一种肿瘤微环境响应的CO气体治疗剂及其制备方法和应用

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种肿瘤微环境响应的co气体治疗剂及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，气体治疗蓬勃发展，成为癌症治疗的新兴领域。气体治疗是一种新兴的、且非常有应用前景的肿瘤治疗新策略。no、h2s和co之类的气态信使分子的药理活性引起了科研人员的兴趣，这类气态信使分子被开发作为针对某些癌症和心血管疾病的新治疗方法，这些内源性气体具有特定的分子靶标、强大的生理功能调节功能，以及跨生物膜的高渗透性，因此与传统药物相比具有很大的优势。例如，在炎症和伤口愈合中很容易证明低剂量的co(100-250ppm)的有益作用，中等剂量的co(>250ppm)在癌细胞而不是正常细胞中显着诱导促凋亡。尽管co仍对正常细胞显示出强大的保护作用，但它对几种癌细胞具有抗增殖和促凋亡作用。然而，在控制向患病部位输送适当的co浓度以及实时监测co浓度以避免对正常组织和血液产生意料之外的系统性副作用方面，利用co作为治疗剂面临着巨大的挑战。因此，如何实现气体分子的肿瘤靶向传输、可控气体释放、并辅助传统的肿瘤治疗方法进行减毒和增效，仍被认为是气体治疗应用于临床的一大挑战。

利用在非肿瘤组织中沉默而在肿瘤特异性代谢条件下被特异性激活的化学药物是一个有前景的方法，例如过度表达的酶、h2o2、过度产生的活性氧、乏氧的微环境。本发明通过利用纳米载体负载co气体前药作为一种肿瘤微环境响应的co气体治疗剂，可以实现co气体在肿瘤部位的精准可控释放。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种特异性强、可控释放且合成方法简单的肿瘤微环境响应性释放的co治疗剂。

本发明的另一目的是提供上述co气体治疗剂的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种肿瘤微环境响应的co气体治疗剂，包括uio-67纳米颗粒、mnbr(co)5和葡萄糖氧化酶gox；

所述mnbr(co)5通过配位键修饰在uio-67纳米颗粒的骨架上，葡萄糖氧化酶gox通过物理作用吸附在uio-67纳米颗粒的孔道内。

肿瘤细胞内的葡萄糖在葡萄糖氧化酶gox的催化作用下生成葡萄糖酸和h2o2；葡萄糖酸会降低肿瘤微环境的ph值从而促进uio-67纳米颗粒发生降解，从而释放出mnbr(co)5，与肿瘤微环境内过表达的h2o2释放co；同时h2o2可触发mnbr(co)5分解释放出mn²⁺并与肿瘤细胞内的h2o2发生类芬顿反应(fenton-likereaction)产生羟基自由基(•oh)。

进一步地，所述uio-67纳米颗粒的直径为70-100nm。

上述co气体治疗剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，采用高温溶剂热法制备uio-67纳米颗粒；

步骤2，采用化学键合的方法将mnbr(co)5修饰到uio-67纳米颗粒骨架上；

步骤3，采用孔道吸附的方法将葡萄糖氧化酶gox吸附到步骤2得到的纳米颗粒孔道内，即得。

进一步地，步骤1中采用高温溶剂热法制备uio-67纳米颗粒的具体过程为：将2,2'-联吡啶-5,5'-二羧酸溶于的n,n'-二甲基甲酰胺中，在搅拌条件下加入三乙胺，持续搅拌至澄清透明；将氯化锆溶于n,n'-二甲基甲酰胺中，在搅拌条件下将上述两种溶液加入到四氟乙烯高压内衬反应釜中，在85℃的烘箱中反应24小时，反应结束后，离心收集产物，用n,n'-二甲基甲酰胺和无水乙醇洗涤，得到uio-67纳米颗粒。

