鹰嘴豆芽素A在防治急性胰腺炎中的应用

鹰嘴豆芽素a在防治急性胰腺炎中的应用
技术领域
1.本发明涉及鹰嘴豆芽素a在防治急性胰腺炎中的应用技术,属于急性胰腺炎的预防和治疗技术领域。


背景技术：

2.急性胰腺炎(acute pancreatitis，ap)是最常见的急性临床腹部疾病之一,临床表现从局部炎症到破坏性的全身性病理状况不等。目前，ap的发病机制尚未完全阐明，其中胰腺外分泌功能的异常激活及胰酶的活化可引起胰腺组织的自身消化，进而促进免疫细胞的浸润及炎性介质的大量产生及胰腺组织的损伤和水肿，并伴随着不同程度的肠道损伤例如肠道紧密链接蛋白表达下降及肠道通透性上升，严重地可引发肠源性感染甚至全身性炎症综合征。因此，探明ap的发病机制并开发高效的预防和治疗ap的方法，对于预防ap的发生及阻断炎症扩散，避免急性胰腺炎发展成为重症急性胰腺炎甚至胰腺癌，降低胰腺炎的病死率以及并发症发生率尤为重要。
3.鹰嘴豆芽素a是从诸如红三叶草，大豆，鹰嘴豆等植物中分离得到的一种天然异黄酮。研究表明，鹰嘴豆芽素a具有抗癌、神经保护、抗氧化、抗微生物等多种药理作用，可用于糖尿病的辅助治疗以及缓解肝损伤和心肌损伤。目前，鹰嘴豆芽素a对ap的保护作用尚不明确。因此，本发明研究了鹰嘴豆芽素a对ap及其相关组织损伤的保护作用。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供鹰嘴豆芽素a在防治和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎方面中的应用。
5.在一种实施方式中，所述防治急性胰腺炎包括如下至少一种作用：
6.(1)缓解胰腺组织水肿及炎症浸润；
7.(2)降低血清淀粉酶、脂肪酶和胰腺组织中mpo表达量；
8.(3)减少胰腺组织促炎细胞因子的释放；
9.(4)提高急性胰腺炎下结肠组织的完整性及紧密链接蛋白zo
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1和/或occludin的表达水平；
10.(5)降低急性胰腺炎下结肠组织促炎症因子tnf
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α和/或il
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6和/或il
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1β和/或mcp
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1的表达水平；
11.(6)减少发生急性胰腺炎的危险性。
12.在一种实施方式中，所述应用是将鹰嘴豆芽素a或含鹰嘴豆芽素a的药物摄入哺乳动物胃肠道中。
13.在一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人类。
14.在一种实施方式中，所述鹰嘴豆芽素a的施用剂量为20mg
‑
100mg/kg体重。
15.本发明的第二个目的是提供一种防治急性胰腺炎的药物，所述药物以鹰嘴豆芽素a作为主要有效成分。
16.在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。
17.在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括药物载体或药物辅料。
18.在一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
19.在一种实施方式中，所述药用辅料包含抗黏合剂、渗透促进剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、吸收剂、保湿剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、ph值调节剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、整合剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、发泡剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
20.在一种实施方式中，所述药物的剂型包含颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
21.有益效果：发明提供了鹰嘴豆芽素a在预防和/或治疗急性胰腺炎药物中的新用途，证明了鹰嘴豆芽素a可对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎发挥保护作用，可作为有效的成分添加到防治急性胰腺炎的药物中，降低临床上急性胰腺炎的发生发展和炎症程度。
22.本发明通过鹰嘴豆芽素a对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型进行预防性处理，验证了鹰嘴豆芽素a对缓解胰腺组织水肿及炎症浸润，降低血清淀粉酶、脂肪酶和胰腺组织中mpo表达量、减少胰腺组织促炎症因子表达、提高肠道完整性及紧密链接蛋白zo
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1和/或occludin的表达水平、降低结肠组织促炎症因子tnf
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α和/或il
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6和/或il
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1β和/或mcp
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1表达方面的作用。本发明拓宽了鹰嘴豆芽素a的应用领域，为防治急性胰腺炎提供了新的选择和思路。
附图说明
23.图1为鹰嘴豆芽素a应用于急性胰腺炎小鼠后胰腺组织水肿及炎症浸润情况。其中，a为胰腺组织水肿情况，b为用he染色的方法观察胰腺组织的病理变化；con表示对照组，cae表示ap模型组，bca+cae表示鹰嘴豆芽素a灌胃后的模型处理组。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p<0.0001。
24.图2为鹰嘴豆芽素a应用于急性胰腺炎小鼠后血清淀粉酶(a)、脂肪酶(b)和胰腺组织中mpo表达情况(c)。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001,****：p<0.0001。
25.图3为鹰嘴豆芽素a应用于急性胰腺炎小鼠后胰腺组织促炎症因子的mrna表达情况。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001,****：p<0.0001。
26.图4为鹰嘴豆芽素a应用于急性胰腺炎小鼠后结肠组织zo1(a)和occludin(b)的mrna表达情况及用he染色的方法观察结肠组织的病理变化(c)。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001,****：p<0.0001。
27.图5为鹰嘴豆芽素a应用于急性胰腺炎小鼠后结肠组织促炎症因子的mrna表达情况。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001,****：p<0.0001。
