一种用于治疗不孕症的药物及其制备方法、应用

1.本发明属于中药技术领域，具体公开一种用于治疗不孕症的药物及其制备方法、应用。


背景技术：

2.不孕症是一种生育障碍状态，不孕症可由多种病因导致，如环境药物的影响、排卵问题及身体器质性问题等均可导致不孕的发生。其中，薄型子宫内膜是直接导致女性不孕症的关键因素之一，约占不孕症发生原因的40％。
3.薄型子宫内膜(thin endometrium)是指子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的阈厚度，目前临床上通常将卵泡成熟时超声视野下子宫内膜厚度<7mm定义为薄型子宫内膜。国内外许多研究报道认为，合适的子宫内膜厚度为8
‑
14mm，子宫内膜的厚薄直接影响子宫内膜容受性，子宫内膜过薄会降低患者子宫内膜的容受性，从而影响胚胎着床，降低受孕率。改善子宫内膜厚度可以显著提高受孕率和活产率，容受性良好的子宫内膜是胚胎着床的必备条件，是成功妊娠的基础。有研究证实薄型子宫内膜与低妊娠率有关，改善子宫内膜厚度、提高子宫内膜容受性是提高临床妊娠率的关键所在，也逐渐成为世界性生殖医学系统研究的焦点和难点。
4.薄型子宫内膜不仅导致不孕症，而且降低体外受精(ivf)的胚胎种植成功率，增加早期自然流产、胎盘植入的风险，同时也是闭经及产后出血的重要原因。子宫内膜厚度监测技术也已经用于预测辅助生殖技术中妊娠成功的概率。
5.薄型子宫内膜的发生常由多种因素共同引发，最常见病因是炎症反应和医源性因素。多次刮宫或手术操作不当，均可损伤子宫内膜基底层进而导致子宫内膜生长不良；此外，如血供差、高血流阻力、低雌激素状态等因素也可导致子宫内膜生长不良。在部分女性中，子宫内膜也存在先天性发育较薄。目前国内外公认的薄型子宫内膜的治疗方法主要有以下几种：大剂量雌激素治疗、粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)宫腔内灌注、口服阿司匹林、维生素e、西地那非及宫腔镜等，但目前都尚未获得循证医学证据的明确支持。
6.中药用时长，一般需要持续用药三个月经周期(即连续三个月时间)，但其相对西药在有效性方面具有明显优势。


技术实现要素：

7.本发明提供一种用于治疗不孕症的药物，有助于子宫内膜厚度增长，并增强卵泡张力、恢复卵泡正常发育，增强助孕。
8.本发明提供的用于治疗不孕症的药物，其按重量份数计由以下原料组成：炒菟丝子10
‑
15份、鹿角霜10
‑
12份、炙巴戟天15
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25份、炒杜仲10
‑
15份、炒续断10
‑
25份、炒芡实10
‑
15份、枸杞子8
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10份、香砂仁6
‑
8份、炒白术15
‑
20份、党参20
‑
30份、熟地黄10
‑
30份、当归8
‑
10份、炙黄芪10
‑
15份、炙甘草8
‑
10份。
9.优选地，所述炒菟丝子、所述炒杜仲、所述炒续断均为盐水炒制。
10.优选地，其按重量份数计由以下原料组成：炒菟丝子15份、鹿角霜10份、炙巴戟天20份、炒杜仲15份、炒续断20份、炒芡实15份、枸杞子8份、香砂仁6份、炒白术20份、党参20份、熟地黄20份、当归8份、炙黄芪15份、炙甘草8份。
11.本发明还提供一种上述用于治疗不孕症的药物的制备方法，包括以下步骤：
12.s1、按重量份数称取炒菟丝子10
‑
15份、鹿角霜10
‑
12份、炙巴戟天15
‑
25份、炒杜仲10
‑
15份、炒续断10
‑
25份、炒芡实10
‑
15份、枸杞子8
‑
10份、香砂仁6
‑
8份、炒白术15
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20份、党参20
‑
30份、熟地黄10
‑
30份、当归8
‑
10份、炙黄芪10
‑
15份、炙甘草8
‑
