一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法

本发明涉及一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，属于纳米复合材料制备和生物医学工程技术领域，特别涉及生物可降解聚合物材料与无机纳米材料形成的复合材料的制备方法。

背景技术：

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，也是女性中癌症死亡的主要原因。据估计2018年全球有超过860万女性被诊断患有癌症，其中乳腺癌患者占比例高达24.2%。在将近一半的癌症死亡病例中，因乳腺癌而死亡的女性占15.0%，同时发病率及死亡率每年都在不断增加。虽然中国不是乳腺癌高发的国家，但研究显示，自1990年至今，中国乳腺癌发病増长速度比全球平均水平高2倍多。尤其是近年来，我国乳腺癌发病率的增长速度甚至比高发国家高出1%-2%，同时乳腺癌的发病率高峰期比西方国家女性一般要早10-15年。具有高复发、高转移、高致死率等特性的三阴性乳腺癌（tnbc）是最常见的乳腺癌之一，tnbc是危害女性生命健康的首要重大疾病。如何实现tnbc的有效治疗是癌症治疗领域面临的重大挑战。

当前tnbc的临床治疗效果并不理想，手术虽然能够清除绝大部分宏观可见的肿瘤组织，但术后残留的微肿瘤导致复发率高；化疗及放疗虽然对癌细胞的杀伤力较强，可以降低术后复发与转移，但是这两种治疗方式具有较高的毒副作用，对患者自身的伤害极大；靶向治疗虽然毒副作用小，能够起到针对性治疗效果，但是靶向药物的价格较贵且容易产生耐药性，同时靶向药物的药物肿瘤内输送效率依然很低；局部给药的方式虽能大大提高局部药物浓度，但其治疗周期较短、生物安全性仍需改进，同时高剂量的光热和光动力治疗会对机体造成不可逆的损伤等。因此亟需一种有效的、安全的治疗方式，不仅能够抑制tnbc的术后局部复发，而且具有长期防止tnbc肿瘤转移的效果。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提出一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，以解决上述背景技术提出的问题。

本发明的技术方案如下：一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）、首先配制不同浓度的r837溶液，利用紫外分光光度计，测得不同浓度的r837溶液在波峰处的吸收强度，由此作出r837在波峰处吸收强度随浓度的变化曲线；

步骤（2）、制备mos2纳米片，其方法为：

在schlenk管中装入mos2粉末，将管密封后抽真空，再通入高纯ar气体以确保管中没有o2存在；抽取正丁基锂溶液，滴加管中，之后将schlenk管密封，放入超声清洗仪中超声；超声后静置分层，将上层的液体取出，在无氧无水的情况下，向管中加入除氧的超纯水10ml，并在超声的条件下通过水与锂反应产生的氢气使mos2的片层相互剥离开来，获得悬浊液状的产物；将所得产物移入离心管中，加入等体积的无水乙醇，混合均匀后离心，去除上层清液，保留沉淀物，再通过无水乙醇清洗、离心；最后通过加入超纯水进行清洗并离心，得到的黑色沉淀用超纯水进行分散，即可得到mos2纳米片溶液；

步骤（3）、对mos2纳米片进行表面功能化：将dtt溶解于mos2纳米片溶液中，通入氮气进行除氧以防止在反应过程中dtt的硫醇基团被氧化，混合溶液在室温下持续搅拌24h；搅拌24h后，通过透析的方法除去过量的dtt，从而得到dtt修饰的mos2纳米片；

步骤（4）、首先称量pva固体颗粒，加入到10ml的小烧瓶内，再加入mos2溶液以及r837溶液，并搅拌均匀；将烧瓶置于油浴锅中加热，每隔2-3分钟搅拌使其混合均匀并形成溶胶；油浴结束后，将溶胶取出并置于注射器内，通过注射器将溶胶均匀地挤入模具内，挤入过程中应保证内部没有气泡，将模具放入-20°c冰箱内，一定时间后将冷冻固化的凝胶取出，密封储存。

步骤（5）、将r837+mos2@pva自愈合水凝胶置于5ml离心管内并加入超纯水，在近红外光下照射，通过调节不同的光功率来实时监测不同功率下的光热效应，用热成像摄像机记录下温度随时间的变化；

步骤（6）、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液，不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度；随后原孔中补充磷酸缓冲溶液，继续孵育；统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线；

