苦荞黄酮在制备治疗糖尿病诱导的组织损伤药物中的应用

本发明属于医药工业领域，涉及苦荞黄酮的药物用途，具体涉及苦荞黄酮用于制备治疗糖尿病诱导的组织损伤药物的用途。

背景技术：

糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢疾病。高血糖是由胰岛素绝对或相对分泌不足而导致引起。在全球范围内糖尿病的发病率呈逐年升高趋势，已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后威胁人类健康和生命安全的第三位重大疾病。长期存在的高血糖会导致许多并发症，包括糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病血管病变等疾病。

糖尿病肾病(dn)的治疗方法很多，包括血管紧张素转换酶抑制剂(acei)和血管紧张素ⅱ受体阻断剂(arb)、内皮素受体拮抗剂、基肽酶和二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂等。但是目前糖尿病肾病缺乏有效的治疗方法，其治疗是以阻止或延缓肾病的进展为重点。

糖尿病视网膜病变(dr)是糖尿病重要的微血管并发症之一，在dr的防治早期主要以改善微循环药物为主，临床上最常用的药物有羟苯磺酸钙、胰激肽原酶以及舒洛地特等，但这些药物存在副作用、毒性和高成本。因此，开发理想的dr治疗药物仍然是目前的研究热点。

糖尿病的血管病变是常见的糖尿病并发症之一，这也是导致糖尿病病人死亡的主要原因之一。血管内皮损伤是糖尿病血管病变的病理生理基础，其中高血糖、氧化应激及胰岛素抵抗等诸多因素参与了糖尿病血管内皮损伤的发病过程。早期有效干预高糖性血管内皮损伤对于防治糖尿病血管并发症有积极意义。目前治疗糖尿病血管损伤的药物包括西格列汀、利格列汀、维格列汀等，但这些药物的副作用较大，价格昂贵且治疗效果也不显著。

因此，如何有效防治糖尿病以及延缓其发生及并发症的发展，依然是目前糖尿病防治中亟待解决的难题之一。

天然产物以其特有的成本低廉，安全无副作用等优点而成为治疗糖尿病及其并发症的研究热点。

苦荞属蓼科植物，富含蛋白质、维生素和黄酮等多种营养成分。苦荞中富含黄酮类物质，其主要成分为芦丁、槲皮素。苦荞黄酮类化合物因其具有抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗糖尿病、抗炎、降胆固醇等多种生物学活性而受到广泛关注。目前，有关苦荞黄酮的研究已有大量报道，而苦荞黄酮干预糖尿病诱导的组织损伤的功能研究尚未被开发。

针对上述技术问题，亟需对苦荞黄酮在治疗糖尿病诱导的组织损伤的功能进一步研究。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明人对苦荞进行了锐意研究，研究发现：苦荞黄酮在制备治疗糖尿病诱导的组织损伤药物的新用途，具体地：通过醇浸及大孔吸附树脂从苦荞中提取并纯化苦荞黄酮，将提纯的苦荞黄酮用于制备预防、治疗或改善糖尿病诱导的组织损伤的药物。本发明中苦荞黄酮的提纯方法简单，提取物中总黄酮含量可达80％以上；利用苦荞黄酮制备的药物具有原料来源广泛、成本低、疗效好、长期应用毒副作用低的优点，从而完成本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供了一种苦荞黄酮的提纯方法，所述方法包括：

