一种改善缺氧应激状态的组合物及其制备方法及其应用

1.本发明涉及一种改善缺氧应激状态的组合物及其制备方法及其应用，属于食品和医药保健领域。


背景技术：

2.缺氧是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍，而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧是高原、航空、潜水等特殊环境最普遍的应激因素。研究表明，持续稳定的缺氧环境可使机体建立缺氧适应，这对机体维护自身平衡和内环境稳定是有益的，但是过强或长期的缺氧应激则会给机体带来严重危害，最终可导致机体心、脑等重要脏器由于能量供应不足而死亡。
3.因此，寻找有效的干预手段对于预防缺氧引起的肺部和心脑血管疾病至关重要。植物提取物在预防缺氧损伤中具有保护作用，如银杏叶提取物可通过抗氧化、抗炎以及抗凋亡机制保护心肌细胞免受缺氧损伤；红景天提取物改善了缺氧小鼠诱导的高原肺水肿，减轻了缺血性脑损伤。因此，从植物中筛选具有抗缺氧活性的提取物或单体化合物是研发抗缺氧药物和保健品行之有效的方法。
4.留兰香为唇形科薄荷属植物(herba menthae spicatae)，《本草纲目》中记载辛、凉、无毒，具有发汗、退热、祛风、止痒等功能。长期作菜生吃或熟食，能却肾气、祛邪毒、除劳气、解劳乏，使人口气香洁。煎汤洗可治膝疮。还可治痰多及各种伤风头脑风。此外，榨汁服可去心脏热及口齿诸病；捣成汁含漱去舌胎语涩；用叶塞鼻，止衄血；还可涂治蜂螫蛇伤。《食医心镜》也写道留兰香煎豉汤、暖酒和饮、煎茶、生吃皆可，比菜更有益处。主要分布于中国河北、江苏、浙江、广东、广西、四川，贵州、云南等地，全年均可采收，来源丰富。留兰香提取物已被报道具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等功效。但是，目前并未见关于留兰香提取物在抗缺氧方面的报道。
5.野樱莓树是蔷薇科的一种落叶灌木，原产于北美洲东部湿树林和沼泽，是集食用、药用、园林和生态等价值于一身的珍贵树种，成熟的野樱莓果可用于加工果汁、果酒、果酱、罐头、果脯等食品和饮料。野樱莓果含有对人体有益的成分，如vb，ve，vc，以及叶酸、奎宁酸、多酚酸、单宁、儿茶素、槲黄素、芸香素、橙皮苷、白藜芦醇和花青素等。野樱莓果提取物已被报道具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肝损伤、抗肥胖、抗高血压等功效。但是，目前野樱莓果提取物在抗缺氧方面的报道暂未发现。
6.因此有必要设计一种新的改善缺氧应激状态的组合物及其制备方法及其应用，以克服上述问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种改善缺氧应激状态的组合物及其制备方法及其应用，该改善缺氧应激状态的组合物具有明显的抗缺氧活性，能显著性抑制脑部小胶质细胞的缺氧凋亡，并显著提高缺氧小鼠的生存时间，减轻缺氧导致的脑组
织损伤，降低动物脑组织中的缺氧诱导因子的表达以及减轻脑部因缺氧导致的氧化应激状态，对缺氧引起的组织损伤有着显著协同增效的作用。
8.本发明是这样实现的：
9.本发明提供一种改善缺氧应激状态的组合物，所述改善缺氧应激状态的组合物包括留兰香提取物和和野樱莓果提取物。
10.进一步地，所述留兰香提取物和野樱莓果提取物的质量比为(1-10)：(0.5-5)。
11.进一步地，所述留兰香提取物和野樱莓果提取物的质量比为(2.5-7)：(1-3.5)。
12.本发明还提供一种改善缺氧应激状态的组合物的制备方法，包括以下步骤：
13.步骤一：取留兰香，粉碎后加入乙醇，回流提取1-3次，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩得浸膏液，喷雾干燥，干膏粉碎，过筛，得到留兰香提取物；
14.步骤二：取野樱莓果，粉碎后加水，提取1-3次，合并提取液，过滤，浓缩至浸膏液，真空干燥，粉碎，过筛，得到野樱莓果提取物；
15.步骤三：将步骤一中的留兰香提取物和步骤二中的野樱莓果提取物按照质量比为(1-10)：(0.5-5)进行混合，即可得到所述改善缺氧应激状态的组合物。
16.进一步地，在步骤二中，真空干燥处理的条件为温度保持40～50℃，压力保持0.06～-0.08mpa。
17.本发明还提供一种改善缺氧应激状态的组合物的应用，所述改善缺氧应激状态的组合物应用于制备口服制剂。