进一步地，步骤2中将mnbr(co)5修饰到uio-67纳米颗粒骨架上的具体过程为：将mnbr(co)5加入uio-67的乙醇溶液中，20-30℃搅拌，随后转入到75°c的油浴锅加热搅拌进行反应，反应结束后，冷却至20-30℃，离心收集产物，无水乙醇洗涤后，得到mnbr(co)5修饰的uio-67纳米颗粒uio-67@mnbr(co)5。

进一步地，步骤3中将葡萄糖氧化酶gox吸附到步骤2得到的纳米颗粒孔道内的具体过程为：将所述步骤2得到的纳米颗粒分散在水中，加入葡萄糖氧化酶gox，避光搅拌反应，离心收集产物，用水洗涤，得到co气体治疗剂uio-67@mnbr(co)5@gox。

上述co气体治疗剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

有益效果：本发明通过将具有介孔的uio-67纳米颗粒作为载体，高效担载co气体释放分子mnbr(co)5，构建得到一种肿瘤微环境响应性的co气体治疗剂。本发明的治疗剂具有肿瘤微环境响应性的特性，通过肿瘤微环境内过表达的h2o2来实现co气体的可控释放。采用上述co气体治疗剂是一种无创、绿色的肿瘤治疗方式；本发明的co气体治疗剂，可实现气体治疗，并结合治疗剂本身分解产生的活性氧进一步增强治疗效果，实现更高效的抗肿瘤治疗；此外，本发明的治疗剂合成步骤比较简单，且产率较高；进一步地，由于合成方法简单，成本较低，因而适合大规模生产。

附图说明

图1为实施例1中uio-67纳米颗粒的sem照片(a)和tem照片(b)。

图2为实施例1中uio-67纳米颗粒的粒径分布图(a)和红外光谱(b)。

图3为实施例1的uio-67@mnbr(co)5在40µmh2o2的pbs溶液中(a)和uio-67@mnbr(co)5@gox在40µmgo的pbs溶液中(c)避光条件下利用牛血清蛋白还原法的紫外光谱时间变化曲线，uio-67@mnbr(co)5在不同浓度h2o2的pbs溶液中co释放曲线(b)和uio-67@mnbr(co)5@gox在不同浓度go的pbs溶液中co释放曲线(d)。

图4为实施例1的不同浓度的uio-67在ph=4.5的h2o2的pbs溶液中与四甲基联苯胺(tmb)发生显色反应在652nm处出峰的紫外光谱图(a)、变色机理图(b)。

图5为hela和mcf-7两种细胞在不同浓度的uio-67中的细胞活性(a)，hela和mcf-7两种细胞在不同浓度的uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox中的细胞毒性(b)。

图6为hela细胞分别在uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox培养下的细胞内co释放的共聚焦荧光成像(a)，hela细胞分别在uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox培养下的细胞内ros的共聚焦荧光成像(b)，hela细胞分别在uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox培养下的细胞死活染色荧光成像图(c)。

具体实施方式

为详细说明本发明的结构特征、技术手段以及所实现的目的及效果，以下结合实施方式并配合附图进行详细说明。

本发明提供了一种肿瘤微环境响应的co气体治疗剂，包括具有高孔隙率uio-67纳米颗粒和骨架上修饰的co前驱分子mnbr(co)5以及为了进一步提高肿瘤内h2o2浓度负载的gox。

具体地，所述uio-67纳米颗粒是直径约为85nm左右的纳米球结构。

上述co气体治疗剂的制备方法包括以下步骤：

步骤1，采用高温溶剂热的制备方法合成uio-67纳米颗粒。

将45mg的2,2'-联吡啶-5,5'-二羧酸溶于20ml的n,n'-二甲基甲酰胺(dmf)并在搅拌时滴加360µl的三乙胺，持续搅拌至澄清透明；45mg氯化锆溶于16ml的dmf，在磁力搅拌下将两溶液加入到50ml的四氟乙烯高压内衬反应釜中，在85°c的烘箱中反应24小时。反应结束后，产物通过高速离心收集，用dmf和无水乙醇洗涤3次。最后将得到的白色产物分散在10ml无水乙醇中。

