TREM-2在制备肿瘤治疗药物和/或诊断试剂中的应用的制作方法

trem
‑
2在制备肿瘤治疗药物和/或诊断试剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，更具体地，涉及trem
‑
2在制备肿瘤治疗药物和/或诊断试剂中的应用。


背景技术：

2.全球肿瘤的发病率和死亡率均在迅速增长，目前在世界各国，癌症是导致死亡的主要原因之一，也是提高人类预期寿命的重要障碍。髓样细胞触发受体(triggering receptors expressed on myeloid cell，trem)是髓系细胞表面表达的一类免疫球蛋白受体家族，其编码基因位于人类染色体6p21和鼠类染色体17c3。trem受体在人类中包括trem
‑
1和trem
‑
2，在小鼠中为trem
‑
3，还有至少两个其他trem样相关分子(trem样转录因子
‑
1和trem样转录因子
‑
2)。trem
‑
2是在trem家族中具有核心作用的重要成员，是由trem
‑
2基因编码的一种膜蛋白，属于trem蛋白家族的跨膜受体，该受体是一种可糖基化的单通道i型膜糖蛋白，包括细胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和胞质尾区3部分，其可通过dnax活化蛋白12和磷酸化络氨酸激酶进行细胞内信号转导，在巨噬细胞、小胶质细胞和破骨细胞上可见其表达。trem
‑
2在慢性炎症进展过程和免疫反应中可刺激炎症因子的产生，其与细胞成熟、存活、增殖、活化、吞噬等多种功能相关。
3.目前trem
‑
2的内源性配体和激动剂尚未发现，信号传导的机制未完全明确。近年来基因筛查结果证实，trem
‑
2基因异源体错义突变是阿尔兹海默病、帕金森病、额颞性痴呆和侧索硬化的危险因素。研究发现，trem
‑
2能够抑制巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素
‑
6等促炎因子从而抑制巨噬细胞活性，削弱其对脂多糖的免疫应答。小胶质细胞中trem
‑
2的过度表达减少经元共培养的细胞中tnf
‑
α和可诱导的一氧化氮合成酶的表达。trem
‑
2表达的抑制使自身免疫性脑脊髓膜炎恶化。这些研究共同表明trem
‑
2在炎症反应中作为一个炎症抑制因子存在。trem
‑
2的调控和表达一直是众多研究者尤其是免疫学家和药学家所感兴趣的，已成为治疗炎症相关中枢神经系统疾病的潜在靶点。
4.现阶段关于恶性肿瘤中trem
‑
2的表达变化和功能活动的研究甚少，尤其是trem
‑
2对于肿瘤特异性杀伤t淋巴细胞的功能目前还没有相关报导研究。目前对于肿瘤的免疫治疗还存在很大的应用局限以及无效性。为了提高肿瘤的早期诊断和非手术治疗效果，提高肿瘤患者的生存率，所以亟需寻找一种新的免疫检查点分子来提高肿瘤的早期诊断率和免疫治疗疗效。


技术实现要素：

5.本发明为了克服现有技术中存在的上述问题，提供了髓系细胞触发受体
‑
2(triggering receptor expressed on myeloid cells，trem
‑
2)的新应用。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.trem
‑
2在制备抗肿瘤的功能产品中的应用，所述功能产品具有抑制肿瘤进展的效果，所述肿瘤为血液肿瘤和实体肿瘤。
8.优选的，所述肿瘤选自肺癌、t淋巴细胞瘤、b淋巴细胞瘤、结肠癌、肝癌、黑色素瘤、肺腺癌。
9.髓系细胞触发受体
‑
2(triggering receptor expressed on myeloid cells，trem
‑
2)是主要表达于单核
‑
巨噬细胞、小胶质细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等细胞表面的免疫球蛋白超家族成员，由胞外免疫球蛋白样区域、跨膜区域和胞内区域组成。目前trem
‑
2的内源性配体和激动剂尚未发现，信号传导机制未完全明确。近年来基因筛查结果证实，trem
‑
2基因异源体错义突变是阿尔兹海默病、帕金森病、额颞性痴呆和侧索硬化的危险因素。这些研究共同表明trem
‑
2在炎症反应中作为一个炎症抑制因子存在。trem
‑
2的调控和表达一直是众多研究者尤其免疫学家和药学家所感兴趣的，已成为治疗炎症相关中枢神经系统疾病的潜在靶点。本发明通过对肿瘤细胞的研究发现，trem
‑
2敲除的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬清除明显减弱，可促进肿瘤的进展，提示trem
‑
2具有抑制肿瘤进展的效果；除了研究对肿瘤细胞的吞噬作用，本发明还研究了肿瘤微环境中trem
