本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种含有生殖干细胞的修复组合物及其制备方法。
背景技术：
随着肿瘤患者年轻化以及生存率的提高，化疗药物所致医源性损害逐渐得到重视。卵巢是生殖系统中对化疗最为敏感的部位，大剂量、长时间的化疗可破坏卵巢组织，导致卵巢功能早衰。卵巢早衰是较为常见的妇科内分泌疾病，以女性青春期之后，40岁之前出现4个月以上的持续闭经，血清雌激素水平降低，卵泡刺激素水平升高为特征。pof致女性闭经、不孕、性功能低下，同时骨质疏松、高脂血症、心血管疾病等的患病风险也大大增加，严重危害女性的身心健康和家庭和睦。
技术实现要素：
本发明提供一种含有生殖干细胞的修复组合物及其制备方法，所述的修复组合物具有良好的抑制卵巢早衰作用。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案：
一种含有生殖干细胞的修复组合物，包括子宫内膜干细胞、β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水；
所述人子宫内膜干细胞的含量为2×105~1×106个/ml；
所述β-雌二醇的含量为0.3~0.8mg/ml；
所述淫羊藿苷的含量为0.3~0.8mg/ml。
本发明的发明人在大量的研究中发现，子宫内膜干细胞对卵巢组织有修复作用，并可改善卵巢的内分泌功能。
β-雌二醇可促使子宫内膜恢复正常增殖，改善卵巢内分泌，有助于妊娠。
淫羊藿苷可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗应激、抗氧化等作用，提高人体免疫力，促进机体恢复，配伍性能好。
同时发明人发现，子宫内膜干细胞与β-雌二醇联用，二者具有良好的协同增效作用，进一步加入淫羊藿苷起到辅助修复卵巢早衰作用，从而三者具有良好的协同增效作用。
作为一种优选方案，所述子宫内膜干细胞的含量为4×105个/ml。
作为一种优选方案，所述β-雌二醇的含量为0.6mg/ml。
作为一种优选方案，所述淫羊藿苷的含量为0.5mg/ml。
作为一种优选方案，所述子宫内膜干细胞的制备方法为：
s1、采集经血，向10~20重量份经血中加入20~50重量份的pbs缓冲液，再加入10~20重量份的分离液，第一次离心，取中间层，加入0.2~0.6重量份ⅰ型胶原酶，混合均匀，第二次离心，弃上清，得到细胞沉淀；
s2、将细胞沉淀用生理盐水配制成2×104~1×105个/ml的浓度，并接种于原代培养基，在33~37℃、体积分数为4.8~5.2%co2的培养箱中培养10~24h，得到p0代细胞；
s3、将p0代细胞用生理盐水配制成2×104~1×105个/ml的浓度，接种于传代培养基，在33~37℃、体积分数为4.8~5.2%co2的培养箱中培养至细胞融合度大于85%，收集细胞，重复至p5代；即得子宫内膜干细胞。
本发明所制备得到的子宫内膜干细胞具有良好的活力，细胞活性高、自我更新和分化强。
作为一种优选方案，所述分离液为淋巴细胞分离液。
作为一种优选方案，所述原代培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括5~10mm/mld-葡萄糖、0.5~1mg/mlβ-甘油磷酸钠、5~12mg/ml海藻糖、0.8~1.5mg/ml维生素c、2~5ng/ml地塞米松、3~6ng/ml干细胞生长因子。
作为一种优选方案，所述传达培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括5~10mm/mld-葡萄糖、0.5~1mg/mlβ-甘油磷酸钠、0.8~1.5mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5~12mg/ml海藻糖、0.8~1.5mg/ml维生素c、2~5ng/ml地塞米松、3~6ng/ml干细胞生长因子。
作为一种优选方案，所述传达培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括9mm/mld-葡萄糖、0.8mg/mlβ-甘油磷酸钠、1.2mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸、8mg/ml海藻糖、1mg/ml维生素c、4ng/ml地塞米松、5ng/ml干细胞生长因子。
本发明还提供了一种含有生殖干细胞的修复组合物的制备方法，将β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水混合均匀，重悬子宫内膜干细胞，即得含有生殖干细胞的修复组合物。
本发明的有益效果：所述的含有生殖干细胞的修复组合物具有良好的抑制卵巢早衰作用子宫内膜干细胞与β-雌二醇联用，二者具有良好的协同增效作用，进一步加入淫羊藿苷起到辅助修复卵巢早衰作用，从而三者具有良好的协同增效作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种含有生殖干细胞的修复组合物，包括子宫内膜干细胞、β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水；