步骤1，将苦荞粉浸提，得到苦荞黄酮粗提物；

步骤2，将步骤1得到的苦荞黄酮粗提物纯化。

其中，步骤1包括以下步骤：

步骤1-1，将苦荞粉浸渍于溶剂，并分离得到上层清液；

步骤1-2，将步骤1-1得到的上层清液浓缩，得到提取液；

步骤1-3，将步骤1-2所得提取液溶解。

其中，在步骤1-1中，所述溶剂为水和/醇类化合物，所述醇类化合物包括甲醇、乙醇、丙醇中的任意一种或几种。

其中，步骤2包括以下步骤：

步骤2-1，利用树脂对苦荞黄酮粗提物提纯；

步骤2-2，对步骤2-1提纯后的树脂进行洗脱，并收集洗脱液；

步骤2-3，对步骤2-2的洗脱液后处理。

其中，在步骤2-1中，所述树脂选自苯乙烯类大孔树脂和/或甲基丙烯酸酯类大孔树脂，优选为苯乙烯类大孔树脂。

第二方面，提供了苦荞黄酮在制备治疗糖尿病诱导的组织损伤药物中的用途，其中，所述苦荞黄酮优选采用第一方面所述方法得到。

其中，所述苦荞黄酮中总黄酮的含量为80％以上。

其中，芦丁的重量占总黄酮中的76％以上，槲皮素的重量占总黄酮重量的2％以上。

其中，所述糖尿病诱导的组织损伤为主动脉血管损伤、视网膜损伤或肾脏组织损伤。

其中，所述主动脉血管包括胸主动脉血管、腹主动脉血管；所述肾脏组织包括肾小管、肾小球。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的苦荞黄酮的提纯方法简单，提取物中总黄酮含量可达80％以上。

(2)本发明提供的苦荞黄酮对糖尿病诱导的胸主动脉血管损伤、腹主动脉血管损伤、视网膜损伤、肾脏组织损伤如肾小管、肾小球，起到治疗、改善或预防的作用。

(3)本发明提供的苦荞黄酮用于制备治疗糖尿病诱导的组织损伤药物，其中，苦荞黄酮从天然产物中提取，使用安全、无毒副作用，可操作性强，治疗糖尿病诱导的组织损伤效果显著，成本低，可降低患者及医疗机构的诊疗费用。

(4)本发明利用苦荞黄酮制备的药物具有原料来源广泛、疗效好、长期应用毒副作用低。

附图说明

图1示出本发明实验例1中1型糖尿病小鼠胸主动脉、腹主动脉、视网膜、肾脏组织的苏木精-伊红染色图；

图2示出本发明实验例2中2型糖尿病小鼠胸主动脉、腹主动脉、视网膜、肾脏组织的苏木精-伊红染色图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

本发明的第一方面，目的在于提供一种苦荞黄酮的提纯方法，所述方法包括：

步骤1，将苦荞粉浸提，得到苦荞黄酮粗提物。

根据优选方式，所述浸提具体包括：

步骤1-1，将苦荞粉浸渍于溶剂，并分离得到上层清液；

步骤1-2，将步骤1-1得到的上层清液浓缩，得到提取液；

步骤1-3，将步骤1-2所得提取液溶解。

以下详述浸提具体过程。

在步骤1-1中，所述溶剂为水和/醇类化合物，所述醇类化合物包括甲醇、乙醇、丙醇中的任意一种或几种，优选水或乙醇各自独立使用，更优选乙醇。

根据本发明，将苦荞粉与溶剂接触，使得苦荞粉被溶剂润湿，水及醇类化合物的极性较强，使得溶剂分子可以渗透浸入苦荞粉内部，根据相似相溶原理，使更多的成分溶解。

根据本发明，醇类化合物中的乙醇安全无毒可回收，浸提的选择性好，渗透性强，非常适用于苦荞的提纯过程。本发明人研究发现，随着乙醇浓度的升高，苦荞中脂溶性的物质增多，不利于后续的提纯过程，乙醇浓度过低，浸提后溶液的黏度较大，过滤、浓缩、分离均较困难，当乙醇的浓度为50％～80％时，优选60～70％，更优选65％，此时，浸提效果最佳。

在步骤1-1中，随着浸提温度的升高，总黄酮得率逐渐增大，过高的温度对苦荞黄酮的提纯影响变小，从经济角度及对反应的影响角度出发，所述浸提温度为50～90℃，优选为60～80℃，更优选为75℃。

在步骤1-2中，优选通过旋转蒸发的方式实现浓缩。其中，根据液体的状态判断浓缩过程的结点，当上层清液中没有液体时，浓缩过程结束。

根据优选方式，所述浓缩时间低于1小时，优选不超过40min，例如20～30min；为了节省浓缩时间，可在浓缩过程中对其加热，浓缩温度为40～80℃，优选50～70℃，更优选55℃。

在步骤1-3中，使用有机溶剂溶解提取液，优选极性有机溶剂，促使提取液能溶解于有机溶剂中。

根据优选方式，溶剂为水和/或醇类化合物，所述醇类化合物包括甲醇、乙醇、丙醇中的任意一种或几种，为了减少其他有机溶剂对反应的影响，优选与浸提苦荞黄酮的有机溶剂相同，如将乙醇稀释使用。

