一种复活草发酵提取液、制备方法、应用与流程

1.本发明涉及化妆品领域，具体是一种复活草发酵提取液、制备方法、应用。


背景技术：

2.复活草，中文学名卷柏，又称为九死还魂草、万年青、石莲花等。复活草的根托只生于茎的基部，根多分叉，主茎自中部开始羽状分枝或不等二叉分枝。作为一种沙漠植物，复活草中的化学成分主要有黄酮类、炔酚类、生物碱、糖苷类等，因此，具有良好的抗氧化、抗菌、降血糖等作用。
3.目前，在现有技术对复活草中的活性成分的提取方式主要为热水提法、有机试剂提取法等。但是，现有这些方法耗费大量有机试剂，在实际应用中能耗大，成本高，并且在提取的过程中，容易造成活性成分损失，降低复活草提取液的有效成分含量与作用，进而导致提取效率低下。
4.因此，以上技术方案在实际使用时存在以下不足：现有技术中的复活草提取方式大部分存在能耗大，成本高，提取效率低的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种复活草发酵提取液，以解决上述背景技术中提出的现有技术中的复活草提取方式大多存在能耗大、成本高、提取效率低的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种复活草发酵提取液，其是以复活草发酵培养基为原料，通过接入酿酒酵母对所述复活草发酵培养基分别进行有氧发酵与无氧发酵后制得；其中，所述复活草发酵培养基包括以下的原料：复活草粉、蛋白粉、葡萄糖、水。
8.需要说明的是，现有技术对复活草中的活性成分的提取方式主要为热水提法、有机试剂提取法等，不仅会耗费大量有机试剂，在实际应用中能耗大，成本高，并且在提取的过程中容易造成活性成分损失，导致提取效率低下。在本发明实施例中，通过利用酿酒酵母对复活草进行发酵，得到一种复活草发酵提取液，该复活草发酵提取液可直接作为化妆品或者作为添加剂加入到化妆品中，具有抗氧化、抑菌等作用。而且，发酵提取法作为一种提取植物活性成分的有效手段，在提取过程中，能耗小，污染少，成本低，并且最终的复活草发酵提取液中的活性成分含量高，且在提取过程中不仅不会对活性成分造成损伤，微生物还会在发酵过程中，利用植物中的活性成分进行生长，代谢出新的活性成分，从而多方面增强最终的复活草发酵提取液的功效。
9.本发明实施例的另一目的在于提供一种所述复活草发酵提取液的制备方法，具体包括以下步骤：
10.将复活草发酵培养基中接入酿酒酵母进行有氧发酵，然后再进行无氧发酵，灭菌后进行静置冷却，离心除去沉淀，得到所述复活草发酵提取液。
11.本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述的复活草发酵提取液的制备方
法制备得到的复活草发酵提取液。
12.本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的复活草发酵提取液在制备化妆品和/或护肤品中的应用。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
14.本发明提供的复活草发酵提取液相对于常规的复活草提取液具有更高的活性物质含量以及更强的抗氧化活性，通过利用酿酒酵母对复活草发酵培养基一次进行有氧发酵和无氧发酵，得到的复活草发酵提取液可以直接作为化妆品使用，也可以作为添加剂添加到化妆品中，由于在发酵过程中未添加任何有机试剂，发酵条件温和，所得到的复活草发酵提取液具有更高的安全性，不会对皮肤造成刺激，解决了现有技术中的复活草提取方式大多存在能耗大、成本高、提取效率低的问题，具有广阔的应用前景。
附图说明
15.图1为本发明一实施例提供的dpph自由基清除实验结果图。
具体实施方式
16.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
17.本发明实施例提供的一种复活草发酵提取液，所述复活草发酵提取液是以复活草发酵培养基为原料，通过接入酿酒酵母对所述复活草发酵培养基分别进行有氧发酵与无氧发酵后制得；其中，所述复活草发酵培养基包括以下的原料：复活草粉、蛋白粉、葡萄糖、水。
18.作为本发明的另一优选实施例，所述水可以是选自纯净水、矿泉水、蒸馏水、去离子水或软水中的任意一种，这里并不作限定，可以根据需要进行选择。