所述dmf、无水乙醇、氯化锆和2,2'-联吡啶-5,5'-二羧酸皆为制备常用的化学原料，均可直接从试剂网上订购。

所述反应的最佳温度为85°c，反应时间为24h。所得到的uio-67纳米颗粒直径约85nm左右。

步骤2，采用化学键合的方法，将mnbr(co)5分子修饰到uio-67纳米颗粒的骨架上，从而得到携带co前驱分子的纳米颗粒。

将uio-67分散在甲醇溶液中浸泡1天，中间更换甲醇溶液三次。称取30mg的mnbr(co)5加入到2mg/ml的10ml的uio-67乙醇溶液中，室温搅拌12小时，随后转入到75°c的油浴锅加热搅拌4小时。待反应结束后，自然冷却至室温，通过6000rpm、5min离心收集产物，无水乙醇洗涤3次后冷冻干燥避光保存uio-67@mnbr(co)5。

步骤3，采用物理吸附的方法，将gox吸附到具有高孔隙率的uio-67纳米颗粒孔道和表面，得到肿瘤微环境响应性功能的最终产物uio-67@mnbr(co)5@gox。

将所述uio-67@mnbr(co)5取5mg分散在10ml水中，加入2mg的gox，避光常温搅拌12h后，离心收集并用水洗涤3次，最后产物冷冻干燥避光保存。

上述制备方法得到的co气体治疗剂，包括纳米颗粒状uio-67纳米颗粒、co前驱分子mnbr(co)5和gox。

所述uio-67纳米颗粒直径为85nm左右，且骨架上修饰mnbr(co)5和孔道内负载gox。

所述的co气体释放分子为mnbr(co)5。

本发明的co治疗剂具有肿瘤微环境响应的功能，在肿瘤内的h2o2环境下释放出co气体。本发明的co气体释放分子mnbr(co)5在肿瘤微环境中过表达的h2o2的响应下释放co气体。所述co治疗剂在肿瘤微环境的响应下通过mnbr(co)5释放出co气体分子可用于肿瘤气体治疗，同时降解出的二价锰离子与肿瘤内过表达的h2o2反应产生•oh用于ros治疗。通过结合二者的相互协同增效，进一步提高co气体治疗剂对肿瘤的杀伤作用。因此，本发明的co治疗剂实现了co气体在肿瘤内的可控释放，同时实现饥饿治疗，通过mn²⁺与h2o2反应生成羟基自由基，实现ros的协同治疗。

上述制备得到的肿瘤微环境响应性释放co气体治疗剂能够作为治疗肿瘤的制剂的应用。

所述的治疗肿瘤的制剂为所述co治疗剂在所述的肿瘤微环境响应释放co气体治疗。

可以理解的，所述ros治疗与co气体能够抑制肿瘤细胞生长并杀死癌细胞，因此，本发明的co治疗剂是一种无创、高效、低毒、绿色的肿瘤治疗方式。

本发明的肿瘤co治疗剂的制备方法，其合成原料价格低廉且制备工艺简单、易于大规模生产。此外，利用本发明制备方法得到的co治疗剂具有良好的单分散性和稳定性、良好的生物相容性以及高的co气体负载量和具有肿瘤微环境响应的气体释放。

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

（1）制备uio-67纳米颗粒。

将45mg的2,2'-联吡啶-5,5'-二羧酸溶于20ml的n,n'-二甲基甲酰胺(dmf)并在搅拌时滴加360µl的三乙胺，持续搅拌至澄清透明；45mg氯化锆溶于16ml的dmf，在磁力搅拌下将两溶液加入到50ml的四氟乙烯高压内衬反应釜中，在85°c的烘箱中反应24小时。反应结束后，产物通过高速离心收集，用dmf和无水乙醇洗涤3次。最后将得到的白色产物分散在10ml无水乙醇中。