根据本发明，使用乙醇溶解提取液时，乙醇的浓度只需满足能将提取液溶解即可，优选乙醇的浓度为10％～60％，更优选20～50％，如30％。

步骤2，将步骤1得到的苦荞黄酮粗提物纯化。

根据优选方式，所述步骤2包括：

步骤2-1，利用树脂对苦荞黄酮粗提物提纯；

步骤2-2，对步骤2-1提纯后的树脂进行洗脱，并收集洗脱液；

步骤2-3，对步骤2-2的洗脱液后处理。

具体而言：

在步骤2-1中，为了获得高纯度的苦荞黄酮，需要进一步对苦荞黄酮粗提纯物进行纯化，鉴于大孔树脂与吸附质之间具有大的比表面积，从而形成了巨大的范德华力，可以达到分离和纯化的目的。

根据本发明，大孔树脂的吸附量与多种因素有关，包括树脂的种类、物化参数、溶剂的特性等。

本发明所述大孔树脂优选选自苯乙烯类大孔树脂如ab-8大孔吸附树脂、dm-2大孔吸附树脂，和/或甲基丙烯酸酯类大孔树脂如diaionhp2mg大孔吸附树脂，此类树脂具有大的比表面积、孔径分布均匀。

在进一步优选实施方式中，所述大孔树脂为苯乙烯类大孔树脂，此类树脂理化性质稳定，不受无机盐类及小分子化合物的影响。

在更进一步优选实施方式中，所述大孔树脂为ab-8大孔吸附树脂，属于苯乙烯型弱极性共聚体，其比表面积和孔径较大，适合于吸附各类具有一定极性或弱极性的中药成分，吸附量较大，洗脱容易，吸附动力学性能良好，性质稳定，使用寿命较长，对无机类化合物及小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将待提纯物质苦荞黄酮与这些物质分离，同时，苦荞黄酮具有具有酚羟基进而糖苷键，具有一定的极性和亲水性，ab-8大孔吸附树脂对苦荞黄酮具有优良的选择性。

在步骤2-2中，为了达到分离的目的，所述洗脱剂极性大于本发明选取的大孔树脂，优选醇类和/或酮类，更优选醇类，例如乙醇。

根据本发明，乙醇不仅极性大，而且安全无毒，是一种理想的洗脱剂。

本发明人研究发现，浓度低于35％的乙醇无法将苦荞黄酮从大孔树脂中洗脱，浓度为40～80％的乙醇可以达到洗脱效果，优选浓度为60～70％的乙醇，更优选浓度为65％的乙醇，此时可以有效将苦荞黄酮从大孔树脂中洗脱，为最佳洗脱浓度。

本发明中，由于大孔树脂会残留惰性溶剂，优选使用大孔树脂前采用90％以上浓度的乙醇对其冲洗，以保证吸附的效果。

本发明中，为了减少小分子亲水性有机物对苦荞黄酮纯度的影响，优选在步骤2-2前，对步骤2-1提纯后的大孔树脂使用自来水冲洗，然后再进行洗脱。

在步骤2-3中，所述后处理包括回收洗脱剂、浓缩苦荞黄酮、干燥。

根据本发明，回收的洗脱剂可以直接应用于下一批次苦荞黄酮的提纯过程。

本发明的第二方面，目的在于提供苦荞黄酮在制备治疗糖尿病诱导的组织损伤药物中的用途，其中，所述苦荞黄酮优选采用第一方面所述的方法制得。

本发明中，苦荞中生物类苦荞黄酮含量丰富，其主要成分为芦丁和槲皮素，苦荞黄酮对改善、预防或治疗糖尿病诱导的组织损伤有优良的效果。

根据优选方式，所述苦荞黄酮中总黄酮的含量达到80％以上，其中，芦丁的重量占苦荞黄酮中总黄酮重量的76％以上，槲皮素的重量占苦荞黄酮中总黄酮重量的2％以上。

在进一步优选实施方式中，所述苦荞黄酮中总黄酮的含量为80.6％以上，其中，芦丁的重量占苦荞黄酮中总黄酮重量的78％以上，槲皮素的重量占苦荞黄酮中总黄酮重量的2.6％以上；更优选地，所述苦荞黄酮中总黄酮的含量为82％以上，芦丁的重量占苦荞黄酮中总黄酮重量的80％以上，槲皮素的重量占苦荞黄酮中总黄酮重量的3％以上。

