包含4-己基间苯二酚作为活性成分的用于预防或治疗骨疾病的药物组合物

1.本公开涉及包含4-己基间苯二酚(4-hr)作为活性成分的用于预防或治疗骨疾病的组合物及其剂型。


背景技术：

2.骨质疏松是一种骨骼组织的骨重建疾病，由于骨强度减弱，即使是小的冲击也很容易骨折。成人骨的维护是通过骨重建，其中破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成在局部位点依序地发生。破骨细胞附着至旧的裂骨的表面并分泌酸和分解酶，以分别去除骨矿物质和基质蛋白。另一方面，成骨细胞分泌含有磷酸钙晶体的基质囊泡，以形成新的骨并维护骨骼。每年约有10％至30％成人的骨通过骨重建进行再生。
3.骨中的内稳态由身体中各种系统性和局部性因素控制。然而，由于身体内激素异常或压力引起的成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用失衡导致代谢性骨疾病。直到30-50岁过度的活动被诱导，骨吸收和骨形成的比例失衡。因此，发生骨丢失，并诱导骨质疏松。
4.随着全球人口老龄化，对骨质疏松和治疗的兴趣逐渐增加。据报道，骨质疏松和其它骨疾病的治疗正在形成一个价值约1300亿美元的市场，预计未来骨质疏松治疗的市场将进一步增长。因此，全球研究机构或制药公司正在大力投资开发用于骨疾病的治疗药剂。
5.用于骨疾病的治疗药剂可分为雌激素制剂、双膦酸盐制剂和甲状旁腺激素制剂，传统上多用于绝经后妇女。雌激素制剂有效减少骨折，但应谨慎使用，因为它们增加血栓形成和乳腺癌的风险。双膦酸盐是应用最广泛的药物，其抑制破骨细胞功能并减少破骨细胞数量，从而防止破骨细胞形成。与骨质疏松的其它药物不同，pth是一种合成代谢剂，增加骨组织，因为成骨细胞被直接激活形成新骨。然而，它很昂贵并且需要通过注射给药。为了解决该问题，需要研究和开发对骨质疏松有效同时减少药物给予中的不适并确保安全给药且无副作用的预防药剂和治疗药剂。
6.[现有技术文件]
[0007]
[专利文件]
[0008]
韩国专利申请公布号10-2011-0135168(于2011年12月16日公布)


技术实现要素：

[0009]
技术问题
[0010]
传统的基于双膦酸盐的药物阻抑破骨细胞的活性，因此是治疗骨疾病(如骨质疏松)的代表性药物。但是，存在诸如破骨细胞死亡、颌骨骨坏死、非典型性骨折、骨折愈合延迟、注射不适等的副作用。本公开的目的是提供用于骨疾病的治疗药剂，所述治疗药剂抑制破骨细胞活性而不诱导细胞死亡，同时刺激成骨细胞活性。此外，具有作为软膏给药容易的优点。
[0011]
技术方案
[0012]
本公开提供用于预防或治疗骨疾病的药物组合物，所述药物组合物包含4-己基间苯二酚(4-hr)或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0013]
有益效果
[0014]
根据本公开的示例性实施例，发现包含4-己基间苯二酚(4-hr)作为活性成分的组合物或软膏通过促进成骨细胞的分化同时阻抑破骨细胞的增殖和分化调节了骨重建，并改善了诱导有骨质疏松的动物模型中的骨厚度、密度和强度。因此，包含4-hr作为活性成分的组合物或软膏可提供为用于骨疾病的治疗药剂，所述骨疾病包括骨折、骨关节炎、类风湿性关节炎和骨质疏松。
附图说明
[0015]
图1显示了评价4-己基间苯二酚(4-hr)对骨质疏松动物模型中小梁和皮质骨的影响的micro-ct图像和图表。a显示了小梁骨体积/组织体积(bv/tv)和小梁厚度(tb.th)变化的确认结果，b显示了皮质骨体积/组织体积(bv/tv)和皮质骨矿物质密度(bmd)变化的确认结果。
[0016]
图2显示了确认4-己基间苯二酚(4-hr)对骨质疏松动物模型中骨强度的影响的图表。
[0017]
图3显示了确认4-己基间苯二酚(4-hr)对骨质疏松动物模型中骨吸收和骨形成标志物的血清水平的影响的图表。
[0018]
图4显示了确认4-己基间苯二酚(4-hr)对骨质疏松动物模型中腹部脂肪积累的影响的图表。
[0019]
图5显示了用碱性磷酸酶(alp)和茜素红染色以确认4-己基间苯二酚(4-hr)对成骨细胞分化的影响的图像。
