一种胆红素纳米颗粒及其制备和应用

本发明属于纳米药物技术领域的一种纳米颗粒及其制备和应用，具体涉及一种胆红素纳米颗粒及其制备和应用。

背景技术：

胆红素是存在于血红素代谢中的正常分解代谢产物。早在上世纪80年代，stocker等研究者就已经提出胆红素是一种具有生理意义的抗氧化剂，随着氧浓度的降低，胆红素的抗氧化能力提高，在相同的实验条件下，其抑制脂质过氧化能力甚至高于α-生育酚。近年来临床研究表明，胆红素水平与多种炎症疾病呈负相关，较高的胆红素水平对炎症疾病的发生发展具有显著的增益作用。现代研究表明，胆红素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，通过调控nf-κb、mapk信号通路和内质网应激等作用机制实现治疗作用。胆红素可促进炎症刺激损伤细胞的修复和再生，并显著降低血清中no和inos水平。值得注意的是，胆红素可直接清除ros，并转化为胆绿素，而胆绿素又可在胆绿素还原酶作用下再转化为胆红素，这也使得胆红素在较低浓度下即可实现有临床意义的细胞保护作用，避免了高浓度引起的毒副作用。

虽然胆红素有望通过调控氧化应激和炎症信号通路治疗炎症性疾病，但其自身溶解度低、稳定性差、半衰期段，普通注射剂策略无法满足其制剂化要求。

纳米药物递送系统可以有效增加药物的溶解度、提高稳定性，且可通过尺寸效应增加药物在炎症部位的蓄积，发挥药物治疗作用。有研究者将胆红素化学结合在聚乙二醇构成纳米粒子用于结肠炎的静脉注射药物治疗。但是peg化学修饰制备复杂，成本较高，形成的纳米结构稳定性较差，且peg的引入易诱发过敏反应，。另有研究者利用高分子聚合物，例如泊洛沙姆、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等用于构建胆红素纳米粒的纳米载体，提高其体内递送效率。但是这类人工合成的高分子材料，存在亲水性差、局部降解产生酸性产物等问题。近年来，天然生物材料例如丝素蛋白、透明质酸等用于胆红素的药物递送，具有良好的生物相容性，但天然生物材料也存在着重复性差，批次质量不稳定都潜在问题。

如何构建一种胆红素制剂，能最大限度地发挥纳米药物的优势，又能避免载体材料带来的潜在副作用，具有很大的创新价值和应用前景。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供一种胆红素单组分纳米颗粒及制备方法，通过纳米载体技术优势，用于炎症疾病治疗药物的制备。该胆红素纳米颗粒含有单一组分，实现载药量100％，性质稳定，并且可操作性强、成本低廉等优势。

本发明所采用的技术方案是：

一、一种胆红素纳米颗粒：

所述的纳米颗粒仅由胆红素作为单一组分自组装形成。

二、胆红素纳米颗粒的制备方法，方法如下：

1)将一定量的胆红素溶解到适宜的有机溶剂中，作为有机相；

2)配置具有一定ph范围的缓冲水溶液，作为水相；

3)将有机相缓慢滴入水相中，搅拌混合，得到混合液；

4)除去混合液中的有机溶剂，得到纳米颗粒溶液。

所述步骤1)中，有机溶剂为二甲基亚砜和乙醇中的一种或两种的混合。

所述步骤1)中，有机相中的胆红素浓度为0.2～2.0mg/ml。

所述步骤2)中的ph范围为6.8～10.6。

所述步骤2)中的缓冲水溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸盐缓冲液、tris缓冲液的一种或几种的混合。

所述步骤3)中的有机相和水相的体积比例在3:1～1:1。

本发明制备方法制成的胆红素纳米颗粒在制备药物传递系统中的应用。

在制备治疗炎症性疾病药物中的应用，所述的炎症性疾病具体为急性胰腺炎，类风湿性关节炎，糖尿病创面修复等，但不限于此。

在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。

本发明的优点和有益效果包括在于：

1)单组分构建纳米颗粒，避免了其他组分的引入，可以提高胆红素载药量；

2)纳米颗粒利用其纳米尺寸，提高其体内半衰期，有利于提高胆红素的生物利用度；

3)胆红素纳米颗粒具有炎症靶向性质，提高了递送效率；

4)纳米颗粒的制备工艺简单，可操作性强，重现性良好，产业化前景好；

5)胆红素纳米颗粒可以直接治疗炎症性疾病效果，也可作其他活性物质的纳米载体，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的胆红素纳米颗粒样品1的透射电镜图；

图2为本发明实施例1制备的胆红素纳米颗粒对巨噬细胞的抗炎作用情况图；

图2的(a)表示tnf-α的mrna表达水平，图2的(b)表示il-1β的mrna表达水平，图2的(c)表示tnf-α的il-6表达水平，图3为各组药物对类风湿性关节炎模型小鼠治疗后的关节炎指数值结果图；

图4为各组药物对类风湿性关节炎模型小鼠治疗后的脚掌厚度值结果图；

图5为各组药物对糖尿病小鼠创面修复治疗的愈合率结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

本发明的具体实施如下：

实施例1胆红素纳米颗粒的制备

根据表1，将一定量的胆红素溶解于2ml二甲基亚砜中形成有机相；缓冲水溶液作为水相；将有机相缓慢地滴入水相中，持续搅拌得到混合液；透析除去有机溶剂后得到胆红素纳米颗粒溶液。

