用于预防癌症复发的组合物和方法

用于预防癌症复发的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年12月9日提交的名称为“compositions and methods for preventing recurrence of cancer”的美国临时专利申请序号62/945,464的优先权权益，其公开内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.免疫检查点阻断疗法被公认为癌症治疗的突破。目前，美国fda已批准伊匹木单抗(ipilimumab)(抗ctla4)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)(抗pd1)、纳武单抗(nivolumab)(抗pd1)和阿特珠单抗(atezolizumab)(抗pdl1)用于治疗若干类型的癌症。这些抗体的基本作用机制是通过中断ctla4-cd80/cd86、pd1-pdl1/pdl2之间的相互作用抑制共抑制途径来恢复细胞毒性t细胞功能。然而，并非所有患者都对这些免疫疗法有响应。这些免疫疗法也取决于肿瘤类型。例如，在胰腺癌、结肠癌和肝癌患者中尚未发现响应率或响应率低。因此，为了提高免疫治疗响应率，正在开发用于免疫抑制的特异性目标导向抑制剂或激动剂以刺激免疫响应。然而，许多这些单个目标导向的免疫增强剂在临床试验中失败。这可能是由于肿瘤环境的复杂性，其中癌细胞高度异质并且免疫细胞由处于不同发育阶段的多种细胞类型组成。
4.考虑到上述情况，本领域需要开发用于癌症免疫疗法的多个目标导向的免疫增强剂。本发明满足了这种需要。


技术实现要素：

5.本公开提供了预防哺乳动物中癌症复发的方法。方法包括向哺乳动物对象给予草药提取物，其含有：黄芩(scutellaria baicalensis)(s)、甘草(glycyrrhiza uralensis)(g)、芍药(paeonia lactiflora)(p)和枣(ziziphus jujuba)(z)的草药提取物、其级分或存在于草药提取物或其级分中的任何活性化学物质；和/或(b)β-葡糖醛酸糖苷酶处理的yiv-906(yiv-906gu)或其级分、或存在于yiv-906gu或其级分中的任何活性化学物质。进一步向哺乳动物给予治疗有效量的至少一种免疫治疗剂。合适的免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂和抗体。
附图说明
6.当结合附图阅读时，将更好地理解以下对本发明具体实施方式的详细描述。为了示例本发明，在附图中显示了具体实施方式。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。
7.图1a-1b示例了yiv-906对于抗pd1(yiv-906，500mg/kg p.o.bid x 7；抗pd-1抗体，200μg/小鼠i.p.qd)针对c57bl6小鼠的hepa 1-6肿瘤生长的抗肿瘤活性的影响。图1a是显示在第0至14天期间每个治疗组中个体肿瘤生长的斑点图(spot plot)。图1b是显示在第0至20天期间每个治疗组的平均(
±
sd)肿瘤生长的图。开始时的肿瘤大小为约180mm3。
8.图2a-2f示例了yiv-906和/或抗pd1对hepa 1-6肿瘤的巨噬细胞和m1/m2标志基因表达的影响。图2a是显示在处理4天后巨噬细胞浸润到hepa 1-6肿瘤中的f4/80的免疫组织化学染色的图像。图2b显示了在处理4天后肿瘤切片的巨噬细胞的定量。图2c和2d显示了在处理4天后hepa 1-6肿瘤的mcp1和inos蛋白表达。图2e是用于指示在第4天处理后通过rt-qpcr确定的mrna表达的热图(heat map)(显著上调：红色，显著下调：绿色)。图2f是基于图2e中显示的特征基因表达，显示处于m1状态的可能性的表。从t检验分析获得p值。
9.图3示例了yiv-906对ifnγ或il4将骨髓源性巨噬细胞(bmdm)极化为m1或m2样巨噬细胞的作用的影响。图3显示了在使用或不使用yiv-906或yiv-906gu处理的ifnγ或il14后，bmdm的mrna表达水平的热图。对于每一行(基因)，mrna的上调以(红色)突出，而下调以(绿色)突出。表中的数字表示每种处理条件下的相对倍数变化基因表达(三个独立实验的平均值；所有基因表达均以肌动蛋白标准化)。骨髓细胞在小鼠m-csf(10ng/ml)的存在下培养7天，然后在ifnγ10ng/ml的存在下培养以诱导极化为m1样巨噬细胞，而m2样巨噬细胞由il-4 20ng/ml诱导24h。将yiv-906或yiv-906gu与ifnγ或il4同时添加。在第8天处理后，通过qrt-pcr确定m1或m2相关基因的mrna表达。
10.图4a-4d示例了yiv-906gu对bmdm的ifnγ信号传导途径的蛋白质的影响。图4a是显示yiv-906gu对bmdm的ifnγ分泌的影响的直方图(histogram)。骨髓细胞在鼠m-csf(10ng/ml)的存在下培养7天，然后将yiv-906添加至细胞中24h。通过elisa检测培养基中的ifnγ。图4b显示了单独的yiv-906gu对bmdm的ifnγ信号传导的影响的蛋白质印迹分析。图4c显示了yiv-906gu对bmdm的ifnγ信号传导的影响的蛋白质印迹分析。图4d显示了yiv-906gu对il4对bmdm的il4信号传导的作用的影响的蛋白质印迹分析。骨髓细胞在鼠m-csf(10ng/ml)的存在下培养7天，然后添加ifnγ10ng/ml以诱导极化为m1样巨噬细胞，而m2样巨噬细胞由il-4 20ng/ml在有或无yiv-906的情况下诱导24h。用蛋白质印迹检测蛋白质表达或磷酸化。组蛋白h3用于蛋白质负载的标准化。
11.图5a-5c示例了yiv-906对ifnγ信号传导途径中的蛋白质的影响。图5a显示了单独的yiv-906对bmdm的ifnγ信号传导的影响的蛋白质印迹分析。图5b显示了yiv-906对于ifnγ对bmdm的ifnγ信号传导的作用的影响的蛋白质印迹分析。图5c显示了yiv-906对于il4对bmdm的il4信号传导的作用的影响的蛋白质印迹分析。骨髓细胞在鼠m-csf(10ng/ml)的存在下培养7天，然后添加ifnγ10ng/ml以诱导极化为m1样巨噬细胞，而m2样巨噬细胞在有或无yiv-906的情况下由il-4 20ng/ml诱导24h。通过蛋白质印迹检测蛋白质表达或磷酸化。组蛋白h3用于蛋白质负载的标准化。
12.图6示例了yiv-906或yiv-906gu对ifnγ将原始细胞(raw cell)264.7极化为m1样巨噬细胞的作用的影响。yiv-906或yiv-906gu可以增强ifnγ以诱导mcp1、tnfa和inos(m1相关基因)。将原始细胞264.7在鼠m-csf(10ng/ml)的存在下培养3天，然后在ifnγ10ng/ml的存在下培养以诱导极化为m1样巨噬细胞24h。在第8天处理后通过rt-qpcr确定mrna表达。
13.图7a-7b示例了yiv-906和/或抗pd1对hepa 1-6肿瘤的pd1(图7a)和pdl1(图7b)蛋白表达的影响。为了进行hepa 1-6肿瘤的pd1和pdl1蛋白表达的蛋白质印迹分析，在抗pd1-/+yiv-906处理4天后，将β-肌动蛋白用于蛋白质负载的标准化。将每个样品标准化为主要混合样品(master mix sample)(mix)，并每个凝胶重复负载。t检验p值显示在图中。
14.图8a-8c示例了yiv-906和/或抗pd1对bd1小鼠中的t细胞和裸鼠中的hepa 1-6肿
瘤生长的影响。图8a示例了yiv-906和/或抗pd1对hepa 1-6肿瘤的活化t细胞的影响，如granyzmeb和cd3染色所示。图8b示例了yiv-906和/或抗pd1对hepa 1-6肿瘤的treg细胞的影响，如cd3+/fox3p+所示。在处理4天后，肿瘤组织被分散酶消化，随后用荧光标记的抗fox3p或抗粒酶(granyzme)b连同cd3(t细胞)和cd45(血细胞)染色。流式细胞仪分析用于确定总t细胞中treg或粒酶(granyzme)b+ve细胞的百分比。图8c示例了使用qrt-pcr，yiv-906和/或抗pd1对与hepa 1-6肿瘤的t细胞相关的mrna表达的影响。
15.图9a-9c示例了yiv-906对体外和体内ido活性的影响。图9a是示例yiv-906、大肠杆菌(e.coli)葡糖醛酸糖苷酶处理的yiv906(yiv906gu)及其类黄酮对培养物中ido转染hek293细胞的ido活性的影响的图。将hek293细胞用小鼠ido表达质粒转染，然后接种进行培养过夜。将具有或不具有yiv906、yiv906gu或其类黄酮的l色氨酸125μm添加至孔中24h。利用基于比色的测定测量培养基中犬尿氨酸的浓度。结果被标准化为每个孔中的蛋白质浓度。图9b显示了不同处理对hepa 1-6肿瘤的犬尿氨酸/色氨酸的影响。图9c显示了不同处理对hepa 1-6肿瘤的单核细胞mdsc的影响。来自t检验的p值显示在图9b和9c中。
16.图10a-10b显示了在没有向细胞中添加yiv-906(图10a)或yiv-906gu(图10b)(用重组大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶预处理以模拟肠道条件)的情况下bmdm(用mcsf20ng/ml预处理7天)的irf3-p蛋白表达再进行24h的蛋白质印迹分析。组蛋白3用于蛋白质负载的标准化。
17.图10c是显示通过elisa测定检测的培养基(48h)中的ifnβ的图。
18.图11示例了yiv-906或yiv-906gu(用大肠杆菌葡糖醛酸糖苷酶预处理)对cd73酶活性的影响。在amp(100μm)作为底物存在下，在具有或不具有yiv-906或yiv-906gu的情况下，使用重组人cd73酶2h。通过hplc检测腺苷的形成。将yiv-906或yiv-906gu存在下的相对面积腺苷峰值与对照进行比较。
19.图12a-12c显示了各种yiv-906制剂对m1/m2 mrna表达的影响。图12a显示了yiv906gu、单一草药(g、p、s和z：gu处理)或一种草药缺失制剂(-g、-p、-s和-z：gu处理)对巨噬细胞的inos/arg的mrna表达的影响。图12b显示了黄芩黄素、汉黄芩素、白杨黄素、木蝴蝶素a、和黄芩苷对巨噬细胞的inos/arg的mrna表达的影响。原始细胞在鼠m-csf(10ng/ml)的存在下培养3天，然后在ifnγ10ng/ml单独存在或与yiv-906gu/其组分一起培养以诱导极化为m1样巨噬细胞24h。在第8天处理后，通过rt-qpcr确定mrna表达。图12c示例了利用本文所述的lc-ms，检测了在具有或不具有抗pd1的情况下，口服给予yiv-906后hepa 1-6肿瘤的yiv-906化合物。
具体实施方式
20.现将详细参考所公开主题的某些实施方式。尽管将结合所列举的权利要求来描述所公开的主题，但是将理解，所示例的主题并不旨在将权利要求限制为所公开的主题。
21.定义
22.如本文所用，以下术语中的每一个在本节中具有与其相关的含义。
23.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以被用于实践或测试本公开，但是描述了示例性方法和材料。
24.总体上，本文使用的命名法和药理学、天然产物化学和有机化学中的实验室程序是本领域公知和常用的那些。
25.如本文所用，术语“约”可以允许值或范围内的可变程度，例如，在规定值或规定范围的限值的10％内、5％内或1％内，并且包括确切的规定值或范围。