10份，备用；
13.s2、将称取的炒菟丝子、鹿角霜、炙巴戟天、炒杜仲、炒续断、炒芡实、枸杞子、香砂仁、炒白术、党参、熟地黄、当归、炙黄芪、炙甘草混合，加水煎煮，收集煎煮液，浓缩，即得所述药物。
14.优选地，所述加水煎煮的具体过程为，第一次加入相当于药材总重量3
‑
4倍的水，浸泡20min后，煎煮20
‑
30min，收集第一次煎煮液，滤渣加入相当于药材总重量2
‑
3倍量的水，继续煎煮20
‑
30min，收集第二次煎煮液，并与所述第一次煎煮液合并，得到混合液。
15.更优选地，所述浓缩是将煎煮液浓缩至药液含生药量为0.5
‑
1g/ml。
16.上述用于治疗不孕症的药物能够用于制备治疗卵泡发育迟缓、薄型子宫内膜不孕症的药物。
17.中医认为肾贮藏着生殖之精，人的形成、生长发育、生殖主要靠肾精的化生来实现，肾气盛衰与否决定肾精是否充盛，生殖能力以肾气的强弱盛衰为主导，与肾气之有余不足有直接关系，女子的生理特点中月经、妊娠均由胞宫所主，肾主藏精系胞宫，肾气的盛衰同时决定着胞宫功能是否正常，肾气虚不能正常濡养胞宫，胞宫功能失常影响内膜的生长，从而导致胚胎种植失败而致不孕的发生。
18.本方中炒菟丝子为君，平补肝肾，既可补阳，又可益阴，温而不燥、补而不滞；炒杜仲甘温、炒续断苦辛温、炙巴戟天甘辛温、枸杞子性平、鹿角霜为臣药，与君药合用更增强补肾、填精、固冲任的作用；党参、炒白术、炙甘草、炒山药、炙黄芪、炒芡实补益脾胃为佐；香砂仁和胃醒脾、快气调中；当归、熟地黄补血和营为使。综合全方，一则补肾固冲填精，肾藏精，精化血；二则补气健脾，使后天生化有源；三则补血和营，补阳药与补阴药熟地黄并用，体现了《景越全书》所说的善补阳者比阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷。全方温补肾气、通养冲任；补肾之精血益肾之元气，精盛血充，气血调和，冲任通畅有养，胎孕以成。
19.本方加味补肾固冲汤中精选了菟丝子、杜仲、续断、巴戟天、枸杞子、鹿角霜六味药并用，大补肾中阳气，其主要特点是温补肾阳而不燥，平补肝肾而不滋腻，药性甘温平和，用之无后顾之忧，非其他补阳药能替代，如仙茅，辛热性猛；胡芦巴，性较温热，此类补肾阳有伤阴之弊；干姜、肉桂、炮附片，温里有伤津之虑，有后顾之忧。本方中精选的党参、炒白术、炙甘草、炒山药、炙黄芪、炒芡实为一组健脾胃药，肾为先天之本，脾胃为后天之源，健脾使后天生化有源，补后天资助先天肾，补肾之精血，益肾之元气，精盛血充，气血调和，冲任通畅、有养，胎孕以成。
20.相较于现有技术，本发明的有益效果为：
21.1、本发明在原有的补肾固冲汤的基础上进行加减，主要加入炒山药、炙黄芪、炙甘草、炒芡实，并删去了原有补肾固冲汤中的大枣、阿胶；基础方“补肾固冲汤”治疗习惯性流产是通过调理习惯性流产患者雌激素水平达到治疗效果，主要通过补肾方式进行调理治
疗；本发明提供的改进方治疗不孕症是通过补肾阳气方式进行调理，且根据患者月经周期关键时间节点进行周期性合理用药，促进子宫内膜厚度增长，并增强卵泡张力、恢复卵泡正常发育，增强助孕；
22.2、基础方仅可对已受孕后习惯性流产患者有一定效果，本发明提供的组方不仅能够使不能顺利受孕患者顺利受孕，还能保证经本方治疗受孕后不易流产，直到整个孕期完成、顺利安全生产。
附图说明
23.图1是mtt法检测本发明实施例提供的药物对原代小鼠子宫内膜上皮细胞的促增殖作用图；
24.图2是mtt法检测本发明实施例提供的药物对huvec细胞的促增殖作用图；
25.图3是本发明实施例提供的药物在体外促进huvec细胞的增殖作用图；
26.图4是本发明实施例提供的药物在体内改善米非司酮所致小鼠着床障碍情况；a是各处理组实验动物体重变化曲线；b是各处理组实验动物着床情况比较；
27.图5是本发明实施例提供的药物在体内修复乙醇诱导的模型动物损伤的子宫内膜h&e染色及免疫组化染色图；(a)h&e染色；(b)免疫组化染色(ihc)，vimentin蛋白染色(100
×
)。
具体实施方式
