钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体为钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用。


背景技术：

2.骨是由钙和磷酸盐结晶形成的有机蛋白基质与无机羟基磷灰石组成，通过成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收形成来进行修复，然而，形成和吸收之间的不平衡会导致许多疾病，包括类风湿关节炎、牙周炎和骨科植入物的无菌性松动。
3.绝经后骨质疏松症(pmo)是一种常见的骨疾病，以骨过度吸收为特征，破坏老年妇女骨平衡，目前，许多抗骨质疏松的药物对骨骼健康有积极作用，但往往伴随严重的副作用，如双膦酸盐导致的颌骨骨坏死和降钙素增加的肝癌风险，故而提出钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用来解决上述所提出的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于利用细胞培养、实时荧光定量pcr、细胞存活实验、trap染色、骨板吸收实验、蛋白免疫印迹实验以及卵巢切除引起的小鼠骨质疏松模型、h&e和trap染色以及micro-ct扫描等技术，证明钩吻素子在体外的作用机制和对小鼠卵巢切除所致骨丢失的保护作用，对未来发展骨质疏松药物有潜在价值。
5.本发明的第一方面，钩吻素子在抑制骨质疏松药物中的应用。
6.进一步的，本发明提供钩吻素子在抑制骨质疏松保健品中的应用。
7.进一步的，本发明钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用，所述钩吻素子通过抑制rankl诱导的破骨细胞形成来防止小鼠卵巢切除引起的骨丢失。
8.进一步的，所述钩吻素子通过抑制il-6和tnf-α的表达而显著缓解骨性关节炎和类风湿性关节炎的症状。
9.进一步的，所述钩吻素子具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用。
10.抑制骨质疏松药物，有效成分为钩吻素子。
11.抑制骨质疏松保健品中，有效成分为钩吻素子。
12.以钩吻素子为有效成分的抑制骨质疏松产品还可以制成各种制剂，包含但不限于片剂、胶囊、颗粒剂、注射液和冻干粉等。
13.本发明的有益效果在于：本发明利用了细胞培养、实时荧光定量pcr、细胞存活实验、trap染色、骨板吸收实验、蛋白免疫印迹实验以及卵巢切除引起的小鼠骨质疏松模型、h&e和trap染色以及micro-ct扫描等技术探讨了体外的作用机制和对小鼠卵巢切除所致骨丢失的保护作用，结果表明，钩吻素子对破骨细胞分化和功能的抑制作用，以及钩吻素子在体外的作用机制和对小鼠卵巢切除所致骨丢失的保护作用，对未来发展骨质疏松药物有潜在价值。
附图说明
14.图1中(a)钩吻素子的化学结构，(b)(c)不同浓度钩吻素子对破骨细胞的毒性；
15.图2中(a)随着浓度的增加钩吻素子对破骨细胞的抑制作用增强，(b)不同浓度钩吻素子下trap阳性细胞数量明显减少，(c)(d)不同浓度钩吻素子下trap阳性细胞面积和数量均小于对照组；
16.图3中(a)鬼笔环肽和dapi染色下破骨细胞核数量和f-action环面积(b)随着钩吻素子浓度的增加，细胞核数量减少，f-action环面积减少(c)成熟破骨细胞培养于不同浓度钩吻素子羟基磷灰石的培养板示意图，(d)钩吻素子降低了羟基磷灰石涂层板表面单位面积吸收坑的百分比；
17.图4钩吻素子以剂量依赖的方式显著抑制trap、v-atpase-d2和nfatc1基因的表达；
18.图5rankl刺激(100ng/ml)60分钟rankl诱导早期信号事件；
19.图6胫骨三维重建证实与ovx组相比，钩吻素子治疗组骨小梁丢失较少；
20.图7h&e和trap染色的胫骨切片分析图。
具体实施方式
21.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实施例一：
23.1实验材料来源
