海棠茶水提取物及用途

本发明提供一种海棠茶水提取物及其应用，尤其涉及海棠茶水提取物在制备治疗痛风的药物中的应用。

背景技术：

尿酸，是人体内嘌呤代谢的终产物。正常嘌呤饮食状态下，当人体内尿酸值超过一定浓度(男性>420μmol/l，女性>360μmol/l)，即发展为高尿酸血症。嘌呤代谢紊乱及(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症与痛风发病存在直接联系。痛风是我国第二大代谢类疾病，会引起关节组织损伤及多种慢性疾病，严重影响人类生活健康。因此，发现调节代谢，降低血尿酸，防治痛风的食物和药物具有重要意义。

黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，xod)是嘌呤代谢的关键酶，可将黄嘌呤催化生成尿酸。因此使用xod抑制剂阻断尿酸合成是治疗高尿酸血症的有效方法之一。临床上使用的别嘌醇可有效抑制体内黄嘌呤氧化酶，使黄嘌呤不能被氧化成尿酸，从而达到控制尿酸水平的目的。但别嘌醇使用中不良反应较多，其引发的严重过敏反应：史-约综合征(stevens-johnsonsyndrome，sjs)和中毒性皮肤坏死症(toxicepidermalnecrolysis，ten)，死亡率高达20％～25％。因此，寻找安全性高、效果显著的xod抑制剂具有重要意义。

中药治疗痛风历史悠久，具有多途径、多靶点、多层次对症治疗的优势，通过降尿酸、抗炎、抗氧化、保护肾脏等发挥治疗作用，其疗效明显且不良反应率低。近年来，有关中药对痛风的防治作用机制研究较多。本研究发现湖北海棠具有良好的降低血尿酸，防治痛风的作用。

湖北海棠(malushupehensis(pamp.)rehder)为蔷薇科苹果属植物，药食两用。海棠茶是湖北海棠的叶，也是三峡地区历史悠久的清凉饮料。湖北海棠叶富含以根皮苷，还含根皮素、三羟基根皮苷等黄酮类物质，含有齐墩果酸熊果酸等三萜类化合物。海棠茶具有保肝护肝、抗氧化、降血糖、抗病毒等多种作用。海棠茶对血糖、血脂代谢具有调节作用，但对尿酸代谢的影响未见国内外文献报道。本研究发现海棠茶及其中根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷等黄酮类物质能抑制黄嘌呤氧化酶的活性，降低血尿酸，防治痛风。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供一种海棠茶水提取物在制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。

本发明还提供海棠茶水提取物在制备抑制肝脏黄嘌呤氧化酶的药物中的应用。

本发明还提供海棠茶水提取物在制备治疗痛风的药物中的应用。

所述的海棠茶水提取物在制备治疗足肿胀所引起的痛风的药物中的应用。

所述的海棠茶水提取物在制备治疗关节尿酸所引起的痛风的药物中的应用。

所述的海棠茶水提取物是将海棠茶叶在100℃中煮沸30-40分钟，经抽滤、减压浓缩、干燥得到海棠茶水提取物。所述的海棠茶水提取物中包括质量分数为6-10％，质量分数为1-4％的三羟基根皮苷，和质量分数为1-3％的根皮素。

所述的海棠茶水提取物还可替换为根皮苷、三羟基根皮苷、根皮素中的一种或多种的组合。

高尿酸血症是由于尿酸的生成增多和/或排泄减少导致的代谢性疾病。实验从尿酸生成途径检测了体外海棠茶水提取物对尿酸生成关键酶，黄嘌呤氧化酶的抑制作用。并分析了其水提取物中主要的黄酮类成分对黄嘌呤氧化酶的影响以及作用机理。结果显示水提取物和主要的黄酮类成分对黄嘌呤氧化酶活性均具有抑制作用，其中三羟基根皮苷体外黄嘌呤氧化酶抑制活性最强，三羟基根皮苷在海棠茶中含量较高，含量与制茶工艺密切相关，是海棠茶降尿酸，防治高尿酸血症和痛风的特征性成分。根皮苷和根皮素联合使用后对体外xod抑制率高达(73.75±2.18)％，表现出较强的协同作用。表明海棠茶水提取物中不同抑制类型的不同成分通过对黄嘌呤氧化酶抑制的协同作用，使水提取物具有更好的作用。根皮苷在多种植物中存在，在肠道内转化为根皮素，海棠茶中根皮苷和根皮素同时含有，根皮苷含量高，二者协同作用，保证海棠茶稳定的降尿酸作用。