（2）制备mnbr(co)5修饰的uio-67纳米颗粒（uio-67@mnbr(co)5）。

将uio-67分散在甲醇溶液中浸泡1天，中间更换甲醇溶液三次。称取30mg的mnbr(co)5加入到2mg/ml的10ml的uio-67乙醇溶液中，室温搅拌12小时，随后转入到75°c的油浴锅加热搅拌4小时。待反应结束后，自然冷却至室温，产物通过6000rpm，5min离心收集产物，无水乙醇洗涤3次后冷冻干燥避光保存uio-67@mnbr(co)5。

（3）制备uio-67@mnbr(co)5孔道负载gox（uio-67@mnbr(co)5@gox）。

将所述uio-67@mnbr(co)5取5mg分散在10ml水中，加入2mg的gox，避光常温搅拌12h后，离心收集并用水洗涤3次，最后产物冷冻干燥避光保存。

性能测试：

1.uio-67纳米颗粒的形貌测定

图1是实施例1制备的uio-67纳米颗粒的sem照片(a)、(b)，该uio-67纳米颗粒呈球状。

2.uio-67、uio-67@mnbr(co)5性能测定

图2(a)中能够观察到合成的uio-67纳米颗粒直径为85nm左右，且分散均匀。

通过图2(b)中对mnbr(co)5、uio-67和uio-67@mnbr(co)5纳米复合物的红外光谱的比较，可以发现在mnbr(co)5装载到uio-67后，mnbr(co)5的三个羰基峰减少为两个峰(图2b中的灰色区域)，这表明在uio-67的内/外表面上联吡啶被羰基部分取代。

3.测定uio-67@mnbr(co)5和uio-67@mnbr(co)5@gox的co释放性能测定

通过测量血红蛋白(hb)向羧基血红蛋白(hbco)的转化，用分光光度法检测pbs中释放的一氧化碳。首先，将实施例1制备的uio-67@mnbr(co)5配成浓度100µg/ml的pbs溶液，将来自牛红细胞的血红蛋白（最终浓度为4.2mm）完全溶解在含有不同浓度h2o2的磷酸盐缓冲盐水（10mm，ph=7.4）中。然后，通过在氮气氛下加入1.6mg的连二亚硫酸钠将其还原。然后将溶液加入新制备的血红蛋白溶液中。立即将整个反应溶液(4ml)密封在4ml紫外石英试管中。溶液的紫外吸收光谱(i=350–600nm)在紫外/可见分光光度计上收集。为了消除影响因素和提高准确度，分别归因于hbco和hb的i=410和430nm的两条强吸附带被用于量化hb向hbco的转化，得到图3(a)，然后通过计算公式计算得到uio-67@mnbr(co)5在不同浓度h2o2磷酸盐缓冲盐水co释放曲线图3(b)，其中cco和chb分别表达释放的co浓度和初始hb浓度(4.2µm)，i410nm和i430nm分别表示在l=410和430nm处的收集光谱的强度。可以看出uio-67@mnbr(co)5的co的释放量随着h2o2浓度的增高而增高。

同样用上述方法可以得到uio-67@mnbr(co)5@gox在不同浓度的go溶液中hb向hbco的转化图3(c)，通过计算得到uio-67@mnbr(co)5@gox在不同浓度go磷酸盐缓冲盐水co释放曲线图3(d)。可以看出uio-67@mnbr(co)5@gox的co的释放量随着h2o2浓度的增高而增高。

4.uio-67产生•oh性能测定

测量在3ml醋酸(acoh)缓冲溶液(0.1ml，ph4.5)中进行，该溶液含有实施例1所制备的不同浓度uio-67(5、10、20、40、80µg/ml)、h2o2(10mm)和tmb(1mm)，在37°c下持续5分钟。tmb会被羟基自由基氧化成ox-tmb，用紫外-可见光谱仪观察吸收光谱，ox-tmb会在652nm的吸光度下出现明显的吸收峰，如图4(a)所示。说明实施例1中制备的随着uio-67浓度的增大产生羟基自由基的能力越好。tmb被羟基自由基氧化成ox-tmb后，会由无色变成蓝色，图4(b)是tmb被羟基自由基氧化成ox-tmb的机理图。