24.钩吻素子(hplc≥98％)从上海源叶生物技术有限公司购买，α-mem和血清(fbs)是从赛默飞(thermo fisher scientific)购买，rankl和m-csf从r&d systems购买，trap染色试剂盒从浙江中技生物股份有限公司购买，pcr引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计并合成，细胞骨架染色剂即phalloidin-ifluor 488reagent(ab176753)从英国abcam(cambridge,uk)公司购买，prime script rt master mix(#rr036a)和tb green premix ex taq(rr420a)从日本takara bio inc(shiga prefecture,japan)公司购买。
25.2实验方法
26.2.1细胞培养
27.取4～6周龄c57bl/6小鼠，脱颈椎处死，无菌分离双侧胫骨和股骨；用无血清α-mem培养基冲洗无菌腔至发白，吹散细胞团；移入75平方厘米的培养瓶在37℃培养箱中培养，所用的α-mem培养基中含有10％的血清(fbs)，青霉素和链霉素的1％抗生素混合物，100ng/ml的m-csf，经过4天的培养之后便获得了破骨细胞。
28.2.2细胞活力测定
29.为了探究钩吻素子对bmms的毒性情况，用细胞计数试剂盒(cck-8)测定不同浓度钩吻素子对bmms的存活率的影响，用完全α-mem(含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素抗生素混合物和m-csf(100ng/ml))，将bmms接种到96孔板中，每孔密度为8000个细胞)，培养24小时后，更换培养基并在培养基中加入不同浓度的钩吻素子(0,3.125,6.25,12.5,25,50和
100μm)，每两天更换一次培养基，细胞孵育96小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤，在此基础上，在每孔中加入10μl的cck-8试剂盒溶液，在37℃下孵育4小时，用elx800吸光度微板阅读器(bio-tek，winooski，vt)测量450nm处的吸光度。
30.2.3破骨细胞形成和trap染色
31.用完全α-mem培养基(含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素)和m-csf(100ng/ml)和rankl(100ng/ml)，用含或不含各个不同浓度钩吻素子的培养基培养细胞，将bmms接种于96孔板(5000个细胞/孔)中，培养5天后形成破骨细胞，每2天更换一次培养基，用pbs洗涤，用4％多聚甲醛(pfa)固定20分钟，加入染色液在37摄氏度培养箱孵育1小时后在光学显微镜下计数，被染色的3个以上细胞核的细胞为trap阳性细胞，除此之外，我们还研究了钩吻素子对破骨细胞分化的时间依赖性的抑制作用，用rankl刺激的bmms分别在第1天(day1-day6)、第3天(day3-day6)、第5天(day5-day6)和第6天加入钩吻素子，根据上述实验程序对细胞进行trap染色，然后观察破骨细胞的大小。
32.2.4肌动蛋白环免疫荧光
33.将bmms接种于含有不同浓度钩吻素子的96孔板中，完全α-mem培养基(含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素)和m-csf(100ng/ml)和rankl(100ng/ml)，培养5天后，用pbs洗涤培养细胞，用4％多聚甲醛(pfa)固定20分钟，用pbs洗涤三次，用phalloidin染色肌动蛋白环，用dapi染色细胞核，用荧光显微镜观察实验结果。
34.2.5破骨细胞骨吸收功能鉴定
35.用m-csf(100ng/ml)和rankl(100ng/ml)在6孔板中播种4天，将细胞分离后在羟基磷灰石包覆的96孔板上培养，培养基中加入不同浓度的钩吻素子，48小时后，细胞被移除，并在光镜下检测吸收坑，用光学显微镜观察骨吸收面积并用image j软件测量羟基磷灰石吸收面积。