海棠茶具有利尿作用，对加强尿酸排泄，降低血尿酸也有积极作用，但没有研究其对痛风的作用。本研究证明海棠茶和主要成分根皮苷、三羟基根皮苷和根皮素对黄嘌呤氧化酶具有抑制活性，主要通过抑制尿酸生成，调节尿酸代谢，防治高尿酸血症，减少痛风风险。

附图说明

图1为根皮苷对不同浓度的黄嘌呤氧化酶的抑制作用。

图2为根皮素对不同浓度的黄嘌呤氧化酶的抑制作用。

图3为三羟基根皮苷对不同浓度的黄嘌呤氧化酶的抑制作用。

图4为根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制类型。

图5为根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制类型。

图6为三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制类型。

图7为根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制常数。

图8为根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制常数。

图9为三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制常数。

具体实施方式

本发明所述的海棠茶，由湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学)提供，经三峡大学王玉兵博士鉴定为湖北海棠malushupehensis(pamp.)rehder的叶。

本发明所述的根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷纯度均95％以上，由湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学)提供；黄嘌呤,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号d1828210；氧嗪酸钾,上海麦克林生化科技有限公司,批号c10652334；尿酸检测试剂盒,批号20200925、黄嘌呤氧化酶,批号20200630、黄嘌呤氧化酶试剂盒,批号20200630，南京建成生物工程研究所。别嘌醇，上海源叶生物科技有限公司，批号x27j10y91606；尿酸钠盐，上海希格玛高技术有限公司，批号：bcbx0421；秋水仙碱片，西双版纳药业有限责任公司，批号190901；酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20201102.

本发明所用的实验动物，180只sd大鼠，雌雄各半，体质量(200±20.0)g。实验动物由三峡大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：scxk(鄂)2017-0012，实验单位使用许可证号：syxk(鄂)2017-0061。温度20～26℃，湿度40％～70％，正常喂养，自由饮水。

本发明所述的仪器中ja2003型电子分析天平，上海天平仪器厂；infinitem200pro酶联免疫检测仪，ati公司；centrifuge5415r高速冷冻离心机，eppendorf公司；kfs-c电子数字秤，凯丰集团有限公司。ph计，上海仪电科学仪器有限公司；超纯水仪，美国aquapro国际有限公司。

实施例1

本发明受试药物配制：海棠茶水提取物的制备：海棠茶叶500g，100℃煮沸三次，每次10倍水，微沸30min，抽滤后，合并滤液，减压浓缩至1：2(即1ml相当于2g海棠茶)，真空干燥，即得(海棠茶水提取物中含根皮苷8％，三羟基根皮苷2％，根皮素约1.8％)。

底物溶液配制：黄嘌呤用1mol/l氢氧化钠溶解加入蒸馏水30ml，1mol/l盐酸调节ph至7.5，配置成1.5mmol/l的储备液。

酶液配置：xod以pbs溶解，配置成0.4u的xod储备液于-80℃保存。临用前稀释成不同梯度并于冰水浴中保存。

样品溶液配置：根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷均以dmso溶解(供体外实验用)，配置成储备液，于4℃保存，临用前稀释至不同浓度。

尿酸钠盐配置：取250mg尿酸钠盐，研碎，加入9ml生理盐水和1ml吐温80，制备25mg/ml的尿酸钠盐混悬液。

实施例2

海棠茶水提取物和主要成分对高尿酸大鼠血尿酸的影响

高尿酸血症大鼠模型建立将90只sd大鼠按体重随机分为空白组、模型组、别嘌呤醇组(5mg/kg)与海棠茶水提物低、中、高剂量组(200、300、400mg/kg)，根皮苷低、中、高剂量组(20、40、60mg/kg)，根皮素低、中、高剂量组(5、10、20mg/kg)，三羟基根皮苷低、中、高剂量组(5、10、20mg/kg)(海棠茶水提物低、根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷均用水制成均匀水悬液，下同。)，每组6只。实验组大鼠灌胃氧嗪酸钾300mg/kg+酵母膏15g/kg复制高尿酸血症模型，每天分两次给药。造模1h后，各实验组灌胃给相应样品，空白组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水。每天1次，连续14天。末次给样1h后，各组大鼠眼球静脉丛取血，3000r/min离心10min，取血清，置于-20℃冰箱备用。处死大鼠，取大鼠肝脏组织，-80℃冰箱保存，备用。