19.优选的，所述水是去离子水。
20.作为本发明的另一优选实施例，所述复活草发酵培养基是将复活草粉、蛋白粉、葡萄糖加水混合后再进行灭菌制得。
21.作为本发明的另一优选实施例，在制备所述复活草发酵培养基时，所述灭菌是进行高压湿热灭菌，具体的灭菌温度为105-125℃，灭菌时间为10min-40min。
22.作为本发明的另一优选实施例，所述复活草发酵培养基包括以下按照重量份的原料：复活草粉3-30份、蛋白粉0.3-6份、葡萄糖1.5-15份、水250-350份。
23.作为本发明的另一优选实施例，所述复活草粉是将复活草进行干燥粉碎至40-200目即可。
24.优选的，所述复活草发酵培养基的制备方法是：
25.将复活草烘干后粉碎至40-200目，得到复活草粉，称取3-30克复活草粉，加入1.5-15克葡萄糖、0.3-6克蛋白粉、300克去离子水，搅拌均匀，置于500毫升的三角瓶中，用封口膜封口后，进行高压湿热灭菌，灭菌温度为105-125℃，灭菌时间为10-40min；灭菌完成后，静置至常温，即得到复活草发酵培养基。
26.作为本发明的另一优选实施例，所述酿酒酵母菌包括啤酒酵母、红酒酵母、黄酒酵
母、清酒酵母等酵母菌中的任意一种。
27.在本发明实施例中，通过利用酿酒酵母对复活草发酵培养基一次进行有氧发酵和无氧发酵，得到的复活草发酵提取液具有更高的活性物质含量以及更强的抗氧化活性，可以直接作为化妆品使用，也可以作为添加剂添加到化妆品中。
28.本发明实施例还提供一种所述复活草发酵提取液的制备方法，具体包括以下步骤：
29.将复活草发酵培养基中接入酿酒酵母进行有氧发酵，然后再进行无氧发酵，灭菌后进行静置冷却，离心除去沉淀，得到所述复活草发酵提取液。
30.作为本发明的另一优选实施例，在所述的复活草发酵提取液的制备方法中，还包括在离心除去沉淀后加入防腐剂进行混合均匀的步骤。所述防腐剂可以是现有技术中的可用于化妆品的防腐剂，具体根据需求进行选择，这里并不作赘述。当然，防腐剂的具体用量根据需求进行选择，也可以不加入防腐剂而进行直接作为化妆品使用。
31.作为本发明的另一优选实施例，在所述的复活草发酵提取液的制备方法中，所述灭菌的灭菌温度为60-100℃，灭菌时间为30min-120min。
32.作为本发明的另一优选实施例，所述将复活草发酵培养基中接入酿酒酵母进行有氧发酵时的接菌量是1wt％-20wt％，即在复活草发酵培养基中接入1wt％-20wt％的复活草发酵培养基重量的酿酒酵母，而且，所述酿酒酵母的菌液浓度为10
4-109cfu/ml。
33.作为本发明的另一优选实施例，在所述的复活草发酵提取液的制备方法中，所述有氧发酵是在20℃-35℃进行恒温震荡并发酵培养4-48h。
34.作为本发明的另一优选实施例，所述恒温震荡的转速是100r/min-200r/min，具体的，所述有氧发酵是置于恒温震荡培养箱中培养4-48h，培养温度为20-35℃，培养箱转速为100-200r/min。此阶段即为有氧发酵阶段。
35.作为本发明的另一优选实施例，所述无氧发酵是在20℃-35℃进行发酵培养24-120h。具体是移至恒温培养箱中进行无氧发酵，培养温度为20-35℃，培养时间为24-120h。
36.作为本发明的另一优选实施例，在所述的复活草发酵提取液的制备方法中，所述离心的转速是2000r/min-10000r/min，离心的时间是5min-40min。
37.优选的，所述的复活草发酵提取液的制备方法包括以下步骤：
38.(1)向复活草发酵培养基中接入酿酒酵母，菌液浓度为10
4-109cfu/ml，接菌量为1％-20％。接菌完成后，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中培养4-48h，培养温度为20-35℃，培养箱转速为100-200r/min。此阶段即为有氧发酵阶段。
39.(2)有氧发酵阶段完成后，将三角瓶移至恒温培养箱中，进行无氧发酵，培养温度为20-35℃，培养时间为24-120h。
