用于宋内志贺氏菌的技术(16-18)。gmma含有亲本细菌的外膜组分，包括表达oag的lps(19)。
[0031]
如所提及，针对志贺氏菌病的广泛保护性疫苗需要涵盖多种福氏志贺氏菌血清型。一个挑战是设计一种实用的疫苗，其在覆盖范围与复杂性和成本之间取得平衡。重要的是，本发明人发现来自宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌1b和3a的gmma的简单三组分疫苗将诱导杀死大多数具有流行病学意义的志贺氏菌菌株。这不是基于目前描述的共享血清型和血清群的交叉反应性预测的。此处呈现的研究为经验性设计这种疫苗提供了框架。
[0032]
血清型内存在强烈的交叉反应，例如，针对福氏志贺氏菌2a产生的血清与福氏志贺氏菌2b强烈反应。我们鉴定了一些免疫原(例如福氏志贺氏菌1b和3a)，其诱导与该群中大多数福氏志贺氏菌结合的广泛反应性抗体，而其他免疫原(例如福氏志贺氏菌2a)具有较窄的特异性。与预期相反，大多数交叉反应不能归属于福氏志贺氏菌血清群，例如，用福氏志贺氏菌1b产生的血清与福氏志贺氏菌6强烈反应，它们不共享任何目前公认的血清群。这些结果表明，存在目前用分型试剂无法识别的共同群体特异性，并且具有有限的组分(例如，仅福氏志贺氏菌1b和3a)的广泛的交叉反应疫苗将是可能的。
[0033]
因此，本发明的第一个方面提供了第一血清型或亚血清型的福氏志贺氏菌o-抗原，其用于产生针对不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原的免疫应答。
[0034]
脂多糖(lps)，也称为脂聚糖和内毒素，是一种大分子，其具有脂质和由o-抗原、核心结构域构成的多糖，所述核心结构域具有通过共价键连接的外核和内核，并且所述脂多糖(lps)存在于革兰氏阴性细菌的外膜中。lps内含有的重复聚糖聚合物被称为细菌的o抗原、o多糖或o侧链。o抗原附接至外核寡糖并包含lps分子的最外结构域。o链的组成随着菌株而不同。核心结构域总是含有直接附接至脂质a的寡糖组分，并且通常含有糖类、诸如庚糖和3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(也称为kdo，酮-脱氧辛酮糖酸)等。在正常情况下，脂质a是一种被多种脂肪酸修饰的磷酸化葡萄糖胺二糖。这些疏水性脂肪酸链将lps锚定至细菌膜中，并且lps的剩余部分从细胞表面突出。脂质a结构域负责革兰氏阴性细菌的大部分毒性。
[0035]“第一血清型的福氏志贺氏菌o-抗原”意指或包括完整的o-抗原，或其片段、融合物和/或衍生物。o-抗原可能会或可能不会与lps核心结构域结合。lps核心结构域可能会或
可能不会与脂质a结合。因此，o-抗原可以包含完整lps分子的一部分。o-抗原的“片段”意指或包括包含参考o-抗原分子的连续长度的至少25%、例如参考o-抗原分子的连续长度的至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或由其组成的分子。当如在专利起草中惯例地以单数提及“第一血清型的福氏志贺氏菌o-抗原”时，我们意指或包括多种相同o-抗原。可替代地或另外地，我们意指或包括单一o-抗原分子。通过“第一血清型”，我们意指或包括“第一血清型”内的单一亚血清型；或者，我们意指或包括“第一血清型”内的血清型的混合物，例如，“第一血清型”内的2种、3种或所有血清型。
[0036]
通过“不同血清型或亚血清型”，我们意指或包括“第一血清型或亚血清型”的另一种血清型或亚血清型。为了避免疑问，在存在多于一种“不同血清型或亚血清型”的情况下，每种“不同血清型或亚血清型”都来自彼此不同的血清型或亚血清型，以及与“第一血清型或亚血清型”不同的血清型或亚血清型。
[0037]
可替代地或另外地，针对不同血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原产生免疫应答。通过“不同血清型”，我们意指或包括相对于“第一血清型或亚血清型”的另一种血清型。因此，所述或每种“不同血清型”来自与“第一血清型或亚血清型”不同的血清型。这不排除“第一血清型或亚血清型”的o-抗原诱导针对“第一血清型或亚血清型”或针对与“第一血清型或亚血清型”相同血清型的其他亚血清型的免疫应答，只是该主题不一定形成请求保护的主题的一部分。
[0038]
表2的sba表明第一福氏志贺氏菌菌株能够诱导针对哪些其他福氏志贺氏菌菌株的补体介导的杀伤。表2显示sba评分，其反映sba测定中免疫应答的强度。可以从实验数据确定相应的sba评分。为了确保请求保护的交叉保护足够强足以与疫苗学生物学相关，选择最小阈值血清杀细菌活性(sba)评分。最小阈值sba评分可以如本文提供的那样凭经验确定，并且可以区分基线(无免疫应答)和免疫应答的存在。对于本文提供的实例，选择2.3的最小阈值sba评分，其代表从基线增加200倍。3.0、3.6和3.7的sba评分分别代表从基线增加400倍、约900倍和1000倍，并且可以用作甚至更严格的sba活性阈值。sba评分可用于生成热图和/或对应答强度进行分类，例如，其中sba评分越高表明免疫应答越强。因此，可替代地或另外地，所述不同血清型或亚血清型是一种或多种在表2中的sba评分大于或等于2.3 (例如，大于或等于3.0，大于或等于3.6，或大于或等于3.7)的血清型或亚血清型。可替代地或另外地，所述不同血清型或亚血清型不是一种或多种在表2中的sba评分小于3.7 (例如小于3.6、小于3.0或小于2.3)的血清型或亚血清型。
[0039]
可替代地或另外地，最小阈值sba评分可以是3.0、3.6或3.7。可替代地或另外地，所述不同血清型或亚血清型是一种或多种sba评分大于或等于2.3和/或不小于2.3的血清型或亚血清型；所述不同血清型或亚血清型是一种或多种sba评分大于或等于3.0和/或不小于3.0的血清型或亚血清型；所述不同血清型或亚血清型是一种或多种sba评分大于或等于3.6和/或不小于3.6的血清型或亚血清型；或所述不同血清型或亚血清型是一种或多种sba评分大于或等于3.7和/或不小于3.7的血清型或亚血清型。
[0040]
因此，本发明涉及一种或多种o-抗原诱导针对一种或多种另外o-抗原的免疫应答的用途，且因此，可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：1，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，
或由其组成；2，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；3，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；4，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；5，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；6，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；x，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；和/或y，且不同血清型或亚血清型包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成。
[0041]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：1，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；2，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；3，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；4，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；5，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；6，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；x，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成；和/或y，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清
型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种，或由其组成。