‑
2调控t淋巴细胞功能状态，免疫荧光检查发现trem
‑
2分子高表达于肿瘤微环境中的cd8+t细胞，在肿瘤建模的动物实验中，我们发现trem
‑
2全敲小鼠的肿瘤生长大小明显大于野生型小鼠，同样得出了trem
‑
2具有抑制肿瘤进展的效果，有望应用于肿瘤的综合治疗中。
10.优选的，所述功能产品具有上调trem
‑
2基因的表达、转录、或者其表达产物的功能。
11.更优选的，trem
‑
2基因的表达产物是指nlrp12基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于trem
‑
2基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cdna、mrna、前体蛋白、成熟的蛋白、及其片段。
12.作为一种优选的实施方式，所述功能产品包括：trem
‑
2蛋白抑制剂、trem
‑
2基因缺陷或者沉默的免疫相关细胞、其分化细胞或者基因重组构建体中的一种或者多种。
13.更优选的，所述功能产品包括：
14.(i)以trem
‑
2转录本为靶序列，且能够激活trem
‑
2基因表达产物的表达或基因转录的激活型抗体、核苷酸、慢病毒或腺病毒；
15.(ii)含有trem
‑
2互补序列，且能够在转入体内后形成促进trem
‑
2基因表达产物的表达或基因转录的激活分子的构建体；
16.(iii)激活trem
‑
2基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
17.本发明一方面研究发现：(1)在肺癌患者外周血单核细胞中trem
‑
2表达水平升高，(2)在肺癌小鼠脾脏单核细胞中trem
‑
2表达水平升高，(3)在肺癌小鼠肺部巨噬细胞中trem
‑
2表达水平升高，(4)巨噬细胞上trem
‑
2敲除小鼠皮下肿瘤体积显著大于未敲除小鼠，(5)trem
‑
2敲除的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬清除能力显著减弱。
18.因此，在实际应用中，可以通过在巨噬细胞中过表达trem
‑
2，以增强细胞对肿瘤细胞的吞噬清除能力，达到治疗肿瘤的目的。作为一种优选的实施方式，上述应用具体可以是：使用trem
‑
2激活型抗体激活体内巨噬细胞上的trem
‑
2，或者制备trem
‑
2高表达的仿生巨噬细胞或car
‑
t，具有靶向治疗肿瘤的作用。
19.本发明另一方面研究还发现：肿瘤患者外周血单个核细胞中cd8+t细胞上trem
‑
2表达明显高于正常人(p<0.0001)；在人肿瘤组织切片中，免疫荧光检查发现trem
‑
2分子高表达于肿瘤微环境中的cd8+t细胞；在肿瘤建模的动物实验中，我们发现trem
‑
2全敲小鼠的
肿瘤生长大小明显大于野生型小鼠(p<0.05)。因此，可以通过在cd8+t细胞上过表达trem
‑
2，再回输到体内，以增强体液免疫，达到治疗肿瘤的目的。
20.从上述两方面研究，本发明还提供trem
‑
2作为靶点在制备诊断肿瘤的试剂中的应用，所述肿瘤为血液肿瘤和实体肿瘤。
21.优选的，所述肿瘤选自t淋巴细胞瘤、b淋巴细胞瘤、结肠癌、肝癌、黑色素瘤、肺腺癌。
22.优选的，term
‑
2表达于cd8+t淋巴细胞表面，或者表达于cd14单核细胞表面；所述肿瘤的诊断试剂用于检测cd8+t淋巴细胞表面，或者表达于cd14单核细胞表面的term
‑
2的表达水平。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明提出了髓系细胞触发受体(trem
‑
2)在肿瘤治疗中的应用前景，依据包括两方面，一方面trem
‑
2高表达并增强单核巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬杀灭作用，另一方面trem
‑
2高表达并促进cd8+t淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用。在多种肿瘤患者外周血单核细胞或者cd8+t淋巴细胞中trem
‑
2表达水平升高可以作为肿瘤诊断的分子标志物。该发明能够为临床治疗肺癌、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤等血液系统肿瘤，以及结肠癌、肝癌、黑色素瘤、肺腺癌等实体肿瘤提供良好的候选药物靶点及诊断指标，具有十分良好的应用前景。
附图说明
25.图1体外吞噬实验显示trem
‑
2敲除使巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力明显降低，trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠为巨噬细胞上trem