根据本发明，所述糖尿病诱导的组织损伤为主动脉血管损伤、视网膜损伤及肾脏组织损伤。

本发明中，苦荞黄酮能改善或预防糖尿病诱导的视网膜损伤，使视网膜内核层以及外核层细胞形态恢复正常。所述主动脉血管包括胸主动脉血管、腹主动脉血管，苦荞黄酮可诱导其出现纤维化症状。所述肾脏组织包括肾小管、肾小球，苦荞黄酮可减轻糖尿病诱导的肾损伤，使肾小管、肾小球细胞恢复正常。

根据本发明，苦荞黄酮应用于治疗糖尿病诱导的组织损伤时，使用剂量为50～500mg/kg，优选为100～400mg/kg，例如200mg/kg。

本发明中，苦荞黄酮安全性高，可单独使用或与传统药物联合用药治疗糖尿病诱导的组织损伤。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

从苦荞粉中提取苦荞黄酮。

将苦荞粉在浓度为65％的乙醇中浸提，浸提温度为75℃，时间为3小时，用循环水多用途真空泵过滤，对上层清液收集，并使用旋转蒸发器对其浓缩，浓缩时间30min，温度55℃，得到提取液，再使用浓度为30％的乙醇溶解提取液。

室温条件下，用浓度为98％的乙醇对ab-8大孔吸附树脂冲洗并上柱，将上述乙醇溶解的提取液注入柱中，静置3h，结束后，先用水缓缓洗脱，弃去水洗液，再用浓度为65％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，并将苦荞黄酮浓缩至稠膏，最后干燥得到的粉末状即为提取的苦荞黄酮，经hplc分析，得到提取物苦荞黄酮中总黄酮含量为84.01％，其中，芦丁的重量占总黄酮重量的80.67％，槲皮素的重量占总黄酮重量的3.33％。

实验例

实验例1

苦荞黄酮对缓解1型糖尿病小鼠诱导的组织损伤。

雄性小鼠从上海斯莱克实验动物有限公司获得。实验前，让所有小鼠在动物房内适应7天，控制动物房室内温度为23±2℃，湿度为55±5％；给实验小鼠提供充足的水和饲料。本实验相关操作的执行均以动物保护管理条例为标准。

将8-10周龄、重量为18～22g的雄性小鼠随机分为6组：正常组1组(nd)、模型组1组(t1dm)、实验组4组(t1dm-tbf150，t1dm-tbf300，t1dm-rutin100，t1dm-rutin200)，每组6只。

其中，模型组和实验组小鼠为1型糖尿病小鼠，建立过程具体如下：在小鼠腹腔注射链脲佐菌素(stz)45mg/kg/d，连续注射5天。

正常组(nd)小鼠，注射等量的柠檬酸缓冲液(ph4.4，浓度0.1mol/l)。

正常组(nd)小鼠和1型糖尿病小鼠最后一次注射72小时后，测定小鼠的空腹血糖，其中，血糖值≥16.7mmol/l时认为1型糖尿病小鼠模型已建立。

各组小鼠治疗方法具体如下：

实验组小鼠分别灌胃给予苦荞黄酮150mg/kg(t1dm-tbf150)、苦荞黄酮300mg/kg(t1dm-tbf300)、芦丁100mg/kg(t1dm-rutin100)、芦丁200mg/kg(t1dm-rutin200)治疗，其中，苦荞黄酮为实施例1制得，芦丁为商品化产品，购自medchemexpress(mce)有限公司。

模型组(t1dm)小鼠不进行给药治疗，灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水；

正常组(nd)灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水。

小鼠在上述条件下治疗或喂养，每周监测各组小鼠血糖和体重，4周后处死上述小鼠，取肝脏组织主动脉、腹主动脉、视网膜、肾脏组织，进行h&e(苏木精-伊红染色法)染色，结果如图1所示。