[0042]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：1a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；1b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；2a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；2b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；3a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；3b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；4a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；5b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；6，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；x，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成；和/或y，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1、2、3、4、5、6、x和y的血清型，例如，所述不同血清型中的1、2、3、4、5、6、7或8种，或由其组成。
[0043]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：1a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；
1b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；2a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2b、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；2b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、3a、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；3a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3b、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；3b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；4a，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、5b、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；5b，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；6，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、x和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；x，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6和y的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成；和/或y，且不同血清型或亚血清型的一种或多种福氏志贺氏菌o-抗原包含选自血清型或亚血清型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5b、6和x的血清型或亚血清型，例如，所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种，或由其组成。
[0044]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型来自相对于所述不同血清型或亚血清型的另一种血清型，例如：在所述第一血清型或亚血清型是1的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型1或不是血清型1的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是2的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型2或不是血清型2的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是3的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型3或不是血清型3的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是4的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血
清型4或不是血清型4的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是5的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型5或不是血清型5的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是6的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型6或不是血清型6的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是x的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型x或不是血清型x的亚血清型；在所述第一血清型或亚血清型是y的情况下，所述不同血清型或亚血清型不是血清型y或不是血清型y的亚血清型。
[0045]
如引言中所示，noriega等人的二价测试疫苗(13)和karnell等人, (1992) (39)的猴的感染报告了福氏志贺氏菌菌株之间的潜在交叉保护。据我们所知，没有关于这些潜在的交叉保护是o-抗原介导还是蛋白介导的教导。
[0046]
可替代地或另外地，其中所述第一血清型或亚血清型是：2，所述不同血清型或亚血清型不是血清型1或不是血清型1的亚血清型；2，所述不同血清型或亚血清型不是血清型2或不是血清型2的亚血清型；2，所述不同血清型或亚血清型不是血清型5或不是血清型5的亚血清型；2，所述不同血清型或亚血清型不是血清型y或不是血清型y的亚血清型；3，所述不同血清型或亚血清型不是血清型1或不是血清型1的亚血清型；3，所述不同血清型或亚血清型不是血清型2或不是血清型2的亚血清型；3，所述不同血清型或亚血清型不是血清型5或不是血清型5的亚血清型；3，所述不同血清型或亚血清型不是血清型y或不是血清型y的亚血清型；2，并且与额外的血清型或亚血清型3的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是血清型1或不是血清型1的亚血清型；2，并且与额外的血清型或亚血清型3的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是血清型2或不是血清型2的亚血清型；2，并且与额外的血清型或亚血清型3的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是血清型5或不是血清型5的亚血清型；2，并且与额外的血清型或亚血清型3的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是血清型y或不是血清型y的亚血清型；2，所述不同血清型或亚血清型不是血清型6或不是血清型6的亚血清型；y，所述不同血清型或亚血清型不是血清型1或不是血清型1的亚血清型；和/或y，所述不同血清型或亚血清型不是血清型2或不是血清型2的亚血清型。
[0047]