步骤（7）、体外培养癌细胞，将其种在r837+mos2@pva自愈合水凝胶上，mtt法测量癌细胞的存活率随时间的变化，测量时每两天换一次新鲜的培养液；

步骤（8）从小鼠中提取树突状细胞（dc），利用24孔板transwell进行dc成熟实验，流式检测dc细胞的成熟度；

步骤（9）构建小鼠肿瘤术后切除模型，局部植入该自愈合水凝胶，随后通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

进一步的，所述步骤（1）中，r837溶液浓度范围为0.001~100μg/ml；r837的波峰处于320nm。

进一步的，所述步骤（2）中，mos2粉末的质量为0.2g、正丁基锂溶液的体积为1ml；schlenk管放入超声清洗仪中的超声时间为1h；清洗产物的离心条件时间为5min，转速为12000rpm。

进一步的，所述步骤（3）中，溶解于mos2纳米片溶液中的dtt质量为36mg，mos2纳米片溶液体积为10ml；混合溶液在室温下持续搅拌时间为24h。

进一步的，所述步骤（4）中，加入的pva固体颗粒质量为1g，加入3.8ml浓度为0.658mg/ml的mos2溶液以及0.2ml浓度为10mg/ml的r837溶液，即pva的含量为20%，mos2的含量为0.05%，r837的含量为0.04%；溶胶的油浴温度为95℃，油浴时间为10-15min，凝胶的冷冻固化时间为1h。

进一步的，所述步骤（5）中，r837+mos2@pva自愈合水凝胶与超纯水的质量比为1：1；照射条件为808nm的近红外光下照射8分钟。

进一步的，所述步骤（6）中，孔板规格为6、12、24、96孔板中的一种。

进一步的，所述步骤（7）中癌细胞为胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

进一步的，所述步骤（8）中通过检测共刺激分子cd80和cd86从而检测dc细胞成熟度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，以聚乙烯醇(pva）作为主体，装载二硫化钼（mos2）和免疫佐剂（r837），通过油浴法制备自愈合水凝胶药物支架，具有生物相容性好、体内安全性良好、自愈合性能好等优点，可植入于体内用于长期药物缓释，结合免疫检查点阻断用于抑制术后肿瘤复发和转移。

附图说明

图1为本发明的光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备过程示意图。

图2为本发明中r837标准曲线的测定，a图为不同浓度r837溶液的紫外吸收峰；b图为r837在320nm处的吸收强度随浓度的变化曲线。

图3为本发明中不同成分的水凝胶的明场图，a图为纯pva的水凝胶照片；b图为r837+mos2@pva自愈合水凝胶照片。

图4为本发明中自愈合水凝胶的表征及自愈合性能测试，a图为mos2纳米片的tem表征图；b图为纯pva水凝胶的sem表征图；c图为r837+mos2@pva自愈合水凝胶的sem表征图；图d为r837+mos2@pva自愈合水凝胶的自愈合实验。

图5为本发明中自愈合水凝胶在近红外光照后与心、肝、脾、肺、肾的贴合效果。

图6为本发明中r837+mos2@pva自愈合水凝胶的体外光热实验，a图为实时监测在不同功率的808nm近红外光照射下自愈合水凝胶的体外升温效果；b图为定量分析a图中水凝胶的体外升温效果。

图7为本发明中不同组（r837@pva（-l）、r837+mos2@pva（-l）、r837+mos2@pva（+l））的体外药物释放百分比曲线。

图8为本发明中mtt所测得的各组（control、pva、pm、pmr(l)、pmr(h)）光照后的细胞活性。

图9为本发明中自愈合水凝胶刺激dc成熟实验。

图10为本发明的动物实验过程示意图。

图11为本发明中自愈合水凝胶植入小鼠肿瘤术后切除部位治疗后，抑制术后肿瘤复发的效果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明的内容，下面结合实施例和附图对本发明进行阐述。本发明实施例以本发明的技术为基础实施，给出了详细的实施方式和操作步骤。

实施例1

步骤1、首先配制不同浓度的r837溶液，溶液浓度为0.001~100μg/ml，利用紫外分光光度计，r837的激发波长为320nm，测得各溶液在320nm处的吸收强度，由此作出r837在320nm处吸收强度随浓度的变化曲线。