26.如本文所用，术语“基本上”指代大部分或绝大部分，如至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％、或至少约99.999％或更多、或100％。如本文所用，术语“基本上不含”可以意为没有或具有微量，使得存在的材料的量不影响包括该材料的组合物的材料性质，使得组合物为材料的约0wt％至约5wt％、或约0wt％至约1wt％、或约5wt％或更小、或小于、等于、或大于约4.5wt％、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、或约0.001wt％或更小。术语“基本上不含”可以意为具有微量，使得组合物为材料的约0wt％至约5wt％，或约0wt％至约1wt％、或约5wt％或更小、或小于、等于、或大于约4.5wt％、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、或约0.001wt％或更小、或约0wt％。
27.如本文所用，术语“癌症”被定义为以异常细胞快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以在局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包括但不限于骨癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
28.在一个方面，与对象相关的术语“共同给予的”和“共同给予”指代向对象给予本公开的化合物和/或组合物以及还可以治疗或预防本文所考虑的疾病或障碍的化合物和/或组合物。在某些实施方式中，共同给予的化合物和/或组合物被单独给予，或以任何种类的组合作为单一治疗方法的部分被给予。共同给予的化合物和/或组合物可以任何种类的组合被配制为在各种固体、凝胶和液体制剂下的固体和液体的混合物，以及作为溶液。
29.如本文所用，术语“治愈”指代缓解对象的特定疾病或障碍，例如特定类型的癌症。
30.如本文所用，术语“提取物”指代衍生自天然存在来源(例如草药或其它植物材料)的化合物或药物的浓缩制剂或溶液。提取物可以通过多种方法制备，包括将药草浸泡在溶液中，或将药草干燥并研磨成粉末并将粉末溶解在溶液中。在将一定量的期望化合物溶解在溶液中之后，可以通过去除部分溶剂来进一步浓缩提取物。还可以将提取物过滤或离心以从溶液中去除任何固体材料。
31.如本文所用，短语“抑制”意为将分子、反应、相互作用、基因和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性降低可测量的量或完全阻止。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断刺激、降低、防止、延迟活化、失活、脱敏或下调蛋白质或基因的稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如拮抗剂。
32.如本文所用，术语“药物组合物”或“组合物”指代在本公开中有用的至少一种化合物与药学上可接受的载体的混合物。药物组合物有助于将化合物给予对象。
33.如本文所用，术语“药学上可接受的”指代不消除在本公开中可用的化合物的生物活性或性质，并且是相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，即可以将材料给予对象而不引起不期望的生物学效果或以有害方式与包含其的组合物的任何组分相互作用。
34.如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意为药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封
材料，涉及在对象体内或向对象携带或运输在本公开中有用的化合物使得其可以执行其预期功能。通常，这种构建体从身体的一个器官或一部分被携带或运输至身体的另一器官或一部分。在与制剂的其它成分相容的意义上，每种载体必须是“可接受的”，包括在本公开中有用的化合物，并且对对象无害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物制剂中采用的其它无毒相容物质。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与本公开中可用的化合物的活性相容并且是对象生理上可接受的任何和所有涂层、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以被掺入组合物中。“药学上可接受的载体”可以进一步包括在本公开中可用的化合物的药学上可接受的盐。可以被包括在本公开的实践中使用的药物组合物中的其它另外成分是本领域已知的并且被描述于例如remington’spharmaceutical sciences(genaro,ed.,mack publishing co.,1985,easton,pa)中，其通过引用并入本文。
35.如本文所用，语言“药学上可接受的盐”指代由药学上可接受的无毒酸和碱，包括无机酸、无机碱、有机酸、无机碱、其溶剂化物、水合物和包合物制备的所给予化合物的盐。合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。无机酸的实例包括硫酸盐、硫酸氢盐、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸(包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐)。适当的有机酸可选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳脂族、杂环族、羧酸和磺酸类有机酸，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸(双羟萘酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、三氟甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、对氨基苯磺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖酸和半乳糖醛酸。本公开的化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括例如金属盐，包括碱金属盐、碱土金属盐和过渡金属盐，如例如钙盐、镁盐、钾盐、钠盐和锌盐。药学上可接受的碱加成盐还包括由碱性胺，如例如n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(n-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。所有这些盐可以由相应的化合物通过例如使适当的酸或碱与化合物反应来制备。
36.术语“药学有效量”和“有效量”指代无毒但足以提供期望的生物学结果的药剂的量。此结果可以是减少和/或减轻疾病或障碍的体征、症状或病因，或生物学系统的任何其它期望改变。任何个体情况下的适当有效量可以由本领域普通技术人员利用常规实验确定。“药物制剂”进一步意为载体、溶剂、赋形剂(一种或多种)和/或盐必须与制剂(例如本公开的化合物)的活性成分相容。本领域普通技术人员理解，术语“药物制剂”和“药物组合物”总体上是可互换的，并且其被用于本技术的目的。
37.如本文所用，术语“yiv-906”指代包含甘草(g)、芍药(p)、黄芩(s)和枣(z)的草药组合物。yiv-906可以指代例如包含在标准操作程序下制备的比例为3:2:2:2的s、g、p和z的特定组合物，在一些实施方式中，包括s、p、g和z的热水提取物。
38.如本文所用，术语“预防(prevent、prevention或preventing)”指代部分或完全预防、延迟或减缓疾病、障碍和/或状况，例如癌症的一种或多种症状或特征的发作的任何方法。预防导致疾病状态的临床症状在可能暴露于疾病状态或易患疾病状态但尚未经历或显示疾病状态的症状的对象中不发展，即抑制疾病发作。可以向未表现疾病、障碍和/或状况的体征的对象给予预防。在一些实施方式中，减缓疾病或障碍的一种或多种症状或特征的发作意为，如果发生疾病或障碍的复发或疾病或障碍的一种或多种症状的复发，则疾病或障碍的复发或疾病或障碍的一种或多种症状的复发比在不给予yiv-906或yiv-906gu的情况下将复发疾病或障碍或疾病或障碍的一种或多种症状慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
39.如本文所用，考虑给予的术语“对象”、“患者”或“个体”包括但不限于人(即，任何年龄组的男性或女性，例如儿科对象(例如，婴儿、儿童、青少年)或成年对象(例如，年轻成人、中年成人或年老成人))和/或其它灵长类动物(例如，食蟹猴(cynomolgus monkeys)、恒河猴)；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑和/或火鸡。
40.如本文所用，术语“治疗有效量”是本公开的化合物的量，当被给予患者时，治疗、最小化和/或改善疾病或障碍的症状。构成“治疗有效量”的本公开的化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重性、待治疗患者的年龄等而变化。治疗有效量可以由本领域普通技术人员在考虑其自身知识和本公开内容后常规确定。
41.如本文所用，术语“治疗(treatment)或处理(treating)”被定义为向对象应用或给予治疗剂，即在本公开中有用的化合物(单独或与另一种药剂组合)或将治疗剂应用或给予来自患有癌症、癌症症状或可能发展为癌症的对象的分离组织或细胞系(例如，用于诊断或离体应用)，目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响癌症、癌症的症状或发展癌症的潜力。基于从药物基因组学领域获得的知识，可以专门定制或修改此类治疗。
42.范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以范围格式呈现。应理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，对范围如1到6的描述应被视为已具体公开子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体和部分数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
43.另外，在此文件中，以范围格式表示的值应以灵活的方式被解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，还包括涵盖在此范围内的所有个体数值或子范围，如同每个数值和子范围均被明确地引用。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应被解释为不仅包括约0.1％至约5％，还包括个体值(例如，1％、2％、3％和4％)和指定范围内的子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另有说明，陈述“约x至y”与“约x至约y”具有相同的含义。同样，除非另有说明，陈述“约x、y或约z”与“约x、约y、或约z”具有相同的含义。