测定大鼠血清尿酸浓度和肝脏xod活性，结果如表1。空白组及实验组大鼠血清尿酸水平明显低于模型组(p<0.05或p<0.01)，且实验组大鼠肝脏xod活性明显低于模型组大鼠xod活性(p<0.05),说明海棠茶水提取物和根皮苷、三羟基根皮苷、根皮素均具有体内xod抑制活性，并可有效降低大鼠血清尿酸水平。黄酮类成分可能为海棠茶水提取物中具有xod抑制活性的主要活性物质。

表1.海棠茶水提取物和主要成分对大鼠体内黄嘌呤氧化酶的抑制作用(s′±s，n＝6)

注：与模型组比较，^*p<0.05。

实施例3

海棠茶水提取物和主要成分对痛风大鼠的影响

痛风大鼠模型建立：

将90只sd大鼠按体重随机分为空白组、模型组、别嘌呤醇组(5mg/kg)与海棠茶水提物低、中、高剂量组，根皮苷低、中、高剂量组，根皮素低、中、高剂量组，三羟基根皮苷低、中、高剂量组(剂量同上)，每组6只。给药后第12天测量右踝关节的初始周径。各组大鼠仰卧固定,剔除右后肢小腿关节毛,消毒,麻醉后用6号注射针以大鼠右深关节外侧后方为穿刺点,距小腿关节背后从45°方向插入至胫骨肌腱内侧，注入25mg/ml尿酸钠溶液200μl,对照组给予等量无菌生理盐水。

痛风大鼠关节肿胀指数测定：

用缚线法测量造模前1h和造模后第24、48小时大鼠右踝关节同一部位的周径，计算肿胀指数。肿胀指数＝(致炎后踝关节周径-致炎前踝关节周径)/致炎前踝关节周径。

痛风大鼠关节囊腔组织液尿酸渗透的测定：

于踝关节上0.5cm处剪下各组致炎足，剥皮剪碎放于3ml生理盐水中浸泡1h，将浸泡液离心，取上清液，使用尿酸检测试剂盒检测尿酸含量。比较药物与对照组之间的差异。

表2.海棠茶水提取物对痛风大鼠的影响(，n＝6)

注：与模型组比较，^*p<0.05。

实施例4

大鼠血清尿酸含量和肝脏黄嘌呤氧化酶活性测定取大鼠血清按照尿酸检测试剂盒说明书进行检测。准确称取肝组织并按质量(g):体积(ml)＝1：9的比例加入生理盐水，-20℃机械匀浆，制备成10％的匀浆液，2500～3000r/min，离心10分钟，取上清液进行测定。使用黄嘌呤氧化酶测定试剂盒按照说明书测定。

黄嘌呤氧化酶活力测定实验条件下，xod在适合条件下可将黄嘌呤氧化成尿酸。

尿酸在295nm处具有特征吸收峰，记录295nm处每分钟增加的od值来计算xod活性(δod·min-1,δod为od值增加值)，以此来测定各组样品对xod的影响。将样品及空白溶液100μl，浓度0.1u/ml的xod50μl,依次加入96孔板，37℃孵育5min，加入0.05mmol/l的底物黄嘌呤溶液。混匀，295nm处每隔15秒读数一次记录od值，监测5min.

抑制率(％)＝[(δod·min-1)空白]-[(δod·min-1)样品]/(δod·min-1)空白×100％.

(δod·min-1)空白：空白组反应速率；(δod·min-1)样品：样品反应速率

体外测定不同浓度海棠茶水提取物对xod活性的抑制率，使用graphpadprism7软件计算ic50(半数抑制浓度)。海棠茶水提取物具有xod抑制活性，为进一步探究其具体发挥作用成分，选择根皮苷、三羟基根皮苷、根皮素等成分测定其xod抑制活性，各成分ic50结果如下(表3)。结果表明，三羟基根皮苷对xod的抑制活性最强，ic50值为(2.02±1.79)μg/ml。根皮苷和根皮素ic50值分别为(355.2±1.78)μg/ml和(123.4±1.03)μg/ml，对xod表现出比较强的抑制活性。

表3.海棠茶提取物及其部分单体对黄嘌呤氧化酶的抑制作用(，n＝3)