可替代地或另外地，其中所述第一血清型或亚血清型是：2a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型1b；2a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型2b；2a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型5b；2a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型y；3a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型1b；3a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型2b；
3a，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型5b；3a，所述不同血清型或亚血清型不是或不是亚血清型y；2a，并且与额外的血清型或亚血清型3a的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型1b；2a，并且与额外的血清型或亚血清型3a的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型2b；2a，并且与额外的血清型或亚血清型3a的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型5b；2a，并且与额外的血清型或亚血清型3a的o-抗原组合提供，所述不同血清型或亚血清型不是或不是亚血清型y；2a，所述不同血清型或亚血清型不是或不是亚血清型6；y，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型1b；和/或y，所述不同血清型或亚血清型不是亚血清型2a。
[0048]
可替代地或另外地，不同血清型或亚血清型的一种或多种o抗原不与第一血清型或亚血清型的o-抗原共享群特异性。
[0049]
通过“不共享群特异性”，我们意指或包括第一和不同o-抗原不共享如通过分型试剂或基因组探针所鉴定的群特异性。可替代地或另外地，第一和不同o-抗原不共享群特异性(3,4)、6、(7,8)、9和10(或决定这些群特异性的结构修饰)。通过“结构修饰”，我们意指或包括：群特异性6：rhapi在位置2处的o-乙酰化；群特异性7,8：在rhap
iii
的位置3位上的α-d-吡喃葡萄糖基取代；群特异性9：rhap
iii
在位置3或4处的o-乙酰化(3/4-o-乙酰化)；和/或群特异性10：glcpnac的o-乙酰化；并且其中rhapi是以1-》3键附接至β-d-glcpnac的l-rhap；rhap
ii
是以1-》3键附接至α-l-rhapi的l-rhap；和/或rhap
iii
是以1-》2键附接至α-l-rhap
ii
的l-rhap。
[0050]
负责群3,4的结构修饰没有明确定义。然而，可以使用抗体分型血清，其定义3,4特异性(3,4)、6、(7,8)、9和10，或确定这些群特异性的结构修饰的存在或不存在的(参见例如，knirel等人，knirel et al., 2015, biochemistry moscow
ꢀ‘
o-antigen modifications providing antigenic diversity of shigella flexneri and underlying genetic mechanisms
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80(7):901-914，其通过引用并入本文，其中特别参考跨越第903-905页的表格中列出的结构)。
[0051]
如引言中所示，文献中可用的有限交叉保护数据表明，无法从已知的类型或群特异性预测福氏志贺氏菌交叉保护。然而，本发明考虑仅包括不能从基于共享的群和/或类型特异性的表2的sba评分预测的那些交叉保护。它们可以通过血清型相比于血清型来定义。因此，可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：血清型1，且不同血清型或亚血清型是选自2、5和x的一种或多种血清型，例如所述不同血清型中的1、2或3种；
血清型2，且不同血清型或亚血清型是选自4、5、6和y的一种或多种血清型，例如所述不同血清型中的1、2或3种；血清型3，且不同血清型或亚血清型是选自1、2、4、5、6、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4、5、6或7种；血清型4，且不同血清型或亚血清型是选自1、2、5、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4或5种；血清型5，且不同血清型或亚血清型是选自1、2、4、6、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4、5或6种；血清型6，且不同血清型或亚血清型是选自5和x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1或2种；血清型x，且不同血清型或亚血清型是选自1、4、6和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3或4种；和/或血清型y，且所述不同血清型或亚血清型是5。
[0052]
它们也可以通过血清型相比于亚血清型来定义。因此，可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：血清型1，且不同血清型或亚血清型是选自2b、5b和x的一种或多种亚血清型，例如所述不同血清型中的1、2或3种；血清型2，且不同血清型或亚血清型是选自1a、4a、5b、6和y的一种或多种血清型，例如所述不同血清型中的1、2、3、4或5种；血清型3，且不同血清型或亚血清型是选自1a、2a、4a、5b、6、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4、5、6或7种；血清型4，且不同血清型或亚血清型是选自1a、2b、5b、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4或5种；血清型5，且不同血清型或亚血清型是选自1a、2a、4a、6和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4或5种；血清型6，且不同血清型或亚血清型是选自5b和x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1或2种；血清型x，且不同血清型或亚血清型是选自1a、4a、6和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3或4种；和/或血清型y，且所述不同血清型或亚血清型是5b。
[0053]
它们可以进一步通过亚血清型相比于血清型来定义。因此，可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：亚血清型1a，且不同血清型或亚血清型是选自5和x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1或2种；亚血清型1b，且不同血清型或亚血清型是选自2、5和x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2或3种；亚血清型1c，且不同血清型或亚血清型是选自2、5或x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2或3种；亚血清型2a，且不同血清型或亚血清型是1、5和y，例如所述血清型中的1、2或3种；
亚血清型2b，且不同血清型或亚血清型是选自4、6和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1或2种；亚血清型3b，且不同血清型或亚血清型是选自1、2、4、5、6、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4、5、6或7种；亚血清型4a，且不同血清型或亚血清型是选自5和x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1或2种；亚血清型4b，且不同血清型或亚血清型是选自1、2、5、x和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4或5种；亚血清型5a，且不同血清型或亚血清型是x；所述第一血清型是亚血清型5b且所述不同血清型或亚血清型是选自1、2、4、6和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3、4或5种；血清型6，且不同血清型或亚血清型是选自5和x的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1或2种；血清型x，且不同血清型或亚血清型是选自1、4、6和y的一种或多种血清型，例如所述血清型中的1、2、3或4种；和/或血清型y，且所述不同血清型或亚血清型是5。