44.在此文件中，除非上下文另有明确说明，术语“一(a)”、“一个/种(an)”或“该/所述”用于包括一个或多于一个。除非另有说明，术语“或”用于指代非排他性的“或”。陈述“a和b中的至少一个”或“a或b中的至少一个”与“a、b或a和b”具有相同的含义。另外，应理解，
本文采用的措辞或术语，并且没有另外定义，仅用于描述的目的而不是限制的目的。任何章节标题的使用旨在帮助阅读文件，而不应被解释为限制；与章节标题相关的信息可能出现在该特定章节之内或之外。本文件中提及的所有出版物、专利和专利文件通过引用其整体并入本文，如同单独地通过引用并入。
45.在本文描述的方法中，可以以任何顺序执行动作，除非明确地列举时间或操作顺序。此外，特定的动作可以同时进行，除非明确要求保护的语言指出其是分开进行的。例如，要求保护的做x的动作和要求保护的做y的动作可以在单个操作中同时进行，并且所产生的过程将落入要求保护的过程的文字范围内。
46.本文使用以下缩写：
47.bmdm＝骨髓衍生的单核细胞；
48.gu＝β-葡糖醛酸糖苷酶；
49.ifnγ＝干扰素-γ；
50.il4＝白细胞介素4；
51.mdsc＝骨髓衍生的抑制细胞；
52.sting＝干扰素基因的刺激剂；和
53.yiv-906gu＝β-葡糖醛酸糖苷酶处理的yiv-906或不含葡糖苷酸(一种或多种)的yiv-906。
54.一方面，本公开涉及这样的意外发现，即包含草药提取物yiv-906或葡糖苷酸缀合的yiv-906或yiv-906gu(β-葡糖醛酸糖苷酶处理的yiv-906或不含葡糖苷酸的yiv-906)的组合物可以预防癌症复发。在某些实施方式中，草药提取物或其分离的级分或其中存在的活性化学物质可以与免疫检查点抑制剂或用于治疗癌症的任何其它治疗剂(一种或多种)组合被共同给予患有癌症的哺乳动物以防止癌症复发。
55.目前针对癌症的多种免疫疗法均试图将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，使得复活的免疫细胞可以攻击肿瘤细胞。免疫检查点抗体(抑制剂)，如抗pd1、抗pdl1、抗ctla4已经为多种肿瘤类型的治疗带来突破。然而，诸如hcc(肝细胞癌)、胰腺癌和结肠癌的肿瘤类型对这些抗体具有相对低的响应率。这些补救措施中的多种被设计靶向免疫周期的特定目标(相对于多个目标)。本公开描述了yiv-906或yiv-906gu(具有全身性生物学作用的植物免疫调节剂)可通过促进适应性和先天性免疫来增强抗pd1对hepa 1-6肿瘤生长的作用。
56.关于适应性免疫，意外地发现yiv-906与抗pd1药剂组合可显著降低pd1肿瘤蛋白并抑制抗pd1诱导的pdl-1表达。进一步，yiv-906可以调节ido活性并导致hepa 1-6肿瘤的mdsc降低。
57.另外，据报道ido抑制剂增强抗pd1、抗pd-l1、抗ctla4对不同类型的动物肿瘤的作用。在临床试验中已进行了将ido抑制剂与免疫检查点抑制剂组合的多种尝试，包括艾卡哚司他(epacadostat)(ido抑制剂)和帕博利珠单抗(echo-301/kn-252)。然而，这种组合在晚期实体瘤的iii期临床试验中未显示足够的功效，并且还具有严重的不良反应。这一挫折并没有阻止临床试验利用ido抑制剂治疗癌症。例如，bms-986205仍与纳武单抗组合作为肝癌的一线或二线疗法而正在进行测试[nct03695250]。
[0058]
不受理论束缚，单个目标导向抑制剂，例如单独的ido抑制剂，可能不足以有效增强免疫检查点抗体的抗肿瘤活性。相比之下，yiv-906不仅增强了适应性免疫应答，还增强
了先天免疫应答。关于先天免疫，意外地发现yiv-906加抗pd1药剂可以吸引较多的m1巨噬细胞浸润，这可能部分是由于肿瘤中mcp1的诱导。有趣的是，当与伊立替康(cpt-11)或索拉非尼组合时，yiv-906还增加了m1巨噬细胞肿瘤浸润。
[0059]
最近，在了解巨噬细胞在免疫检查点阻断疗法中的重要作用方面已取得了进展。越来越多的证据支持肿瘤中m1巨噬细胞的存在可以增强化学疗法和靶向疗法的功效。
[0060]
m1巨噬细胞可以通过产生no(一氧化氮)直接杀死肿瘤细胞或通过活化t细胞间接杀死肿瘤细胞。另一方面，具有高pd1表达和低吞噬活性的m2巨噬细胞促进肿瘤生长，并且不利于免疫疗法。低pd1表达有利于具有高吞噬活性的m1巨噬细胞并且可以增加免疫检查点阻断治疗作用。最近的报道表明抗pd1药剂可以帮助将肺癌中的巨噬细胞极性状态从m2转变为m1表型。单独使用抗pd1药剂可以使肿瘤微环境中m1巨噬细胞的概率增加约40％。在一些实施方式中，出乎意料地是，yiv-906与抗pd1药剂组合可以进一步增强m1巨噬细胞和肿瘤微环境中的先天免疫应答。
[0061]
在各个实施方式中，yiv-906与抗pd1药剂组合甚至可以进一步降低肿瘤组织中的pd1蛋白，这为具有高肿瘤吞噬能力的m1巨噬细胞增殖提供有利条件。如本文其它部分详述，yiv-906加抗pd1组中pd1蛋白水平的降低也可以解释，在不受理论束缚的情况下，更低剂量(与单独的抗pd1相比至少约1/3)的抗pd1与yiv-906组合如何可以实现与单独更高剂量的抗pd1药剂相同的抗肿瘤活性。
[0062]
通过给予yiv-906增加m1巨噬细胞来增强先天性免疫和适应性免疫，而通过组合给予抗pd1药剂来重新活化适应性免疫可以在体内对hepa 1-6肿瘤生长具有出乎意料的强协同作用。该组合不仅根除每只小鼠中的hepa 1-6肿瘤，其还模拟肿瘤特异性疫苗样行为，如对重新植入的hepa 1-6肿瘤的选择性排斥和植入的cmt167或pan02肿瘤的生长所证明的。
[0063]
ifnγ在巨噬细胞m1极化中起重要作用。不受理论束缚，yiv-906可以增强ifnγ活性，以将信号转导响应提高至较高水平；由于单独的抗pd1可以活化肿瘤中释放ifnγ的t细胞，添加yiv-906可以进一步放大ifnγ信号并增强m1巨噬细胞极化。这些m1巨噬细胞具有高水平的inos蛋白，用于将l-精氨酸代谢为瓜氨酸和no，从而可以杀死癌细胞。
[0064]
yiv-906的另一出乎意料的性质是通过ifr4的下调对m2诱导剂il4表现出抑制活性。当用yiv-906与抗pd1的组合处理时，促进m1极性同时抑制m2状态的双重作用确保了m1巨噬细胞在肿瘤组织中的优势地位。
[0065]
在一些实施方式中，黄芩(s)可以促进m1巨噬细胞极化。在一些实施方式中，一种或多种类黄酮是s中促进m1巨噬细胞极化的药物活性化合物。在hepa 1-6肿瘤中检测到黄芩黄素、汉黄芩素和木蝴蝶素a的存在，并且这些类黄酮可以增强肿瘤中的ifnγ以使巨噬细胞极化为m1。应注意，类黄酮不是简单地穿过肠道并进入肿瘤部位。在口服给予后，yiv-906的多数类黄酮将经历被来自肠道微生物群(微生物组，microbiome)(例如大肠杆菌)的β-葡糖醛酸糖苷酶脱葡糖醛酸化(de-glucuronidation)。例如，黄芩苷(具有葡糖苷酸)将被转化成黄芩黄素(不具有葡糖苷酸)。糖苷配基类黄酮在穿过肠道时被不同的udp-葡糖醛酸转移酶(ugt)同工酶葡糖醛酸化，以形成不同的葡糖醛酸化类黄酮的代谢物。肿瘤β-葡糖醛酸糖苷酶还可以将葡糖醛酸化类黄酮的代谢物转化为糖苷配基类黄酮，如汉黄芩素。ugt和β-葡糖醛酸糖苷酶的比可以影响葡糖醛酸化类黄酮的存在，并将其转化为肿瘤或其它组
织中的糖苷配基类黄酮。yiv-906加抗pd1组中的肿瘤比yiv-906组具有更多的汉黄芩素和木蝴蝶素a，但不具有黄芩黄素。
[0066]
方法
[0067]
在一个实施方式中，本公开包括预防哺乳动物中癌症复发的方法，其中方法包括向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的至少一种选自下列的草药组合物：(a)草药提取物yiv-906或其级分或存在于草药提取物或其级分中的任何活性化学物质，(b)葡糖苷酸缀合的yiv-906或其级分、或存在于葡糖苷酸缀合的yiv-906或其级分中的任何活性化学物质，(c)yiv-906gu(β-葡糖醛酸糖苷酶处理的yiv-906或不具有葡糖苷酸的yiv-906)或其级分、或存在于yiv-906gu或其级分中的任何活性化学物质。在某些实施方式中，草药提取物yiv-906包含黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物。在某些实施方式中，进一步向哺乳动物给予至少一种免疫治疗剂。
[0068]
在另一实施方式中，本公开包括减缓哺乳动物中癌症复发的方法，其中方法包括向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的至少一种本文所述的草药组合物，以及在某些实施方式中，至少一种免疫治疗剂。
[0069]
在某些实施方式中，癌症包括实体瘤。在某些实施方式中，癌症是选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝癌、结肠癌、膀胱尿路上皮癌和胰腺癌中的至少一种。
[0070]
在某些实施方式中，所述至少一种免疫治疗剂是选自抗pd1、抗pd-l1和抗ctla4的免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，所述至少一种免疫检查点抑制剂选自伊匹木单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗(durvalumab)和阿特珠单抗。
[0071]
在某些实施方式中，所述至少一种免疫治疗剂是选自siglec 15抗体、抗磷脂酰丝氨酸、抗ox40、抗cd73、抗tim3、抗cd24、抗cd47、抗pd1、抗pdl1、抗ctla4、抗gitr、抗cd27、抗cd28、抗cd122、抗tigit、抗vista、抗icos和抗lag3的抗体。
[0072]
在某些实施方式中，给予草药组合物增强了至少一种免疫治疗剂的响应。
[0073]
在某些实施方式中，将草药组合物口服给予哺乳动物。在某些实施方式中，草药组合物以选自丸剂、片剂、胶囊、汤、茶、浓缩物、糖衣丸(dragees)、液体、滴剂和囊形片(gelcaps)的形式给予哺乳动物。
[0074]
在某些实施方式中，草药组合物的治疗有效量是约20mg/天至约2000mg/天。在某些实施方式中，草药组合物(yiv-906或yiv-906gu)的治疗有效量是约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、或约2000mg/天。
[0075]
在一个具体实施方式中，草药组合物的治疗有效量是例如约1600mg/天。
[0076]
在某些实施方式中，每天给予草药组合物2次。在某些实施方式中，给予草药组合物约1至约2周，随后暂停处理至少1周。
[0077]
在某些实施方式中，其中在给予化学疗法或放射疗法之前约30min每天给予草药组合物2次。在某些实施方式中，所述给予持续约4天。
[0078]
在某些实施方式中，在选自将一种或多种免疫治疗剂给予哺乳动物之前、同时和之后的时间给予草药组合物。
[0079]
在某些实施方式中，给予组合物增强了ifnγ在将巨噬细胞极化为m1(或肿瘤排
斥)表型的作用。在某些实施方式中，给予组合物抑制il4在将巨噬细胞极化为m2(或肿瘤促进)表型中的作用。在某些实施方式中，给予组合物促进sting激动剂作用。在某些实施方式中，给予组合物降低或抑制cd73活性。在某些实施方式中，给予组合物对吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)活性具有抑制作用。
[0080]
在某些实施方式中，哺乳动物是人。
[0081]
给药/剂量/制剂
[0082]