实验例2

苦荞黄酮对缓解2型糖尿病小鼠诱导的组织损伤。

本实施例与实施例1小鼠来源相同，实验前对小鼠的喂养条件与实施例1完全相同。

将8-10周龄、重量为18～22g的雄性小鼠随机分为6组：正常组1组(nd)、模型组1组(t2dm)、实验组4组(t2dm-tbf150，t2dm-tbf300，t2dm-rutin100，t2dm-rutin200)，每组6只。

其中，模型组和实验组小鼠为2型糖尿病小鼠，建立过程具体如下：小鼠被喂养高脂饲料(hfd)，其中，脂质含量为45％，蛋白质含量为19％，碳水化合物含量为36％；

以此同时，正常组(nd)小鼠被喂养正常饲料，其中，脂质含量为10％，蛋白质含量为19％，碳水化合物含量为71％。

小鼠在上述条件下喂养8周，8周后隔夜禁食12小时，对正常组小鼠注射柠檬酸缓冲液(ph4.4，浓度0.1mol/l)，其余各组小鼠腹腔注射stz(35mg/kg/d)及柠檬酸缓冲液(ph4.4，浓度0.1mol/l)，连续注射三天，每天一次，最后一次注射72小时后，测定小鼠的空腹血糖，其中，血糖值≥16.7mmol/l时认为2型糖尿病小鼠模型已建立。

各组小鼠治疗方法具体如下：

实验组小鼠分别灌胃给予苦荞黄酮150mg/kg(t2dm-tbf150)、苦荞黄酮300mg/kg(t2dm-tbf300)、芦丁100mg/kg(t2dm-rutin100)、芦丁200mg/kg(t2dm-rutin200)治疗，其中，苦荞黄酮为实施例1制得，芦丁与实验例1使用的芦丁来源相同。

模型组(t2dm)小鼠不进行给药治疗，灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水；

正常组(nd)灌胃相同剂量的0.9％的生理盐水。

小鼠在上述条件下治疗或喂养，每周监测各组小鼠血糖和体重，4周后处死上述小鼠，取肝脏组织主动脉、腹主动脉、视网膜、肾脏组织，进行h&e(苏木精-伊红染色法)染色，结果如图2所示。

结合图1和图2可知：

正常组中，小鼠的胸主动脉、腹主动脉血管、视网膜、肾脏组织形态正常。

模型组中，小鼠的胸主动脉、腹主动脉血管管壁增厚，出现纤维化症状；视网膜内核层以及外核层细胞分界不清晰，形态异常，神经细胞排列杂乱；肾脏组织中大量空泡变性和/或坏死，肾小管、肾小球细胞形态异常，出现增生现象。

实验组中，当苦荞黄酮剂量为150mg/kg时，小鼠的胸主动脉、腹主动脉血管管壁与模型组相比变薄，细胞排列有序，纤维化症状减轻；视网膜内核层以及外核层细胞分界清晰，形态正常，神经细胞排列整齐；肾脏组织中空泡变性和/或坏死减少，肾小球细胞恢复正常；

当苦荞黄酮剂量为300mg/kg时，小鼠的胸主动脉、腹主动脉血管、视网膜以及肾脏组织损伤程度逐步减轻，治疗效果优于苦荞黄酮150mg/kg的剂量组；

当芦丁剂量为100mg/kg时，小鼠的胸主动脉、腹主动脉血管管壁与模型组相比变薄，细胞排列有序，纤维化症状减轻；视网膜内核层以及外核层细胞分界清晰，形态正常，神经细胞排列整齐；肾脏组织中空泡变性和/或坏死减少，肾小球细胞恢复正常；

当芦丁剂量为100mg/kg时，小鼠的胸主动脉、腹主动脉血管、视网膜以及肾脏组织损伤程度逐步减轻，治疗效果优于芦丁为100mg/kg的剂量组。

此外，结合图1和图2还可以明显看出，芦丁对糖尿病诱导的组织损伤具有一定的治疗效果，但使用苦荞黄酮的治疗效果优于单独使用芦丁治疗的效果。

可见，在糖尿病小鼠模型中，苦荞黄酮能够缓解糖尿病诱导的组织损伤，且具有一定的剂量依赖性。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。