USP16抑制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的应用的制作方法

本发明属于前列腺癌治疗技术领域，具体涉及usp16抑制剂在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

背景技术：

前列腺癌是世界范围内男性死亡的主要原因之一。由于雄激素受体(ar)在前列腺癌的发生发展起着重要作用，大多数原发性前列腺癌患者均接受雄激素剥夺治疗(adt)作为一线治疗。虽然adt对前列腺癌的早期治疗效果较好，但在18-24个月内，多数患者都会复发为去势抵抗性前列腺癌(crpc)，这被认为是前列腺癌的晚期阶段，几乎无法治愈。目前crpc的一线治疗有恩杂鲁胺，多西他赛等，但多西他赛化疗会导致严重的不良反应，影响患者的生活质量。因此，前列腺癌迫切需要新的治疗策略。

原癌基因myc是一种强力的转录因子，调控至少15％的全基因组的转录及一系列生物过程，包括细胞增殖、代谢、蛋白翻译和细胞周期进程。此外，myc被认为是crpc的关键驱动因素之一。c-myc在大多数crpc中表达上调，其表达与不良预后相关。据报道，小鼠myc水平的降低有益于延长寿命。但由于c-myc的结构和亚细胞定位，针对c-myc的有效治疗方法很少。作为转录因子，c-myc缺乏酶活性，很难被小分子靶向。此外，c-myc主要位于细胞核中，这使得基于单克隆抗体的治疗不切实际。为了克服这一局限性，通过抑制c-myc的上游从而抑制c-myc表达是一种具有可观前景的治疗方案。

人类usp16基因位于21号染色体上，并在ds中为三体型。usp16基因包含具有相同起始密码子、终止密码子和翻译框架的3个mrna转录本。usp16首先被鉴定为一种组蛋白h2a特异性去泛素化酶，其调节人细胞中的细胞周期进程和基因表达，这种去泛素化酶能将泛素蛋白从dna相关性组蛋白h2a的第119号位上的赖氨酸残基h2a-k119上分解下来，并上调ink4a基因座的转录。为了应对dna损伤，usp16会herc2依赖性的上调。此外，usp16可以调节胚胎干细胞基因表达和造血干细胞功能。最近研究报道，usp16的下调会促使肝细胞癌细胞的生长。但是，对于usp16的表达是否参与前列腺癌细胞的生长并未有任何报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为前列腺癌的诊断和治疗提供新治疗手段及治疗药物，具体提供了usp16抑制剂及其在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的应用。我们选择了usp16，发现usp16通过稳定c-myc促进前列腺癌的发生发展，在翻译后水平上，敲除usp16显著降低了c-myc的丰度，证实了usp16作为一种新型c-myc去泛素化酶，使其成为原发性前列腺癌和crpc的有效治疗靶点。

本发明第一方面提供了usp16抑制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为抑制或降低usp16基因转录或翻译的物质，或能抑制usp16蛋白正常生物学功能的物质。

在某些实施例中，所述usp16抑制剂选自sirna、mirna、shrna中的一种或多种。

在某些实施例中，所述sirna的序列如seqidno:1所示或seqidno:2所示。

在某些实施例中，所述shrna的正义链序列如seqidno:3所示，所述shrna的反义链序列如seqidno:4所示。

在某些实施例中，所述前列腺癌为激素敏感型前列腺癌或去势抵抗型前列腺癌。

在某些实施例中，所述药物为组合物，包括至少一种其他治疗或预防前列腺癌药物。

在某些实施例中，所述至少一种其他治疗或预防前列腺癌药物为恩杂鲁胺。

第二方面，本发明提供了usp16抑制剂和恩杂鲁胺联合制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的应用。

在某些实施例中，所述usp16抑制剂为序列如seqidno:1所示或seqidno:2所示的sirna。

在某些实施例中，所述usp16抑制剂为shrna，所述shrna正义链序列如seqidno:3所示，所述shrna的反义链序列如seqidno:4所示。

本发明相对与现有技术具有的效果：

1)本发明首次提出了usp16作为一种新型c-myc去泛素化酶，使其成为原发性前列腺癌和crpc的有效治疗靶点。

2)本发明还提供了usp16的抑制剂分子，例如sirna、mirna及shrna等，能够有效沉默usp16的表达，在敲降usp16，与对照组相比，细胞增殖及生长受到显著抑制，且c-myc的蛋白水平显著下调，