给药方案可能影响有效量的构成。治疗制剂可以在本公开所考虑的疾病或障碍发作之前或之后被给予对象。进一步，可以每天或依次给予若干分开的剂量以及交错的剂量，或者该剂量可以被连续输注，或者可以是推注(bolus injection，弹丸注射)。进一步，治疗制剂的剂量可以根据治疗或预防情况的紧急性按比例增加或减少。
[0083]
可以利用已知的程序，以有效治疗本公开中考虑的疾病或障碍的剂量和时间段，将本公开的组合物给予患者，优选哺乳动物，更优选人。实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据诸如患者的疾病或障碍的状态；患者的年龄、性别和体重；以及治疗化合物治疗本公开所考虑的疾病或障碍的能力的因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可以每天给予若干分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急性按比例减少剂量。本公开的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约1至1,000mg/kg体重/天。可以给予可用于实践本公开的药物组合物以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并确定治疗化合物的有效量而无需过度实验。
[0084]
具体地，选择的剂量水平取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、给药时间、化合物的排泄率、治疗的持续时间、其它药物、化合物或与化合物组合使用的材料、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和接受治疗的患者的既往病史、以及医学领域中公知的类似因素。
[0085]
具有本领域普通技术的医生，例如医师或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中采用的本公开化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至实现期望的效果。
[0086]
在具体实施方式中，将化合物配制成剂量单位形式是有利的，以便于给药和剂量的均匀性。本文所用的剂量单位形式指代适合作为待治疗患者的统一剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的治疗化合物，经计算产生与所需药物载体相关的期望治疗效果。本公开的剂量单位形式由以下决定并直接取决于以下：(a)治疗化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，和(b)配混/配制此类治疗化合物用于治疗本公开中考虑的疾病或障碍的领域中固有的限制。
[0087]
在某些实施方式中，利用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体配制本公开的组合物。在其它实施方式中，本公开的药物组合物包含治疗有效量的本公开的化合物和药学上可接受的载体。在又一实施方式中，本公开的化合物是组合物中唯一的生物活性剂(即，能够治疗癌症)。在又一实施方式中，本公开的化合物是组合物中治疗有效量的唯一生物活性剂(即，能够治疗癌症)。
[0088]
载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，可以例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各
种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在多种情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠，或多元醇，例如甘露醇和山梨糖醇。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
[0089]
在某些实施方式中，以每天1至5次或更多次范围的剂量向患者给予本公开的组合物。在其它实施方式中，以包括但不限于每天一次、每两天一次、每三天一次至每周一次和每两周一次的剂量范围向患者给予本公开的组合物。本领域技术人员显而易见的是，本公开的各种组合性组合物的给予频率因个体而异，这取决于多种因素，包括但不限于年龄、待治疗的疾病或障碍、性别、整体健康状况和其它因素。因此，本公开不应被解释为限于任何特定的剂量方案，并且要给予任何患者的精确剂量和组合物由主治医师考虑到关于患者的所有其它因素确定。
[0090]
用于给予的本公开的化合物和/或组合物可以在约1mg至约10,000mg、约20mg至约9,500mg、约40mg至约9,000mg、约75mg至约8,500mg、约150mg至约7,500mg、约200mg至约7,000mg、约400mg至约6,000mg、约500mg至约5,000mg、约750mg至约4,000mg、约1,000mg至约3,000mg、约1,000mg至约2,500mg、约20mg至约2,000mg的范围内，以及其间的任何和所有全部或部分增量。在某些实施方式中，本公开的化合物和/或组合物的剂量为约800mg。
[0091]
在某些实施方式中，本公开涉及包装的药物组合物，其包括：容器，该容器容纳单独或与第二药剂组合的治疗有效量的本公开的化合物；以及使用该化合物治疗、预防或减轻本公开中考虑的疾病或障碍的一种或多种症状的说明书。
[0092]
制剂可以与常规赋形剂混合使用，即本领域已知的适用于口服、肠胃外、鼻、静脉内、皮下、肠内或任何其它合适的给药模式的药学上可接受的有机或无机载体物质。药物制剂可以被灭菌，并且如果期望，可以与助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、调味剂和/或芳香物质等混合。其也可以在期望时与其它活性剂组合。
[0093]
本公开的任何组合物的给予途径包括经口鼻、直肠、阴道内、肠胃外、颊、舌下或局部。用于本公开的化合物可以被配制成通过任何合适的途径给予，例如口或肠胃外，例如经皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、(内)鼻和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、腹膜内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部给予。
[0094]
合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊片、丸剂、囊形片、糖锭、分散液、悬浮液、溶液、糖浆、细粒、珠粒、透皮贴剂(transdermal patches)、凝胶、粉末、颗粒、乳浆剂、锭剂、乳膏、糊剂、膏剂(plasters)、洗剂、圆片、栓剂、用于鼻或口服给药的液体喷雾剂、用于吸入的干粉剂或雾化制剂、用于膀胱内给药的组合物和制剂等。应理解，将在本公开中可用的制剂和组合物不限于本文所述的特定制剂和组合物。
[0095]
口服给药
[0096]
对于口服应用，特别合适的是汤、茶、浓缩物、片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂或胶囊、囊片和囊形片。旨在用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的任何方法制备，并且此类组合物可以含有选自适合制造片剂的惰性、无毒药用赋形剂的一种或多种药剂。此类赋形剂包括例如惰性稀释剂，例如乳糖；造粒和崩解剂，例如玉米淀粉；粘合剂，例如淀粉；
和润滑剂，例如硬脂酸镁。片剂可以是未包衣的，或者其可以通过已知的技术进行包衣，以优雅(elegance)或延迟活性成分的释放。口服使用的制剂也可以硬明胶胶囊的形式提供，其中活性成分与惰性稀释剂混合。
[0097]
对于口服给药，本公开的化合物可以是通过常规手段与药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，玉米淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)制备的片剂或胶囊的形式。如果期望，片剂可以利用合适的方法和包衣材料，例如可得自colorcon,west point,pa.的opadry
tm
膜包衣系统(例如，opadry
tm oy型、oyc型、有机肠溶oy-p型、水性肠溶oy-a型、oy-pm型和opadry
tm white、32k18400)进行包衣。用于口服给药的液体制剂可以是溶液、糖浆或悬浮液的形式。液体制剂可以通过常规手段与药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油性酯或乙醇)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)一起制备。
[0098]
造粒技术在药物领域中是公知的，用于改进活性成分的起始粉末或其它颗粒材料。粉末通常与粘合剂材料混合成较大的永久自由流动的附聚物或颗粒，称为“造粒”。例如，使用溶剂的“湿法”造粒工艺的一般特征在于将粉末与粘合剂材料混合，并在一定条件下用水或有机溶剂润湿，导致形成湿的颗粒状物质，然后必须从其蒸发溶剂。
[0099]
熔融造粒总体上包括在基本上不添加水或其它液体溶剂的情况下，使用在室温下为固体或半固体的材料(即，具有相对低的软化或熔点范围)以促进粉末状材料或其它材料的造粒。当加热到熔点范围内的温度时，低熔点固体液化以充当粘合剂或造粒介质。液化的固体在与其接触的粉末状材料的表面上扩散，并在冷却时形成固体颗粒状物质，其中初始材料结合在一起。然后可以将所得的熔融造粒提供给压片机或封装以制备口服剂型。熔融造粒通过形成固体分散体或固溶体(solid solution)来提高活性物质(即药物)的溶出速率和生物利用度。
[0100]
美国专利号5,169,645公开了具有改进的流动性质的可直接压缩的含蜡颗粒。当蜡与某些流动改进添加剂混合在熔体中，然后通过冷却和造粒混合物时，获得颗粒。在某些实施方式中，只有蜡本身在蜡(一种或多种)和添加剂(一种或多种)的熔体组合中熔融，而在其它情况下，蜡(一种或多种)和添加剂(一种或多种)均熔融。
[0101]
本公开还包括多层片剂，其包含提供用于延迟释放本公开的一种或多种化合物的层，以及提供用于立即释放用于治疗本公开中考虑的疾病或障碍的药物的另一层。利用蜡/ph敏感性聚合物混合物，可以获得胃不溶性组合物，其中活性成分被包埋，确保其延迟释放。
[0102]
肠胃外给药
[0103]
如本文所用，药物组合物的“肠胃外给药”包括任何给药途径，其特征在于对象组织的物理破裂和通过组织中的破裂(突破口，breach)给予药物组合物。因此，肠胃外给药包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口应用组合物、通过组织穿透性非手术伤口应用组合物等给予药物组合物。具体地，考虑肠胃外给药包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
[0104]