18.进一步地，所述口服制剂剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液。
19.进一步地，所述改善缺氧应激状态的组合物应用于制备抗缺氧药物、保健品或食品。
20.进一步地，所述抗缺氧药物、保健品或食品是指预防或治疗急慢性缺氧引起的损伤的药物、保健品或食品。
21.进一步地，所述抗缺氧药物、保健品或食品是指预防或治疗因体内血氧浓度下降所引发的肺部及心脑血管疾病的药物、保健品或食品。
22.本发明具有以下有益效果：
23.本发明提供了一种改善缺氧应激状态的组合物，即留兰香提取物和野樱莓果提取物复配使用，具有明显的抗缺氧活性，能显著性抑制脑部小胶质细胞的缺氧凋亡，并显著提高缺氧小鼠的生存时间，减轻缺氧导致的脑组织损伤，降低动物脑组织中的缺氧诱导因子的表达以及减轻脑部因缺氧导致的氧化应激状态，对缺氧引起的组织损伤有着显著协同增效的作用。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
25.图1为本发明实施例提供的bv2细胞活性图；
26.图2为本发明实施例提供的亚硝酸钠诱导小鼠缺氧性存活时间图。
27.图3为本发明实施例提供的动物在缺氧模型下，血液中hif-1α(缺氧诱导因子α)，sod(超氧化物歧化酶)、ros(活性氧)的表达示意图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明提供一种改善缺氧应激状态的组合物，所述改善缺氧应激状态的组合物包括留兰香提取物和和野樱莓果提取物。
30.进一步地，所述留兰香提取物和野樱莓果提取物的质量比为(1-10)：(0.5-5)。
31.在本较佳实施例中，所述留兰香提取物和野樱莓果提取物的质量比为(2.5-7)：(1-3.5)。
32.本发明还提供一种改善缺氧应激状态的组合物的应用，所述改善缺氧应激状态的组合物应用于制备口服制剂。所述口服制剂剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液或其它适合口服的剂型形态。本发明所述组合物的口服制剂，可采用现有制药领域中的常规方法制得，必要时可以添加各种药学上可接受的辅料，包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂等。
33.进一步地，所述改善缺氧应激状态的组合物应用于制备抗缺氧药物、保健品或食品。所述抗缺氧药物、保健品或食品是指预防或治疗急慢性缺氧引起的损伤的药物、保健品或食品。另，所述抗缺氧药物、保健品或食品还可以是指预防或治疗因体内血氧浓度下降所引发的肺部及心脑血管疾病的药物、保健品或食品。
34.本发明还提供一种改善缺氧应激状态的组合物的制备方法，包括以下步骤：
35.步骤一：取留兰香，粉碎后加入3-8倍量的70％乙醇，回流提取1-3次，过滤，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩得浸膏液，喷雾干燥，干膏粉碎，过80目筛，得到留兰香提取物。
36.步骤二：取野樱莓果，粉碎后加2-8倍量水，提取1-3次，第一次0.5-2h，第二次0.5-2h，合并提取液，过滤，浓缩至浸膏液，真空干燥，粉碎，过80目筛，得到野樱莓果提取物；其中，真空干燥处理的条件为温度保持40～50℃，压力保持0.06～-0.08mpa。
37.步骤三：将步骤一中的留兰香提取物和步骤二中的野樱莓果提取物按照质量比为(1-10)：(0.5-5)进行混合，即可得到所述改善缺氧应激状态的组合物。
38.本发明中药组合物中的留兰香提取物和野樱莓果提取物可以分别用适宜的溶剂和方法单独提取加工得到提取物，再加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的口服制剂。所述的“单独提取”是指留兰香和野樱莓果分别通过不同的工艺单独提取得到提取物。
39.上述留兰香提取物和野樱莓果提取物的提取制备方法中，所用的溶剂是指药学上常用的溶剂，可以是水或乙醇等；所用的方法是指中药提取的一般方法，可以是煎煮法、回流提取法、浸渍法、渗漉法或连续提取法等。例如，留兰香可以用乙醇回流提取或水提醇沉的方法提取制备得到留兰香，野樱莓果以用乙醇回流提取制备得到野樱莓果提取物。本发
明提供了留兰香提取物和野樱莓果提取物的优选提取制备工艺，以下通过具体实施例进行说明：