[0054]
然而，它们可以通过亚血清型相比于亚血清型来定义。因此，可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：亚血清型1a，且不同血清型或亚血清型是选自5b和x的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；亚血清型1b，且不同血清型或亚血清型是选自2b、5b和x的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1、2或3种；亚血清型1c，且不同血清型或亚血清型是选自2b、5b和x的一种或多种亚血清型，例如所述血清型中的1、2或3种；亚血清型2a，且不同血清型或亚血清型是亚血清型1a、5b和y，例如所述亚血清型中的1、2或3种；亚血清型2b，且不同血清型或亚血清型是选自4a、6和y的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1、2或3种；亚血清型3b，且不同血清型或亚血清型是选自1a、2a、4a、5b、6、x和y的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1、2、3、4、5、6或7种；亚血清型4a，且不同血清型或亚血清型是选自5b和x的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；亚血清型4b，且不同血清型或亚血清型是选自1a、2b、5b、x和y的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1、2、3、4或5种。亚血清型5a，且不同血清型或亚血清型是x；亚血清型5b，且不同血清型或亚血清型是选自1a、2a、4a、6和y的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1、2、3、4或5种；血清型6，且不同血清型或亚血清型是选自5b和x的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；
血清型x，且不同血清型或亚血清型是选自1a、4a、6和y的一种或多种血清型，例如所述亚血清型中的1、2、3或4种；和/或血清型y，且不同血清型或亚血清型是亚血清型5b。
[0055]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是血清型1，且所述一种或多种不同血清型或亚血清型包含选自2、5、6、x和y的一种或多种血清型，例如这些血清型中的1、2、3、4或5种，或由其组成。可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是血清型1，且所述一种或多种不同血清型或亚血清型包含血清型或亚血清型6，或由其组成。可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型包含1a、1b或1c，或由其组成。可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是1b。
[0056]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是血清型3，且另外的血清型或亚血清型是血清型6。可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是选自3a、3b和3c的一种或多种亚血清型。可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是3a。
[0057]
可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是血清型6，且所述不同血清型或亚血清型是血清型5。可替代地或另外地，所述不同血清型或亚血清型是选自5a的一种或多种亚血清型。
[0058]
相反，本发明还考虑排除可以从基于共享的群和/或类型特异性的表2的sba评分预测的那些交叉保护。因此，可替代地或另外地，所述第一血清型或亚血清型是：亚血清型1a，且不同血清型或亚血清型不是3a；亚血清型1b，且不同血清型或亚血清型不是选自3a和3b的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；亚血清型1c，且不同血清型或亚血清型不是3a；亚血清型2a，且不同血清型或亚血清型不是选自3a和6的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；亚血清型2b，且不同血清型或亚血清型不是3a；亚血清型3a，且不同血清型或亚血清型不是选自1a、2b和x的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1、2或3种；亚血清型4a，且不同血清型或亚血清型不是选自1b和3a的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；亚血清型4b，且不同血清型或亚血清型不是1b；亚血清型5a，且不同血清型或亚血清型不是选自1b和3a的一种或多种亚血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；所述第一血清型是亚血清型5b，且所述不同血清型或亚血清型不是x；血清型6，且不同血清型或亚血清型不是3a；血清型x，且不同血清型或亚血清型不是选自2b和3a的一种或多种血清型，例如所述亚血清型中的1或2种；和/或血清型y，且不同血清型或亚血清型不是选自1b、2a和3a的一种或多种血清型，例如所述亚血清型中的1、2或3种。
[0059]
如所讨论，本发明的目标是提供针对志贺氏菌病的广泛保护性疫苗，其在覆盖范围与复杂性和成本之间取得平衡。因此，可替代地或另外地，第一血清型的o-抗原与另外的
血清型或亚血清型的一种或多种额外的o-抗原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种另外的o-抗原血清型或亚血清型)组合提供。为了避免疑问，第一和额外o-抗原具有彼此不同的亚血清型。
[0060]
可替代地或另外地，第一和另外的血清型包含选自以下的组合，或由其组成：a. 血清型1(例如，亚血清型1a、1b或1c)和血清型3(例如，亚血清型3a、3b或3c)；b. 血清型2(例如，亚血清型2a、2b或2c)和血清型3(例如，亚血清型3a、3b或3c)；c. 血清型3(例如，亚血清型3a、3b或3c)和血清型4(例如，亚血清型4a或4b)；和d. 血清型3(例如，亚血清型3a、3b或3c)和血清型5(例如，亚血清型5a或5b)。
[0061]
可替代地或另外地，第一和另外的亚血清型包含选自以下的组合，或由其组成：a. 1b和3a；b. 1b和3b；c. 1c和3a；d. 1c和3b；e. 2a和3b；f. 3a和4b；和g. 3b和5b。
[0062]
由于本发明寻求提供在覆盖范围与复杂性和成本之间取得平衡的广泛保护性的疫苗，其中第一o-抗原血清型或亚血清型针对另外的血清型或亚血清型进行保护，可替代地或另外地，未提供所述不同血清型或亚血清型中的一种或多种，例如，未提供1a、1b、1c(或7a)、1d、2a、2b、3a、3b、4a、4av、4b、5a、5b、x、xv、y、yv、6和7b中的一种或多种，例如，未提供所述不同血清型或亚血清型中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种。
[0063]
可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原能够产生针对未提供的所述不同血清型或亚血清型中的一种或多种的免疫应答。可替代地或另外地，提供血清型1(例如，1a、1b或1c)并且未提供血清型6。可替代地或另外地，提供血清型3(例如，3a、3b或3c)并且未提供血清型6。可替代地或另外地，提供血清型6并且未提供血清型5(例如，5a或5b)。
[0064]
血清型和/或亚血清型的进一步组合对于技术人员而言从表2和图2将是显而易见的并且形成本发明的一部分。
[0065]