40.(3)无氧发酵完成后，将三角瓶进行灭菌，灭菌温度为60-100℃，灭菌时间为30-120min。灭菌完成后，静置冷却后离心，离心转速为2000-10000r/min，离心时间为5-40min。将上清液过滤，即为复活草发酵提取液。将得到的复活草发酵提取液进行防腐或者添加到化妆品中，即为复活草发酵化妆品，也为本发明所保护的范围。
41.本发明实施例还提供一种采用上述的复活草发酵提取液的制备方法制备得到的复活草发酵提取液。
42.本发明实施例还提供一种上述的复活草发酵提取液在制备化妆品和/或护肤品中
的应用。
43.以下通过列举具体实施例对本发明的复活草发酵提取液的技术效果做进一步的说明。
44.实施例1
45.一种复活草发酵提取液，其制备方法具体包括以下步骤：
46.将复活草烘干后粉碎至100目，得到复活草粉，称取15克复活草粉，加入6克葡萄糖、3克蛋白粉、300克去离子水，搅拌均匀，置于500毫升的三角瓶中，用封口膜封口后，进行高压湿热灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min。灭菌完成后，静置至常温后接入酿酒酵母，菌液浓度为107cfu/ml，接菌量为5wt％。接菌完成后，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中进行有氧发酵培养24h，培养温度为28℃，培养箱转速为160r/min。有氧发酵阶段完成后，将三角瓶移至恒温培养箱中，进行无氧发酵，培养温度为25℃，培养时间为72h。无氧发酵完成后，将三角瓶进行灭菌，灭菌温度为80℃，灭菌时间为40min。灭菌完成后，静置冷却后离心，离心转速为5000r/min，离心时间为30min。将上清液过滤，即为复活草发酵提取液。
47.实施例2
48.一种复活草发酵提取液，是以复活草发酵培养基为原料，通过接入酿酒酵母对所述复活草发酵培养基分别进行有氧发酵与无氧发酵后制得；其中，所述复活草发酵培养基包括以下的原料：复活草粉3克、蛋白粉0.3克、葡萄糖1.5克、去离子水250克。所述复活草发酵培养基是将复活草粉、蛋白粉、葡萄糖加水混合后再进行进行高压湿热灭菌制得，具体的灭菌温度为105℃，灭菌时间为10min。所述酿酒酵母是啤酒酵母。
49.在本发明实施例中，所述复活草发酵提取液的制备方法，具体包括以下步骤：
50.将所述复活草发酵培养基中接入酿酒酵母(接菌量是1wt％)，置于恒温震荡培养箱中培养4h，培养温度为20℃，培养箱转速为100r/min；有氧发酵阶段完成后，移至恒温培养箱中进行无氧发酵，培养温度为20℃，培养时间为24h；无氧发酵完成后进行灭菌，灭菌温度为60℃，灭菌时间为30min。灭菌完成后，静置冷却后离心，离心转速为2000r/min，离心时间为40min。将上清液过滤，得到所述复活草发酵提取液。
51.实施例3
52.一种复活草发酵提取液，是以复活草发酵培养基为原料，通过接入酿酒酵母对所述复活草发酵培养基分别进行有氧发酵与无氧发酵后制得；其中，所述复活草发酵培养基包括以下的原料：复活草粉30克、蛋白粉6克、葡萄糖15克、去离子水350克。所述复活草发酵培养基是将复活草粉、蛋白粉、葡萄糖加水混合后再进行进行高压湿热灭菌制得，具体的灭菌温度为125℃，灭菌时间为40min。所述酿酒酵母是啤酒酵母。
53.在本发明实施例中，所述复活草发酵提取液的制备方法，具体包括以下步骤：
54.将所述复活草发酵培养基中接入酿酒酵母(接菌量是20wt％)，置于恒温震荡培养箱中培养48h，培养温度为35℃，培养箱转速为200r/min；有氧发酵阶段完成后，移至恒温培养箱中进行无氧发酵，培养温度为35℃，培养时间为120h；无氧发酵完成后进行灭菌，灭菌温度为100℃，灭菌时间为120min。灭菌完成后，静置冷却后离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min。将上清液过滤，得到所述复活草发酵提取液。
55.实施例4
56.一种复活草发酵提取液，是以复活草发酵培养基为原料，通过接入酿酒酵母对所