所述人子宫内膜干细胞的含量为4×105个/ml；
所述β-雌二醇的含量为0.6mg/ml；
所述淫羊藿苷的含量为0.5mg/ml。
所述子宫内膜干细胞的制备方法为：
经血来源为正常健康女性月经周期间收集的。
s1、采集经血，向12重量份经血中加入38重量份的pbs缓冲液，再加入12重量份的淋巴细胞分离液，第一次离心，取中间层，加入0.5重量份ⅰ型胶原酶，混合均匀，第二次离心，弃上清，得到细胞沉淀；
s2、将细胞沉淀用生理盐水配制成5×104个/ml的浓度，并接种于原代培养基，在35℃、体积分数为5%co2的培养箱中培养18h，得到p0代细胞；
s3、将p0代细胞用生理盐水配制成5×104个/ml的浓度，接种于传代培养基，在35℃、体积分数为5%co2的培养箱中培养至细胞融合度大于85%，收集细胞，重复至p5代；即得子宫内膜干细胞。
所述原代培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括7mm/mld-葡萄糖、0.9mg/mlβ-甘油磷酸钠、10mg/ml海藻糖、0.9mg/ml维生素c、3ng/ml地塞米松、4ng/ml干细胞生长因子。
所述传达培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括9mm/mld-葡萄糖、0.8mg/mlβ-甘油磷酸钠、1.2mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸、8mg/ml海藻糖、1mg/ml维生素c、4ng/ml地塞米松、5ng/ml干细胞生长因子。
所述的含有生殖干细胞的修复组合物的制备方法，将β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水混合均匀，重悬子宫内膜干细胞，即得含有生殖干细胞的修复组合物。
实施例2
一种含有生殖干细胞的修复组合物，包括子宫内膜干细胞、β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水；
所述人子宫内膜干细胞的含量为2×105个/ml；
所述β-雌二醇的含量为0.3mg/ml；
所述淫羊藿苷的含量为0.3mg/ml。
所述子宫内膜干细胞的制备方法为：
经血来源为正常健康女性月经周期间收集的。
s1、采集经血，向12重量份经血中加入38重量份的pbs缓冲液，再加入12重量份的淋巴细胞分离液，第一次离心，取中间层，加入0.5重量份ⅰ型胶原酶，混合均匀，第二次离心，弃上清，得到细胞沉淀；
s2、将细胞沉淀用生理盐水配制成5×104个/ml的浓度，并接种于原代培养基，在35℃、体积分数为5%co2的培养箱中培养18h，得到p0代细胞；
s3、将p0代细胞用生理盐水配制成5×104个/ml的浓度，接种于传代培养基，在35℃、体积分数为5%co2的培养箱中培养至细胞融合度大于85%，收集细胞，重复至p5代；即得子宫内膜干细胞。
所述原代培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括7mm/mld-葡萄糖、0.9mg/mlβ-甘油磷酸钠、10mg/ml海藻糖、0.9mg/ml维生素c、3ng/ml地塞米松、4ng/ml干细胞生长因子。
所述传达培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括9mm/mld-葡萄糖、0.8mg/mlβ-甘油磷酸钠、1.2mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸、8mg/ml海藻糖、1mg/ml维生素c、4ng/ml地塞米松、5ng/ml干细胞生长因子。
所述的含有生殖干细胞的修复组合物的制备方法，将β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水混合均匀，重悬子宫内膜干细胞，即得含有生殖干细胞的修复组合物。
实施例3
一种含有生殖干细胞的修复组合物，包括子宫内膜干细胞、β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水；
所述人子宫内膜干细胞的含量为4×105个/ml；
所述β-雌二醇的含量为0.6mg/ml；
所述淫羊藿苷的含量为0.5mg/ml。
所述子宫内膜干细胞的制备方法为：
经血来源为正常健康女性月经周期间收集的。
s1、采集经血，向12重量份经血中加入38重量份的pbs缓冲液，再加入12重量份的淋巴细胞分离液，第一次离心，取中间层，加入0.5重量份ⅰ型胶原酶，混合均匀，第二次离心，弃上清，得到细胞沉淀；
s2、将细胞沉淀用生理盐水配制成5×104个/ml的浓度，并接种于原代培养基，在35℃、体积分数为5%co2的培养箱中培养18h，得到p0代细胞；