如所提及，本发明的目标是提供针对志贺氏菌病的广泛保护。因此，可替代地或另外地，来自除了福氏志贺氏菌以外的一种或多种志贺氏菌属物种的o-抗原与第一血清型的o-抗原组合提供。可替代地或另外地，一种或多种其他志贺氏菌属物种选自：a. 宋内志贺氏菌；b. 鲍氏志贺氏菌(例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；和c. 痢疾志贺氏菌(例如，血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)。
[0066]
因此，可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含(例如，可以分开或作为混合物提供)宋内志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌的o-抗原。可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含宋内志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌的o-抗原。可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌的o-抗
原。可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌的o-抗原。可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含宋内志贺氏菌的o-抗原。可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含鲍氏志贺氏菌的o-抗原。可替代地或另外地，所用的福氏志贺氏菌o-抗原可以包含痢疾志贺氏菌的o-抗原。
[0067]
可替代地或另外地，所述宋内志贺氏菌选自宋内志贺氏菌、宋内志贺氏菌菌株moseley、宋内志贺氏菌08-7761、宋内志贺氏菌08-7765、宋内志贺氏菌09-1032、宋内志贺氏菌09-2245、宋内志贺氏菌09-4962、宋内志贺氏菌1dt-1、宋内志贺氏菌3226-85、宋内志贺氏菌3233-85、宋内志贺氏菌4822-66、宋内志贺氏菌s6513和宋内志贺氏菌ss046。
[0068]
可替代地或另外地，两种或更多种福氏志贺氏菌o-抗原类型组合提供并且包含福氏志贺氏菌1b、福氏志贺氏菌2a、福氏志贺氏菌3a和宋内志贺氏菌，或由其组成：。
[0069]
可替代地或另外地，o-抗原获得自或可获得自包含降低脂多糖(lps)毒性(特别是其致热潜能)的改变的细菌菌株。可替代地或另外地，相对于未改变的菌株，脂多糖(lps)表达修饰改变降低福氏志贺氏菌、由其释放的外膜囊泡(omv)和/或由其产生的lps的毒性。用于降低毒性和测量该降低的合适方法是本领域已知的，并且可以在例如rossi等人，2014. modulation of endotoxicity of shigella generalized modules for membrane antigens (gmma) by genetic lipid a modifications: relative activation of tlr4 and tlr2 pathways in different mutants. j biol. chem., 289:24922
–
24935(其通过引用并入本文)中找到。可替代地或另外地，脂多糖(lps)表达修饰改变由选自以下的一种或多种基因的下调、突变或缺失(部分或完全)诱导：
‑ꢀ
msbb1 (lpxm)(脂质a生物合成肉豆蔻酰转移酶)；
‑ꢀ
msbb2 (lpxm)(脂质a生物合成肉豆蔻酰转移酶)；
‑ꢀ
htrb (lpxl)(脂质a生物合成月桂酰转移酶)；
‑ꢀ
lpxp (脂质a棕榈油酰转移酶)
‑ꢀ
pagp (将棕榈酸酯添加至2-位外膜的初级连接的酰基链)；
‑ꢀ
lpxe (除去1-磷酸酯基团)；
‑ꢀ
lpxf (除去4-磷酸酯基团)；
‑ꢀ
lpxo (将羟基添加至3位的脂肪酸肉豆蔻酸酯)；
‑ꢀ
lpxr (从3位除去酰基链)；
‑ꢀ
pagl (从3位除去酰基链)。
[0070]
可替代地或另外地，o-抗原或lps获得自或可获得自经修饰以加强omv释放的细菌菌株。通过下调或消除一种或多种tolr或ompa的表达，可以基因修饰福氏志贺菌、痢疾志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌的菌株，以表现出过度起泡表型。用于下调或消除表达的合适突变包括点突变、基因缺失、基因插入和基因组序列的任何修饰，其导致基因表达的改变，特别是降低，且更特别是失活或沉默。
[0071]
可以通过选自以下组的一种或多种方法进一步对细菌进行基因工程：(a)下调免疫显性可变或非保护性抗原的表达的方法，(b)上调保护性抗原的表达的方法，(c)下调参与使lps的脂质a部分有毒的基因的方法，(d)上调参与使lps的脂质a部分毒性降低的基因的方法，和(e)对细菌进行基因修饰以表达异源抗原的方法。
[0072]
可替代地或另外地，所述o-抗原中的一种或多种如下提供：
a. 未与另一大分子缔合；b. 作为脂多糖(lps)的组分或其片段；或c. 缀合至另一大分子，例如蛋白(例如，载体蛋白，诸如crm197、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(ompc)、白喉类毒素和流感嗜血杆菌蛋白d [参见，例如，pichichero, 2013, 'protein carriers of conjugate vaccines characteristics, development, and clinical trials' hum. vaccin. immunother., 9(12):2505
–
2523，其通过引用并入本文])。
[0073]
可替代地或另外地，所述蛋白是载体蛋白(即，能够增加针对多糖或与其缀合的其他聚合物的免疫应答的功效的蛋白)。
[0074]
可替代地或另外地，提供第一血清型或亚血清型、另外的血清型或亚血清型和/或其他志贺氏菌属物种作为一种或多种膜组分，例如细胞膜(例如革兰氏阴性细菌细胞膜)或囊泡膜(例如，革兰氏阴性细菌外膜囊泡[omv])。
[0075]
可替代地或另外地，其中所述膜组分获得自细菌细胞，其中至少25%的o-抗原与所用的o-抗原的血清型相同；例如，至少35%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的o-抗原与所用的o-抗原的血清型相同。
[0076]
可以使用本领域已知的任何合适的方法、诸如micoli等人, 2018,
ꢀ‘
comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal salmonella
’ꢀ
pnas, 115(41): 10428-10433 (其通过引用并入本文)中教导的方法来确定存在的不同o-抗原类型的百分比。
[0077]
可替代地或另外地，所述细菌细胞是选自以下的菌株：宋内志贺氏菌53g、福氏志贺氏菌1b stansfield、福氏志贺氏菌2a 2457t、福氏志贺氏菌2b 69/50、福氏志贺氏菌3a菌株6885和福氏志贺氏菌6菌株10.8537。
[0078]
可替代地或另外地，所述膜组分是选自以下的omv的组分：去污剂提取的omv (domv)；或天然omv (nomv)。
[0079]
可替代地或另外地，omv由经突变以增强囊泡产生并除去或修饰抗原(例如，脂质a)的基因修饰的细菌菌株产生。
[0080]
本发明中使用的志贺氏菌属细菌相对于它们的对应野生型菌株而言是高起泡的(hyperblebbing)，即它们相比野生型菌株向它们的培养基中释放更大量的gmma。这些gmma可用作本发明的志贺氏菌疫苗的组分。术语gmma用于提供与常规去污剂提取的外膜囊泡(domv)和从革兰氏阴性细菌自发地释放的天然外膜囊泡(nomv)的明显区别。gmma在两个关键方面不同于nomv。首先，为了诱导gmma形成，已经通过缺失编码关键结构组分的基因(具体地tolr)修饰了膜结构。其次，作为遗传修饰的结果，大量外膜“出芽”(芽的意大利语单词是
‘
芽(gemma)’)以提供用于疫苗生产的膜材料的实际来源，导致增加的制造容易和潜在成本降低。尽管nomv已经用于免疫原性研究，但是产率对于实际疫苗而言过低。
[0081]
通过电子显微术，本发明中使用的宋氏志贺氏菌gmma通常具有25 nm至140 nm、例如25nm至40nm的直径。gmma也可以具有双模式大小分布。例如，大部分gmma具有25 nm至40nm直径的平均大小(通过em)，且一部分颗粒具有65 nm至140 nm的平均大小。具体地，至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%的gmma将