28.下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
29.本发明提供一种用于治疗不孕症的药物，其按重量份数计由以下原料组成：炒菟丝子10
‑
15份、鹿角霜10
‑
12份、炙巴戟天15
‑
25份、炒杜仲10
‑
15份、炒续断10
‑
25份、炒芡实10
‑
15份、枸杞子8
‑
10份、香砂仁6
‑
8份、炒白术15
‑
20份、党参20
‑
30份、熟地黄10
‑
30份、当归8
‑
10份、炙黄芪10
‑
15份、炙甘草8
‑
10份。
30.需要说明的是，本发明中所用炒菟丝子、炙巴戟天、炒杜仲、炒续断均为盐水炒制；所用炒芡实为清炒；所用炙甘草、炙白术、炙黄芪均为蜜炙。
31.上述用于治疗不孕症的药物的制备方法，包括以下步骤：
32.s1、按重量份数称取炒菟丝子10
‑
15份、鹿角霜10
‑
12份、炙巴戟天15
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25份、炒杜仲10
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15份、炒续断10
‑
25份、炒芡实10
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15份、枸杞子8
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10份、香砂仁6
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8份、炒白术15
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20份、党参20
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30份、熟地黄10
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30份、当归8
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10份、炙黄芪10
‑
15份、炙甘草8
‑
10份，备用；
33.s2、将称取的炒菟丝子、鹿角霜、炙巴戟天、炒杜仲、炒续断、炒芡实、枸杞子、香砂仁、炒白术、党参、熟地黄、当归、炙黄芪、炙甘草混合，第一次加入相当于药材总重量3
‑
4倍的水，浸泡20min后，煎煮20min，收集第一次煎煮液，滤渣加入相当于药材总重量2
‑
3倍量的水，继续煎煮20min，收集第二次煎煮液，并与所述第一次煎煮液合并，得到混合液，浓缩至药液含生药量为0.5
‑
1g/ml，即得所述药物。
34.下面列举几个实施例对本发明提供的治疗不孕症的药物进行说明。
35.实施例1
36.一种用于治疗不孕症的药物，其由以下原料组成：炒菟丝子15g、鹿角霜10g、炙巴戟天20g、炒杜仲15g、炒续断20g、炒芡实15g、枸杞子8g、香砂仁(连壳)6g、炒白术20g、党参20g、熟地黄20g、当归8g、炙黄芪15g、炙甘草8g。
37.制备方法如下：
38.以上诸药置于陶制砂锅中，以水600ml淹没浸泡20min后，用大火将其煮沸后转成小火维持沸腾状态20min，分离药液，重新向锅中加入550ml水，按以上方法继续重复煎煮1次，收集2次煎煮药液，混匀后置于陶制砂锅中继续浓缩药液至100ml，使得最终药液含生药量为2.0g/ml。
39.实施例2
40.一种用于治疗不孕症的药物，其由以下原料组成：炒菟丝子10g、鹿角霜10g、炙巴戟天15g、炒杜仲10g、炒续断10g、炒芡实10g、枸杞子8g、香砂仁6g、炒白术15g、党参20g、熟地黄10g、当归8g、炙黄芪10g、炙甘草8g。
41.制备方法同实施例1。
42.实施例3
43.一种用于治疗不孕症的药物，其由以下原料组成：炒菟丝子15g、鹿角霜12g、炙巴戟天25g、炒杜仲15g、炒续断25g、炒芡实15g、枸杞子10g、香砂仁8g、炒白术20g、党参30g、熟地黄30g、当归10g、炙黄芪15g、炙甘草10g。