s3、将p0代细胞用生理盐水配制成5×104个/ml的浓度，接种于传代培养基，在35℃、体积分数为5%co2的培养箱中培养至细胞融合度大于85%，收集细胞，重复至p5代；即得子宫内膜干细胞。
所述原代培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括5mm/mld-葡萄糖、0.5mg/mlβ-甘油磷酸钠、5mg/ml海藻糖、0.8mg/ml维生素c、2ng/ml地塞米松、3ng/ml干细胞生长因子。
所述传达培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括5mm/mld-葡萄糖、0.5mg/mlβ-甘油磷酸钠、0.8mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5mg/ml海藻糖、0.8mg/ml维生素c、2ng/ml地塞米松、3ng/ml干细胞生长因子。
所述的含有生殖干细胞的修复组合物的制备方法，将β-雌二醇、淫羊藿苷、生理盐水混合均匀，重悬子宫内膜干细胞，即得含有生殖干细胞的修复组合物。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1不含有子宫内膜干细胞，其他都相同。
对比例2
对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2不含有β-雌二醇，其他都相同。
对比例3
对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3不含有淫羊藿苷，其他都相同。
对比例4
对比例4与实施例1不同之处在于，对比例4所述的原代培养基、传代培养基的添加物与实施例1不同，其他都相同。
所述原代培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括7mm/mld-葡萄糖、10mg/ml海藻糖、0.9mg/ml维生素c、4ng/ml干细胞生长因子。
所述传达培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为mem培养基，所述添加物包括9mm/mld-葡萄糖、1.2mg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸、8mg/ml海藻糖、1mg/ml维生素c、5ng/ml干细胞生长因子。
为了进一步证明本发明的效果，提供了以下测试方法：
1、选用2-3月龄、体重200±20g、具有正常动情周期的wistar雌性大鼠80只，适应性饲养1周后，随机分为8组。
2.构建大鼠卵巢早衰模型：一次性腹腔注射环磷酰胺溶液(120mg/kg)和白消安溶液(12mg/kg)各0.1ml，每日8：00用棉签轻取阴道分泌物涂片，再巴氏染色，观察阴道脱落细胞变化，当连续10d观测到持续动情间期，视为卵巢早衰建模成功，造模成功后，每只实验大鼠腹腔注射苯巴比妥钠60mg/kg，15min后将大鼠背部向上固定在动物手术台上，消毒皮肤，持眼科镊捏紧下腹部正中线皮肤，用外科剪作小的横切口，剪刀钝性分离充分暴露手术视野，切开筋膜，用镊子拖出脂肪垫，卵巢。再用镊子固定住卵巢，然后用微量注射器对八组大鼠分别注射实施例1~3、对比例1~4所述的修复组合物，另外一组为对照组，注射等量生理盐水，注射剂量为20μl/g大鼠体重，注射一周后测量指标。
3.采用免疫组织化学染色的方法检测实验大鼠卵巢bax、bcl-2蛋白的表达水平，测试结果见表1，其具体过程为：取6μm厚的卵巢组织连续切片，采用sabc法行免疫组化染色，卵巢组织切片常温干燥；20ml的30％h2o2和200ml蒸馏水混合，然后加入卵巢组织切片中，室温10min以灭活内源性过氧化物酶，再用蒸馏水洗涤3次，每次5min；用微波炉进行热修复抗原后，用5％bsa封闭液室温封闭30min，再分别滴加bcl-2和bax一抗的混合液(体积比为1：200)于4℃下过夜；翌日，室温下滴加生物素化山羊抗兔igg作用10min，再滴加sabc作用30min，然后dab显色3～10min，苏木素复染，自来水返蓝15min；常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
表1测试结果
从表1中可看出，本发明所述的含有生殖干细胞的修复组合物能够有效的抑制卵巢早衰。
对比实施例1与实施例2可知，实施例1所述的子宫内膜干细胞、β-雌二醇、淫羊藿苷添加量具有更好制备出来的修复组合物具有更好的抑制卵巢早衰效果。
对比实施例1与实施例3可知，实施例3所述的培养基添加量制备出来的修复组合物具有更好的抑制卵巢早衰效果。
对比实施例1与对比例1~3可知，子宫内膜干细胞、β-雌二醇、淫羊藿苷三者在治疗卵巢早衰中具有协同增效作用。
对比实施例1与对比例4可知，培养基中β-甘油磷酸钠、地塞米松的加入可以提高子宫内膜干细胞的活性，从而提高抑制卵巢早衰效果。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。