3)本发明还提供了联合用药的方案，通过实验证明对激素敏感型前列腺癌细胞系lncap敲降usp16，细胞生长受到抑制，且在低雄激素环境下受到的抑制更明显。与单用恩杂鲁胺或单独敲降usp16的情况相比，二者联合对lncap细胞的抑制更为显著。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例2中sirna序列敲降usp16后引起细胞生长的显著抑制效果。

图2示实施例5中对激素敏感型前列腺癌细胞系lncap敲降usp16，细胞生长受到抑制。

图3示实施例6中与单用恩杂鲁胺或单独敲降usp16的情况相比，二者联合对lncap细胞的抑制效果。

图4示实施例7中对去势抵抗型前列腺癌细胞系pc3、du145(购自atcc)敲降usp16，与对照组相比细胞增殖及生长的已知效果。

图5示实施例8中用pc3细胞在裸鼠(balb/cnude，购自上海斯莱克)皮下荷瘤，每只注射1*10^6个细胞，8周后取出测量瘤重及大小。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。

实施例1sirna的设计与制备

设计sirna序列：

利用thermo公司的block-itrnaidesigner的在线设计网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)进行设计，选着sirna设计选项，输入基因编号，勾选orf、5‘utr、3’utr选项，选择种属，gc含量控制在35％-55％，点击rnaidesign按钮，选择生成的评分较高的sirna序列。

根据sirna序列设计引物，通过化学合成得到4条单链dna模板，再退火得到双链模板。dna模板序列设计如下：gatcac(增强子序列)+taatacgactcactataggg(t7启动子序列)+x19-21(特点sirna序列)+tt，其中sirna序列分别为si1：ccuccuguucuuacucuucauuuaa(seqidno:1)、si2：ccggaaaucuuagauuuggcuccuu(seqidno:2)。

退火模板：

1)按rnase-freeh2o14μl，100μm引物模板2μl，100μm反向互补引物模板2μl，10×annealingbuffer2μl体系进行退火；

退火程序如下：95℃2min，0.1℃/sec降至22℃，22℃10min。

转录反应：

1)按ntpmix8μl，10×transcriptionbuffer2μl，t7enzymemix2μl，引物退货模板14μl，引物退火模板24μl混合，在恒温水浴锅中，37℃过夜反应。

2)向转录产物中加入：rnase-freeh2o17μl，dnasei1μl，rnaset1(10u/μl)2μl，37℃孵育30min。

产物纯化：

1)rnacleanbeads取出，平衡至室温，使用前颠倒混匀；

2)向酶解后的液体中，加入200μl异丙醇、80μl磁珠，充分混匀，室温孵育8min；

3)置于磁力架上，待上清澄清后，去除，加入200μldepc水配制的80％乙醇，室温孵育30sec，再去除，并再重复一次；

4)干燥磁珠10min后，加入40μl的depc水，充分混匀，并室温孵育3min；

5)置于磁力架上，待上清澄清后，小心吸取上清，检测其a260吸光度，并-20℃保存。

实施例2sirna的转染

细胞准备：

1)提前一天，将待转染细胞消化，铺于6孔板中，过夜贴壁，使之处于60％的汇合度；

2)在转染前半个小时，将上清去除，pbs清洗两遍，加入1ml空白培养基(不含双抗、血清)。

转染试剂孵育：

每个ep管中加入250μlopti-mem培养基，一管中加入5μl实施例1制备得到的sirna(20μm)，另一管中加入5μllipofectamine2000，放置5min后，混合，轻弹混匀，室温孵育20-30min。

转染：

将孵育好的转染体系加入细胞，培养箱中孵育6h后更换为完全培养基。

我们发现，如图1所示，在激素敏感型前列腺癌lncap细胞系中，使用此两条sirna序列敲降usp16后引起细胞生长的显著抑制。

实施例3核酸载体构建

1、构建插入片段

1)按照如下格式设计引物：5'-ccgg-敲除序列-ctcgag-反向互补敲除序列-tttttg-3'；5'-aattcaaaaa-敲除序列-ctcgag-反向互补敲除序列-3'。敲降usp16的shrna序列为：gccagaagaaatcatgtttat(seqidno:3)；cggtgatattccacaagattt(seqidno:4)