步骤2、制备mos2纳米片，其方法为：在schlenk管中装入0.2g的mos2粉末，将管密封后抽真空，再通入高纯ar气体以确保管中没有o2存在。抽取1ml的正丁基锂溶液，滴加管中，之后将schlenk管密封，放入超声清洗仪中超声1小时。超声后静置分层，将上层的液体取出，在无氧无水的情况下，向管中加入除氧的超纯水10ml，并在超声的条件下通过水与锂反应产生的氢气使mos2的片层相互剥离开来，获得悬浊液状的产物。将所得产物移入离心管中，加入等体积的无水乙醇，混合均匀后在5000rpm的条件下离心5分钟，去除上层清液，保留沉淀物，再通过无水乙醇清洗、离心。最后通过加入超纯水进行清洗并离心，得到的黑色沉淀用超纯水进行分散，即可得到mos2纳米片溶液。

步骤3、对mos2纳米片进行表面功能化：将36mgdtt溶解于10ml的mos2纳米片溶液中，通入氮气进行除氧以防止在反应过程中dtt的硫醇基团被氧化。混合溶液在室温下持续搅拌24h。24h后，通过透析的方法除去过量的dtt，从而得到dtt修饰的mos2纳米片。

步骤4、首先称量1g的pva固体颗粒，加入到10ml的小烧瓶内，再加入3.8ml浓度为0.658mg/ml的mos2溶液以及0.2ml浓度为10mg/ml的r837溶液，并搅拌均匀（即mos2的含量为0.05%，r837的含量为0.04%）。将烧瓶置于油浴锅中加热（95°c），每隔2-3分钟搅拌使其混合均匀并形成溶胶。10-15分钟后，将溶胶取出并置于注射器内，通过注射器将溶胶均匀地挤入模具内，挤入过程中应保证内部没有气泡，将模具放入-20°c冰箱内。1h后将冷冻固化的凝胶取出，密封储存。

步骤5、用透射电子显微镜对mos2的形貌进行表征；用扫描电子显微镜对自愈合水凝胶的表面形貌进行表征；对自愈合水凝胶进行自愈合实验。

步骤6、将r837+mos2@pva水凝胶置于5ml离心管内并加入相同质量的超纯水，在808nm的近红外光下照射8分钟左右，通过调节不同的光功率来实时监测不同功率下的光热效应，用热成像摄像机记录下温度随时间的变化。

步骤7、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液。不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度。随后原孔中补充缓冲溶液，继续孵育。统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线。

步骤8、体外培养癌细胞，将其种在自愈合水凝胶上。mtt法测量癌细胞的存活率随时间的变化（每两天换一次新鲜的培养液），癌细胞可以是胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

步骤9、从小鼠中提取树突状细胞（dc），利用24孔板transwell进行dc成熟实验。将提取出的dc培养在24孔板transwell的下部，将之前处理后的癌细胞及相应的培养液置于transwell的上部，共孵育24h，之后离心获得dc细胞。流式检测dc细胞的成熟度。

步骤10、构建小鼠肿瘤术后切除模型，然后局部植入该自愈合水凝胶，随后用808nm激光照射10min并注射apdl1抗体。最后，通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

实施例2

步骤1、首先配制不同浓度的r837溶液，溶液浓度为0.001~100μg/ml，利用紫外分光光度计，r837的激发波长为320nm，测得各溶液在320nm处的吸收强度，由此作出r837在320nm处吸收强度随浓度的变化曲线。

步骤2、制备mos2纳米片，其方法为：在schlenk管中装入0.2g的mos2粉末，将管密封后抽真空，再通入高纯ar气体以确保管中没有o2存在。抽取1ml的正丁基锂溶液，滴加管中，之后将schlenk管密封，放入超声清洗仪中超声1小时。超声后静置分层，将上层的液体取出，在无氧无水的情况下，向管中加入除氧的超纯水10ml，并在超声的条件下通过水与锂反应产生的氢气使mos2的片层相互剥离开来，获得悬浊液状的产物。将所得产物移入离心管中，加入等体积的无水乙醇，混合均匀后在12000rpm的条件下离心5分钟，去除上层清液，保留沉淀物，再通过无水乙醇清洗、离心。最后通过加入超纯水进行清洗并离心，得到的黑色沉淀用超纯水进行分散，即可得到mos2纳米片溶液。