44.制备方法同实施例1。
45.由于实施例1
‑
3制备得到的药物的治疗效果基本相同，故以下仅以实施例3制备的药物为例对本发明提供的治疗不孕症的药物的治疗效果进行说明。
46.1、促进原代小鼠子宫内膜上皮细胞增殖
47.1.1原代小鼠子宫内膜上皮细胞(meec)的分离和培养
48.选取6
‑
8周龄c57bl/6小鼠(18
‑
20g，上海斯莱克动物中心，上海)饲养于spf级实验室。动物经检疫后，应用co2处死动物后，无菌手术收集小鼠子宫置于35mm细胞培养皿中，应用含3％100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无菌pbs清洗小鼠子宫后，用外科剪将其剪碎成约1mm小块，将后者转移至50ml离心管中，加入10ml含1mg/ml胶原酶和2ng/ml dnase的消化液于37℃处理30min
‑
1h，收集上清液并加10ml含fbs的dmem培养基终止酶消化活性，40μm滤器过滤细胞悬液于15ml离心管中，并应用10ml不含血清的dmem培养基对过滤器进行反洗，收集过滤器中的腺团块于15ml管中，500
×
g离心5min，弃上清，将离心所得沉淀重悬于1ml含0.25％胰蛋白酶
‑
edta消化液中37℃摇床进行二次孵育消化10分钟后，加9ml细胞培养基，500
×
g离心5min，弃上清液，将收集的meec细胞培养于60mm培养皿中于37℃，5％co2培养箱中孵育24h后进行meec的纯度用于后续实验。
49.1.2mtt实验法
50.收集处于对数生长期的原代小鼠子宫内膜上皮细胞meec细胞，按照5
×
104个细胞/孔接种于96孔板24h后，应用本发明提供药物的不同浓度(0.16mg/ml、0.32mg/ml、0.64mg/ml、1.28mg/ml、2.56mg/ml和5.12mg/ml 6个梯度，每个浓度5个复孔，并设空白培养基与阴性溶剂对照组)处理24h、48h后，应用1
×
pbs洗去残留培养基后，加入含5mg/ml的mtt溶液50μl/孔后，于37℃细胞培养箱内避光孵育2～4h，加入150μl dmso/孔，置于摇床震荡5～10min至结晶物完全融解后，应用全波长酶标仪(thermo scientific，usa)测其在570nm
波长的光吸收值(od570)，将每孔的od值减去相应阴性对照孔od值即为该细胞的最终od值，应用graphpad prism 8.0软件(graphpad software,ca,usa)进行数据处理。实验重复三次。
51.1.3mtt实验结果用不同浓度药物处理分别原代小鼠子宫内膜上皮细胞(meec)24h和48h，以mtt法检测细胞的增殖情况，结果图1所示。
52.mtt结果显示，使用本发明提供的药物处理meec细胞24h
‑
48h后，其呈浓度和时间依赖式地诱导了小鼠子宫内膜上皮细胞的增殖活力。
53.2、促进人源血管内皮细胞增殖
54.2.1mtt实验法检测药物对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响
55.将3
×
103个人脐静脉血管内皮细胞huvec接种于96孔板内培养24h后，应用0.16mg/ml、0.32mg/ml、0.64mg/ml、1.28mg/ml、2.56mg/ml和5.12mg/ml不同浓度本发明提供的药物处理细胞24h后(同时设置空白细胞培养基和溶剂对照组)，应用1
×
pbs洗去残留培养基后，每孔加入含5mg/ml的mtt溶液50μl，置于37℃培养箱内避光孵育2h～4h，每孔加入150μl dmso溶液，置于摇床震荡5～10min直到结晶物充分融解，应用全波长酶标仪(thermo scientific，usa)测定各孔od570，将每孔的od值减去相应阴性对照孔od值即为该细胞的最终od值，应用graphpad prism 8.0软件(graphpad software,ca,usa)进行数据处理。每个实验重复三次。