40.所述的留兰香提取物的优选提取制备工艺如下：取所述重量份的留兰香，粉碎后加入70％乙醇6倍量，回流提取3次，滤过，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩浸膏液，喷雾干燥，干膏粉碎，过80目筛，得留兰香提取物。
41.所述的野樱莓果提取物的优选提取制备工艺如下：取所述重量份的干燥野樱莓果，粉碎后，加水8倍量，提取2次，第一次2h，第二次1.5h，合并提取液，滤过，浓缩至浸膏液，真空干燥，粉碎，过80目筛，得野樱莓果提取物。其中，所述的低温真空干燥为在40～50℃，0.06～-0.08mpa下进行。
42.将留兰香提取物和野樱莓果提取物按照质量比为(1-10)：(0.5-5)进行混合，即可得到所述改善缺氧应激状态的组合物。
43.实施例1，
44.对改善缺氧应激状态的组合物的抗缺氧活性进行体外研究：
45.本实验采用mtt法测定药物对异常增生的前列腺上皮及基质细胞的细胞活性抑制作用，利用体外实验初步验证药物对前列腺增生细胞的抗增殖活性。
46.实验材料与方法：
47.(1)实验材料：以鼠小胶质细胞bv2细胞为实验细胞。
48.(2)实验分组：细胞实验分为空白对照组和药物组，其中药物组包括留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组(y)、组合物组(l/y)，各组所用剂量浓度分别为50μg/ml，100μg/ml，40μg/ml，其中组合物组的留兰香提取物组和野樱莓果提取物组的质量比为5：3。
49.在补充有10％胎牛血清和10μl/ml的链霉素/青霉素的dmem培养基中培养了bv2细胞；培养维持在37℃下、5％co2的培养箱中，每2-3天更换培养基；然后bv2细胞细胞接种于96孔板上，培养24h后，根据不同分组的药物浓度，将药物单独和组合地加入96孔板中，并加入终浓度为1mmcocl2，处理细胞24h。
50.(3)细胞活力检测：通过mtt比色测定评价细胞活力，通过四唑盐的比色测定测量处理后的细胞活力，评价细胞通过线粒体琥珀酸脱氢酶还原3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(mtt)的能力。mtt进入细胞并进入线粒体中，在线粒体中被还原为有颜色的不溶产物甲臜(formazan)。为了使颜色可见，通过添加dmso将有颜色的甲臜颗粒溶解。mtt裂解反应需在完整的细胞中进行，且其与细胞的代谢活性程度成比例。
51.在37℃、5％co2条件下将细胞与溶于培养基的100μl的mtt溶液(500μg/ml)一起孵育4h之后，除去上清液并添加150μl的dmso。然后，通过酶标仪在570nm的波长下测量光密度(o.d.)。
52.细胞活力表达为相对与未处理的空白对照组的光密度的百分比，对于每种样品，均进行三次重复实验。
53.实验结果：不同处理组bv2细胞增殖测定结果如图1所示，图1是bv2细胞活性图，表示留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组(y)以及组合物组(l/y)在1mmcocl2存在的环境下给药24h后获得的bv2细胞的细胞活力百分比，以对比药物对小胶质细胞缺氧性凋亡的抑制作用；
54.从所进行的mtt测定获得的数据显示了当单独使用留兰香提取物组(l)、野樱莓果
提取物组(y)时，它们均能够提高bv2细胞的细胞活力，降低因cocl2引起的细胞缺氧性凋亡。而利用组合物组(l/y)处理相同的细胞系，细胞活力显著增加，药物合用组比单独用药组的细胞抑制率高了20％，具有明显的协同抗增殖作用。
55.药物协同作用判断标准：利用多药物效应方程来判断三种药物的协同效应。多药物效应方程为：
[0056][0057]
其中，(dx)1是关于药物d1单独给药时细胞存活率为x％时的浓度，(dx)2同理。药物组合(d)1、(d)2为联合用药时细胞存活率为x％时的浓度；ci《1、＝1、》1分别对应协同、加和与拮抗。
[0058]
从图1可得，dx1、dx2细胞增殖率约为50％，dx1＝50μg/ml，dx2＝100μg/ml，假设组合物增殖率为70％时，则dx1＝70μg/ml，dx2＝140μg/ml，d1＝25，d2＝15，则ci《1，三种药物组合有协同增效的效果。
[0059]
实施例2，
[0060]
对改善缺氧应激状态的组合物的抗缺氧活性体内评价：