步骤3、对mos2纳米片进行表面功能化：将36mgdtt溶解于10ml的mos2纳米片溶液中，通入氮气进行除氧以防止在反应过程中dtt的硫醇基团被氧化。混合溶液在室温下持续搅拌24h。24h后，通过透析的方法除去过量的dtt，从而得到dtt修饰的mos2纳米片。

步骤4、首先称量0.5g的pva固体颗粒，加入到10ml的小烧瓶内，再加入3.8ml浓度为0.658mg/ml的mos2溶液以及0.2ml浓度为10mg/ml的r837溶液，并搅拌均匀（即mos2的含量为0.05%，r837的含量为0.04%）。将烧瓶置于油浴锅中加热（95°c），每隔2-3分钟搅拌使其混合均匀并形成溶胶。10-15分钟后，将溶胶取出并置于注射器内，通过注射器将溶胶均匀地挤入模具内，挤入过程中应保证内部没有气泡，将模具放入-20°c冰箱内。1h后将冷冻固化的凝胶取出，密封储存。

步骤5、用透射电子显微镜对mos2的形貌进行表征；用扫描电子显微镜对自愈合水凝胶的表面形貌进行表征；对自愈合水凝胶进行自愈合实验。

步骤6、将r837+mos2@pva水凝胶置于5ml离心管内并加入相同质量的超纯水，在808nm的近红外光下照射8分钟左右，通过调节不同的光功率来实时监测不同功率下的光热效应，用热成像摄像机记录下温度随时间的变化。

步骤7、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液。不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度。随后原孔中补充缓冲溶液，继续孵育。统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线。

步骤8、体外培养癌细胞，将其种在自愈合水凝胶上。mtt法测量癌细胞的存活率随时间的变化（每两天换一次新鲜的培养液），癌细胞可以是胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

步骤9、从小鼠中提取树突状细胞（dc），利用24孔板transwell进行dc成熟实验。将提取出的dc培养在24孔板transwell的下部，将之前处理后的癌细胞及相应的培养液置于transwell的上部，共孵育24h，之后离心获得dc细胞。流式检测dc细胞的成熟度。

步骤10、构建小鼠肿瘤术后切除模型，然后局部植入该自愈合水凝胶，随后用808nm激光照射10min并注射apdl1抗体。最后，通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

实施例3

步骤1、首先配制不同浓度的r837溶液，溶液浓度为0.001~100μg/ml，利用紫外分光光度计，r837的激发波长为320nm，测得各溶液在320nm处的吸收强度，由此作出r837在320nm处吸收强度随浓度的变化曲线。

步骤2、制备mos2纳米片，其方法为：在schlenk管中装入0.2g的mos2粉末，将管密封后抽真空，再通入高纯ar气体以确保管中没有o2存在。抽取1ml的正丁基锂溶液，滴加管中，之后将schlenk管密封，放入超声清洗仪中超声1小时。超声后静置分层，将上层的液体取出，在无氧无水的情况下，向管中加入除氧的超纯水10ml，并在超声的条件下通过水与锂反应产生的氢气使mos2的片层相互剥离开来，获得悬浊液状的产物。将所得产物移入离心管中，加入等体积的无水乙醇，混合均匀后在12000rpm的条件下离心5分钟，去除上层清液，保留沉淀物，再通过无水乙醇清洗、离心。最后通过加入超纯水进行清洗并离心，得到的黑色沉淀用超纯水进行分散，即可得到mos2纳米片溶液。

步骤3、对mos2纳米片进行表面功能化：将36mgdtt溶解于20ml的mos2纳米片溶液中，通入氮气进行除氧以防止在反应过程中dtt的硫醇基团被氧化。混合溶液在室温下持续搅拌24h。24h后，通过透析的方法除去过量的dtt，从而得到dtt修饰的mos2纳米片。

步骤4、首先称量1g的pva固体颗粒，加入到10ml的小烧瓶内，再加入3.8ml浓度为0.658mg/ml的mos2溶液以及0.2ml浓度为10mg/ml的r837溶液，并搅拌均匀（即mos2的含量为0.05%，r837的含量为0.04%）。将烧瓶置于油浴锅中加热（95°c），每隔2-3分钟搅拌使其混合均匀并形成溶胶。10-15分钟后，将溶胶取出并置于注射器内，通过注射器将溶胶均匀地挤入模具内，挤入过程中应保证内部没有气泡，将模具放入-20°c冰箱内。1h后将冷冻固化的凝胶取出，密封储存。