‑
2敲除小鼠；图中*代表p<0.05、**代表p<0.01、***代p<0.001；
26.图2体内吞噬实验显示trem
‑
2敲除使巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力明显降低，trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠为巨噬细胞上trem
‑
2敲除小鼠；
27.图3皮下移植瘤实验显示巨噬细胞上trem
‑
2敲除小鼠的皮下移植瘤体积显著增大，trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠为巨噬细胞上trem
‑
2敲除小鼠；
28.图4流式细胞术实验显示trem
‑
2在肺癌患者外周血cd14单核细胞的阳性比例显著升高；
29.图5为流式分析仪检测trem
‑
2在cd8+t淋巴细胞中的统计散点图；检测的是trem
‑
2和cd8双阳性细胞占cd8细胞的百分比；
30.图6流式细胞术实验显示trem
‑
2在肺癌小鼠肺部f4/80巨噬细胞的阳性比例显著升高；
31.图7显示在结肠癌患者肿瘤组织切片中cd8+t淋巴细胞上trem
‑
2表达的免疫荧光图，发现trem
‑
2在肿瘤微环境中cd8+t淋巴细胞上高表达；(图中蓝色代表dapi，红色代表trem
‑
2分子，绿色代表cd8分子，上排表示低倍镜下观察，下排为高倍镜下观察)；
32.图8为一组小鼠黑色素瘤皮下建模实验的肿瘤生长曲线，下图中白色圆圈代表野生型小鼠的肿瘤生长体积，黑色方框代表trem
‑
2全敲小鼠的肿瘤生长体积；(图中*代表p<0.05、**代表p<0.01、***代p<0.001)；
33.图9为一组小鼠肝癌皮下建模动物实验，其中a图为肿瘤组织生长曲线对比，白色
圆圈代表野生型小鼠的肿瘤生长体积，黑色方框代表trem
‑
2全敲小鼠的肿瘤生长体积；b图为肿瘤组织外观图；c图为皮下肿瘤组织剥离后重量，(图中*代表p<0.05、**代表p<0.01、***代p<0.001)。
具体实施方式
34.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
35.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
36.实施例1体外吞噬实验探究trem
‑
2对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的影响
37.1、检测样品的收集：
38.收集共孵育培养的巨噬细胞和肿瘤细胞。
39.2、检测方法，具体包括如下步骤：
40.(1)骨髓来源的巨噬细胞bmdm(取自c57bl/6j wt或者trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠)细胞按照1
×
105/孔的密度接种24孔板，过夜培养。
41.(2)第二天弃掉培养液，用1
×
pbs洗两遍，加无血清的基础dmem培养基饥饿2小时。以小鼠肺腺癌细胞llc细胞为例，2小时后加入2x105个cfse标记的肿瘤细胞37度培养箱共培养2小时。
42.(3)然后消化收集所有的细胞进行流式染色f4/80(吞噬率：cfse+f4/80+双阳性细胞的百分比)；完全清洗bmdm细胞，倒置荧光显微镜观察黏附情况(吞噬率：100个巨噬细胞中含有绿色荧光肿瘤细胞的数目的比率)。
43.3、实验结果：
44.结果如图1示，trem
‑
2敲除的巨噬细胞对一系列肿瘤细胞(a20：小鼠b淋巴瘤细胞，raji：人b淋巴瘤细胞，jurkat：人t淋巴瘤细胞，llc：小鼠肺腺癌细胞，a549：人肺腺癌细胞)的吞噬能力明显降低，提示trem
‑
2在体外条件下具有抑制肿瘤的作用。
45.实施例2体内吞噬实验探究trem
‑
2对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的影响
46.1、检测样品的收集：
47.收集腹腔内剩余的肿瘤细胞。
48.2、检测方法，具体包括如下步骤：
49.(1)cfse标记的小鼠肺腺癌细胞细胞llc以1x107个/只小鼠腹腔注射于c57bl/6j wt或者trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠。
50.(2)24小时后颈椎脱臼法处死小鼠，收集腹腔内剩余的肿瘤细胞，1500转/分钟离心5分钟后再加pbs 1ml进行清洗。