述复活草发酵培养基分别进行有氧发酵与无氧发酵后制得；其中，所述复活草发酵培养基包括以下的原料：复活草粉20克、蛋白粉2克、葡萄糖5克、去离子水280克。所述复活草发酵培养基是将复活草粉、蛋白粉、葡萄糖加水混合后再进行进行高压湿热灭菌制得，具体的灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min。所述酿酒酵母是啤酒酵母。
57.在本发明实施例中，所述复活草发酵提取液的制备方法与实施例2相同。
58.实施例5
59.一种复活草发酵提取液，是以复活草发酵培养基为原料，通过接入酿酒酵母对所述复活草发酵培养基分别进行有氧发酵与无氧发酵后制得；其中，所述复活草发酵培养基包括以下的原料：复活草粉15克、蛋白粉4克、葡萄糖8克、去离子水300克。所述复活草发酵培养基是将复活草粉、蛋白粉、葡萄糖加水混合后再进行进行高压湿热灭菌制得，具体的灭菌温度为115℃，灭菌时间为25min。所述酿酒酵母是啤酒酵母。
60.在本发明实施例中，所述复活草发酵提取液的制备方法，具体包括以下步骤：
61.将所述复活草发酵培养基中接入酿酒酵母(接菌量是10wt％)，置于恒温震荡培养箱中培养20h，培养温度为28℃，培养箱转速为150r/min；有氧发酵阶段完成后，移至恒温培养箱中进行无氧发酵，培养温度为28℃，培养时间为80h；无氧发酵完成后进行灭菌，灭菌温度为80℃，灭菌时间为90min。灭菌完成后，静置冷却后离心，离心转速为6000r/min，离心时间为20min。将上清液过滤，得到所述复活草发酵提取液。
62.实施例6
63.与实施例2相比，除了所述酿酒酵母菌是啤酒酵母、红酒酵母、黄酒酵母、清酒酵母等重量混合后进行使用外，其他与实施例2相同。
64.实施例7
65.与实施例2相比，除了所述酿酒酵母菌是红酒酵母外，其他与实施例2相同。
66.实施例8
67.与实施例2相比，除了所述酿酒酵母菌是黄酒酵母外，其他与实施例2相同。
68.实施例9
69.与实施例2相比，除了所述酿酒酵母菌是清酒酵母外，其他与实施例2相同。
70.实施例10
71.与实施例1相比，除了复活草粉的粒径是40目外，其他与实施例1相同。
72.实施例11
73.与实施例1相比，除了复活草粉的粒径是80目外，其他与实施例1相同。
74.实施例12
75.与实施例1相比，除了复活草粉的粒径是200目外，其他与实施例1相同。
76.实施例13
77.与实施例1相比，除了是将去离子水替换为纯净水外，其他与实施例1相同。
78.实施例14
79.与实施例1相比，除了是将去离子水替换为矿泉水外，其他与实施例1相同。
80.实施例15
81.与实施例1相比，除了是将去离子水替换为软水外，其他与实施例1相同。
82.实施例16
83.与实施例1相比，除了接入酿酒酵母进行有氧发酵时的接菌量是4wt％，且酿酒酵母的菌液浓度为104cfu/ml外，其他与实施例1相同。
84.实施例17
85.与实施例1相比，除了接入酿酒酵母进行有氧发酵时的接菌量是12wt％，且酿酒酵母的菌液浓度为106cfu/ml外，其他与实施例1相同。
86.实施例18
87.与实施例1相比，除了接入酿酒酵母进行有氧发酵时的接菌量是20wt％，且酿酒酵母的菌液浓度为109cfu/ml外，其他与实施例1相同。
88.实施例19
89.一种复活草发酵化妆品，其制备方法具体包括以下步骤：
90.(1)将复活草烘干后粉碎至40-200目，得到复活草粉，称取3-30克复活草粉，加入1.5-15克葡萄糖、0.3-6克蛋白粉、300克去离子水，搅拌均匀，置于500毫升的三角瓶中，用封口膜封口后，进行高压湿热灭菌，灭菌温度为105-125℃，灭菌时间为10-40min；灭菌完成后，静置至常温，即得到复活草发酵培养基。
91.(2)在步骤(1)中得到的复活草发酵培养基中接入酿酒酵母，菌液浓度为10
4-109cfu/ml，接菌量为1％-20％。接菌完成后，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中培养4-48h，培养温度为20-35℃，培养箱转速为100-200r/min。此阶段即为有氧发酵阶段。
92.(3)在步骤(2)的有氧发酵阶段完成后，将三角瓶移至恒温培养箱中，进行无氧发酵，培养温度为20-35℃，培养时间为24-120h。