具体实施方式
28.化合物信息：鹰嘴豆芽素a(biochanin a，bca)的分子式是c
16
h
12
o5，纯度为98％，购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
29.实施例1鹰嘴豆芽素a用于防治急性胰腺炎
30.(1)急性胰腺炎模型的建立
31.采用雨蛙素间断腹腔注射的方法建立小鼠急性胰腺炎模型(ap模型)。在建立ap模型前，bca+cae组小鼠灌胃200μl bca(剂量40mg/kg体重)，con组与cae组灌胃等体积的生理盐水，连续灌胃7天。将雨蛙素溶于生理盐水中，bca+cae组与cae组每小时注射一针雨蛙素(剂量50μg/kg体重)，连续注射8针，建立急性胰腺炎模型。con组注射等剂量生理盐水。末针雨蛙素注射完成后一小时，向各组小鼠注射致死剂量的戊巴比妥钠(1％)并快速收集新鲜的血液，胰腺组织等样品。
32.(2)鹰嘴豆芽素a缓解胰腺组织水肿及炎症浸润
33.用h&e染色的方法，将con组、cae组、bca+cae组胰腺经固定、脱水、染色、脱蜡、透明和封片等主要过程，观察胰腺组织的组织完整性、胰腺水肿程度和炎症细胞浸润程度。如图1a所示，与con组相比，cae组小鼠胰腺水肿程度显著上升(p<0.0001)，而bca+cae组小鼠上述指标较cae组则下降了约20％。同时对胰腺病理切片的形态学观察显示(图1b)，con组胰腺组织结构密实，无明显裂纹。cae组小鼠观察到腺泡细胞存在空泡和死亡情况，大量炎症细胞浸润。而bca+cae组相比于cae组胰腺组织损伤得到减轻，说明bca对小鼠急性胰腺炎发挥了保护作用。
34.(3)鹰嘴豆芽素a降低血清淀粉酶、脂肪酶和胰腺组织中mpo表达量
35.急性胰腺炎发生时，血清中淀粉酶和脂肪酶含量上升，而免疫细胞的募集和浸润，则引起胰腺组织水肿及mpo活力升高，分别采用血清淀粉酶、脂肪酶和髓过氧化物酶试剂盒进行测定。结果显示，cae小鼠上述3项指标较con组小鼠显著升高(p<0.0001)，而bca+cae小鼠的血清淀粉酶(图2a)、脂肪酶(图2b)和mpo(图2c)表达水平分别下降了约26％、20％、26％。
36.(4)鹰嘴豆芽素a减少胰腺组织促炎症因子的表达
37.采用荧光定量pcr法(qpcr)测定小鼠胰腺中促炎因子tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的mrna表达相对含量。组织样品通过使用高通量组织研磨机在trizol中进行破碎，之后使用氯仿等进行抽提，离心后吸取上清，加入等体积的异丙醇进行沉淀rna，离心后弃上清，用75％乙醇depc进行洗涤所得rna。对得到的rna进行浓度和纯度的测量后，使用takara反转录试剂盒将组织样品中的rna反转到cdna。根据mrna设计的引物在正式实验前需进行qpcr测试其特异性和扩增效率，得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为单峰，峰形偏窄，无明显引物二聚体熔解曲线峰。引物验证结果良好后进行正式实验。
38.使用sybr green mix进行相关基因的扩增检测。扩增程序为:55℃预热30秒；95℃5分钟；接下来循环39次：95℃30秒；58℃30秒；之后进行引物特异性检测，从65℃保持5秒之后每秒上升0.1℃至95℃，观察引物特异性。如通过对胰腺组织中tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的mrna水平进行检测。如图3，与con组相比，cae组小鼠胰腺中tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的表达显著上调(p<0.001)，而bca处理后细胞因子tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的水平分别下调了约42％、43％、48％、47％。
39.(5)鹰嘴豆芽素a保护结肠组织完整性
40.急性胰腺炎的发生会导致肠道屏障受损，紧密连接蛋白(zo
‑
1,occludin)的含量是反映肠道组织紧密与通透程度的重要指标。采用荧光定量pcr法(qpcr)测定小鼠结肠中zo
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1和occludin的mrna表达相对含量。如图4a和4b所示，与cae组相比，bca处理后结肠组织中zo
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1和occludin的表达水平均上调了40％。同时用h&e染色的方法观察结肠组织的完整
性，bca+cae组结肠绒毛脱落，固有层肿胀情况得到改善(图4c)。
41.(6)鹰嘴豆芽素a减少结肠组织促炎症因子的表达
42.采用荧光定量pcr法(qpcr)测定小鼠结肠中促炎因子tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的mrna表达相对含量。如图5，与con组相比，cae组小鼠结肠中tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的表达显著上调(p<0.001)，而bca处理后细胞因子tnf
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α、il
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6、il
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1β和mcp
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1的水平分别下调了约46％、47％、43％、42％。
43.实施例2鹰嘴豆芽素a用于缓解和治疗急性胰腺炎
44.建立ap小鼠模型，将雨蛙素溶于生理盐水中，bca+cae组与cae组每小时注射一针雨蛙素(剂量50μg/kg体重)，连续注射8针，建立急性胰腺炎模型。con组注射等剂量生理盐水。bca+cae组小鼠灌胃200μl bca(剂量40mg/kg体重)，con组与cae组灌胃等体积的生理盐水，连续灌胃7天，向各组小鼠注射致死剂量的戊巴比妥钠(1％)并快速收集新鲜的血液，胰腺组织等样品。按照实施例1的方法测定相关指标，结果显示鹰嘴豆芽素a具有缓解和治疗急性胰腺炎的作用。
45.实施例3含鹰嘴豆芽素a的药物的制备
46.将鹰嘴豆芽素a与要用辅料混合，获得液体制剂；可选地，压制成型，制得片剂；可选地，将液体制剂干燥，获得粉剂；可选地，将粉剂作为填充物制备胶囊剂。
47.其中，所述药用辅料包含抗黏合剂、渗透促进剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、吸收剂、保湿剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、ph值调节剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、整合剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、发泡剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
48.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。