一种碳化聚合物点协银杏内酯B突破血脑屏障进行的脑部药物递送系统

一种碳化聚合物点协银杏内酯b突破血脑屏障进行的脑部药物递送系统
技术领域
1.本发明属于纳米材料和生物医用材料技术领域，具体涉及一种碳化聚合物点协银杏内酯b突破血脑屏障进行的脑部药物递送系统。


背景技术：

2.银杏内酯b是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，也可扩张脑部血管，使缺血性脑部组织血流恢复，对于治疗缺血性脑中风疾病已显示出巨大的潜力。然而由于血脑屏障阻隔作用，使银杏内酯b无法有效的穿透血脑屏障递送进脑部组织并发挥相应的药效。因此研制可穿透血脑屏障的药物递送方法，对于实现脑部疾病治疗具有重要意义。
3.以纳米材料为平台构建的药物递送系统，可将药物高效的递送至脑部病变部位，以发挥药效。碳化聚合物点作为一种新型碳基纳米材料，由于其荧光特性、无(低)毒、易制备、易修饰等优点，已广泛的用于生物成像、药物递送、光热/光动力治疗等领域。例如：专利cn112080277a公开了一种氮掺杂碳量子点及其制备方法及其用于核酸类药物的递送。再如：cn108359453a公开了一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点及其在生物成像中的应用。
4.然而，目前以碳化聚合物点为载体，用于脑部药物递送的方法，还未见报道。因此，以碳化聚合物点构建脑部药物递送系统，实现银杏内酯b的高效递送，对于治疗缺血性脑中风疾病具有重要意义。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术中存在的不足。本发明提供了一种以碳化聚合物点负载银杏内酯b突破血脑屏障进行的脑部药物递送系统。该系统由10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b和碳化聚合物点通过10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b上的羧基与碳化聚合物点上的氨基形成酰胺键连接；
6.集合药物示踪和药物的脑部递送功能于一体。由于碳化聚合物点本身的光致发光特点，通过荧光成像仪观察，可以清楚看到，搭载了银杏内酯b的碳化聚合物点在小鼠的脑部富集，有利于提高银杏内酯b的治疗效果。
7.构建所提供的银杏内酯b脑部递送系统的方法，包括以下过程：
8.(1)碳化聚合物点的制备
9.用于银杏内酯b负载的碳化聚合物点，是以柠檬酸和尿素通过溶剂热的方法制备得到。优选地，柠檬酸和尿素的物质的量比为10:1～1:10；反应溶剂包括：n,n
‑
二甲基甲酰胺，甲酰胺，n
‑
甲基吡咯烷酮；溶剂热反应温度150～250℃；反应时间5～12小时。反应所得的溶液通过离心，反沉淀，过滤，渗析等过程纯化，然后冻干得到碳化聚合物点干燥粉末，实验步骤如下：
10.称取柠檬酸200～2000mg溶于10～50ml的溶剂中，称取尿素60～600mg，充分搅拌，
混合均匀。置于150～250℃的烘箱中反应12小时。冷却至室温后，所得反应液用10000转/分钟的转速离心10分钟，然后用乙酸乙酯反沉淀。得到的固体沉淀，溶于水，用0.22μm的聚醚砜滤膜过滤，然后置于500
‑
1000da的渗析袋中渗析3天(每12小时换一次水)，除去未反应的小分子。渗析结束后，至于冻干机(
‑
30～
‑
10℃，1～10pa)完全除去水溶剂，得到碳化聚合物点干燥粉末，碳化聚合物点的反应如式i：
[0011][0012]
(2)10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b的合成
[0013]
银杏内酯b上无可与碳化聚合物点反应的基团，在此用对溴甲基苯甲酸对银杏内酯b进行衍生化，产生可以与碳化聚合物点上的氨基反应的羧基。苄溴易与羟基发生醚化反应，因此需要控制对溴甲基苯甲酸的量。实验步骤如下：
[0014]
向50ml的圆底烧瓶中加入无水四氢呋喃(10ml)，银杏内酯b(0.05mmol，21.22mg)，对溴甲基苯甲酸(0.055mmol，11.83mg)，碳酸钠(0.1mmol，11.83mg)，在室温下反应2小时。在冰水浴中，向反应液加入100μl的浓盐酸和10ml的去离子水。用10ml的乙酸乙酯萃取3次，用去离子水洗2次，分液取乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，最后用二氯甲烷：甲醇(95:5)的洗脱剂过柱子，最后减压蒸馏得到产物10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b，反应式如下式ii：