guhathakurta等人, 1999,
ꢀ‘
adhesion and invasion of a mutant shigella flexneri to an eukaryotic cell line in absence of the 220-kb virulence plasmid
’ꢀ
fems microbiol. lett., 181(2):267-75;或bando等人, 2010,
ꢀ‘
expression of bacterial virulence factors and cytokines during in vitro macrophage infection by enteroinvasive escherichia coli and shigella flexneri: a comparative study
’ꢀ
mem. inst. oswaldo cruz., 105(6):786-91 (其各自通过引用并入本文)。
[0092]
由于该生物体不能通过顶端途径侵入上皮细胞，志贺氏菌利用m细胞(覆盖淋巴组织的滤泡相关上皮(fae)中的特化上皮细胞)以获得进入结肠上皮(wassef等人1989)。m细胞允许完整的志贺氏菌穿入巨噬细胞所在的下层上皮下袋。巨噬细胞吞噬志贺氏菌，但巨噬细胞不是成功摧毁吞噬体内的细菌，而是死于凋亡性死亡(zychlinsky等人，1992)。在细胞死亡之前，受感染的巨噬细胞通过志贺氏菌对胱天蛋白酶-1的直接活化来释放il-1b (zychlinsky等人.1994)。该细胞因子的促炎性质导致多形核细胞(pmn)的募集，所述多形核细胞(pmn)浸润受感染部位并使上皮不稳定(perdomo等人. 1994a,b)。上皮屏障完整性的丧失允许更多的细菌穿入上皮下空间，并使这些生物体进入上皮细胞的基底外侧极(mounier等人，1992)。然后志贺氏菌可以侵入结肠内衬的上皮细胞，从细胞扩散至细胞，并在整个组织中散布。受感染的上皮细胞释放的细胞因子将增加数目的免疫细胞吸引至感染部位，因此恶化和加剧炎症。
[0093]
志贺氏菌病产生一系列临床结果，范围从水样腹泻到典型的痢疾，其特征在于发烧、剧烈的肠道抽筋以及粘脓性和血便的排出。受感染组织的炎症是志贺氏菌病的一个关键特征。对来自受感染患者的结肠活检样品的组织病理学研究揭示炎性细胞浸润至结肠上皮的上皮层、组织水肿和侵蚀区域(mathan & mathan 1991)。
[0094]
可替代地或另外地，所述免疫应答预防、消除或减少选自以下的福氏志贺氏菌感染的一种或多种症状：a. 水样腹泻；b. 发热；c. 肠抽筋；d. 腹痛；e. 里急后重；f. 粘脓性粪便；g. 血便；h. 受感染组织(例如，结肠组织[例如，炎性细胞浸润至上皮层中])的炎症；i. 受感染组织(例如结肠组织)的水肿；j. 粪便血红蛋白；k. 细菌脱落；l. 结肠上皮(侵蚀区域的数量、直径、深度)的侵蚀；和m. 巨噬细胞凋亡细胞死亡。
[0095]“预防、消除或减少”包括或意指症状减少至少25%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%。可替代地或另外地，一种或多种症状减少至少10%，例如减少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50 %、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
[0096]“产生免疫应答”意指或包括免疫系统在暴露于抗原(例如，福氏志贺氏菌o-抗原)后在宿主中被活化。
[0097]
可替代地或另外地，所述免疫应答在哺乳动物中产生。
[0098]
可替代地或另外地，所述哺乳动物选自犰狳(dasypus novemcinctus)、狒狒(papio anubis; papio cynocephalus)、骆驼(camelus bactrianus, camelus dromedarius, camelus ferus)、猫(felis catus)、狗(canis lupus familiaris)、马(equus ferus caballus)、雪貂(mustela putorius furo)、山羊(capra aegagrus hircus)、豚鼠(cavia porcellus)、金仓鼠(mesocricetus auratus)、袋鼠(macropus rufus)、美洲驼(lama glama)、小鼠(mus musculus)、猪(sus scrofa domesticus)、兔(oryctolagus cuniculus)、大鼠(rattus norvegicus)、恒河猴(macaca mulatta)、绵羊(ovis aries)和人类(homo sapiens)。
[0099]
可替代地或另外地，所述保护性免疫应答针对由选自以下的生物体引起的疾病或病况是保护性的：宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌。
[0100]
术语“omv”和“gmma”在本文中可互换使用。
[0101]
第二个方面提供了结合部分，其能够特异性结合第一个方面中定义的一种或多种o-抗原。
[0102]“特异性结合”意指或包括结合部分结合其靶抗原或表位的强度是结合任何其他抗原或表位(特别是任何其他志贺氏菌[特别是福氏志贺氏菌])o-抗原或其片段)的强度的至少10倍；优选至少50倍且更优选至少100倍。优选地，本发明的结合部分在生理条件下(例如，体内；和例如，在福氏志贺氏菌感染期间)特异性结合所述抗原或表位。结合强度可以通过使用例如biacoretm表面等离子体共振系统和biacoretm动力学评估软件(例如，版本2.1)的表面等离子体共振分析来测量。
[0103]
可替代地或另外地，所述结合部分选自：抗体；抗原结合片段；和抗体模拟物。可替代地或另外地，所述结合部分是抗体。可替代地或另外地，所述抗体是多克隆或单克隆的。可替代地或另外地，所述结合部分是选自以下的抗原结合片段：fab(抗原结合片段)；f(ab')2；fab'；scfv(单链可变片段)；双-scfv；sdab(单结构域抗体/结构域抗体)；三功能抗体；化学连接的f(ab')2；和bite (双特异性t-细胞接合子)。可替代地或另外地，所述抗体或其抗原结合片段是选自以下的抗原结合片段：亲和体分子；affilins；affimers；affitins；alphabodies；anticalins；avimers；darpins；fynomers；kunitz结构域肽；单抗体和nanoclamps。
[0104]
第三个方面提供了药物组合物，其包含：第一个方面中定义的所用的o-抗原和/或如第二个方面中所定义的结合部分。可替代地或另外地，所述免疫原性组合物包含佐剂。又更具体地，所述佐剂是吸附剂。仍又更具体地，所述佐剂是不增强gmma的免疫原性(例如，如通过抗
‑ꢀ
lps抗体应答所测量)的吸附剂。特定佐剂包括，例如，铝佐剂，包括氢氧化铝、alhydrogel
®
、磷酸铝、硫酸铝钾和明矾。
[0105]
第四个方面提供了试剂盒，其包含第一个方面中定义的所用的o-抗原、如第二个方面中所定义的结合部分和/或如第三个方面中所定义的药物组合物；和(任选)使用说明，或由其组成。
[0106]
第五个方面提供了第一个方面中定义的所用的o-抗原、如第二个方面中所定义的结合部分、如第三个方面中所定义的药物组合物和/或如第四个方面中所定义的试剂盒，其用于医药中。
[0107]
第六个方面提供了第一个方面中定义的所用的o-抗原、如第二个方面中所定义的结合部分、如第三个方面中所定义的药物组合物和/或如第四个方面中所定义的试剂盒，其用于预防或治疗细菌感染和/或其症状。
[0108]
可替代地或另外地，所述细菌感染全部或部分是被第一方面中定义的一种或多种细菌感染。
[0109]
第七个方面提供了有效量的第一个方面中的o-抗原、如第二个方面中所定义的结合部分、如第三个方面中所定义的药物组合物和/或如第四个方面中所定义的试剂盒，其用于制备药物，所述药物用于预防或治疗细菌感染和/或其症状(例如，其中所述细菌感染全部或部分是被第一方面中定义的一种或多种细菌感染)。
[0110]
第八个方面提供了治疗或预防细菌感染和/或其症状的方法，其包括施用合适量的第一个方面中定义的所用的o-抗原、如第二个方面中所定义的结合部分、如第三个方面中所定义的药物组合物和/或如第四个方面中所定义的试剂盒。
[0111]
第九个方面提供了如第二个方面中所定义的结合部分，其用于检测细菌的存在，例如，其中所述细菌是第一个方面中定义的一种或多种细菌。可替代地或另外地，所述检测是体外和/或体内的。
[0112]