[0020]
图6显示了通过trap染色和pit测定确认4-己基间苯二酚(4-hr)对细胞分化和破骨细胞活性的影响的结果。
具体实施方式
[0021]
说明书中使用的术语是当前广泛使用并考虑到本公开的功能而选择的常用术语。然而，这些术语可以根据本领域技术人员的意图或先例以及新技术的出现而变化。此外，在某些情况下，可能有申请人任意选择的术语。在这种情况下，将在与其对应的本公开的描述中详细描述该含义。因此，本公开中使用的术语应根据术语的含义和本公开的整体内容来定义，而不是根据术语的简单名称来定义。
[0022]
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术术语或科学术语)具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。常用词典中定义的术语应解释为具有与相关技术背景中的含义一致的含义，除非在本技术中明确定义，否则不应解释为理想或过于形式化的含义。
[0023]
数值范围包括在该范围内定义的数值。在整个说明书中给出的每个最大数值限制都包括所有更低的数值限制，就好像这些更低的数值限制被明确写出一样。整个说明书中给出的每个最小数值限制包括所有更高的数值限制，就好像这些更高的数值限制被明确写出一样。在整个说明书中给出的所有数值限制将包括在更宽的数值范围内的所有更好的数
值范围，就好像更窄的数值限制被明确写出一样。
[0024]
在下文中将详细描述本公开的示例性实施方式。
[0025]
本公开的示例性实施方式提供了用于预防或治疗骨疾病的药物组合物，所述药物组合物包含4-己基间苯二酚(4-hr)或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0026]
4-己基间苯二酚(4-hr)是化学式为c
12h18
o2，iupac名称为4-己基苯-1,3-二醇的物质，其结构由以下化学式1表示。
[0027][0028]
4-己基间苯二酚(4-hr)表现出增加骨体积、骨密度和骨厚度的活性，降低血液中ctx水平，并显示出增加alp水平的作用。
[0029]
4-己基间苯二酚(4-hr)表现出降低腹部脂肪积累的抗肥胖活性。
[0030]
4-己基间苯二酚(4-hr)表现出促进成骨细胞分化同时阻抑破骨细胞分化的活性。
[0031]
骨疾病可包括骨折、骨关节炎、类风湿性关节炎和骨质疏松，但不限于此。
[0032]
所述药物组合物可以配制成一种或多种外用制剂的形式，所述一种或多种外用制剂选自于由霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、搽剂、糊剂和巴布剂(cataplasmas)所组成的组。
[0033]
本公开的示例性实施方式的药物组合物可包括配方额外所需的药学上可接受的载体和稀释剂。所述药学上可接受的载体和稀释剂包括赋形剂(例如淀粉、糖和甘露糖醇)、填充剂和增量剂(例如磷酸钙)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟丙基纤维素)、粘合剂(例如明胶、藻酸盐和聚乙烯吡咯烷酮)、润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、氢化蓖麻油和聚乙二醇)、崩解剂(例如聚维酮和交联聚维酮)、以及表面活性剂(例如聚山梨醇酯、鲸蜡醇和甘油)，但不限于此。所述药学上可接受的载体和稀释剂可与受试者在生物学和生理学上相容。稀释剂的实例可包括盐水、水性缓冲剂、溶剂和/或分散介质，但不限于此。
[0034]
本公开的示例性实施方式的药物组合物可于局部、肠胃外途径给予，所述途径涉及根据所需方法通过施用于皮肤以吸收。此外，本公开的示例性实施方式的药物组合物的剂量范围根据受试者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药持续时间、给药方法、排泄率和疾病严重程度而变化，但不限于此。
[0035]
实施例
[0036]
在下文中，将详细描述实施例以帮助理解本公开。然而，以下实施例仅用于说明本公开的内容，而本公开的范围不限于以下实施例。提供本发明的实施例以向本领域技术人员更完整地解释本公开。