取出胆红素纳米颗粒样品在透射电镜下观察结果如图1所示。

表1胆红素纳米颗粒的制备要点

实施例2胆红素纳米颗粒的性状表征

取实施例1中制备得到的样品，分别进行外观观察，对具有丁达尔效应的样品测定其粒径大小。记录结果见表2。并通过透射电子显微镜进行样品1的形态学检查，具体来说，将胆红素纳米颗粒稀释至适宜浓度后，滴于涂有碳膜的铜网上制备样品，然后在透射电镜下观察样品形态。取实施例1中制备得到的胆红素纳米颗粒(样品1-6)，在室温条件下放置3个月后，分别测定其粒径大小和包封率，结果见表2。

表2胆红素纳米颗粒的性状表征

本发明制备得到的胆红素纳米颗粒为球形，边缘平整光滑，粒径范围在160～200nm之间，表明在适宜的制备条件下，胆红素可成功制备单组分纳米颗粒，实验制备方法合理、简便。当胆红素的浓度过大或过小时，会导致胆红素纳米颗粒无法形成或无法稳定存在。当选取不适宜的有机溶剂会造成药物无法溶解、有机相和水相无法混合等使得实验失败。当水相中缓冲液的ph体系过低或过高时，都会导致胆红素无法自组装形成纳米结果。因此，按照提供的制备方法(参考样品1-6)可成功制备得到160～200nm之间的胆红素单组分纳米颗粒。

本发明制备得到的胆红素纳米克里里具有良好的储存稳定性，在室温放置1个月后，依然保持良好的纳米结构。

实施例3胆红素纳米颗粒对巨噬细胞的抗炎作用

将实施例1制得的胆红素纳米颗粒样品1-6或自由药物与被脂多糖激活的巨噬细胞共培养。48小时候后收集细胞，提取细胞rna，通过实时定量pcr的方法，对三个关键的炎症因子tnf-α，il-1β，il-6的表达进行检测。

由图2可知，与自由药物相比，本发明制得的胆红素纳米颗粒能够实现细胞层面的高效抗炎。

实施例4胆红素纳米颗粒对急性胰腺炎的抗炎治疗效果

采用腹部注射精氨酸法构建急性胰腺炎大鼠模型后，分别腹部注射生理盐水、胆红素溶液、胆红素纳米颗粒。24小时后，收集血清测定淀粉酶、脂肪酶水平及炎症因子水平(tnf-α，il-6)，收集胰腺组织进行常规h&e染色后双盲组织病理学评分。其中评分标准参照schmidt胰腺组织病理学评分标准(0～4分)，分数越高表示病理恶性程度越高。

表3胆红素纳米颗粒对急性胰腺炎的抗炎治疗效果

实验结果如表3所示。胆红素纳米颗粒的淀粉酶以及脂肪酶水平明显低于单纯造模组和其他给药干预组，相比于胆红素溶液组具有更好地缓减胰腺炎病情的优势。该结果表明，胆红素纳米颗粒可以有效降低急性胰腺炎大鼠中淀粉酶以及脂肪酶，缓减其胰腺组织的炎症，从而提示急性胰腺炎的发生和发展得以改善。相对于胆红素溶液，胆红素纳米颗粒具有更好地抑制炎症效果。

实施例5胆红素纳米颗粒对类风湿性关节炎的抗炎治疗效果

采用经典的胶原诱导性关节炎构建类风湿性关节炎小鼠模型。在加强免疫5天后出现炎症高峰，表现为小鼠双侧足爪明显肿胀，可累及前爪。分别关节腔内注射生理盐水、胆红素溶液、胆红素纳米颗粒(实施例1制备的胆红素纳米颗粒样品1)。通过关节炎指数和脚掌厚度值来评价胆红素纳米颗粒对类风湿性关节炎的抗炎治疗效果。关节炎指数值越低，说明关节的炎症程度越弱。脚掌厚度值越小，同样说明关节炎肿胀程度越低。

结果如图3和图4所示。结果表明本发明所制备的胆红素纳米颗粒治疗类风湿性关节炎模型小鼠后，小鼠具有更低的关节指数值和脚掌厚度值越小。说明胆红素纳米颗粒对于类风湿性关节炎具有最好的治疗效果，其治疗效果优于游离药物。

实施例5胆红素纳米颗粒对糖尿病小鼠创面的治疗效果

采用腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病小鼠模型(血糖浓度持续超过250mg/dl)。两周后，在糖尿病小鼠背部切取直径为6mm圆形全层皮肤,制作全层皮肤缺损创面模型。创面分别注射生理盐水、胆红素溶液和胆红素纳米颗粒(实施例1制备的胆红素纳米颗粒样品1)。其后于术后第4、7、9、15天更换创面敷料注射药物并拍照记录创面面积。创面愈合率(％)＝(原始创面面积-残余创面面积)/原始创面面积×100％。通过创面愈合率(％)来来评价胆红素纳米颗粒对糖尿病伤口修复的治疗效果。

结果如图5所示。结果表明本发明所制备的胆红素纳米颗粒能有效提升糖尿病创面愈合速率，缩短创面愈合时间。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的。