实施例5

海棠茶主要成分对黄嘌呤氧化酶的抑制作用机理

保持反应体系中底物黄嘌呤浓度不变，改变加入的xod浓度，使酶浓度分别为0.2、0.1、0.05、0.0250u/ml(0u/ml为加等量pbs)，测定不同浓度样品对xod活性影响。以反应速率对酶活性作图，若得到一组平行直线，为不可逆抑制，若所有直线均过原点，则抑制作用机理为可逆抑制。

选择根皮苷、根皮素和三羟基根皮苷测定抑制作用机理。以不同样品对xod的反应速率(δod/min)对酶活性(u/ml)分别做图。得到一组经过原点的直线，并且直线斜率随着加入的样品浓度升高而降低。由此可见根皮苷/根皮素/三羟基根皮苷对xod的抑制均为可逆抑制，其抑制作用均是经过降低酶活来达到降低催化效率(如图1、2、3)。

实施例6

海棠茶主要成分对黄嘌呤氧化酶的抑制类型和抑制常数在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶测活体系中，保持酶浓度0.1u/ml不变，改变反应体系中底物黄嘌呤浓度，使黄嘌呤浓度分别为1、0.5、0.25、0.0125、0mmol/l(0mmol/l为加入等量pbs)。测定不同浓度样品对xod活性影响。以酶的反应速率倒数1·v^-1为纵坐标，底物黄嘌呤浓度倒数1·[s]^-1为横坐标以lineweaver-burk双倒数法作图。判断样品对xod的抑制类型。

采用dixon作图法选取两个底物浓度，以抑制剂浓度和反应速率倒数作图。得到两个相较于一点直线，交点处横坐标绝对值即为该抑制剂对xod的抑制常数(ki)。

根皮苷、三羟基根皮苷和根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制类型可逆抑制可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制。采用了lineweaver-burk双倒数法作图，测定根皮苷、根皮素和三羟基根皮苷对xod的抑制类型。如图4所示，在反应体系中保持酶浓度不变，改变加入的底物浓度，加入不同浓度根皮苷得到一组相交于第一象限的直线，随着根皮苷浓度的增大直线斜率逐渐增大。符合可逆抑制中混合型抑制特点。加入不同浓度的根皮素得到一组相交于y轴的直线，如图5，并随着根皮素浓度的增加，直线纵轴截距基本不变，符合竞争性可逆抑制特点。加入不同浓度的三羟基根皮苷得到一组相互平行的直线，如图6，并随着三羟基根皮苷浓度的增加，直线斜率基本不变，符反合竞争性可逆抑制特点。综合各组抑制类型，选择ic50值相差相对不大且同为竞争性抑制作用的根皮苷和根皮素为联合使用素材，测定联合用药后的xod抑制率和共毒系数。

根皮苷、三羟基根皮苷和根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制常数以dixon作图法得图7、图8、图9，计算得根皮苷、根皮素和三羟基根皮苷对xod的抑制常数ki分别为411.04μg/ml、80.05μg/ml和1.39μg/ml。

实施例7

根皮苷与根皮素对黄嘌呤氧化酶的联合抑制作用使用等毒法测定，将根皮苷和根皮素单独使用对xod抑制率为25％时所需剂量混合，测定混合物对xod的抑制率大小。以50％为预期抑制率，根据以下公式计算处共毒系数，参考联合抑制作用类型评价标准表，以此评价联合用药对xod的抑制作用。当共毒系数大于10且小于20时属于弱协同作用，共毒系数大于20时属于协同作用，共毒系数小于-10时为拮抗作用。

共毒系数＝(实测抑制率预期抑制率)/预期抑制率×100％

将根皮苷和根皮素对xod单独使用抑制率分别达到25％时的剂量混合。联合作用结果如表4，共毒系数为(47.49±4.36)；根皮苷和根皮素联合作用的抑制率为(73.75±2.18)％，明显高于预期抑制率，且共毒系数远大于20，根皮苷和根皮素联合使用对抑制xod活性具有协同作用，可显著降低xod活性。

表4.根皮苷与根皮素混合物对xod的抑制作用(，n＝3)

以上实施例2-7中的统计学方法采用spss25、graphpadprism7软件进行数据分析。各项结果都用平均值±标准差(s′±s)表示。采用单因素anova进行方差分析和多重比较，p<0.05具有统计学意义。