[0037]
《实验实施例》
[0038]
以下实验实施例旨在提供通常应用于根据本公开示例性实施方式的每个示例性实施方式的实验实施例。
[0039]
1.试剂
[0040]
用于示例性实施方式中的茜素红s、碱性磷酸酶(alp)染色试剂盒、抗坏血酸、β-甘
油磷酸盐、萘酚as-mx磷酸盐、二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺、固红紫色lb和多聚甲醛(pfa)购自sigma-aldrich(st.louis,mo)。
[0041]
示例性实施方式中使用的丙酮、甲醛溶液、乙酸钠三水合物、酒石酸钠二水合物、乙醇和甘油购自junsei(日本桥本町，中央区，东京)。α-最低必需培养基(α-mem)购自thermo scientific(rockford,il,u.s.a)。
[0042]
示例性实施方式中使用的胎牛血清(fbs)购自gibco(grand island,ny,u.s.a)，人巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)购自peprotech,inc.(rocky hill,nj,usa)，n,n-二甲基对甲苯胺购自mp biomedicals(solon-ohio,bc,u.s.a)，青霉素/链霉素购自lonza(rockland,me,usa)，以及红血细胞裂解液购自biolegend(san diego,ca,u.s.a)。核因子κb配体的受体激活剂(rankl)购自r&d systems(minneapolis,mn,u.s.a)。
[0043]
2.细胞培养
[0044]
于37℃下在存在5％(v/v)co2的情况下使用恒温恒湿培养箱，在含有10％(v/v)fbs、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100单位/ml)的α-mem中培养mc3t3-e1(小鼠颅盖成骨细胞系)细胞。当培养皿中充满100％汇合的成骨细胞时，以50μg/ml抗坏血酸和10mmβ-甘油磷酸盐进行处理以诱导细胞分化。在细胞分化过程中，每3天更换分化培养基。
[0045]
从8周龄小鼠的股骨和胫骨中分离出小鼠骨髓单核细胞(bmm)。从通过颈椎脱位安乐死的小鼠中分离股骨和胫骨后，取出肌肉，切掉两端，用注射器过滤α-mem，以分离骨髓细胞。将分离的骨髓细胞离心后，添加红血细胞裂解液以使红血细胞进行溶解，然后于37℃下在存在5％(v/v)co2的情况下使用恒温恒湿培养箱，在含10％(v/v)fbs、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100单位/ml)的α-mem中将培养进行一天。仅收集未粘附至培养皿的悬浮细胞，用20ng/ml m-csf进行处理，培养3天，从而得到骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞。为了使巨噬细胞分化为破骨细胞，以20ng/ml m-csf和30ng/ml rankl进行处理，然后培养4天。在诱导分化的同时每2天更换培养基。
[0046]
3.碱性磷酸酶(alp)染色
[0047]
将mc3t3-e1和骨髓干细胞以5
×
104个细胞/孔接种到48孔多孔板中，用浓度为10-9
m至10-6
m浓度的4-己基间苯二酚(4-hr)处理并将培养进行7天，同时每2天更换分化诱导培养基。培养后，用pbs洗涤细胞3次，用含有5ml柠檬酸、13ml丙酮、1.6ml甲醛溶液的固定剂处理45秒。然后，将细胞用pbs洗涤两次，用碱性染料混合物进行处理，并在黑暗中于室温下反应30分钟。除去溶液后，用pbs洗涤细胞数次并在显微镜下进行观测。
[0048]
4.茜素红s染色(矿化)
[0049]
将mc3t3-e1和骨髓干细胞以5
×
104个细胞/孔接种到48孔多孔板中，用浓度为10-9
m至10-6