适用于肠胃外给药的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类制剂可以以适合于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以单位剂型制备、包装或销售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外给药的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳液、糊剂和可植入的缓释或生物降解制剂。此类制剂可以进一步包含一种或多种另外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给药的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外给予重构的组合物之前用合适的载体(例如，无菌无热原水)重构。
[0105]
药物组合物可以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。这种悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外还可以包含另外的成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。此类无菌可注射制剂可以利用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂如例如水或1,3-丁二醇制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油，例如合成甘油单酯或甘油二酯。其它可用的肠胃外给予制剂包括包含微晶形式、脂质体制剂或作为生物可降解聚合物系统组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
[0106]
控制释放制剂和药物递送系统
[0107]
在某些实施方式中，本公开的制剂可以是但不限于短期、快速偏移(rapid-offset)以及受控的例如缓释、延迟释放和脉冲释放制剂。
[0108]
术语缓释以其传统意义使用，以指代在延长的时间段内提供药物的逐渐释放的药物制剂，并且可以(尽管不一定)导致在延长的时间段内药物的血液水平基本上恒定。时间段可以长达一个月或更长，并且应该是比以推注形式给予的相同量的药剂更长的释放。
[0109]
对于缓释，化合物可以与为化合物提供缓释性质的合适的聚合物或疏水材料一起配制。因此，可用于本公开的方法的化合物可以微粒的形式给予，例如通过注射，或以晶片或圆片的形式通过植入给予。
[0110]
在本公开的一个实施方式中，本公开的化合物利用缓释制剂单独或与另一药剂组合给予患者。
[0111]
术语延迟释放在本文中以其传统意义使用，以指代在给药后的一些延迟之后提供药物的初始释放的药物制剂，并且可以(尽管不一定)包括约10min上至约12h的延迟。
[0112]
术语脉冲释放在本文中以其传统意义使用，以指代以在给药后产生药物的脉冲血浆分布的方式提供药物释放的药物制剂。
[0113]
术语立即释放以其传统意义使用以指代在给药后立即提供释放药物的药物制剂。
[0114]
如本文所用，短期指代给药后上至并包括约8h、约7h、约6h、约5h、约4h、约3h、约2h、约1h、约40min、约20min、约10min、或约1min的任何时间段及其任何或所有或部分增量。
[0115]
如本文所用，快速偏移指代给药后上至并包括约8h、约7h、约6h、约5h、约4h、约3h、约2h、约1h、约40min、约20min、约10min、或约1min的任何时间段及其任何和所有全部或部分增量。
[0116]
剂量
[0117]
本公开的化合物的治疗有效量或剂量取决于患者的年龄和体重、患者的当前医学
状况以及本公开中考虑的疾病或障碍的进展。熟练的技术人员能够根据这些和其它因素确定合适的剂量。
[0118]
本公开的化合物、组合物或提取物的合适剂量可以在每天约0.01mg至约5,000mg的范围内，例如每天约0.1mg至约1,000mg，例如约1mg至约500mg，如约5mg至约250mg。该剂量可以单个剂量或多个剂量给予，例如每天1至5次或更多次。当使用多个剂量时，每个剂量的量可以相同或不同。例如，每天1mg的剂量可以作为两个0.5mg剂量给予，剂量之间间隔约12h。
[0119]
在各种实施方式中，给予的yiv-906或yiv-906gu草药提取物的量或剂量可以为约0.5mg/kg至约5000mg/kg、约1mg/kg至约2500mg/kg、约5mg/kg至约1000mg/kg、或约10mg/kg至约1000mg/kg。在各种实施方式中，给予的yiv-906或yiv-906gu草药提取物的量或剂量可以为约0.01、0.5、1、2、3、4、5,6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1020、1040、1060、1080、1100、1120、1140、1160、1180、1200、1220、1240、1260、1280、1300、1320、1340、1360、1380、1400、1420、1440、1460、1480、1500、1520、1540、1560、1580、1600、1620、1640、1660、1680、1700、1720、1740、1760、1780、1800、1820、1840、1860、1880、1900、1920、1940、1960、1980、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或约5000mg/kg。yiv-906或yiv-906gu草药提取物的这些量可以利用本文所述的剂量方案中的任一种给予。
[0120]
在各种实施方式中，本文所述的任何免疫检查点抑制剂或免疫治疗剂的量或剂量可以为约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.05mg/kg至约30mg/kg、或约1mg/kg至约20mg/kg。在各种实施方式中，本文所述的任何免疫检查点抑制剂或免疫治疗剂的量或剂量可以为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.2、11.4、11.6、11.8、12、12.2、12.4、12.6、12.8、13、13.2、13.4、13.6、13.8、14、14.2、14.4、14.6、14.8、15、15.2、15.4、15.6、15.8、16、16.2、16.4、16.6、16.8、17、17.2、17.4、17.6、17.8、18、18.2、18.4、18.6、18.8、19、19.2、19.4、19.6、19.8、或约20mg/kg。在一些实施方式中，本文所述的任何免疫检查点抑制剂或免疫治疗剂的最大给予每日量或剂量可以为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1020、1040、1060、1080、1100、1120、1140、1160、1180、1200、1220、1240、1260、1280、1300、1320、1340、1360、1380、1400、1420、1440、1460、1480、1500、1520、1540、1560、1580、1600、1620、1640、1660、1680、1700、1720、1740、1760、1780、1800、1820、1840、1860、1880、1900、1920、1940、1960、1980、或约2000mg。
[0121]
在一些实施方式中，yiv-906和单个免疫治疗剂是药物组合物中唯一的治疗活性剂。在各种实施方式中，yiv-906gu和单个免疫治疗剂是药物组合物中唯一的治疗活性剂。在一些实施方式中，yiv-906或yiv-906gu和抗pd1免疫抑制剂是给予对象的药物组合物中
唯一的治疗活性剂。在一些实施方式中，yiv-906或yiv-906gu和抗pd-l1检查点抑制剂是给予对象的药物组合物中唯一的治疗活性剂。在一些实施方式中，yiv-906或yiv-906gu和抗ctla4检查点抑制剂是给予对象的药物组合物中唯一的治疗活性剂。yiv-906或yiv-906gu可以与本文所述的免疫治疗剂中的任一种同时或依次给予。在一些实施方式中，与单独给予抗pd1、抗pdl1、和/或抗ctla4药剂相比，当与yiv-906或yiv-906gu一起给予时，需要更少量的抗pd1、抗pdl1、和/或抗ctla4药剂以产生治疗效果。当与yiv-906或yiv-906gu一起给予时，抗pd1、抗pdl1、和/或抗ctla4药剂的更少量可以是与单独给予抗pd1、抗pdl1、和/或抗ctla4药剂相比小约1、2、3、4,5 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、33、35、40、45、50、55、60、65、或约70％的剂量。
[0122]
应理解，在非限制性实例中，每天给药的化合物的量可以每天、每隔1天、每2天、每3天、每4天或每5天给予。例如，在每隔1天给药的情况下，可以在星期一开始5mg/天的剂量，然后在星期三给予第一个后续5mg/天的剂量，在星期五给予第二个后续5mg/天的剂量，依此类推。
[0123]
在患者的状态确实改善的情况下，根据医生的判断，任选地连续给予本公开的抑制剂；可选地，正在给予的药物的剂量被暂时减少或暂时暂停某一段时间(即“药物假期”)。药物假期的长度任选地在2天至1年之间变化，包括仅作为实例，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天、或365天。药物假期期间的剂量减少包括10％-100％，包括仅作为实例，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％。
[0124]
在患者的状况改善后，在必要时给予维持剂量。随后，给药的剂量或频率或两者均作为疾病或障碍的函数降低至保持改善疾病的水平。在某些实施方式中，患者在症状和/或感染的任何复发时需要长期的间歇性治疗。
[0125]
用于本公开的方法的化合物可以被配制成单位剂型。术语“单位剂型”指代适合作为接受治疗的患者的统一剂量的物理离散单位，其中每个单位含有经计算以产生期望治疗效果的预定量的活性材料，任选地与合适的药物载体结合。单位剂型可以是单个日剂量或多个日剂量中的一个(例如，每天约1至5次或更多次)。当使用多个日剂量时，每个剂量的单位剂型可以相同或不同。
[0126]
这种治疗方案的毒性和治疗功效任选地在实验动物中确定，包括但不限于确定ld
50
(对50％的人群致死的剂量)和ed
50
(在50％的人群中治疗有效的剂量)。毒性与治疗作用的剂量比为治疗指数，以ld
50
与ed
50
之比表示。从动物研究中获得的数据任选地用于制定用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选地位于包括具有最小毒性的ed
50
的循环浓度范围内。根据所采用的剂型和所利用的给药途径，剂量任选地在此范围内变化。
[0127]
除非另有说明，本公开的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在技术人员的能力范围内。这些技术在文献中被充分解释，例如“molecular cloning:a laboratory manual”，第2版(sambrook,1989)；“oligonucleotide synthesis”(gait,1984)；“animal cell culture”(freshney,1987)；“methods in enzymology”“handbook of experimental immunology”(weir,1996)；“gene transfer vectors for mammalian cells”(miller and calos,1987)；“current protocols in molecular biology”(ausubel,1987)；“pcr:the polymerase chain reaction”,(mullis,1994)；“current protocols in immunology”(coligan,1991)。这些技术适用于本公开的多核苷酸和多肽的生产，并且因此可以在制定和实践本公开时被考虑。用于特定实施方式的特别有用的技术将在以下部分中被讨论。