[0015][0016]
(3)银杏内酯b偶联碳化聚合物点
[0017]
利用4
‑
二甲氨基吡啶和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐作为催化剂，银杏内酯b衍生物的羧基与碳化聚合物点的氨基发生酰胺反应，反应产物命名为银杏内酯b@碳化聚合物点，实验步骤如下：
[0018]
向50ml的圆底烧瓶中加入20ml n,n
‑
二甲基甲酰胺，然后称取14mg 10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b，3.66mg 4
‑
二甲氨基吡啶，5.75mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，充分溶解，在室温下活化1小时，然后烧瓶中加入70mg碳化聚合物点。室温下反应5小时。反应产物用乙酸乙酯反沉淀，离心得到固体沉淀，将固体沉淀溶于水，用0.22μm的聚醚砜滤膜过滤，然后置于500
‑
1000da的渗析袋中渗析3天(每12小时换一次水)，除去未反
应的小分子。渗析结束后，至于冻干机(
‑
30～
‑
10℃，1～10pa)完全除去水溶剂，得到银杏内酯b@碳化聚合物点粉末，其反应如下式iii：
[0019]
附图说明
[0020]
图1、银杏内酯b@碳化聚合物点的透射电镜照片
[0021]
图2、4
‑
溴甲基苯甲酸、银杏内酯b、10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b傅里叶红外光谱图
[0022]
图3、碳化聚合物点、银杏内酯b@碳化聚合物点的傅里叶红外光谱图
[0023]
图4、10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b核磁共振氢谱
[0024]
图5、碳化聚合物点、银杏内酯b@碳化聚合物点的核磁共振氢谱
[0025]
图6、(a)碳化聚合物点、(b)银杏内酯b@碳化聚合物点荧光光谱图
[0026]
图7、银杏内酯b@碳化聚合物点在小鼠体内的分布图
[0027]
图8、ttc染色观察银杏内酯b@碳化聚合物点对大鼠脑梗死面积的影响
[0028]
图9、he染色观察碳接银杏内酯b@碳化聚合物点对大鼠海马组织病例变化的影响(400x)
具体实施方式
[0029]
下面以具体实施例的形式对本发明技术方案做进一步解释和说明。
[0030]
实施例1碳化聚合物点的制备
[0031]
称取柠檬酸(7.5mmol，1.44g)溶于10ml的n,n
‑
二甲基甲酰胺，称取尿素(10mmol，0.6g)，充分搅拌，混合均匀。置于200℃的烘箱中反应12小时。冷却至室温后，所得反应液用10000转/分钟的转速离心10分钟，然后用乙酸乙酯反沉淀。得到的固体沉淀，溶于水，用0.22μm的聚醚砜滤膜过滤，然后置于500
‑
1000da的渗析袋中渗析3天(每12小时换一次水)，除去未反应的小分子。渗析结束后，至于冻干机(
‑
30～
‑
10℃，1～10pa)完全除去水溶剂，得到碳化聚合物点干燥粉末。
[0032]
实施例2 10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b的合成
[0033]
向50ml的圆底烧瓶中加入无水四氢呋喃(10ml)，银杏内酯b(0.05mmol，21.22mg)，对溴甲基苯甲酸(0.055mmol，11.83mg)，碳酸钠(0.1mmol，11.83mg)，在室温下反应2小时。在冰水浴中，向反应液加入100μl的浓盐酸和10ml的去离子水。用10ml的乙酸乙酯萃取3次，用去离子水洗2次，分液取乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，最后用二氯甲烷：甲醇(95:5)的洗脱剂过柱子，最后减压蒸馏得到产物10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯
b。
[0034]
实施例3银杏内酯b@碳化聚合物点的合成
[0035]
向50ml的圆底烧瓶中加入20ml n,n
‑
二甲基甲酰胺，然后称取14mg 10
‑
(4
’‑
羧基苄氧基)
‑
银杏内酯b，3.66mg 4
‑
二甲氨基吡啶，5.75mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，充分溶解，在室温下活化1小时，然后烧瓶中加入70mg碳化聚合物点。室温下反应5小时。反应产物用乙酸乙酯反沉淀，离心得到固体沉淀，将固体沉淀溶于水，用0.22μm的聚醚砜滤膜过滤，然后置于500
‑
1000da的渗析袋中渗析3天(每12小时换一次水)，除去未反应的小分子。渗析结束后，至于冻干机(
‑
30～
‑
10℃，1～10pa)完全除去水溶剂，得到银杏内酯b@碳化聚合物点粉末。
[0036]
实施例4银杏内酯b@碳化聚合物点的体内分布
[0037]
在640nm激发下以705nm发射评估了cpd在裸鼠体内的成像性能。使用六周大的雄性balb/c裸鼠(20g
±
3g)进行体内成像。尾静脉注射银杏内酯b@碳化聚合物点之前，用乙醚麻醉小鼠。然后通过荧光成像仪对银杏内酯b@碳化聚合物点的全身分布进行成像。
[0038]
实施例5碳化聚合物点
‑
银杏内酯b对大鼠行为学评分和脑梗死面积的影响
[0039]
大鼠水合氯醛麻醉后，分离右侧颈总动脉，颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉，用眼科剪在颈总动脉剪一小口，栓线沿颈内动脉入颅至大脑中动脉，阻断其供血。待缺血3h后将尼龙线轻轻向外拔出1cm左右，进行大脑中动脉再灌注21h。假手术组只结扎颈总动脉，不进行栓塞。手术后将大鼠置于室温25℃环境下饲养。根据longa法评分标准进行行为学评分。在再灌注21h对大鼠进行行为学评分。行为学评分后，将大鼠处死，取脑，将大脑冠状切片，每片厚度2mm左右。用2％ttc溶液，37℃孵育30min染色。缺血区域为白色，非缺血区域为玫瑰红色。应用image j软件分析梗死面积。
[0040]
大鼠行为学评分显示，与假手术组比较，模型组大鼠行为学评分明显增加；与模型组比较，碳接银杏内酯b组大鼠行为学评分明显降低(p＜0.05)，此作用与银杏内酯相似，荧光材料组大鼠行为学评分变化不明显。脑梗死面积检测显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死面积明显增加；与模型组比较，碳接银杏内酯b组大鼠脑梗死面积明显降低(p＜0.05)，荧光材料作用不明显。
[0041]
表1.碳接银杏内酯b对大鼠行为学评分和脑梗死面积的影响(n＝6，x
±
sd)###p＜0.001,vs假手术组；*p＜0.05,vs模型组
[0042][0043]
实施例6碳化聚合物点接银杏内酯b对大鼠海马组织病理学改变的影响
[0044]
脑组织用10％中性福尔马林液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、he染色。光镜下观察病理形态的改变。将大鼠处死后取缺血侧大脑进行匀浆，参照试剂盒说明书进行
指标检测。与假手术组比较，模型组大鼠海马神经元排列紊乱，细胞出现坏死脱落，变形，结构不清晰；与模型组比较，碳接银杏内酯b组大鼠海马神经元损伤减轻；荧光材料组大鼠神经元变性坏死、间质水肿。
[0045]
实施例7碳接银杏内酯b对大鼠脑组织中sod/mda/ldh含量的影响
[0046]
生化指标检测显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中sod含量明显降低，ldh含量明显增高，与模型组比较，碳接银杏内酯b组大鼠脑组织sod含量明显增高，ldh含量明显降低(p＜0.05，p＜0.01)，荧光材料组大鼠脑组织sod/ldh变化不明显。与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中mda含量有升高趋势，与模型组比较，碳接银杏内酯b组大鼠脑组织中mda含量无明显降低。
[0047]
表2.碳接银杏内酯b对大鼠脑组织中sod/mda/ldh含量的影响(n＝6，x
±
sd)#p＜0.05,##p＜0.01vs假手术组；*p＜0.05,**p＜0.01vs模型组
[0048]