m的4-己基间苯二酚(4-hr)处理并将培养进行14-21天，同时每2天更换分化诱导培养基。孵育后，将细胞用pbs洗涤3次，并使用4％甲醛作为固定剂在室温下固定10分钟。用三级蒸馏水洗涤细胞3次，添加ph 4.2的茜素红溶液，室温下10分钟进行染色。用pbs洗涤细胞数次并在显微镜下进行观测。
[0050]
5.抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色
[0051]
用20ng/ml m-csf处理从小鼠股骨和胫骨分离的髓质单核细胞并反应一天。收集附着至培养皿的细胞后，将细胞以5
×
104个细胞/孔分配到96孔多孔板中，用浓度为10m至6m的4-己基间苯二酚(4-hr)处理并将培养进行4天，同时更换为破骨细胞分化诱导培养基。
移除培养基并用pbs洗涤后，将细胞用10％甲醛溶液固定并用trap染色溶液处理，然后在37℃下染色30分钟，在所述染色溶液中将萘酚as-mx磷酸盐红紫色lb(萘酚as-mx，固红紫色lb)和n,n-二甲基甲酰胺溶解在50mm ph5.0的醋酸盐缓冲液中。移除溶液，用pbs洗涤两次，然后在显微镜下进行观测。
[0052]
6.pit测定
[0053]
将单核细胞灭菌并接种在放置在96孔板上的骨切片上，然后在rankl(30ng/ml)和m-csf(30ng/ml)的存在下培养3天。3天后，用4-己基间苯二酚(4-hr)处理分化的破骨细胞，并进行培养2天。培养2天后，移除破骨细胞，将骨切片与辣根过氧化物酶-小麦胚芽凝集素(sigma-aldrich)反应，然后用3,3'-二氨基联苯胺(sigma-aldrich)染色。根据制造商的方法使用基于java的图像分析程序(imagej)分析染色的细胞。
[0054]
7.micro-ct分析
[0055]
分离小鼠股骨并去除肌肉后，于4℃下使用4％pfa进行固定一天。次日，用pbs溶液洗涤3次，贮存在pbs中。使用skysan1272(bruker,massachusetts,usa)模式，通过以6μm为单位扫描生长板下1.6mm至2.3mm的部分来分析由此保存的股骨。使用micro-ct，在测量小梁骨体积/组织体积(bv/tv)、小梁厚度(tb.th)、小梁数量(tb.n)、小梁分离(tb.sp)和小梁骨矿物质密度(bmd)期间，也测量了皮质骨的骨体积/组织体积(bv/tv)和骨矿物质密度(bmd)。
[0056]
8.骨强度的测量
[0057]
分离小鼠股骨并去除肌肉后，将股骨置于ph7.4的0.9％nacl中，并在-20℃下贮存。在分析样品之前，将其在4℃下缓慢解冻，并用instron(拉伸测试仪，williamston，sc，usa)测量最大载荷(n)和斜率(n/mm)。
[0058]
实施例1：4-己基间苯二酚(4-hr)软膏的制备
[0059]
将4-己基间苯二酚(4-hr)试剂溶解在乙醇中，并在处理细胞时稀释至1000
×
。购自sigma的羊毛脂油用作为软膏基材。测量羊毛脂油的重量，将相当于2％重量的羊毛脂油的4-己基间苯二酚(4-hr)粉末溶解在100％乙醇中。使羊毛脂油在设定为50℃至60℃的水浴中完全液化后，添加溶解在乙醇中的4-己基间苯二酚(4-hr)并用均质器混合。通过在水浴中蒸发残留的乙醇，将混合有4-己基间苯二酚(4-hr)的羊毛脂油制成软膏的形式。
[0060]
实施例2：通过给予含4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏来确认对骨质疏松的治疗作用
[0061]
1.通过给予含4-hr的软膏确认骨体积增加作用
[0062]
为了评价4-己基间苯二酚(4-hr)对骨重建的影响，在骨质疏松模型中通过卵巢切除术(ovx)诱导骨质疏松后，将含有2％4-hr的软膏施用于小鼠背部皮肤4周，并通过micro-ct分析骨体积的变化。
[0063]
如图1所示，诱导的骨质疏松(ovx)小鼠显示出颅骨骨体积减少。在施用4-己基间苯二酚(4-hr)的诱导的骨质疏松(ovx)小鼠组的情形下，与诱导的骨质疏松(ovx)小鼠相比，骨体积增加，以及骨密度、小梁数量和小梁厚度增加。
[0064]
上述结果表明，4-己基间苯二酚(4-hr)具有增加因诱导骨质疏松而减少的骨体积的作用，这证明含有4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏对骨疾病具有治疗作用。