[0128]
本领域技术人员将认识到或能够仅利用常规实验确定本文描述的具体程序、实施方式、权利要求和实施例的许多等效物。这些等效物被认为在本公开的范围内并且由所附权利要求覆盖。例如，应理解，以本领域公认的替代方案并且仅利用常规实验改变反应条件，包括但不限于反应时间、反应大小/体积和实验试剂均在本技术的范围内。
[0129]
应理解，无论在本文何处提供值和范围，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活限制。因此，这些值和范围所涵盖的所有值和范围都意为包括在本公开的范围内。此外，本技术还考虑落入这些范围内的所有值，以及值的范围的上限或下限。范围的描述应被视为已具体公开了所有可能的子范围以及此范围内的个体数值，并且在适当时，范围内的数值的部分整数。例如，对范围如1至6的描述应被视为已具体公开了子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及此范围内的个体数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
[0130]
实施例
[0131]
参考以下实验实施例进一步详细描述本公开。除非另有说明，提供这些实施例仅用于示例目的，而不旨在限制。因此，本公开决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
[0132]
在没有进一步描述的情况下，相信本领域普通技术人员可以利用先前描述和以下示例性实施例制造和利用本公开的化合物并实践要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本公开的优选实施方式，而不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
[0133]
材料和方法
[0134]
动物研究
[0135]
将hepa 1-6细胞(100μl磷酸盐缓冲盐水中的约2
×
106个细胞)皮下移植到4至6周龄雌性c57bl6小鼠(charles river laboratories,wilmington,ma)中。每天监视小鼠的体重、肿瘤大小和死亡率。在10-14天后，选择肿瘤大小为180mm3的小鼠。通过使用式长
×
宽2×
π/6检查肿瘤体积。每组由7只小鼠组成。yiv-906被口服给予4天(500mg/kg po，每天2次)，而抗pd1被腹膜内给予7天(200μg/小鼠，每天1次)。在对照组中，小鼠被口服给予水。在第0天，在抗pd1给予前30min给予yiv-906。
[0136]
在各种实施方式中，本文所述的实验和附图中使用的抗pd1药剂是小鼠抗pd1单克隆抗体、克隆g4、仓鼠igg。
[0137]
免疫组织化学
[0138]
在处理4天后，在药物处理开始后2天或4天通过颈椎脱位处死小鼠。去除肠和结肠组织，福尔马林固定，石蜡包埋，并切成10μm切片。将切片安装在superfrost载玻片上，用二甲苯脱蜡并逐渐水合。通过10mm柠檬酸钠ph 6.0和0.02％tween-20在汽蒸30min下实现抗原修复。使用含有1％bsa和0.5％tween-20的tris-hcl缓冲液稀释一抗，并在室温下培育1h。作为阴性对照，在没有一抗的情况下处理一组载玻片。使用super-picture免疫组织化学检测试剂盒(invitrogen,inc.)进行检测。将载玻片用苏木精复染并固定。使用的抗体
是：切割的胱天蛋白酶-3(#9664,cell signaling technology,inc.)、切割的胱天蛋白酶-8(#9496,cell signaling technology,inc.danvers,ma)、切割的胱天蛋白酶-9(#ab52298,abcam,cambridge,england)、f4/80(#ab16911,abcam)。
[0139]
流式细胞仪分析
[0140]
在0.5ml rpm1 640培养基中将肿瘤组织(200mg)切成小块。添加liberase以在室温下解离连接的肿瘤细胞15min。解离的细胞穿过细胞过滤器(70μm)。在将细胞以1000g离心10min后，在冰上用1ml bd pharm lyse裂解红细胞。以1000g离心10min收集细胞。每个染色样品使用2
×
106个细胞。将细胞重新悬浮在具有3％fbs的rpm1 640中。使用抗小鼠cd16/cd32克隆2.4g2(bd pharmingen，#553142)阻断细胞上的fc受体。将总t细胞在冰上用抗cd3-pe(bd pharmingen，克隆145-2c11，#553064)染色30min。固定/透化的(ebioscience)用于固定和透化细胞。将活化的细胞毒性t细胞用抗粒酶b太平洋蓝(anti-granzyme b-pacific blue)(biolegend，克隆gb11，#515408)进一步染色，并将t调节细胞用抗fox3p-apc(ebioscience，克隆fjk16s，#17-5773-83)染色。洗涤染色的细胞并通过流式细胞仪lsr ii(bd canto ii,new jersey,usa)进行分析。
[0141]
蛋白质印迹
[0142]
bmdm或raw264.7细胞(american type culture collection)在5％co2的37℃培养箱中于补充有5％fbs的rpmi中培养。将2
×
106个细胞接种在12孔板中。在药物处理后，对于每孔，细胞在0.3ml蛋白质加载缓冲液(对于20ml缓冲液，4ml 10％sds、0.75ml tris-hcl(ph 6.8)、5ml 10％甘油、0.5mlβ-巯基乙醇和溴酚蓝)中裂解，并超声处理30s以破坏dna。细胞提取物通过minitgxtm precast凝胶(12％，15孔齿梳(comb)，15μl/孔目录号#456-1046)在运行缓冲液(10
×
、tris 30g、甘氨酸144g、sds 10g、双重蒸馏的h2o)中电泳，并在转移缓冲液(tris 30g、甘氨酸144g、sds 0.5g)中转移到硝酸纤维素膜(bio-rad laboratories,inc)。将膜封闭并在含有1:5000脱脂牛奶(印迹级封闭剂(blotting-grade blocker)，目录号#170-0604脱脂奶粉)的tbs-t缓冲液(tbst+1％tween，ab14330-01000，american bionanlytical)中进行探测。
[0143]
一抗(pd-1(d7d5w)兔mab#84651s小鼠特异性组(lot)：1ref:08/2017)以1:1000在tbs-t缓冲液(tbst+1％吐温(tween),ab14330-01000,american bionanalytical)中与膜在4℃下振荡培育过夜。组蛋白h3用作用于标准化的内部对照，并使用以1:1000稀释的单克隆肌动蛋白抗体(h3(d1h2)兔mab#4499s ref:06/2017)进行检测。在用tbs-t洗涤3次，每次5min后，然后将膜与山羊抗兔igg-hrp sc-2004,lot#b1711 hrp缀合1:5000进一步培育，并在室温下培育1h。然后再用tbs-t洗涤膜3次。使用稳定的过氧化物溶液1ml(supersignaltm west pico plus,prod#1863097)和鲁米诺/增强溶液1ml(supersignaltm west pico plus,prod#1863096)进行可视化并用光密度计扫描。抗体列表：pd-1(d7d5w)兔mab#84651s小鼠特异性lot:1ref:08/2017(cell signaling)、抗pd-l1抗体[epr20529]ab213480、精氨酸酶-1(d4e3mtm)兔mab#93668(cell signaling)、inos抗体(小鼠特异性)#2982(cell signaling)、jak1(6g4)兔mab#3344(cell signaling)、p-jak1(y1034/1035)(d7n4z)兔mab#74129(cell signaling)、jak2(d2e12)兔mab#3230(cell signaling)、p-jak2(y1008)(d4a8)兔mab#8082(cell signaling)、stat1抗体#9172
(cell signaling)、磷酸-stat 1(tyr701)(d4a7)兔mab#7649(cell signaling)、stat2(d9j7l)兔mab#72604(cell signaling)、磷酸-stat2(tyr690)-r sc-21689#k1609(santacruz)、stat6(d3h4)兔mab#5397(cell signaling)、磷酸-stat6(tyr641)(d8s9y)兔mab#56554(cell signaling)、irf-1(d5e4)兔mab#8478(cell signaling)、irf-4(d9p5h)兔mab#15106(cell signaling)。
[0144]
定量实时pcr(qrt-pcr)
[0145]
用trizol试剂(invitrogen，california，usa)提取总rna。收集水相，然后按照制造商的说明添加一体积的乙醇。在离心之前，将此浆液添加至柱(mirneasy，qiagen，venlo，limburg)中以进一步提取和同时进行dna消化(rnase-free dnase set，qiagen)。使用随机引物和逆转录酶mmlv(new england biolabs，ipswich，ma)合成cdna。使用itaq
tm
green supermix和cfx96实时pcr检测系统(bio-rad laboratories，hercules，ca)进行qpcr测定。目标基因对β-肌动蛋白的相对表达以2-δct
表示，并以yiv-906和/或抗pd1处理样品与未处理样品的表达mrna计算倍数差异。引物序列显示在表1中。
[0146]
表1：qrt-pcr中使用的引物序列：
[0147][0148]
通过细胞计数珠阵列(cytometric bead array)进行细胞因子分析
[0149]
在处理后96h收集yiv-906和/或抗pd-1处理小鼠和对照小鼠的动物血浆和肿瘤组织。在暴露24h后收集未处理和yiv-906处理bmdm的培养基。根据制造商的说明(bd biosciences,uk)通过流式细胞仪(bd canto ii,new jersey,usa)利用细胞计数珠阵列flex set试剂盒(cytometric bead array flex set kit)进行细胞因子表达(il-6、mip-1a、il-5、il-17a、il-12p70、tnfa、il-1b、il-10、mig、ifnγ、mcp-1、g-csf)的确定。
[0150]
分离骨髓衍生的单核细胞(bmdm)和巨噬细胞分化
[0151]
从10周龄c57bl/6小鼠的胫骨和股骨收集骨髓细胞，在鼠m-csf(10ng/ml)存在下用完全rpmi-1640培养基(补充有5％胎牛血清和1％penn/strep)培养7天，以允许单核细胞分化为巨噬细胞。将巨噬细胞在含有ifnγ(10ng/ml)的5％fbs rpmi-1640培养基中培养，以诱导极化为m1样巨噬细胞，而m2样巨噬细胞由il4(20ng/ml)诱导。
