人工培育的雪峰虫草用于制备抗肿瘤药物的用途的制作方法

本发明涉及药物化学
技术领域：
，尤其涉及一种人工培育的雪峰虫草用于制备抗肿瘤药物的用途。
背景技术：
：虫草类药材，如冬虫夏草、蛹虫草，在中国、日本和其他亚洲地区一直被用作民间滋补类药品。全世界已报道的虫草多达500种以上，我国已报道的虫草属约有120种，其中，最为著名的就是冬虫夏草。由于近年来冬虫夏草的市场需求量在急剧增长，导致资源过度采挖及自然资源破坏，使冬虫夏草为虫草属的珍稀危药用品种，价格一路狂升，成为天然中药中的“软黄金”。因此，国内外大量学者对虫草属有关品种进行了研究，以期寻找冬虫夏草的替代品或具有新的功效的虫草品种，如蛹虫草、蝉花虫草、亚香棒虫草、江西虫草、古尼虫草、戴氏虫草和大团囊虫草等。雪峰虫草是线虫草菌科真菌雪峰虫草菌(ophiocordycepsxuefengensist.c.wen,r.c.zhu,j.c.kang&k.d.hyde)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，为线虫草菌科线虫草菌属的一个新种，主要分布在湖南省武陵山片区(洞口县、隆回县)。该品种因产于雪峰山脉，故命名为“雪峰虫草”。真菌分类学、分子生物学研究表明，雪峰虫草是目前同属真菌中与冬虫夏草亲缘关系最近的一个种。雪峰虫草具有补肺益肾、止咳化痰的功效，主治肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘等症，民间用于增强免疫力、强身健体、防癌治癌，疗效显著。野生雪峰虫草具有较好的体外抗肿瘤活性，但是其野外资源分布小、产量少、价格昂贵，且容易沾染杂菌。因此，对其可替代资源类型的挖掘迫在眉睫。技术实现要素：鉴于上述问题，本发明的目的就是提供一种人工培育的雪峰虫草用于抗肿瘤药物的用途。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供了一种人工培育的雪峰虫草用于制备抗肿瘤药物的用途，其中，所述人工培育的雪峰虫草选自人工培育的雪峰虫草子座、雪峰虫草菌丝体和人工培育的虫菌复合体中的至少一种。本发明在人工培育的过程中所采用的雪峰虫草菌为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年8月10日，保藏编号为cgmccno.11107；分类命名：雪峰虫草菌ophiocordycepsxuefengensis。在本发明的一些实施方案中，所述人工培育的雪峰虫草子座、雪峰虫草菌丝体和人工培育的虫菌复合体均含有相同的活性成分。在本发明的一些实施方案中，所述人工培育的虫菌复合体中活性成分的含量大于所述人工培育的雪峰虫草菌丝体中活性成分的含量，所述人工培育的雪峰虫草菌丝体中活性成分的含量大于所述人工培育的雪峰虫草子座中活性成分的含量。在本发明的一些实施方案中，所述活性成分主要为吲哚生物碱类。在本发明的一些实施方案中，所述吲哚生物碱类选自吲哚二萜类和细胞松弛素类。在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤选自乳腺癌、白血病和肺癌。在本发明的一些实施方案中，所述雪峰虫草子座降低mcf-7细胞数的ic50为20.5μg/ml，所述虫菌复合体降低mcf-7细胞数的ic50为24.8μg/ml，所述雪峰虫草菌丝体降低mcf-7细胞数的ic50为17.6μg/ml。在本发明的一些实施方案中，所述人工培育的雪峰虫草选自人工培育的雪峰虫草菌丝体或虫菌复合体，所述肿瘤选自淋巴肿瘤和绒毛膜癌。在本发明的一些实施方案中，所述虫菌复合体降低u937细胞数的ic50为33.5μg/ml，所述虫菌复合体降低bewo细胞数的ic50为88.3μg/ml。在本发明的一些实施方案中，所述人工培育的雪峰虫草选自人工培育的雪峰虫草菌丝体。本发明提供的实施方案，至少具有如下有益效果：本发明提供的人工培育的雪峰虫草用于制备抗肿瘤药物的用途，通过对人工培育的雪峰虫草进行化学成分分析，并且通过mtt法进行了体外抗肿瘤活性检测，结果表明人工培育的雪峰虫草中的活性成分对肿瘤细胞起到一定的抑制作用。