36.2.6rna提取和real-time qpcr
37.破骨细胞在没有或存在不同浓度的钩吻素子的情况下，用100ng/ml m-csf和100ng/ml rankl培养7天后，总rna按说明书用trizol reagent(thermo fisher scientific)提取，用1mg提取的由rna逆转录合成的cdna用作后续real-time qpcr反应的模板，在含有tb green premix ex taq、cdna和正向和反向引物的反应混合物中，在qtower real-time pcr thermal cycler(analytik jena,ena,germany)上进行real-time pcr，反应条件为95℃，3min；循环40次95℃，10s；60℃，20s，and72℃，20s；最后一个扩展步骤在72℃下延伸20秒。
38.rt-pcr引物见下表格
39.nfatc1 forward:5
′‑
ca acgccctgaccaccgatag-3
′
40.reverse:5
′
ggctgccttccgtctcatagt-3
′
41.ctsk forward:5
’‑
gggagaaaaacctgaagc-3’42.reverse:5
’‑
attctggggactcagagc-3’43.trap forward:5
′‑
tcctggctcaaaaagcagtt-3
′
44.reverse:5
′‑
acatagcccacaccgttctc-3
′
45.v-atpase-d2 forward:5
′‑
gtgagaccttggaagacctgaa-3
′
46.reverse:5
′‑
gagaaatgtgctcaggggct-3
′
47.gadph forward:5
′‑
acccagaagactgtggatgg-3
′
48.reverse:5
′‑
cacattgggggtaggaacac-3
′
49.免疫印迹检测蛋白表达
50.为了探究钩吻素子影响破骨细胞形成的机制，将bmmss接种到四孔完全培养基的六孔板中，24小时后，更换无血清培养基并使细胞饥饿2小时，在钩吻素子(100μm)的情况下，对第二和第四组进行2小时的预处理，使用rankl(100ng/ml)刺激第三和第四组30分钟，弃去培养基并用pbs洗涤3次，加入150μm含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，并通过离心获得蛋白质上清液，并在100℃下向蛋白质溶液中加入5
×
sds上样缓冲液10分钟，对于蛋白质印迹，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离蛋白质裂解液，然后将其转移至硝酸纤维素膜上的trans-blot turbo转移系统(bio-rad laboratories，hercules，ca，美国)，将膜用5％bsa封闭1小时，然后用tbst(含有0.1％tween 20的tris缓冲盐水)洗涤3次，将膜与特异性一抗(1：1,000稀释度)在4℃孵育12h，与适当的荧光标记的二抗(irdye；1：1,000稀释度)在室温下孵育1小时，使用bioradchemidocmp凝胶成像系统(美国加利福尼亚的bio-rad实验室)来可视化蛋白质条带，并使用imagej软件基于灰度印迹计算相对蛋白质表达。
51.小鼠卵巢切除(ovx)诱导骨丢失模型
52.二十只8周大的雌性c57bl/6小鼠，平均20g，购自中国科学院动物中心，上海，中国，随机分为4组(n＝每组5只)分别命名为sham组，ovx组，ovx+1mg/kg钩吻素子(low)和ovx+10mg/kg钩吻素子(high)，除假手术组外，各组动物均双侧去除卵巢，手术后，小鼠可以休息一周以恢复，然后，ovx+1mg/kg钩吻素子(low)和ovx+10mg/kg钩吻素子(high)分别进行给药，假手术组、ovx组小鼠腹腔注射相同体积的pbs，最后处死所有动物，切除并处理其胫骨，进行微断层扫描(micro-ct)分析和组织学染色。
53.micro-ct扫描