[0152]
ido活性测定
[0153]
用小鼠ido(2μg/10cm板)转染2
×
106个hek293细胞48h。对于1个板，使用1ml pbs将细胞收集至2ml管中。以3,500rpm将细胞离心1min。然后在冰冷的pb缓冲液(1ml，ph 6.5)中对细胞进行超声处理。通过在4℃下以12,000rpm离心5min来澄清细胞裂解物。将25μl细胞裂解溶液与yiv906或yiv906gu(25μl)以期望浓度混合。反应缓冲液含有50μl pb缓冲液(100mm,ph 6.5)、10μl亚甲基蓝(2.5％)、100μl过氧化氢酶(20mg/ml)、250μl l-色氨酸(500mm)，以及每10ml总溶液中含有70mg维生素c。然后将反应缓冲液添加至细胞裂解溶液中。使溶液在37℃下反应1.5h。添加三氯乙酸30％(25μl)并在50℃下培育1h。添加ehrlich试剂0.8％[4-(二甲基氨基)苯甲醛、乙酸中的80mg/10ml，100μl，来自sigma aldrich]。使用uv可见分光光度计测量540nm处的吸光度以确定犬尿氨酸浓度。已发现540nm(黄色)处的吸光度与样品中犬尿氨酸的量呈正相关。
[0154]
cd73活性测定
[0155]
通过cd73随时间从amp形成腺苷确定cd73核苷酸酶活性。反应在37℃下在200μl含有50mm tris-hcl(ph 7)、100mm nacl、1mm mgcl2、1mm cacl2、100μg/ml bsa、10mm amp和200ng人重组cd73的缓冲液中进行3h。将反应用15％三氯乙酸萃取。用45/55比的三辛胺和1,1,2-三氯三氟乙烷萃取含有核苷及其磷酸化形式的上清液。使用partisil sax柱(whatman,clifton,nj)和10mm磷酸盐缓冲液作为流动相通过高压液相色谱法(shimadzu,braintree,ma)分析腺苷。
[0156]
lc-ms检测
[0157]
每个肿瘤样品在200μl乙腈/甲醇/水(2/2/1,v/v/v)和1mm玻璃珠(biospec products,bartlesville,ok)中以3500rpm均质化30s两次。然后将匀浆在4℃下以12000rpm离心15min。将上清液在speedvac中干燥。将每个肿瘤样品的残留物重新溶解在100μl乙腈中，并以3000rpm涡旋3min。然后将溶液在4℃下以12000rpm离心15min，并将2μl上清液注入uplc-qtof系统中进行分析。所有样品分析均在联接具有电喷雾电离(esi)源的四极杆飞行时间(q-tof)ms器械(uplc xevo g2-xs qtof ms,waters corp.,milford,ma,usa)的acquity超高效液相色谱(uplc)系统上进行。在带有保护柱的waters acquity beh c18柱(2.1mm
×
100mm id,1.7μm)(waters acquity beh c18柱(2.1mm
×
5mm id,1.7μm))上进行分离。
[0158]
流动相由乙腈(a)和含有0.1％甲酸的水(b)组成，利用0
–
2min 5％a、2
–
3min 5
–
10％a、3
–
10min 10
–
17％a、10
–
15min 17
–
30％a、15
–
20min 30
–
40％a、20
–
25min 40
–
80％a、25
–
30min 80％a、30
–
31min 80
–
5％a和31
–
35min 5％a的洗脱梯度。流速为0.3ml/min。在water xevo g2-xs qtof上进行质谱分析。扫描范围为50至1000da。对于负电喷雾模式，毛细管电压和锥体电压分别设置为2.5kv和60v。在500℃的温度下将去溶剂化气体(desolvation gas)设置为800l/h。在120℃的温度下将锥体气体(cone gas)设置为50l/h。利用mse实现数据采集，碰撞能量为15-60v。
[0159]
统计分析
[0160]
通过单向或双向方差分析(anova)(graphpad prism 7)、相关分析(graphpad prism7)和学生t检验(microsoft office excel)分析数据。p《0.05时差异有统计学显著性。
[0161]
实施例1：yiv-906增强(dnhanced)抗pd1在体内抑制hepa1-6肿瘤生长的作用并证
明肿瘤特异性疫苗样作用。
[0162]
为了研究yiv-906和抗pd1对ncr裸鼠中的hepa 1-6肿瘤生长的影响，将hepa 1-6细胞(106个细胞)皮下植入到ncr裸鼠中10天。当初始肿瘤大小达到约180mm3时，从第0天至第7天，在有或无抗pd1(200μg/小鼠i.p.qd)的情况下每天2次向携带hepa1-6肿瘤的小鼠给予yiv-906(500mg/kg,p.o.)。hepa1-6肿瘤生长不受yiv-906处理的影响(p》0.05)(图1a和1b)。在处理4天后，抗pd1开始减慢hepa 1-6的肿瘤生长(图1a和1b)。在第8天观察到一些肿瘤缩小，并且到实验结束时，约40％肿瘤在检测限以下(图1a和1b)。
[0163]
在yiv-906加抗pd1免疫检查点抑制组中观察到最强的抗肿瘤活性。肿瘤在短至2天内对yiv-906和抗pd1的组合响应，所有肿瘤在处理7天后消失(p《0.001)(图1a和1b)。在没有进一步处理上至21天后，yiv-906加抗pd1组合组中没有再次出现肿瘤。这表明在这些小鼠中肿瘤已被阻止形成并被治愈(图1a和1b)。当将hepa 1-6细胞重新植入治愈小鼠体内时，未发现肿瘤生长，而幼稚小鼠则有肿瘤生长(数据未显示)。当用hepa1-6、cmt167或pan02重新攻击(re-challenged)后将cmt167细胞(小细胞肺癌)或pan02细胞植入治愈小鼠体内时，观察到肿瘤生长。这种行为表明，在一些实施方式中，yiv-906与抗pd1检查点抑制剂或与其它免疫检查点抑制剂疗法组合可以产生肿瘤特异性疫苗样作用以防止肿瘤复发。在各种实施方式中，yiv 906和抗pd1的组合治疗不影响小鼠的体重。
[0164]
实施例2：yiv-906/抗pd1处理在hepa 1-6肿瘤中诱导更多的巨噬细胞浸润，具有更高的m1样巨噬细胞特征。
[0165]
免疫组织化学研究显示yiv-906和抗pd1检查点抑制剂的组合，而不是单独的yiv906或单独的抗pd1，在处理4天后显著诱导hepa 1-6肿瘤中的巨噬细胞浸润(图2a和2b)。不受理论束缚，这可归因于在yiv-906加抗pd1处理组的肿瘤中，单核细胞趋化蛋白mcp1(ccl2)的增加，其中mcp1高于仅抗pd1组(p《0.05)(图2c)。
[0166]
根据组织微环境和表现刺激的活化途径，巨噬细胞可以被分为两种不同的表型：m1(肿瘤排斥)和m2(肿瘤促进)。在yiv-906加抗pd1处理后，对m1和m2样巨噬细胞特征基因的mrna表达的生物统计分析表明m1样巨噬细胞是肿瘤中的主要表型(图2e和2f)。蛋白质印迹分析进一步证实在yiv-906加抗pd1处理后inos蛋白(m1标记物)显著增加(图2d)。此结果还表明yiv-906加抗pd1处理的肿瘤高度发炎。因此，不受理论束缚，yiv-906与抗pd1组合诱导的m1样巨噬细胞的浸润增强可能是辅助抵抗hepa1-6肿瘤生长的机制。
[0167]
实施例3：yiv-906增强ifnγ在将巨噬细胞极化为m1表型中的作用，同时抑制il4在将巨噬细胞极化为m2型中的作用。
[0168]
研究了yiv-906对于在培养物中将bmdm极化为m1样或m2样表型的任何影响。β-葡糖醛酸糖苷酶(gu)处理可催化β-d-葡糖醛酸残基从yiv-906的某些组分中水解，并对yiv-906的巨噬细胞极化活性具有影响。结果表明，yiv-906gu对bmdm的ifnγ、il1a、tfnαmrna表达的诱导作用比单独的yiv-906更强(图3)。此外，yiv-906可以增强ifn-γ以将bmdm极化为m1巨噬细胞，其中inos、mcp-1、cxcl9、cxcl11、coxii、il1a、tnf-α和cd86的表达信号增加(图3)。gu处理进一步增强了yiv-906对inos、il1a、cxcl11的增强活性(图3)。
[0169]
相反，yiv906可以通过降低arg1、cd206和irf4的mrna表达水平所呈现的抑制il4对m2巨噬细胞极化的作用。gu处理可在il4存在下进一步增加yiv-906对arg、il10和irf4 mrna表达的抑制活性(图3)。总体而言，yiv906可以增强ifnγ以诱导某些m1相关特征基因
表达，同时抑制il4以诱导bmdm的某些m2特征基因表达。不受理论束缚，上述活性的免疫调节作用可以通过存在于yiv-906中的化学物质的糖部分，特别是看起来最活跃的糖苷配基化学物质来解释。
[0170]
实施例4：yiv-906诱导ifnγ分泌并活化bmdm的干扰素诱导级联反应。
[0171]
yiv-906和yiv-906gu(具有更高效力)可以刺激bmdm分泌ifnγ蛋白(图4a-4d)。此结果显示yiv-906gu对bmdm的ifnγmrna具有较强的诱导作用(图3)。由于在yiv-906gu处理下检测到较高的p-jak1/2、p-stat1/2和irf1水平，因此培养基中ifnγ的增加触发了ifnγ诱导级联反应的活化(图4a-4d和图5a-5c)。yiv-906gu对ifnβ的刺激为促进m1巨噬细胞极化提供了另外的机制。
[0172]
在ifnγ的存在下，yiv-906gu可以在早至30min内进一步增强p-jak1/2和p-stat2蛋白。在bmdm中存在ifnγ的情况下，其可以在24h维持较高的p-stat2。在24h，yiv-906或yiv-906gu增强ifnγ诱导inos蛋白表达，但不增强bmdm的ifr1蛋白(图4a-4d)。不受理论束缚，这可能是由于在给定的ifnγ浓度下，ifr1可能已达到其最大水平。另外，在bmdm中存在ifnγ的情况下，yiv-906gu也可以上调il15ra和icam mrna。yiv-906或yiv-906gu增强的ifnγ作用不限于bmdm，在gm-csf处理的原始细胞264.7(巨噬细胞)中，其还可以增强ifnγ以诱导mcp1、tnfa、inos mrna(图6)。
[0173]
与ifnγ相比，yiv-906或yiv-906gu通过抑制irf4表达(il4信号传导途径的关键转录因子)来抑制il4的作用(图4a-4d和图5a-5c)。在yiv-906或yiv-906gu 24h处理后，il4的抑制也导致bmdm中arg蛋白的下调(图4a-4d和图5a-5c)。不受理论束缚，ifr4和arg蛋白的减少可归因于在il4存在下yiv-906或yiv-906gu对其mrna的下调(图3)。
[0174]
这些结果表明yiv-906或yiv-906gu本身可以诱导ifnγ和ifnβ分泌。两者还可以通过刺激p-jak1/2和p-stat2磷酸化来增强ifnγ作用，同时通过下调bmdm的fr4蛋白来抑制il4作用。该模式可以解释yiv-906的多种机制如何起作用以有利地将巨噬细胞极化为m1表型。
[0175]
实施例5：yiv-906和抗pd1药剂的组合降低pd1并使hepa 1-6肿瘤的pdl1蛋白表达正常化。
[0176]