除了上面所描述的本发明解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的有益效果外，本发明提供的人工培育的雪峰虫草用于制备抗肿瘤药物的用途所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征带来的有益效果，将在具体实施方式中作出进一步详细的说明。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明提供的人工培育的雪峰虫草和野生雪峰虫草的外观图(1-雪峰虫草子座；2-雪峰虫草菌丝体；3-人工培育的虫菌复合体；4-雪峰虫草野生药材)；图2为本发明提供的人工培育的雪峰虫草和野生雪峰虫草的总离子流色谱(tic)图(a-雪峰虫草子座；b-雪峰虫草菌丝体；c-人工培育的虫菌复合体中；d-雪峰虫草野生药材)；图3为本发明提供的人工培育的雪峰虫草和野生雪峰虫草中主要活性成分含量的柱状图；图4为为本发明提供的人工培育的雪峰虫草和野生雪峰虫草的主成分分析(pca)图(s1-6-雪峰虫草子座；s7-12-雪峰虫草菌丝体；s13-18-人工培育的虫菌复合体中；s19-24-雪峰虫草野生药材)。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特别说明，以下实施例和对比例中所用化学材料及仪器，均为常规化学材料及常规仪器，均可商购获得。实验仪器高效液相仪：安捷伦1290系列高效液相色谱(安捷伦，美国)，配四元泵、自动进样器、柱温箱、dad检测器；质谱仪：安捷伦四级杆飞行时间串联质谱仪(6530q-tof-ms/ms，安捷伦，美国)；色谱柱：色谱柱1(agilentporoshell120sb-aqc18色谱柱，4.6×100mm，2.7μm)、色谱柱2(依利特ods柱，4.6×150mm，5μm)、色谱柱3(inertsilods-sp柱，4.6×150mm，5μm)与色谱柱4(inertsilods-2柱，4.6×250mm，5μm)；液晶台式超声波清洗器：km-500db，昆山美美超声仪器有限公司；ae240型电子分析天平(mettler)。实验材料雪峰虫草菌：保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年8月10日，保藏编号为cgmccno.11107；分类命名：雪峰虫草菌ophiocordycepsxuefengensis。甲醇(色谱纯)：默克，德国；甲酸(色谱级)：tedia(fairfield,oh,usa)；纯净水：怡宝纯净水(中国怡宝)；甲醇(分析纯)：湖南汇虹试剂有限公司；乙酸乙酯：湖南汇虹试剂有限公司。实施例1本实施例提供了一种雪峰虫菌丝体的人工培育方法，具体步骤如下：1)在米饭培养基上接种适量的雪峰虫草菌丝发酵液；2)将上述接种后的培养基于20～25℃条件下，避光培育至菌丝布满培养基表层，然后转移至5～10℃或20～25℃变温条件下继续培养；3)待培养至子座长至8～12cm，获得人工培育的雪峰虫草子座。图1中标有数字1的标识为本实施例中的人工培育的雪峰虫草子座。实施例2本实施例提供了一种雪峰虫草菌丝体的人工培育方法，具体步骤如下：将分离纯化的雪峰虫草菌接种于液体培养基中，并在25℃黑暗条件下置于恒温摇床中培养，即可得到人工培育的雪峰虫草菌丝体。图1中标有数字2的标识为本实施例中的人工培育的雪峰虫草菌丝体。实施例3本实施例提供了一种雪峰虫草虫菌复合体的人工培育方法，具体步骤如下：1)采集巨疖蝙蛾幼虫(湖南省邵阳市洞口县)，将培育发酵菌丝体注射侵染巨疖蝙蛾幼虫，7～15℃黑暗条件培育至待菌丝布满虫体；2)待虫体的体表有子座原基分化后，转入20～25℃环境中继续培育，待子座成熟后，即可得到人工培育的雪峰虫草虫菌复合体。图1中标有数字3的标识为本实施例中的人工培育的雪峰虫草虫菌复合体。对比例1该对比例采用雪峰虫草野生药材，其采自湖南省洞口县雪峰山脉。通过此类野外珍稀资源进行人工培育得到三个品种：人工浸染虫菌复合体、人工培育子座、菌丝体等。其中，人工浸染培养技术复杂，产量低；菌丝体则是通过液体发酵，其优势是简单、快速、菌种单一。但这些不同方式培育的品种与野生药材之间的成分与活性一致性可能不同。因此，通过hplc-q-tof-ms/ms技术，以吲哚类生物碱为指标，对比分析雪峰虫草人工培育子座、雪峰虫草菌丝体、雪峰虫草人工培育虫菌复合体、雪峰虫草野生药材之间化学成分异同。在活性方面，采用mtt法对四者进行体外抗肿瘤活性检测。