56.2.2edu
‑
dna掺入法检测人源血管内皮细胞增殖活性
57.基于edu可以在dna合成的s期合并到染色体和复制dna中并染成红色，我们应用edu
‑
dna掺入检测试剂盒检测本发明提供的药物(mx)对huvec细胞增殖的影响。3
×
103个细胞/孔接种于96孔板中24h后，应用不同浓度的本发明提供的药物(0.16mg/ml、0.32mg/ml和0.64mg/ml)，并设空白培养基对照和溶剂对照组)处理细胞48h，按照试剂盒说明书要求应用edu
‑
dna试剂处理细胞后于37℃细胞培养箱中避光孵育2
‑
3h后，应用倒置荧光显微镜(carl zeiss,germany)观察药物对huvec细胞增殖活性的影响。每个实验重复三次。
58.2.3实验结果
59.2.3.1mtt实验法检测药物对huvec细胞增殖的促进作用
60.huvec细胞以不同浓度本发明提供的药物(mx)处理24h，以mtt法检测细胞的增殖情况(mean
±
sd；n＝3)，结果图2所示。
61.由图2可知，本发明提供的药物可显著促进人脐静脉内皮细胞huvec细胞增殖，5.12mg/ml本发明提供的药物(mx)处理huvec细胞24h后，其对细胞增殖的诱导率达到32％，表明本发明提供的药物在体外具有促进huvec的增殖、促进血管新生的作用。
62.2.3.2edu染色检测药物在体外对huvec细胞增殖的促进作用
63.应用edu染色法分析经本发明提供的药物(mx)处理48h后的huvec细胞增殖情况(100
×
，n＝3)。数据是三个平行实验的代表。结果如图3所示。
64.由图3可知，与溶剂对照组比较，本发明提供的药物0.16mg/ml处理组的edu染色阳性细胞的百分比是10.0％，0.32mg/ml处理组的edu染色阳性细胞的比例升高到13.5％，0.64mg/ml处理组的edu染色阳性细胞的比例升高到25.5％。
65.3、在体内改善米非司酮(mifepristone，ru)所致小鼠胚胎着床障碍
66.3.1本发明提供的药物(mx)体内药效学分析实验法
67.选取c57bl/6小鼠(6
‑
8周龄，18
‑
20g，雌雄小鼠的性别比为2:1，上海斯莱克动物中心，上海)用于本研究。动物饲养于严格按实验动物福利要求建立的spf级实验室，实验动物经检疫后，将雌性实验小鼠随机分为正常对照组(control)、米非司酮模型组(mifepristone，ru)。将雄性小鼠与各组雌性小鼠按1:2合笼配对繁育(发现阴道栓记为妊娠第1天，d1)后，模型组在妊娠第4天(d4)单次皮下注射0.8g/l米非司酮0.1ml，对照组单次皮下注射溶剂丙二醇溶液0.1ml，第12天(d12)观察各组胚胎着床数量，确定米非司酮诱导的模型构建成功。
68.随后，按上述方法将雌性小鼠与雄性小鼠合笼配对繁育后，将妊娠小鼠(每组10只)随机分成control(正常对照组)、ru(ru模型组)、ru+gst(ru造模后使用基础方补肾固冲汤治疗组)、ru+mx(ru造模后使用本发明提供的药物治疗组)。分别应用生理盐水(n.s.)处理control和ru组、ru+gst(ru造模后使用基础方补肾固冲汤治疗组，实验小鼠的口服灌胃剂量为25.0g/kg)、ru+mx(ru造模后使用本发明提供的药物治疗，实验小鼠的口服灌胃剂量为25.0g/kg)处理12天，期间观察实验动物临床症状，并定期称量实验动物体重，实验结束后，处死实验动物，收集各组妊娠小鼠子宫和卵巢后观察胚胎着床数量，并收集各组的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器用于形态学及组织学观察。数据采用spss 13.0软件(spss inc.，chicago,il,usa)进行统计分析，以平均数
±
sd/sem表示。
69.3.2实验结果