[0061]
(1)实验材料：以c57小鼠为实验动物。
[0062]
(2)验分组：动物实验分为空白组、模型组和药物组，其中药物组包括留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组(y)、组合物组(l/y)，所用剂量浓度分别为50mg/kg、40mg/kg、30mg/kg，其中组合物组的留兰香提取物和野樱莓果提取物的质量比为4：1。
[0063]
(3)实验方案：给药周期为14天，期间每天记录小鼠体重，给药方案为：小鼠按照10g/0.2ml的灌胃比例给药，空白组与模型组灌胃生理盐水，药物组灌胃对应药物。灌胃结束后，用生理盐水将nano2配制成10mg/ml溶液，腹腔注射(0.2ml/10g)到小鼠体内(最终剂量为200mg/kg)。记录从注射到小鼠死亡时间。小鼠死亡后，立即取小鼠血液检测hif-1α、sod、ros含量。
[0064]
(4)实验结果：如图2所示，图2是亚硝酸钠诱导小鼠缺氧性存活时间图，表示留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组(y)以及组合物组(l/y)在给药14天后，对急性亚硝酸钠诱导小鼠缺氧死亡的存活时间，以对比药物对动物急性缺氧模型的抑制作用；当单独给药留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组(y)时，它们均能延长缺氧小鼠的死亡时间，且留兰香提取物的效果比野樱莓果提取物效果好。而组合物组(l/y)给药后，同样显著提高缺氧小鼠的死亡时间，且相较于单独用药组，死亡时间延长了近30％。具有明显的协同抗缺氧作用。
[0065]
如图3所示，对小鼠血液中的hif-1α(缺氧诱导因子α)，sod(超氧化物歧化酶)、ros(活性氧)的表达量进行检测，留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组(y)以及组合物(l/y)均能降低hif-1α的表达，说明三者都存在一定的抗缺氧活性，其中，组合物组(l/y)较单独给药留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组，对hif-1α的下调力度更大。sod和ros是经典的能准确反映体内存在氧化应激状态的指标，氧化应激状态越严重，sod的表达会下降，而ros的表达增加。组合物组(l/y)较单独给药留兰香提取物组(l)、野樱莓果提取物组，明显增加对sod的表达，同时下调体内的ros水平，以上数据反映出组合物组(l/y)具有明显的协同抗缺氧作用。
[0066]
实施例3，
[0067]
将改善缺氧应激状态的组合物制备成用于抗缺氧的微胶囊：
[0068]
留兰香提取物1kg，野樱莓果提取物0.4kg，卵磷脂2kg，乳化剂(单甘油脂肪酸酯、双甘油脂肪酸酯按重量1:1的混合物)0.5kg，油性组份(亚麻籽油、南瓜籽油及椰子油按重量1：1：1的混合物)10kg，填充剂(麦芽精3％、糊精1％及淀粉2％)水溶液46.1kg。
[0069]
制备方法：
[0070]
(1)先将卵磷脂与油性组份混合均匀成油相，加入留兰香提取物到油相中，80℃加热并均质搅拌9h，让留兰香提取物均匀分散，形成留兰香提取物油相分散液；
[0071]
(2)1:4的水和乳化剂，加入野樱莓果提取物，加热到70℃，均质搅拌1h，形成水分散乳液；
[0072]
(3)将水分散乳液加入留兰香提取物油相分散液，加热到70℃，均质搅拌1h；
[0073]
(4)加入其余原料，混合均匀，通过喷雾塔进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为120℃，塔内温度60℃，出风温度65℃，通过流化床进行冷却，冷却到30℃得到棕褐色粉末，即得到用于抗缺氧的微胶囊。
[0074]
综上所述，本发明提供的改善缺氧应激状态的组合物，即留兰香提取物和野樱莓果提取物复配使用，具有明显的抗缺氧活性，能显著性抑制脑部小胶质细胞的缺氧凋亡，并显著提高缺氧小鼠的生存时间，减轻缺氧导致的脑组织损伤，降低动物脑组织中的缺氧诱导因子的表达以及减轻脑部因缺氧导致的氧化应激状态，对缺氧引起的组织损伤有着显著协同增效的作用。
[0075]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。