2)将两条引物稀释到100nm浓度，按照如下体系进行退火：1μl前向引物，1μl后向引物，8μlddh2o；于水浴锅中退火：95℃5min，冷却至室温。

2、酶切、回收载体

1)按照如下体系酶切plko.1载体：4μg质粒，5μlbuffer，1μlagei，1μlecori，加ddh2o至50μl，于37℃水浴锅中酶切2-4h；

2)向酶切产物中加入6×dna上样缓冲液，混匀，再加热琼脂糖凝胶上样孔内，140v，30min进行琼脂糖凝胶电泳；

3)将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外成像仪中，观察酶切产物条带是否高于质粒对照条带，如是，则切取该条带，加入500μldna回收试剂盒中buffergdp，置于55℃水浴锅中，直到完全溶解；

4)取出溶解的液体，冷却至室温，再加入dna回收柱，12000rpm1min，丢弃滤过液；

5)加入600μlbuffergw，12000rpm1min，丢弃滤过液，重复一遍，再12000rpm3min；

6)取出过滤柱，注意不要碰到下部的液体，置于新的ep管中，向柱内加入40μlddh2o，室温放置10min，再12000rpm3min；

7)滤过液即为酶切好的载体，-20℃保存备用。

实施例4酶联转化、病毒包装及稳转系建立

1、酶联转化

1)按如下体系进行酶联：1μl酶切好的载体，4μl退火产物，5μlsolutioni；16℃水浴锅反应30min；

2)取感受态于冰上溶解，10μl酶联产物中加入100μl感受态，冰上吸附10-20min；

3)将吸附过酶联产物的感受态置于42℃水浴锅中，热激1min；

4)热激后，迅速置于冰上10min；

5)加入1ml不含氨苄抗生素的lb，与摇床上，37℃，250rpm，振荡培养1h；

6)将菌液3000rpm离心3min，去除上清，用100μllb重悬菌体沉淀，涂在含有氨苄抗生素的平板上，再置于37℃烘箱中，过夜培养；

7)挑取直径达1-2mm的菌落，加入1ml含氨苄抗生素的lb中，37℃摇床250rpm，振荡培养8h，送测序；

8)比对测序结果，判断片段是否成功插入载体中。

2、病毒包装

1)提前一天将293t细胞消化铺于6孔板中，使细胞贴壁后约30-50％汇合度；

2)按如下体系配制转染体系：500μlopti-mem，15μlpei溶液，2μg目的质粒，1.33μgpspax2，0.66μgpvsvg,混匀后，室温孵育15-30min；

3)将孵育好的转染体系加入带转染的293t细胞中，继续培养，第二天补充培养基1ml；

4)转染后48h收取培养基，1500rpm离心10min，再吸取上清-80℃保存备用，重新向细胞中加入2.5ml完全培养基，转染后72h，重复上述步骤，收取病毒-80℃保存备用。

3、稳转系建立

1)提前一天将待转染细胞消化铺于12孔板中，使细胞贴壁后约30-50％汇合度；

2)将病毒液取出溶解，去除待转染细胞上清，加入400μl病毒液及200μl完全培养基，再加入4μlpolybrene(2mg/ml)；

3)培养16h后，更换完全培养基，继续培养两天；

4)加入含puromycin的完全培养基(5μg/ml)，每两天更换一次，筛选至细胞不再死亡，而对照未感染的亲代全部死亡为止。

实施例5

按照实施例4中的方法使用shrna敲降lncap细胞中的usp16后，使用mtt法分别测量对照组与敲降组的细胞生长曲线。

1)将贴壁细胞消化后，重悬，血球计数板计数，随后稀释细胞浓度至1000-2000个/100μl，将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μl，边缘孔加入pbs进行液封；

2)待过夜细胞贴壁后，加入15μlmtt溶液，37℃孵育3-4h，去除上清，加入150μl分析级dmso，吹打以溶解甲臢，于m1000pro全自动酶标仪中，检测并记录490nm波长的吸光度；

3)随后去除dmso，pbs清洗两遍后，pbs液封，每次检测重复以上步骤，每隔3天更换孔中培养基。

将对照组与敲降组lncap细胞先用去雄血清配置的培养基接种于24孔板中，再分别加入指定浓度的双氢睾酮(dht，雄激素受体激动剂)，5天后消化计数，如图2所示，发现在低雄激素环境下，usp16敲降组细胞生长受到明显抑制。

实施例6

cck8法

1)将贴壁细胞消化后，重悬，血球计数板计数，随后稀释细胞浓度至1000-2000个/100μl，将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μl，边缘孔加入pbs进行液封；