70.米非司酮(ru)诱导的胚胎着床障碍模型实验动物经本发明提供的药物(mx)治疗或正常空白对照(n.s.)处理12天后，未观察mx组实验动物明显异常，且与模型对照组比较，本发明提供的药物(mx)处理组实验动物体重略有增高(见图4a所示)；实验终点时，处死实验动物后，收集各实验动物的子宫以及心、肝、脾、肺、肾等主要脏器组织，并定量拍照观察各实验组动物的子宫大小、内膜厚度等。结果显示，与模型组和基础方补肾固冲汤组比较，本发明提供的药物(mx)处理后可以明显改善ru诱导的小鼠胚胎着床障碍(见图4b所示)。
71.4、改善酒精(乙醇)致子宫内膜损伤
72.4.1动物造模及治疗的实验方法
73.实验动物购买、检疫与饲养等如上述。将雌性小鼠随机分为正常对照组、模型组，模型组于雌性小鼠生理周期的动情期用0.5ml酒精(质量分数95％乙醇溶液)经子宫角进行小鼠子宫宫腔灌注处理5min后应用生理盐水冲洗吸出残余乙醇、control正常对照组用pbs注入冲洗处理后，分为二种不同的处理类型：(1)短期急性诱导模型组(short
‑
time acute model，sam)6h后处死动物并解剖观察各组小鼠子宫内膜损伤情况，确定乙醇急性诱导的子宫内膜损伤实验模型构建成功；长期慢性诱导模型组(long
‑
time chronic model，lcm)常规饲养观察实验动物3个动情周期后，处死动物并解剖观察各组小鼠子宫内膜损伤情况，确定乙醇慢性诱导的子宫内膜损伤实验模型构建成功。
74.随后，按上述方法造模后，分别应用n.s.处理control、sam和lcm组、基础方补肾固冲汤gst处理sam+gst(乙醇急性造模后基础方补肾固冲汤治疗组，实验小鼠的口服灌胃剂量为25.0g/kg)和lcm+gst(乙醇慢性造模后基础方补肾固冲汤治疗组，实验小鼠的口服灌胃剂量为25.0g/kg)、mx处理sam+mx(乙醇急性造模后本发明提供的药物治疗组，实验小鼠的口服灌胃剂量为25.0g/kg)和lcm+mx(乙醇慢性造模后本发明提供的药物治疗组，实验小鼠的口服灌胃剂量为25.0g/kg)并观察12天(每组10只)。期间观察实验动物临床症状。实验
结束后，处死实验动物，收集各组妊娠小鼠子宫和卵巢后观察胚胎着床数量，并收集各组实验动物的主要脏器用于组织形态学观察。数据采用spss 13.0软件(spss inc.，chicago,il,usa)进行统计分析，以平均数
±
sd/sem表示。
75.4.2h&e染色
76.(1)动物实验结束后，收集主要脏器置于4％多聚甲醛(pfa)中固定保存，包埋前将组织冲水过夜，充分去除固定液；
77.(2)梯度乙醇和二甲苯脱水透明(控制时间，过长组织容易变脆)、石蜡包埋；
78.(3)对组织块进行冠状切片(4μm)，经漂片、摊片和烘片；
79.(4)将石蜡切片置于切片架中于60℃中烘片2h，进行切片的脱蜡处理，分2次置于二甲苯中各10min，梯度乙醇100％、95％、80％、70％各2min，蒸馏水洗3次，每次5min；
80.(5)进行苏木素染色，显微镜下观察细胞核染色情况，适时将切片置于自来水中终止染色，确定染色时间，每张切片都以此为标准进行染色；
81.(6)自来水冲洗返蓝10min；
82.(7)进行伊红染色，显微镜下观察细胞质染色情况，适时将切片置于自来水中终止染色，确定染色时间，每张切片都以此为标准进行染色；
83.(8)自来水冲洗3min；
84.(9)梯度乙醇洗脱，80％乙醇，5min；95％乙醇，5min；100％乙醇，5min；二甲苯脱水透明，5min；中性树胶封片；
85.(10)封片完成后将切片置于显微镜下拍照，分析统计结果。
86.4.3免疫组化染色
87.(1)动物实验结束后，收集主要脏器置于4％多聚甲醛(pfa)中固定，包埋前将组织冲水过夜，充分去除固定液；
88.(2)梯度乙醇和二甲苯脱水透明(控制时间，过长组织容易变脆)、石蜡包埋；
89.(3)对组织块进行冠状切片(4μm)，经漂片、摊片和烘片；
90.(4)将切片置于切片架中于60℃中烘片2h，进行石蜡切片的脱蜡处理，依次置于二甲苯i、ii各10min，梯度乙醇100％、95％、80％、70％各2min，蒸馏水洗3次，每次5min；