检查了yiv-906与抗pd1药剂组合时对hepa 1-6肿瘤的pd1和pdl1的蛋白表达的影响。抗pd1或yiv-906处理未显著改变pd1肿瘤蛋白。与对照组相比，yiv-906加抗pd1药剂在4天处理后可显著降低pd1肿瘤蛋白(p＝0.02)或抗pd1组(p＝0.003)(图7)。不受理论束缚，此结果至少可以部分解释为什么与更高剂量的单独抗pd1相比，具有相似的抗肿瘤活性需要更少的抗pd1与yiv-906组合。另外，抗pd1而不是仅yiv-906处理显著增加pdl-1肿瘤蛋白(p＝0.01)，但这种增加可以通过组合yiv-906和抗pd1来克服(p＝0.008)(图7)。总体而言，这些结果进一步表明yiv-906可以促进抗pd1作用，以克服肿瘤对免疫监视的抗性。
[0177]
实施例6：yiv-906/抗pd1处理诱导hepa 1-6肿瘤中与t细胞活化相关的基因表达。
[0178]
抗pd1的关键功能是通过抑制t细胞的共抑制途径来恢复细胞毒性t细胞功能。如所预期，抗pd1药剂诱导hepa 1-6肿瘤的活化t细胞(粒酶b+/cd3+)的数量(图8a)。抗pd1处理后活化的t细胞和treg的数量不受yiv-906共同处理的影响(图8a和8b)。然而，组合处理确实在hepa 1-6肿瘤中诱导了较多的t细胞活化相关基因(图8c)，并表明t细胞的功能可以被增强。
[0179]
目前的结果表明抗pd1或yiv-906单一疗法没有显著改变pd1肿瘤蛋白(图7a)。与对照组或单独的抗pd1组相比，yiv-906加抗pd1可以在4天处理后显著减少pd1肿瘤蛋白(分别为p＝0.02或0.003)(图7a)。此结果部分有助于解释为什么与更高剂量的单独抗pd1相比，具有相似的抗肿瘤活性需要更少的抗pd1与yiv-906组合。另外，抗pd1而不是仅yiv-906处理确实显著增加pdl-1肿瘤蛋白(p＝0.01)，但这种增加可以通过组合yiv-906和抗pd1来抵消(p＝0.008)(图7b)。这些结果表明，yiv-906可以促进抗pd1作用，以克服肿瘤对免疫监视的抗性并产生较强的抗肿瘤作用。
[0180]
实施例7：yiv-906可以调节吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)活性，其在免疫检查点抗体的活性中起重要作用。
[0181]
ido——负责将l-色氨酸代谢为犬尿氨酸的酶——可以是抗pd1、抗ctla4疗法的关键抗性因子。据报道，ido抑制剂增强抗pd1、抗pd-l1和抗ctla4药剂对不同类型的动物肿瘤的作用。ido表达抑制效应t细胞(teff)的活化和foxp3+调节性t细胞(tregs)的活化，这有助于将cd11b+gr1int骨髓衍生的抑制细胞(mdsc)募集到肿瘤中以抑制t细胞增殖。另外，发现单核细胞高ido表达有利于m2样巨噬细胞极化，而单核细胞中ido低表达有利于m1样巨噬细胞极化。
[0182]
ido测定结果显示yiv-906可以调节细胞培养物中的ido酶(图9a)。在利用纯化的大肠杆菌葡糖醛酸糖苷酶(gu)从化学物质中去除葡糖醛酸以模拟下gi道的条件后，yiv-906gu比yiv-906具有更强的ido抑制作用(图9a)。黄芩黄素被显示是类黄酮中最有效的化合物(图9a)。yiv-906或yiv-906/抗pd1具有降低hepa 1-6肿瘤的犬尿氨酸/色氨酸比率的趋势(图9b)。这表明yiv-906可以在体内调节ido活性。此外，发现抗pd1加yiv-906处理降低hepa 1-6肿瘤的单核细胞mdsc(图9c)。yiv-906对ido的调节可能是降低免疫耐受和促进抗pd1作用的另外机制作用。
[0183]
实施例8：yiv906增加磷酸化irf3蛋白水平和ifnβ，其是sting信号传导的关键介质。
[0184]
sting的活化是癌症免疫疗法的最新方法。sting(干扰素基因的刺激剂)是与内质网(er)相关的信号传导分子，并且对于控制许多宿主防御基因的转录是重要的。sting信号传导可以由与cgas结合的细胞死亡双链dna(dsdna)触发。dsdna/cgas复合物将atp和gtp转化为cgamp，从而将sting活化以磷酸化tbk。最后，磷酸化的tbk将使irf3磷酸化以转录ifnβ，其可以活化树突状细胞以募集和活化t细胞对抗肿瘤。sting信号传导还可以作为肿瘤疫苗发挥重要作用。如图10a和10b所示，yiv-906或yiv-906gu(用重组大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶预处理以模拟肠道条件)可以触发bmdm(小鼠骨髓衍生的巨噬细胞)的irf3磷酸化。yiv-906或yiv-906gu处理(48h)还可以诱导bmdm分泌ifnβ(图10c)。
[0185]
实施例9：yiv-906调节cd73酶活性。
[0186]
cd73(5'-核苷酸酶(5'-nt)或胞膜(ecto)-5'-核苷酸酶)是膜核苷酸酶，负责将胞外amp转化为与a2ar结合的腺苷。高水平的胞外腺苷可通过降低il2/ifnγ表达来抑制t效应细胞功能和增殖。腺苷还可以抑制树突状细胞和天然杀伤细胞活性。如图11所示，在体外测定中，yiv-906和yiv-906gu以不同的剂量抑制曲线抑制cd73酶活性。yiv-906在200μg/ml下对cd73的抑制作用比yiv-906gu更强。yiv-906在400μg/ml至800μg/ml范围内可抑制cd73最多60％，而yiv-906gu具有更强的效力，并以从200μg/ml至800μg/ml的剂量依赖性方式抑
制cd73。这些结果表明，yiv-906的葡糖苷酸缀合化合物可以调节cd73活性，而yiv-906的糖苷配基化合物对cd73具有真正的抑制作用。
[0187]
实施例10：yiv-906中的类黄酮在增强ifnγ作用以将巨噬细胞极化为m1样表型中起重要作用。
[0188]
在yiv-906gu中的四种草药成分：g、p、s和z中，结果表明在ifnγ的存在下，s在增加inos/arg比率方面具有最高的生物学活性(图12a)。一致地，不含s(-s)的制剂失去了ifnγ增强性质(图12a)。类黄酮黄芩黄素、汉黄芩素、白杨黄素、木蝴蝶素a和黄芩苷是用gu处理的s中的主要标记化合物，因此随后比较了对ifnγ的增强作用。结果表明，所有测试的类黄酮都可能对ifnγ增加inos/arg比率的作用具有积极影响(图12b)。在一些实施方式中，从yiv-906中删除任何一种草药都可降低ifnγ作用的增强(图12a)。这些结果表明，g、p、z也可以在ifnγ增强中起作用或与s相互作用以增强ifnγ作用。
[0189]
进行分析以确定在给药后hepa 1-6中存在yiv-906的哪些代谢物。结果表明，在肿瘤块(图12c)中检测到黄芩黄素、汉黄芩素和木蝴蝶素a，它们都可以增强ifnγ作用(图12b)。值得注意的是，与单独的yiv-906组相比，yiv-906加抗pd1组的肿瘤中汉黄芩素和木蝴蝶素a的量更高(图12c)。因此，在一些实施方式中，存在于yiv-906和抗pd1组合中的组分s中的这些类黄酮化合物可能是活性成分，与其它成分一起，有助于ifnγ增强，在hepa1-6肿瘤中将巨噬细胞极化为m1表型。
[0190]
列举的实施方式
[0191]
提供了以下列举的实施方式，其编号不应被解释为指定重要性水平：
[0192]
实施方式1提供了预防哺乳动物中癌症复发的方法，该方法包括向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的至少一种选自下列的草药组合物：
[0193]
(a)草药提取物yiv-906，包含黄芩(s)、甘草(g)、芍药(p)和枣(z)的草药提取物、其级分、或存在于草药提取物或其级分中的任何活性化学物质，和
[0194]
(b)β-葡糖醛酸糖苷酶处理的yiv-906(yiv-906gu)或其级分、或存在于yiv-906gu或其级分中的任何活性化学物质；
[0195]
其中哺乳动物被进一步给予有效量的至少一种免疫治疗剂。
[0196]
实施方式2提供了根据实施方式1的方法，其中癌症包括实体瘤。
[0197]
实施方式3提供了根据实施方式1-2中任一项的方法，其中癌症是选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝癌、结肠癌、膀胱尿路上皮癌、和胰腺癌中的至少一种。
[0198]
实施方式4提供了根据实施方式1-3中任一项的方法，其中所述至少一种免疫治疗剂是选自抗pd1、抗pd-l1、和抗ctla4抑制剂的免疫检查点抑制剂。
[0199]
实施方式5提供了根据实施方式1-4中任一项的方法，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂选自伊匹木单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、德瓦鲁单抗和阿特珠单抗。
[0200]
实施方式6提供了根据实施方式1-5中任一项的方法，其中所述至少一种免疫治疗剂是选自siglec 15抗体、抗磷脂酰丝氨酸、抗ox40、抗cd73、抗tim3、抗cd24、抗cd47、抗pd1、抗pdl1、抗ctla4、抗gitr、抗cd27、抗cd28、抗cd122、抗tigit、抗vista、抗icos和抗lag3的抗体。
[0201]
实施方式7提供了根据实施方式1-6中任一项的方法，其中给予草药组合物增强了所述至少一种免疫治疗剂的响应。
[0202]
实施方式8提供了根据实施方式1-7中任一项的方法，其中将草药组合物口服给予哺乳动物。
[0203]
实施方式9提供了根据实施方式1-8中任一项的方法，其中给予草药组合物促进了干扰素基因的刺激剂(sting)激动作用。
[0204]
实施方式10提供了根据实施方式1-9中任一项的方法，其中草药组合物以选自丸剂、片剂、胶囊、汤、茶、浓缩物、糖衣丸、液体、滴剂和囊形片的形式被口服给予哺乳动物。
[0205]
实施方式11提供了根据实施方式1-10中任一项的方法，其中草药组合物的治疗有效量为约20mg/天至约2000mg/天。
[0206]
实施方式12提供了根据实施方式1-11中任一项的方法，其中草药组合物的治疗有效量为约1600mg/天。
[0207]
实施方式13提供了根据实施方式1-12中任一项的方法，其中每天给予草药组合物2次。
[0208]
实施方式14提供了根据实施方式1-12中任一项的方法，其中给予草药组合物约1周至约2周，随后暂停处理至少1周。
[0209]
实施方式15提供了根据实施方式1-14中任一项的方法，其中在给予化学疗法或放射疗法之前约30min给予草药组合物。
[0210]
实施方式16提供了根据实施方式1-14中任一项的方法，其中所述给予持续约4天。
[0211]
实施方式17提供了根据实施方式1-16中任一项的方法，其中在选自将一种或多种免疫治疗剂给予哺乳动物之前、同时和之后的时间给予草药组合物。
[0212]
实施方式18提供了根据实施方式1-17中任一项的方法，其中哺乳动物是人。
[0213]
本文对变量的任何定义中的要素列表的叙述包括将该变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或子组合)。本文对实施方式的叙述包括作为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
[0214]
本文引用的每个和每一个专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用其整体并入本文。尽管本公开是参考具体实施方式做出的，但显而易见的是，本领域的其他技术人员可以在不背离本公开的真实精神和范围的情况下设计出本公开的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这种实施方式和等效变型。