[0065]
2.通过给予含4-hr的软膏确认骨强度增加作用
[0066]
为了评价4-己基间苯二酚(4-hr)对骨强度的作用，定期将4-己基间苯二酚(4-hr)施用于具有通过卵巢切除术诱导的骨质疏松的小鼠模型，以检查骨强度的变化。
[0067]
如图2所示，在具有通过卵巢切除术诱导的骨质疏松的小鼠模型中，骨体积和骨强度均有下降。在定期施用4-己基间苯二酚(4-hr)软膏的诱导的骨质疏松小鼠模型组中，与诱导的骨质疏松小鼠对照相比，小鼠不仅骨体积有所增加，而且骨强度也增加了。
[0068]
上述结果表明，4-己基间苯二酚(4-hr)具有增加因诱导骨质疏松而减少的骨体积和骨强度的作用，这证明含有4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏对骨疾病具有治疗作用。
[0069]
3.通过给予含4-hr的软膏来确认阻抑骨吸收和促进骨形成的作用
[0070]
为了评价4-己基间苯二酚(4-hr)对骨吸收和促进骨形成的作用，通过血液生化分析测量了骨质疏松动物模型中ctx、alp和rankl的水平。ctx用作评价血液中骨吸收(骨破坏)程度的标志物，alp是成骨细胞分泌的指示骨形成程度的标志物，rankl用作成骨细胞分泌并促进破骨细胞分化的标志物。
[0071]
如图3所示，据发现骨质疏松动物模型中ctx水平有所升高而alp水平有所降低。此外，当将4-己基间苯二酚(4-hr)定期施用于骨质疏松动物模型时，ctx水平有所降低而alp水平有所升高。
[0072]
上述结果表明，通过将4-己基间苯二酚(4-hr)施用于皮肤，使得由骨质疏松诱导的骨形成降低和骨吸收增加得到改善，这表明含有4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏展现出对骨质疏松的治疗作用。
[0073]
4.通过给予含4-hr的软膏来确认抑制腹部脂肪积累的作用
[0074]
为了确认4-己基间苯二酚(4-hr)是否具有抗肥胖作用，施用含4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏，并在具有通过卵巢切除术诱导的骨质疏松的动物模型中检查腹部脂肪积累程度。
[0075]
如图4所示，在骨质疏松小鼠模型中，骨体积降低，腹部脂肪积累，从而导致肥胖。在施用含有4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏的组中，骨体积有所增加，但腹部脂肪积累有所降低。
[0076]
上述结果表明，通过将4-己基间苯二酚(4-hr)施用至皮肤，使得由骨质疏松导致的腹部脂肪积累和肥胖得到改善，这表明由于缺乏雌激素，含有4-己基间苯二酚(4-hr)的软膏展现出抗肥胖的作用。
[0077]
5.通过4-hr处理促进成骨细胞分化
[0078]
为了确认4-己基间苯二酚(4-hr)对成骨细胞分化的作用，用4-己基间苯二酚(4-hr)处理成骨细胞(mc3t3-e1)，然后使其经受用碱性磷酸酶(alp)和茜素红进行的染色，以检查分化程度。
[0079]
如图5所示，发现通过用4-己基间苯二酚(4-hr)处理成骨细胞(mc3t3-e1)，促进了分化。上述结果表明4-己基间苯二酚(4-hr)促进成骨细胞的细胞分化。
[0080]
6.4-hr处理抑制破骨细胞的分化和活性
[0081]
为了评价4-己基间苯二酚(4-hr)对破骨细胞分化和活性的作用，用4-己基间苯二酚(4-hr)对破骨细胞进行处理，并通过trap染色和pit测定分析检查细胞分化和破骨活性。
[0082]
如图6所示，发现4-己基间苯二酚(4-hr)抑制破骨细胞的分化以及破骨活性。上述结果表明，4-己基间苯二酚(4-hr)通过破骨细胞抑制骨破折。
[0083]
尽管上面已经详细描述了本公开的具体部分，但是对于本领域技术人员来说清楚的是，这些具体描述仅仅是优选的示例性实施方式，并且本公开的范围不限于此。换言之，本公开的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。