第十个方面提供了如本文说明书和附图中所述的o-抗原、结合部分、药物组合物、试剂盒、用途或方法。
[0113]
实施例1. 引言针对志贺氏菌病的广泛保护性疫苗需要涵盖多种福氏志贺氏菌血清型。一个挑战是设计一种实用的疫苗，其在覆盖范围与复杂性和成本之间取得平衡。重要的是，我们基于小鼠中的免疫原性发现，来自宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌1b和3a的简单三组分gmma疫苗会诱导杀死大多数具有流行病学意义的志贺氏菌菌株。这不是基于当前描述的共享的血清型和血清群的交叉反应性预测的。我们不知道这些结果如何转化为人免疫原性—存在数据显示人对一些志贺氏菌血清特异性的识别与小鼠不同。然而，本文呈现的研究提供了用于为即将到来的人疫苗试验经验性地设计这种疫苗的框架。
[0114]
2. 材料和方法2.1 志贺氏菌菌株宋内志贺氏菌53g (32)获得自沃尔特里德陆军研究所(walter reed army institute of research, washington, d.c., usa)。用于facs和sba中的宋内志贺氏菌δvirg::cat菌株由caboni等人(33)生成，以通过经由在氯霉素存在的情况下培养细菌来稳定含有oag簇基因的pss毒力质粒，确保oag在生长期间的稳定表达。
[0115]
14种亚型的福氏志贺氏菌系购自英格兰公共卫生部(public healthe england, london, uk)。制备工作细胞库，并通过用来自denka seiken co., ltd.的商业志贺氏菌分型抗血清(类型特异性血清i、ii、iii、iv、v、vi和分组血清3,4；6；7,8；9；10)的facs分型使用凝集和表面染色来分型。对于凝集，遵循制造商的推荐。对于facs分型，细菌在lb培养基
al3+/ml，然后搅拌2h。测试制备物以显示它们没有细菌污染，并在使用前在2-8℃下储存一周。
[0121]
2.3. 小鼠中的免疫原性研究动物研究作为意大利卫生部动物伦理委员会(italian ministry of health animal ethics committee)项目编号201309的一部分进行。在第0天和第21天，每组四只cd1小鼠(雌性，4至6周龄)用2
ꢀµ
g gmma(蛋白)腹膜内免疫(每只小鼠500
ꢀµ
l)；在第21天和第35天收集血清(出血)。合并第35天血清并用于本文中报告的研究。
[0122]
2.4. 通过facs测量的交叉反应性在评价交叉反应性前，使用以下描述的方法，测试该研究中使用的来自不同血清型的所有福氏志贺氏菌细菌与针对oag阴性福氏志贺氏菌2a gmma产生的血清的结合。
[0123]
用合并的来自14个免疫组的第35天血清和合并的类似地针对oag阴性福氏志贺氏菌2a gmma产生的血清实施11个oag阳性福氏志贺氏菌系的组的表面染色。还对oag阳性和阴性宋内志贺氏菌测试所述血清，并且还对oag阴性福氏志贺氏菌2a细菌测试针对oag阴性福氏志贺氏菌2a产生的血清。
[0124]
将合并的第35天血清添加至细菌悬浮液中，孵育1 h，洗涤，然后添加apc-缀合的抗小鼠igg (1:400稀释液)并孵育1 h。然后在别藻蓝蛋白(apc)通道中测量信号。基线由仅与二抗孵育且没有与任何小鼠血清孵育的福氏志贺氏菌1b、2a、3a和6个对照设定。显示不同血清型的福氏志贺氏菌野生型细菌系的表面染色的平均荧光强度(mfi)的矩阵报告于表s3中。
[0125]
2.5. 高通量发光-血清杀细菌测定(l-sba)sba如所述(36)进行。简而言之，使源自用于facs的相同工作细胞库的宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌细菌生长至对数期(od：0.2)，在pbs中1:1,000稀释并分布在96-孔板中。向每个孔中添加热灭活的合并小鼠血清和活性幼兔补体(brc；最终体积的7-20%)的稀释液。作为对照，将细菌与血清加热灭活的brc、单独的血清(无brc)、sba缓冲液或活性brc孵育。孵育3h后，通过测量atp确定存活的细菌。sba以血清滴度报告，定义为在阳性对照中给出atp水平的50%抑制的血清稀释度。低于100的最小可测量滴度的滴度被指定为滴度10。显示不同血清型的福氏志贺氏菌野生型细胞系的血清滴度的矩阵报告于表s4中。
[0126]
2.6. 建模的sba热图对同源血清型测试的血清(即对福氏志贺氏菌2a或福氏志贺氏菌2b测试的抗福氏志贺氏菌2a抗血清)的观察到的平均log(sba滴度)为4.7。因此，在构建理论sba热图中，对同源血清型测试的血清的sba log滴度被指定为4.7的值。对其中sba可测量的异源血清型测试的观察到的平均sba log滴度为3.9。在接种疫苗的gmma共享单一强分型群特异性的情况下，我们为该相互作用分配3.9的值。如表s1中所示，用标准群特异性试剂对靶标细菌的分型显示给出与分型试剂的阳性、但弱相互作用的几种菌株。平均而言，这些具有的log mfi比高应答者低0.9(群3,4)或0.7(群7,8)对数单位。在该情况下，我们将3.1的值(即比高应答者低0.8个对数单位)分配给建模的sba值(我们假设弱分型阳性gmma生产菌株仍然具有足够的群特异性抗原来引发全群特异性抗体应答)。在免疫gmma和靶标细菌共享两群特异性的情况下，我们指定sba对数滴度作为滴度总和的对数。因此，抗福氏志贺氏菌1a gmma对共享3,4和9群特异性的福氏志贺氏菌2a的建模滴度被指定4.2 = log (10^3.9 + 10^
3.9)的sba log滴度。对于观察到的sba滴度和建模的sba滴度，类似地计算可以通过用福氏志贺氏菌1a和3a的混合物免疫而获得的计算的sba log滴度：例如，估计的福氏志贺氏菌1b和3a gmma的混合物对福氏志贺氏菌2a的sba log滴度为4.0 = log (10^3.9 + 10^3.1)。
[0127]
3. 结果3.1. 该研究中使用的细菌的血清型和群特异性该研究中使用的基于用特定抗血清分型或通过编码o-乙酰酶的基因的存在推断的细菌的血清型和群特异性的总结显示于表1中。通过nmr表明福氏志贺氏菌1b、2a和3a的o-乙酰化的存在。分型的细节包括在表s1中。
[0128]
3.2. 评估在小鼠中产生的针对来自福氏志贺氏菌的一种亚型的gmma的抗体对异源福氏志贺氏菌亚型的交叉反应性和交叉功能性3.2.1. 通过facs评估交叉反应性用一组福氏志贺氏菌细菌的表面染色的平均荧光强度的log
10 (log mfi)生成热图，以可视化交叉反应模式(图1a)。详细的mfi值报告于表s3中。应用阈值标准来区分相关的交叉反应性：可以预测现场交叉覆盖范围的交叉反应水平与不太可能提供现场交叉覆盖范围的低交叉反应水平。该阈值是基于以下文献证据估计的：在临床前动物模型中，不能用福氏志贺氏菌2a免疫的动物保护免于福氏志贺氏菌3a攻击，且反之亦然(13,20)。对于facs实验，该阈值被估计为mfi ≥ 130。通过评价由接种疫苗血清型产生的抗体对同源和异源结合血清型的染色强度，可以鉴定广泛特异性免疫原。
[0129]
针对oag阴性gmma产生的血清的结合：针对oag阴性福氏志贺氏菌2a gmma (来自福氏志贺氏菌2a δtolr δrfbg的gmma)产生的抗血清对oag阴性福氏志贺氏菌2a细菌(mfi 5000)和oag阴性宋内志贺氏菌(mfi 6300)产生强荧光；对所有测试的oag阳性细菌，包括oag阳性福氏志贺氏菌2a，结合是检测不到的。
[0130]
3.2.2. 针对o抗原阳性gmma产生的血清的结合3.2.2.1. 与o抗原阴性宋内志贺氏菌的结合用oag阳性gmma产生的所有抗血清都得到与oag阴性宋内志贺氏菌的可检测的结合。抗福氏志贺氏菌4b具有最弱的结合(mfi 40)。包括抗福氏志贺氏菌4b在内，全都给出与对测试的oag阳性福氏志贺氏菌中的至少一种的mfi相比，更强烈的对宋内志贺氏菌oag阴性gmma的mfi。
[0131]
3.2.2.2. 同源结合(与免疫gmma的亲本细菌的结合)所有同源血清都给出强结合，范围从对于福氏志贺氏菌5b的4,508 (log mfi 3.7)的mfi到对于福氏志贺氏菌2b的98,520 (log mfi 5.0)的mfi，除了福氏志贺氏菌x，其给出与福氏志贺氏菌x细菌的相对较弱的结合(mfi 541，log mfi 2.7)。福氏志贺氏菌4b合并血清通常给出弱结合，但未针对与亲本福氏志贺氏菌4b的结合进行测试。
[0132]
3.2.2.3. 异源结合(与非免疫gmma的亲本的细菌的结合)对于大多数测试的抗血清，在同源血清型间鉴定最高水平的交叉反应(在oag骨架上的相同位置处具有共同的葡萄糖基或乙酰基修饰的福氏志贺氏菌血清型，例如福氏志贺氏菌1c抗血清与福氏志贺氏菌1a和1b细菌的结合)。交叉反应水平不同：来自福氏志贺氏菌2a gmma的抗血清仅与同源血清型强烈反应，并且仅与两种其他血清型福氏志贺氏菌4a和y微弱反应(即，其中对于测试的9种异源血清型中的2种，mfi 》 130)。相比之下，针对福氏志