51.(3)收集所有的细胞进行流式细胞仪检测，定量剩余cfse标记的肿瘤细胞，计算剩余细胞的比例remaining llc cells(％)＝(remaining llc cells/1x107)
×
100％。
52.3、实验结果：
53.结果如图2示，巨噬细胞上trem
‑
2敲除小鼠体内残留的肿瘤细胞比例明显高于wt小鼠，提示trem
‑
2在体内也具有抑制肿瘤的作用。
54.实施例3 trem
‑
2敲除小鼠皮下移植瘤实验成瘤大小比较
55.1、检测样品的收集：
56.构建皮下移植瘤模型，每隔两天记录肿瘤大小，记录生长体积。
57.2、检测方法，具体包括如下步骤：
58.(1)小鼠肺腺癌细胞细胞llc以1x106个/侧皮下接种于c57bl/6j wt或者trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠的腹股沟，双侧接种。
59.(2)第7天待肿瘤开始生长之时每隔两天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，并观察小鼠的状态。
60.(3)至19天肿瘤直径超过动物伦理之前停止记录，颈椎脱臼法处死小鼠。
61.3、实验结果：
62.结果如图3示，trem
‑
2f/f
‑
lyz2
‑
cre小鼠肿瘤体积显著大于wt小鼠，提示巨噬细胞上的trem
‑
2对肿瘤的生长有抑制作用。
63.实施例4 trem
‑
2在肺癌患者外周血cd14单核细胞的阳性比例比较
64.1、检测样品的收集：
65.收集受试对象外周血，包括健康人36例、肺癌患者28例。
66.2、检测方法，具体包括如下步骤：
67.(1)采用人淋巴细胞分离液从外周血中分离得到pbmc，取1
×
105～1
×
107个细胞，加入pbs 1ml，1500转/分钟离心5分钟。
68.(2)特异性抗体染色反应：100μl反应体系含有：pbmc为1
×
105～1
×
107个细胞，pbs 100μl，trem
‑
2抗体或同型对照抗体igg 3μl，cd14抗体2μl，将上述反应体系置于冰上(0～4℃)避光孵育30分钟。加入pbs 1ml，1500转/分钟离心5分钟，重复3次。
69.(3)加入pbs 500ul重悬细胞，流式分析仪检测。
70.(4)结果判定：以同型对照抗体作为阴性，判断非特异性染色，如果没有明显染色效果，即说明非特异染色可以忽略，然后计数阳性细胞。计算trem
‑
2和cd14双阳性细胞占cd14单阳性细胞的百分比。
71.3、实验结果：
72.结果如图4示，在28例肺癌病人的cd14单核细胞中，trem
‑
2和cd14双阳性细胞占cd14单阳性细胞的百分比平均值大于95％；在36例健康人的cd14单核细胞中，所有健康人的trem
‑
2和cd14双阳性细胞占cd14单阳性细胞的百分比平均值小于80％。以上结果表明肺癌患者cd14单核细胞表面的trem
‑
2显著升高，可用于肺癌的诊治。
73.实施例5 trem
‑
2在肿瘤患者外周血cd8淋巴细胞的阳性比例检测实验
74.1、检测样品的收集：
75.收集受试对象外周血，包括健康人134例，肿瘤患者包括肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、乳腺癌、胃癌共51例。
76.2、检测方法，具体包括如下步骤：
77.采用淋巴细胞分离液从外周血中分离得到pbmc，取1
×
105～1x107个细胞，加入pbs 1ml，1500转/分钟离心5分钟；
78.(1)特异性抗体染色反应：100ul反应体系含有：pbmc为1
×
105～1x107个细胞，pbs100ul，trem
‑
2抗体或同型对照抗体igg 3ul，cd14抗体2ul，cd8抗体2ul，将上述反应体
系置于冰上(0～4℃)避光孵育30分钟。加入pbs 1ml，1500转/分钟离心5分钟，重复3次；
79.(2)加入pbs 500ul重悬细胞，流式分析仪检测；
80.3、结果判定：以同型对照抗体作为阴性，判断非特异性染色，如果没有明显染色效果，即说明非特异染色可以忽略，然后计数阳性细胞。计算trem
‑
2和cd8双阳性细胞占cd8单阳性细胞的百分比。计算trem
‑
2和cd14双阳性细胞占cd14单阳性细胞的百分比。
81.4、实验结果：
82.图5的结果显示，在50例肿瘤患者的cd8+t淋巴细胞中，有48例的trem
‑
2和cd8双阳性细胞占cd8单阳性细胞的百分比大于30％，准确率为96％；在125例健康人的cd8淋巴细胞中，所有健康人的trem
‑
2和cd8双阳性细胞占cd8单阳性细胞的百分比均小于30％，准确率达到100％。以上结果表明cd8淋巴细胞表面的trem
‑
2能有效区分健康人和肿瘤患者。