研究目的以期从谱-效关系对人工培育与野生药材之间的成分与抗肿瘤活性异同进行综合阐述，为雪峰虫草资源开发提供科学依据。图1中标有数字4的标识为本实施例中的野生雪峰虫草。以下对实施例1-3和对比例所得到的样品进行成分分析以及毒性试验。1、成分分析1)样品的采集将实施例2中的样品用纱布过滤，滤渣置烘箱60℃烘干。实施例1、实施例3和对比例1的样品分别平于托盘上，置烘箱60℃烘干。分称取适量的样品，并将其粉碎，经过80目筛选后，备用。2)确定洗脱条件色谱条件为：色谱柱：inertsilods-sp柱(4.6×150nm，5μm)；检测波长：280nm，全波长扫描，扫描范围为190nm～400nm；柱温：30℃；进样量20μl；流动相：甲醇-甲酸水(0.1％)；洗脱梯度见表1。表1时间(min)甲醇(％)0.1％甲酸水(％)流速(ml/min)050500.4865350.42086140.24086140.25087130.26088120.27090100.27210000.48710000.4质谱条件为：电喷雾离子化(esi)；干燥气(n2)体积流量：8.0l/min；干燥气温度：320℃；鞘气温度：320℃；nebulize35psig；鞘气流速：11l/min；毛细管电压：3.5kv；喷嘴电压：1.0kv；碰撞电压：110v；skimmervoltage65v；octopolerf750v；检测方式：正负离子检测；扫描范围：m/z100～1000da。3)抗肿瘤化学成分对比分析分别称取实施例1-3和对比例1的样品浸膏，配制成10mg/ml的的待测溶液，通过孔径为0.22μm的有机微孔滤膜，采用上述色谱条件和质谱条件进行如下分析。通过对比四种类型雪峰虫草主要准离子峰，从定性角度来而言，四者所含的化合物大致相似，如图2所示。再通过提取离子对四种类型雪峰虫草主要活性成分雪峰虫草素a、雪峰虫草素b、雪峰虫草碱a进行相对定量分析。结果表明，这些吲哚类生物碱在人工培育的雪峰虫草子座、雪峰虫草菌丝体、人工培育雪峰虫草虫菌复合体及野生药材含量差异较大，其中以野生药材中含量最高，其次为人工培育的雪峰虫草虫菌复合体，而人工培育的雪峰虫草子座中吲哚生物碱类成分含量最低，如图3所示。4)人工培育的雪峰虫草与野生雪峰虫草组间组内一致性分析对不同批次人工培育的雪峰虫草子座、雪峰虫草菌丝体、人工培育的雪峰虫草虫菌复合体及野生药材进行lc-ms分析，采用主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)对数据进行分析。结果表明，人工培育的雪峰虫草子座、雪峰虫草菌丝体、人工培育的雪峰虫草虫菌复合体及野生药材之间差异性比较大，结合定性定量分析可知，这些差异是由四者化学成分含量差异所导致。此外，不同批次人工培育的雪峰虫草的雪峰虫草子座(s1-6)与雪峰虫草菌丝体(s7-12)一致性较好。相对而言，不同批次人工培育的雪峰虫草虫菌复合体(s13-18)一致性稍微差一点，而不同批次野生雪峰虫草药材(s19-24)一致性最差，如图4所示。2、人工培育的雪峰虫草与野生雪峰虫草体外抗肿瘤活性对比分析通过mtt法对不同类型雪峰虫草甲醇提取物进行体外抗肿瘤活性评价，结果如表2所示。四种虫草对mcf-7肿瘤细胞均有一定抑制作用，其中，以野生药材效果最好(ic5012.9μg/ml)，其次为雪峰虫草菌丝体次之(ic5017.6μg/ml)。对于u937、bewo细胞，人工培育的雪峰虫草菌丝体、人工培育的雪峰虫草虫菌复合体均有一定抑制作用，野生药材则未表现出抑制作用。表2从图2、图3和表2可知，对人工培育的雪峰虫草与野生雪峰虫草药材的抗肿瘤活性成分进行定量分析，同时采用mtt法对四者进行体外抗肿瘤实验。结果表明，人工培育的雪峰虫草与野生药材之间化学成分比较相似，但含量具有很大差异。从三种主要抗肿瘤活性成分定量结果来看，人工培育的雪峰虫草虫菌复合体活性成分含量与野生药材相近。雪峰虫草不同批次样品组间组内一致性分析结果可知，人工培育的样品各批次间一致性比较好，而野生药材各批次间差异性比较大。体外抗肿瘤结果表明，四者对mcf-7肿瘤细胞均有一定抑制作用，其中，以野生药材效果最好，其次为菌丝体。此外，人工培育的雪峰虫草菌丝体、人工培育的雪峰虫草虫菌复合体u937、bewo细胞均有一定抑制作用。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12