54.收集每只小鼠左胫骨并固定在4％pfa中2天，然后用高分辨率micro-ct扫描它们，其等距分辨率为9μm，x射线能量设置为80kv和100μa，三维(3d)图像由skyscan nrecon program和skyscan ctan software(bruker,billerica,ma,usa)处理分析，在生长板下0.5mm方面积内对骨参数进行定量和定性分析，通过测量每组织体积的骨容量bv/tv、骨小梁数(tb.n)、骨小梁厚度(tb.th)和小tb.sp，对其进行了表征。
55.组织学鉴定
56.将胫骨固定在4％多聚甲醛中2天，在10％乙二胺四乙酸(edta)中脱钙2周，h&e和trap染色均由杭州顺联生物技术有限公司提供服务
57.实验结果
58.首先，钩吻素子的化学结构如图1a所示，采用cck-8法检测不同浓度钩吻素子对破骨细胞的毒性，结果表明对bmms无毒浓度在100μm以下(图1b-c)，然后选择几种不同浓度的钩吻素子(10,20和40μm)评价影响rankl引起的破骨细胞的形成，trap染色结果显示，随着钩吻素子浓度的增加，钩吻素子对破骨细胞的抑制作用增强(图2a)，与对照组相比，trap阳性多核破骨细胞(》3个细胞核)面积减少(图2b)，trap阳性细胞数量明显减少(图2b)，最后，结果表明钩吻素子在浓度低于40μm以剂量依赖性的方式抑制破骨细胞分化，为了找出钩吻素子主要抑制破骨细胞分化的哪一阶段，我们在三个不同的时间点将钩吻素子加入rankl
和mcsf处理的bmms培养中(图2a)。
59.结果表明，与d3-d6相比，d1-d3对破骨细胞的作用更明显，trap阳性细胞面积和数量均小于对照组(图2c和2d)，这些结果提示，在破骨细胞分化的早期，钩吻素子抑制破骨细胞的形成，选择几种不同浓度的钩吻素子(10,20和40μm)评价影响rankl引起的破骨细胞的形成，并通过鬼笔环肽和dapi染色，观察破骨细胞核数量和f-action环面积(图3a)，我们发现，随着钩吻素子浓度的增加，钩吻素子对破骨细胞的抑制作用增强，表现为细胞核数量减少，f-action环面积减少(图3b)，此外，将成熟破骨细胞培养于不同浓度钩吻素子羟基磷灰石的培养板上，观察钩吻素子是否能抑制破骨细胞功能(图3c)，我们发现，相对于对照，钩吻素子降低了羟基磷灰石涂层板表面单位面积吸收坑的百分比(图3d)，因此，钩吻素子以剂量依赖的方式抑制破骨细胞对骨吸收的影响。
60.钩吻素子抑制基因表达来调节破骨细胞分化、成熟和功能，我们研究了钩吻素子对破骨细胞基因表达的影响，我们使用rt-pcr来评估基因表达水平，bmms接种mcsf(50ng/ml)和rankl(25ng/ml)并加入各种不同浓度的钩吻素子，直至破骨细胞形成，钩吻素子以剂量依赖的方式显著抑制trap、v-atpase-d2和nfatc1基因的表达(图4)。
61.此外，我们还研究了钩吻素子对破骨细胞形成的抑制作用，我们用免疫印迹技术检测信号通路(图4)，细胞培养在有或没有钩吻素子(40μm)培养基中2小时，然后rankl刺激(100ng/ml)60分钟rankl诱导早期信号事件(图5)，如图5b所示，相对p-erk表达明显下降，提示钩吻素子抑制破骨细胞分化的主要信号通道为mapk/erk信号通道。
62.钩吻素子可以防止卵巢切除引起的小鼠骨质流失，研究钩吻素子对小鼠骨丢失的抑制作用，我们建立了一个ovx模型来模拟pmo，分析显示，与ovx组相比，钩吻素子治疗组骨小梁丢失较少，胫骨三维重建进一步证实了这一点(图6)，其次，形态测量分析显示随着药物浓度的升高，模型组小鼠的bv/tv、bmd、tb.n、tb.tn显著升高。
63.h&e和trap染色的胫骨切片的组织学分析证实，钩吻素子可防止小鼠卵巢切除引起的骨丢失(图7)，在trap染色中，钩吻素子处理后，trap阳性的多核破骨细胞数量减少，h&e染色进一步证实了钩吻素子对ovx诱导的骨丢失的保护作用，综上所述，我们的结果表明，钩吻素子可以预防卵巢切除引起的小鼠骨丢失。
64.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。