83.综上可见，在肿瘤患者的外周血中，cd8+t淋巴细胞表面的trem
‑
2较健康人显著升高，提示可通过分析cd8+t淋巴细胞表面的trem
‑
2来进行肿瘤的诊断，准确率可达96％，具有灵敏度高、特异好的优点。
84.实施例6 trem
‑
2在肺癌小鼠肺部f4/80巨噬细胞的阳性比例比较
85.1、检测样品的收集：
86.收集实验小鼠肺组织，包括对照小鼠、肺癌建模小鼠各5只。
87.2、检测方法，具体包括如下步骤：
88.(1)小鼠肺腺癌细胞细胞llc以1x106个/侧皮下接种于c57bl/6j wt小鼠的腹股沟，双侧接种。每天并观察小鼠的状态，至肿瘤直径超过动物伦理规定之前停止饲养，颈椎脱臼法处死小鼠。
89.(2)取小鼠的肺脏，用胶原酶消化研磨后，取1
×
105～1
×
107个细胞，加入pbs 1ml，1500转/分钟离心5分钟。
90.(3)特异性抗体染色反应：100μl反应体系含有：肺部细胞悬液为1
×
105～1
×
107个细胞，pbs100μl，trem
‑
2抗体或同型对照抗体igg 3μl，f4/80抗体2μl，将上述反应体系置于冰上(0～4℃)避光孵育30分钟。加入pbs 1ml，1500转/分钟离心5分钟，重复3次。
91.(4)加入pbs 500ul重悬细胞，流式分析仪检测。
92.(5)结果判定：以同型对照抗体作为阴性，判断非特异性染色，如果没有明显染色效果，即说明非特异染色可以忽略，然后计数阳性细胞。计算trem
‑
2和f4/80双阳性细胞占f4/80单阳性细胞的百分比。
93.3、实验结果：
94.结果如图6示，肺癌小鼠肺部巨噬细胞中，trem
‑
2和f4/80双阳性细胞占f4/80单阳性细胞的百分比平均值接近95％；在对照小鼠的肺部巨噬细胞中，trem
‑
2和f4/80双阳性细胞占f4/80单阳性细胞的百分比平均值小于85％。以上结果表明肺癌小鼠巨噬细胞表面的trem
‑
2显著升高，可用于肺癌的诊治中。
95.实施例7 trem
‑
2在人肿瘤组织切片中cd8+t细胞上的表达检测
96.1、实验材料
97.石蜡包埋的人结肠癌组织样本。
98.2、实验方法
99.具体操作如表1。
100.表1
[0101][0102]
3、实验结果
[0103]
实验结果见图7。结果显示，trem
‑
2在肿瘤组织微环境中的cd8+t淋巴细胞上高表达。
[0104]
实施例8针对黑色素瘤的动物实验
[0105]
1、实验材料
[0106]
(1)细胞株：小鼠黑色素瘤细胞(b16细胞)，培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)。
[0107]
(2)实验动物：雄性c57bl/6j trem
‑
2基因全敲小鼠(6
‑
8周)以及相同性别和周龄的同窝对照野生型c57bl/6j小鼠，均置于spf级环境中饲养。
[0108]
2、实验方法
[0109]
(1)细胞培养：
[0110]
细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清，ph 7.2)，培养基加2mmol/l谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37℃、5％co2环境下培养。
[0111]
3、动物实验：
[0112]
将含5
×
10^5个b16细胞的生理盐水注射到小鼠右腹股沟皮下，当肿瘤长成并可测量时，每两天测量一次肿瘤大小(测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积＝1/2
×
长径
×
短径^2)。第17天处死小鼠。
[0113]
4、实验结果
[0114]
实验结果见图8，结果显示：trem
‑
2能抑制小鼠黑色素瘤的生长。
[0115]
实施例9针对肝癌的动物实验
[0116]
1、实验材料
[0117]
(1)细胞株：小鼠肝癌细胞(hepa1
‑
6细胞)，培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)。
[0118]
(2)实验动物：参见实施例3。
[0119]
2、实验方法
[0120]
(1)细胞培养参见实施例3。
[0121]
(2)动物实验：
[0122]
将含5
×
10^5个hepa1
‑
6细胞的生理盐水注射到小鼠右腹股沟皮下，当肿瘤长成并可测量时，每两天测量一次肿瘤大小(测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积＝1/2
×
长径
×
短径^2)。第16天处死小鼠。
[0123]
3、实验结果
[0124]
实验结果见图9，结果显示：trem
‑
2能抑制小鼠肝癌的生长。