gmma)在没有oag的情况下引发强烈结合细菌的抗体，表明gmma可以诱导广泛范围的抗体应答。然而，来自该研究的三个观察结果显示，通过facs和通过sba测量的由oag阳性gmma诱导的针对oag阳性细菌的抗体主要针对oag：1. 观察到的facs和sba应答主要是血清型或亚型特异性的，并且没有福氏志贺氏菌gmma诱导识别具有相似的lps核心寡糖(21)和大多数外膜蛋白(19)的宋内志贺氏菌的免疫应答。此外，对于每种福氏志贺氏菌抗血清的合并物，存在抗血清未能得到比在宋内志贺氏菌上看到的更强的结合的至少一种福氏志贺氏菌细菌的亚型，再次尽管它们共享除了oag之外的大多数外膜组分。阴性亚型根据合并物的特异性而不同，例如抗福氏志贺氏菌1a没有给出与福氏志贺氏菌3a的可检测结合(图1a和1b)。2. 针对来自oag阴性细菌的gmma产生的血清与oag阳性细菌没有结合或可检测到的结合非常弱，但与oag阴性细菌的结合非常强。3. 针对来自福氏志贺氏菌的oag阳性gmma或宋内志贺氏菌gmma产生的血清与oag阴性宋内志贺氏菌结合。
[0141]
尽管所有血清都具有能够显著结合细菌的表面的抗体，但如果细菌具有oag外壳，它们就无法做到这一点。这与来自用完整细菌的免疫研究的较早发现一致(22)，表明oag掩护细菌免于与外膜表面上的抗原结合，并且观察到与在血清型之间不同的主要表面组分(即oag)的结合。
[0142]
由gmma生成的抗体存在两个重要后果：
•ꢀ
观察到的菌株特异性和交叉反应性必须主要针对每种血清型的oag中的表位。
•ꢀ
由gmma诱导的oag特异性对于通过抗体与细菌表面的结合来诱导疫苗的广泛保护将是重要的。
[0143]
这与由减毒志贺氏菌菌株引发的人类中的免疫主要是oag特异性的观察结果相一致，以及与用通过杀死或减毒细菌免疫的较早动物研究的结果一致(23-25)。鉴于志贺氏菌侵入肠腔并建立感染的复杂机制，这不排除经由不涉及oag的其他机制进行保护，例如针对巨噬细胞或其他含有细胞内志贺氏菌的细胞的t细胞应答(26-29)。
[0144]
来自facs和sba两者的数据显示，如所预期，不同的gmma对共享相同血清型特异性的福氏志贺氏菌菌株产生显著的交叉反应性。例如，针对福氏志贺氏菌2a gmma的抗血清与福氏志贺氏菌2b细菌强烈结合，且反之亦然。这两种血清型仅共享ii型表位，并且没有群特异性。重要的是，对不共享相同类型特异性的菌株也存在显著的结合。例如，针对福氏志贺氏菌1a、1b和1c gmma的抗血清与福氏志贺氏菌2a细菌强烈结合。
[0145]
通常已经假设对于不共享相同类型特异性的免疫和靶标对，交叉反应性将由群特异性介导(即表位3,4；6；7,8；9和10)。这是由noriega等人(13)开发的实验性交叉保护疫苗的基础，其基于减毒的福氏志贺氏菌2a和福氏志贺氏菌3a来递送ii型和iii型以及群3,4；6和7,8特异性。
[0146]
然而，在这个gmma研究中用较大组观察到的交叉反应模式是出乎意料的：在共享的群特异性上建模的交叉保护的详细比较(图1b与图1c相比)与观察到的几乎没有相似之处。该建模对用于创建图1c的详细假设不敏感。仅将反应评分为可检测或不可检测得到类似的图像。例如，针对福氏志贺氏菌1b和1c gmma产生的抗血清得到对没有共享已知的群特异性的福氏志贺氏菌2b的一些观察到的最强结合。也存在从共享的群特异性预期交叉反
应、但未观察到的多种情况。例如，针对福氏志贺氏菌y gmma产生的抗血清确实与福氏志贺氏菌1a细菌反应，如用独特共享的3,4特异性所预期，但与福氏志贺氏菌1b和福氏志贺氏菌2a(其与群3,4分型血清强烈反应)没有可检测到的结合。因此，甚至观察到的抗福氏志贺氏菌y血清和福氏志贺氏菌1a细菌之间的交叉反应也几乎肯定不是由于群3,4反应性。
[0147]
因此，我们得出结论，大多数交叉反应不能通过群特异性来解释。
[0148]
一个特征是免疫原和抗原之间缺乏互惠性(reciprocity)。例如，针对所测试的10种非同源oag阳性福氏志贺氏菌菌株中的所有9种，福氏志贺氏菌3b gmma生成大量的sba滴度，并在较小程度上生成facs mfi。相比之下，除了由福氏志贺氏菌4b生成的弱反应性以外，生成针对福氏志贺氏菌3b的可检测sba/facs活性的唯一其他菌株是福氏志贺氏菌3a。类似地，福氏志贺氏菌1b gmma生成针对10种异源福氏志贺氏菌oag阳性福氏志贺氏菌菌株中的8种(除了福氏志贺氏菌3a和3b)的显著的sba/facs活性。事实上，交叉反应性如此广泛，使得仅由福氏志贺氏菌1b和3a组成的二价疫苗可以在小鼠中得到与所有测试分离株强烈反应的抗体(图1a和1b)。
[0149]
也观察到相反的情况。来自福氏志贺氏菌2a、4b、x和y的gmma以及在较小程度上来自福氏志贺氏菌6的gmma生成的抗体与相对较少的其他分离株反应。除了福氏志贺氏菌4b以外的全部生成与oag阴性宋内志贺氏菌的显著反应(通过facs)，表明它们具有内在免疫原性，至少对于非oag组分如此。与观察到的较差免疫原性相反，福氏志贺氏菌2a、4b、5a、6、x和y通常被来自其他血清型的抗血清识别，表明在疫苗中包括这些血清型不是那么关键，因为很可能被交叉反应覆盖。
[0150]
交叉反应与已知的群特异性不匹配的发现反映了关于类型和群特异性分型血清的生成的数据较旧。最初针对一种细菌菌株产生的血清具有广泛的交叉反应，并且只有在彻底吸附以除去交叉反应后，该血清才可用作单特异性分型试剂(30)。
[0151]
这种缺乏交叉反应性和血清型/群特异性的相关性限制了仅基于这些血清型和群特异性的组合疫苗的合理设计。尽管如此，在该小鼠系统中的广泛的交叉反应性的观察以及对广泛特异性免疫原(诸如福氏志贺氏菌1b和3a)的观察是令人鼓舞的，表明覆盖多种血清型、且由于目前未描述的特异性而组分有限的实用的志贺氏菌疫苗是可能的。存在一个重要的警告：这些数据从小鼠研究生成，并且至少一组来自人类的数据显示小鼠结果可能并不总是可转化为人类(31)。如该研究中用福氏志贺氏菌2a gmma免疫的小鼠所发现(图1)，用福氏志贺氏菌2a oag缀合物免疫的小鼠也没有引发与福氏志贺氏菌6 oag反应的抗体，尽管来自用福氏志贺氏菌2a oag缀合物免疫的人的血清确实引发与福氏志贺氏菌6 oag结合的抗体，并且可能已经针对被该菌株的感染保护儿童(31)。显然，来自用福氏志贺氏菌构建体的疫苗试验的人血清的精细特异性的仔细分析对于设计广泛特异性的福氏志贺氏菌疫苗将是重要的。
[0152]
参考文献
[0153]
表格表1. 本研究中使用的福氏志贺氏菌细菌的类型和群特异性
[0154]
替代表1. 本研究中使用的福氏志贺氏菌细菌的类型和群特异性
[0155]
表2.图1a、b和c的比较
ꢀ
[0156]
表s1
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通过载片凝集和facs分型表征该研究中使用的福氏志贺氏菌菌株用denka单价兔分型和分组血清(仅凝集)对从英格兰公共卫生部收到的福氏志贺氏菌细胞系进行facs分型和凝集，以证实血清型的身份。
[0157]
10至100的平均荧光强度被认为指示没有信号(指定的抗血清不结合福氏志贺氏菌血清型的表面)并与阴性凝集(-)相关
[0158]
表s2
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gmma oag与蛋白的比率材料比率w/woag/蛋白gmma-1a0.39gmma-1b0.58gmma-1c0.53gmma-2a0.42gmma-2b0.8gmma-3a0.48gmma-3b0.39gmma-4a0.39gmma-4b0.48gmma-5a0.38gmma-5b0.58gmma-60.39gmma-x0.12gmma-y0.46
[0159]
表s3
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表面染色平均荧光强度显示用合并的针对gmma产生的血清对福氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌的表面染色
的平均荧光强度的矩阵。与同源血清型的结合以粗体显示。s.s.：宋内志贺氏菌
[0160]
表s4 血清杀细菌活性(sba)滴度。
[0161]
显示用合并的针对gmma产生的血清对福氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌细胞系的sba滴度的矩阵。对同源血清型的滴度以粗体显示。brc %：sba中幼兔补体的百分比。s.s.：宋内志贺氏菌