5.uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox的细胞毒性

分别将hela、mcf-7细胞(1×10⁴个/孔)接种到96孔板中，每孔加入200µldmem培养基，置于37°c、5%co2的培养箱内培养过夜。细胞完全贴壁后，更换新鲜的dmem培养基，每孔加入50µl含有不同浓度的fe-bpyd的dmem溶液，在培养箱内继续培养48h。培养完成后，用pbs清洗三次，洗去多余的药品，每孔中加入100µl的dmem和10µl预先配置的噻唑蓝(mtt)溶液(5mg/ml)，继续在培养箱内培养4h后吸出dmem培养基，每孔中加入150µl二甲基亚砜(dmso)溶剂，轻微振荡10min使蓝紫色甲瓒完全溶解，用酶标仪测定490nm处吸光度。以未加入uio-67处理的细胞作为对照组，细胞活性记为100%，计算出各浓度下的细胞存活率。每组实验重复三次，计算平均值。可以从图5(a)和(b)可以看出，160µg/mluio-67对细胞活性在90%左右，uio-67@mnbr(co)5@gox对hela抑制效果最好，uio-67@mnbr(co)5效果次之。是因为gox的修饰，增加了癌细胞内h2o2的含量，增加了释放co的能力，并同时消耗细胞内go，阻断能量来源，所以uio-67@mnbr(co)5@gox的细胞毒性最高。

6.uio-67@mnbr(co)5@gox的在hela内产生•oh、释放co性能测试。

用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(dcfh-da)监测细胞内活性氧的产生。简而言之，hela细胞用100µg/ml的uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox孵育4小时，然后用pbs洗涤三次。然后，将细胞在37°c下与2mm的dcfh-da培育30分钟。最后，通过clsm在488nm的激发下观察到活性氧的分布。图6(a)可以看出uio-67@mnbr(co)5@gox的那组绿色荧光最强，表明uio-67@mnbr(co)5@gox产生•oh的量最多。

图6(b)通过co探针(探针1+氯化钯，每个1µm，15µldmso)对hela细胞中的co进行荧光成像。hela细胞用100µg/m的uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox孵育4小时，然后用pbs洗涤三次。然后，将细胞在37°c、5%co的培养箱内下与2mm的co探针孵育30分钟。最后，通过clsm在520nm的激发下观察到co的分布。

图6(c)uio-67、uio-67@mnbr(co)5、uio-67@mnbr(co)5@gox对hela细胞的治疗作用通过活/死细胞染色荧光成像图。将hela细胞以每培养皿1.0×10⁵个细胞的密度接种到玻璃底培养皿（20mm）上24小时。然后，将细胞与样品溶液孵育24小时后，吸掉培养基，并用pbs洗涤细胞3次去除培养基。然后，将细胞用钙黄绿素-am和碘化吡啶(pi)的pbs缓冲溶液染色30分钟。最后，将细胞用pbs洗涤3次并通过clsm成像。钙黄绿素-am的绿色荧光在488nm处激发，并用500-550nm带通滤光片检测到。pi的红色荧光在633nm处激发，并用660–710nm带通滤光片检测到。图6(c)可以看出uio-67@mnbr(co)5@gox的那组绿色荧光最弱，红色荧光最多，表明uio-67@mnbr(co)5@gox杀死细胞的效果最好。

本发明提供的co治疗剂通过以uio-67为载体并在其骨架上修饰mnbr(co)5和孔道内负载gox。首先所述的高孔隙率uio-67是采用高温溶剂热的方法制备的，其具有单分散性和尺寸分布均一。其次，通过形成配位键，将mnbr(co)5修饰到uio-67骨架上，可以作为co气体的载体。再进一步在uio-67的多孔道内负载gox，最终实现了肿瘤微环境响应性的功能。再次，利用uio-67@mnbr(co)5本身的降解的mn²⁺和细胞内过表达的h2o2反应生成•oh实现ros治疗，因此本发明的co气体治疗剂可以结合co气体、活性氧、肿瘤饥饿治疗三者协同作用，实现高效抗肿瘤治疗。