步骤5、用透射电子显微镜对mos2的形貌进行表征；用扫描电子显微镜对自愈合水凝胶的表面形貌进行表征；对自愈合水凝胶进行自愈合实验。

步骤6、将r837+mos2@pva水凝胶置于5ml离心管内并加入相同质量的超纯水，在808nm的近红外光下照射8分钟左右，通过调节不同的光功率来实时监测不同功率下的光热效应，用热成像摄像机记录下温度随时间的变化。

步骤7、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液。不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度。随后原孔中补充缓冲溶液，继续孵育。统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线。

步骤8、体外培养癌细胞，将其种在自愈合水凝胶上。mtt法测量癌细胞的存活率随时间的变化（每两天换一次新鲜的培养液），癌细胞可以是胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

步骤9、从小鼠中提取树突状细胞（dc），利用24孔板transwell进行dc成熟实验。将提取出的dc培养在24孔板transwell的下部，将之前处理后的癌细胞及相应的培养液置于transwell的上部，共孵育24h，之后离心获得dc细胞。流式检测dc细胞的成熟度。

步骤10、构建小鼠肿瘤术后切除模型，然后局部植入该自愈合水凝胶，随后用808nm激光照射10min并注射apdl1抗体。最后，通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

采用本发明的方法，由图2可知，r837的吸收强度在一定范围内与r837的浓度呈线性关系。

采用本发明的方法，由图3中的明场图可见，纯pva水凝胶呈透明状胶体，而r837+mos2@pva水凝胶则是呈黑色。这些水凝胶质地较软，具有一定的粘性。

采用本发明的方法，由图4可见，通过tem对mos2纳米片的形貌进行观察。如图3a所示，mos2纳米片呈现均匀的薄片状。通过sem对纯pva水凝胶和r837+mos2@pva水凝胶进行表征。如图3b和c所示，纯pva水凝胶具有蜂窝状的多孔网络结构；当加入少量mos2纳米片之后，会形成更加致密的多孔结构，原因是r837+mos2@pva水凝胶中经dtt修饰后的mos2纳米片与pva的羟基之间形成了氢键作用，从而使得水凝胶结构更加紧密。图3d为水凝胶的自愈合性能研究，断开的自愈合水凝胶在光照后能够粘合在一起，轻微的拉拽不会将其拉断。结果表明该自愈合水凝胶在近红外光照条件下具有良好的自愈合性能，在近红外光照射下r837+mos2@pva水凝胶温度逐渐升高，加速了pva链的流动性，从而导致破损处发生了愈合。

采用本发明的方法，由图5可见，自愈合水凝胶在近红外光照后与心、肝、脾、肺、肾紧密粘合。

采用本发明的方法，由图6可见，当光的功率为1w/cm²时，该水凝胶的光热最高温度可以达到大约60°c；功率为0.75w/cm²时温度可达到大约55°c；功率为0.5w/cm²时温度为44°c左右，结果表明该自愈合水凝胶的光热转换性能良好。

采用本发明的方法，由图7可见，前期r837药物大量释放，但随着时间的推移，药物的释放速率逐渐放缓，在第六天基本达到平台。

由图8可见，在没有光照的条件下，各组均没有明显的细胞毒性，且即使在光照条件下，纯pva同样没有明显的细胞毒性，结果说明pva、mos2和r837的生物安全性良好；r837+mos2@pva水凝胶具有显著的光热细胞毒性，能够在近红外光照的条件下达到杀死癌细胞的目的。

采用本发明的方法，由图9可见，pmr+l组能够显著引起dc的成熟（cd80：57.68%、cd86：55.96%），这说明癌细胞在被光热杀死后，大量凋亡的癌细胞确实分泌出了各种肿瘤相关抗原，正是由于这些肿瘤相关抗原的存在，从而促进了dc的大量成熟。

采用本发明的方法，由图11可见，在治疗22天后，pmr+apdl1+light组肿瘤术后切除部位生物发光信号十分微弱，而仅手术组和pmr组肿瘤术后切除部位生物发光信号很强，说明pmr+apdl1+light组能有效抑制肿瘤术后切除之后的复发。