2)待过夜细胞贴壁后，吸去培养基，加入100μl培养基和10μlcck8溶液，37℃孵育2-3h，于m1000pro全自动酶标仪中，检测并记录450nm波长的吸光度；

3)每次检测重复以上步骤，每隔3天更换孔中培养基。

如图3所示，将对照组与敲降组lncap细胞分别用恩杂鲁胺(10μm)或二甲基亚砜(dmso)处理，再利用cck8法检测细胞活性，发现恩杂鲁胺对usp16敲降组的抑制较对照组及dmso处理组更为明显。

实施例7

按照例4中的方法建立稳定敲降usp16的pc3与du145细胞系，使用cck8法与克隆形成实验检测细胞生长增殖能力。使用westernblot法验证usp16敲降效率并检测细胞c-myc蛋白水平。

克隆形成实验

1)将贴壁细胞消化后，重悬，血球计数板计数，6孔板中每孔加入1000-5000个细胞；

2)培养2周后，待克隆生长到肉眼可见大小，去除上清，pbs清洗两遍，加入1ml甲醇固定10min；

3)再去除甲醇，加入1ml结晶紫溶液，染色1h以上；

4)回收结晶紫，用蒸馏水冲洗直至背景透明，晾干，于扫描仪中采集图像，统计克隆数量。

westernblot法

1)蛋白样本收集与处理

吸去细胞培养基上清，pbs清洗两遍，视细胞量，加入50-200μl2×上样缓冲液，冰上裂解5min，收集于ep管中，100℃加热10min。

2)sds-page电泳

将sds-page胶组装进电泳槽中，加入1×电泳液，再将冷却至室温的蛋白样品或蛋白maker，加至sds-page胶加样孔内，电泳仪设置为：70v，40min，120v，1h，接上电极后，开始电泳。

3)转膜

将1x转膜液提前置于4℃冷房中预冷，并将pvdf膜在无水甲醇中浸泡1min。将电泳结束的sds-page胶取下，按照海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵叠加，注意驱赶气泡，放入转膜槽中，90v、100min转膜。

4)封闭与抗体孵育

封闭

将转好的pvdf膜取出，加入tbst，清洗两遍，随后加入5％bsa，置于水平摇床室温封闭1h以上。

一抗孵育

将封闭完成的pvdf膜取出，tbst清洗两遍，加入稀释好的一抗，4℃过夜或室温2h孵育；回收一抗，pvdf膜用tbst振荡清洗三遍，每次10min。

二抗孵育

加入稀释好的化学二抗，置于水平摇床室温孵育1h；回收二抗，pvdf膜用tbst振荡清洗三遍，每次10min。

蛋白检测

将膜放入化学成像仪中，滴加曝光液，获取蛋白检测图像。

如图4所示，我们发现，敲降usp16组的450nm吸光值及克隆数目显著小于对照组，提示细胞生长增殖能力受到显著抑制；westernblot结果显示，usp16被成功敲降，且c-myc蛋白水平显著下调。

实施例8

裸鼠皮下荷瘤

1)pc3对照组与敲降usp16组细胞消化计数，中和后，1500rpm离心5min；

2)去除上清，pbs重悬，1500rpm离心5min，重复该步一遍；

3)将细胞用pbs重悬，置于冰上；

4)抓取6周龄雄性裸鼠，于裸鼠下肢皮肤松软处进针注射，每只注射100μl体积，1×106细胞；

5)一周后每隔两天观察皮下是否有肿瘤长出，并记录肿瘤大小。

荷瘤收集处理

1)约八周后，将小鼠至于密闭笼盒中，首先利用较低浓度二氧化碳麻醉小鼠，再利用高浓度二氧化碳处死小鼠；

2)将小鼠固定于解剖板上，完整取出皮下荷瘤；

3)称量荷瘤重量，拍照记录，保存供后续实验备用。

检测结果如图5所示，敲降usp16组肿瘤大小及重量均显著小于对照组，p<0.001。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

sequencelisting

<110>上海市第五人民医院

<120>usp16抑制剂在制备治疗或预防前列腺癌的药物中的应用

<130>2021

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>1

ccuccuguucuuacucuucauuuaa25

<210>2

<211>25

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>2

ccggaaaucuuagauuuggcuccuu25

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>3

gccagaagaaatcatgtttat21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>4

cggtgatattccacaagattt21