93.(4)在步骤(3)的无氧发酵完成后，将三角瓶进行灭菌，灭菌温度为60-100℃，灭菌时间为30-120min。灭菌完成后，静置冷却后离心，离心转速为2000-10000r/min，离心时间为5-40min。将上清液过滤，即为复活草发酵提取液。将得到的复活草发酵提取液进行防腐或者添加到化妆品中，即为复活草发酵化妆品。
94.一：复活草发酵提取液的抗氧化性能检测
95.dpph是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，dpph的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对dpph自由基的清除效果。
96.取不同量的实施例1制备得到的复活草发酵提取液溶于去离子水中，制得体积百分浓度为20％、40％、60％、80％、100％、的一系列待测液，以维生素c为阳性对照。
97.dpph自由基清除实验的具体实验步骤为：
98.(1)取等体积(3ml)的待测液与2
×
10-4
mol/l的dpph溶液混匀(a1管)；
99.(2)取等体积(3ml)的无水乙醇(待测物溶剂)与2
×
10-4
mol/l的dpph溶液混匀(a2管)；
100.(3)取等体积(3ml)的无水乙醇与待测液混匀(a3管)；
101.(4)反应30min后，在517nm下测a1管、a2管、a3管吸光度值。
102.清除率计算公式为：清除率(％)＝[(a2+a3)-a1]/a2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0103]
以待测液的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作dpph自由基清除作用曲线，其中，a：不同浓度的复活草发酵提取液，b：维生素c(1mg/ml)。
[0104]
由图1可知，实施例1所得复活草发酵提取液的清除dpph自由基的ic50为70.71％，说明复活草发酵提取液具有很强的抗氧化能力。
[0105]
二：复活草发酵提取液的安全性检测
[0106]
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1中获得的复活草发酵提取液进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
[0107]
1、试验对象
[0108]
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
[0109]
2、试验方法
[0110]
将液体样品0.2ml到0.025ml滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油(本实施例采用蒸馏水)。
[0111]
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
[0112]
3、试验结果
[0113]
斑贴试验结果如表1所示，表1中各符号表示的含义如下："-"＝阴性反应；"
±
"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。
[0114]
表1实施例1获得的复活草发酵提取液的斑贴试验结果
[0115]
[0116][0117]
从表1中可以看出：实施例1得到的复活草发酵提取液未产生可疑反应，说明本发明提供的复活草发酵提取液均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
[0118]
需要说明的是，本发明针对现有技术对复活草中活性成分提取效率低、成分高，能耗大等缺点，利用酿酒酵母对复活草进行发酵，得到复活草发酵提取液，相对于常规的复活草提取液，该复活草发酵提取液具有更高的活性物质含量以及更强的抗氧化活性。在发酵过程中，未添加任何有机试剂，发酵条件温和，所得到的复活草发酵提取液具有更高的安全性，不会对皮肤造成刺激，该提取液可直接作为化妆品或者作为添加剂加入到化妆品中，具有抗氧化、抑菌等作用。
[0119]
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。