91.(5)将3％过氧化氢(h2o2)溶液滴与组织切片上封闭内源性过氧化物酶，并在湿盒中避光放置10min；
92.(6)将切片置于蒸馏水中洗3次后将切片置于抗原修复盒中加入枸橼酸钠缓冲液浸没，置于高压锅中煮沸(上汽3min)进行抗原修复处理；
93.(7)取出抗原修复盒，待切片自然冷却后，将切片置于pbs中洗3次，再将切片置于0.1％tritonx
‑
100中，摇床慢摇震荡15min，pbs中再冲洗3次，每次5min；
94.(8)将切片置于5％脱脂牛奶中，37℃孵箱中封闭40min；
95.(9)取出切片后，不用pbs洗脱直接应用滤纸吸去脱脂牛奶，滴加相应一抗(anti
‑
vimentin，1：500稀释，elabscience，中国，武汉)，于湿盒内4℃冰箱避光孵育过夜；
96.(10)次日，从4℃冰箱取出湿盒置于室温30min，待切片恢复至室温，应用pbs洗3次，每次5min；
97.(11)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1％bsa
‑
pbs稀释)，37℃孵育10
‑
30min，应用pbs洗3次，每次5min；
98.(12)滴加适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(pbs稀释)，37℃孵育10
‑
30min，应用pbs洗3次，每次5min；
99.(13)显色剂显色(dab)。将切片置于显微镜下观察染色时间，自来水终止显色；
100.(14)苏木素染色细胞核，将切片置于显微镜下观察染色时间，自来水终止显色，自来水充分冲洗返蓝；
101.(15)梯度乙醇洗脱，80％乙醇，5min；95％乙醇，5min；100％乙醇，5min；二甲苯脱水透明，5min，中性树胶封片；
102.(16)将封片完毕的切片置于显微镜下拍照，分析统计结果。
103.4.4实验结果
104.4.4.1h&e染色
105.结果如图5a所示，乙醇灌注进行急性或慢性造模后，小鼠子宫内膜严重受损脱落，连续给予模型小鼠本发明提供的药物进行治疗至实验终点，显著改善了乙醇引起的子宫内膜损伤，表明本发明提供的药物可修复模型动物损伤的子宫内膜。
106.4.4.2免疫组化染色
107.结果如图5b所示，乙醇短期急性和长期慢性造模可显著降低vimentin在小鼠子宫组织细胞中的表达量，vimentin作为增殖相关标志物，可以反映细胞有丝分裂快慢；与模型组和基础方补肾固冲汤组比较，使用本发明提供的药物治疗后，vimentin表达量有所恢复，表明本发明提供的药物在动物体内具有促进子宫内膜细胞增殖和血管新生的作用。
108.以上结果显示，本发明提供的药物具有促进细胞增殖、改善米非司酮所致小鼠着床障碍、修复乙醇致子宫内膜损伤的作用。
109.5、临床实验
110.5.1对266个患有薄型子宫内膜症的年龄在25岁至40岁育龄妇女的临床观察与检测结果发现，于患者每个月的月经干净后连续使用本发明提供的药物治疗3
‑
4个疗程，10天为一个疗程，有效率达到约90％以上。
111.5.2子宫内膜厚度统计
112.对266个患有薄型子宫内膜症的年龄在25岁
‑
40岁育龄妇女的临床观察与检测结果发现，使用本发明提供的药物治疗一个疗程(于每个月的月经干净后连续使用10天，计算为一个疗程)后，子宫内膜厚度在排卵期月经后14天由原来的5mm增长至6mm，一个疗程增长1mm，一般3至4个疗程即可使得子宫内膜增厚康复至8
‑
10mm。
113.5.3增强卵泡张力及恢复卵泡发育统计
114.对266个患有薄型子宫内膜伴有卵泡张力不足及发育迟缓症的年龄在25岁
‑
40岁育龄妇女的临床检测结果发现，使用本发明提供的药物3
‑
4个疗程(于每个月的月经干净后连续使用10天，计为一个疗程)后，卵泡张力明显增强，卵泡发育由原来的不足10mm增长至19mm
‑
20mm，助力卵泡发育和成功受孕。
115.以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。