一种抗MRSA的荨麻提取物及其提取方法和应用

本发明涉及抗mrsa技术领域，具体涉及一种抗mrsa的荨麻提取物及其提取方法和应用。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，sa)是一种重要的人类病原体，130多年前被公认为化脓性脓肿的病因，属于葡萄球菌属(staphylococcus)，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌可通过多种途径侵入机体，导致皮肤或器官的多种感染，甚至败血症等，同时还可致机体多个器官系统的功能紊乱或引起毒性休克综合征，其感染可从轻度皮肤和软组织感染到危及生命的心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血症等。从上世纪中叶青霉素、甲氧西林等抗生素的出现和应用，初步证明了治疗金黄色葡萄球菌的有效性，但是，金黄色葡萄球菌对这些抗生素迅速产生耐药性，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)被发现。自1961年英国科学家jevons首次发现mrsa以来，全世界的mrsa感染率从1980年代中期的1-5％迅速上升到今天的60-70％，mrsa感染的急剧上升已成为全世界公众健康的严重威胁。

研究显示几乎所有临床mrsa分离物都产生β-内酰胺酶和一种与β-内酰胺类抗生素亲和力低的青霉素结合蛋白2a(penicillin-bindingprotein2a，pbp2a)。许多非β-内酰胺类抗生素，如万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺和达普霉素已被推荐用于治疗mrsa感染。万古霉素是目前治疗mrsa感染最有效的药物，但是在临床上该药具有一些较为严重的不良反应如耳肾毒性和低ph值所引起的静脉炎，同时万古霉素只能静脉给药，这些都限制了其使用，目前总体疗效仍不满意。而且大量研究发现，耐万古霉素的mrsa目前已存在，且在多个国家均被发现。试想最严重的情况是，如果发展到mrsa对万古霉素产生了普遍的耐药性，那么其感染患者的治疗将会陷入绝境，全世界公共卫生健康将受严重威胁。因此，探寻有效的抗mrsa候选药物具有重要意义，开发针对mrsa的新型抗菌药物刻不容缓。

随着时代的发展，目前从天然植物和中草药中寻找有效的抗菌活性成分，同时探索其作用机理，已成为药学研究的热点课题。中药作为我国的传统药物，具有非特异性抗菌作用，能调节和提高机体的免疫力，且副作用小、不易产生耐药。现有大量研究表明中药如穿心莲、大黄、黄芪、丹参等可发挥抗菌作用。同时结果提示，黄酮类、生物碱、有机酸等可能是具有抗菌活性的成分。中药的抗菌作用由来已久，有研究表明，中药制剂对耐药菌具有一定的抑菌作用。有研究对中药黄岑、苦参、连翘、蒲公英、薄荷等所制的中药颗粒剂和水煎剂的抗mrsa活性做了比较，结果发现两者均有抗mrsa活性。另有研究表明，把同类中草药提取物对标准菌株和耐药菌株的抗菌活性拿来比较，结果发现对标准菌株抑制作用较强的中草药，对耐药菌株的抗菌活性亦如此，这提示中草药在抗耐药性问题上具有较为良好的前景。

异株荨麻(urticadioical.)为荨麻科植物，为多年生草本植物，为中国常用的民间药。常有木质化的根状茎，茎四棱形，常密生刺毛和细糙毛，分枝少；叶对生，成卵形或狭卵形边缘齿形，具有蛰毛，内含刺激性有毒液体(蚁酸、五羟色胺、组胺等)，皮肤触及立即产生强烈的刺痛感；雌雄异株，稀同株；花期7～8月，果期8～9月，多生长于海拔3300～3900米山坡阴湿处。

异株荨麻中主要含有酚类及木脂素、黄酮、香豆素类、多糖、挥发油、甾醇和有机酸等多种活性成分，这些有效成分具有抗风湿、抗炎镇痛、降糖、抑菌、抗病毒等作用。近年来荨麻属植物的抑菌活性研究也有一定的进展，等通过对荨麻属植物不同部位的甲醇提取物以及水提物的抗菌活性进行比较，发现其种子的甲醇提取物抗菌活性最强。同时有研究结果表明荨麻科植物的乙醇提取物能影响sa的增殖生长，其可能是通过抑制细菌核酸的合成以及蛋白的表达来实现的。另有研究者对荨麻属植物麻叶荨麻籽进行了不同溶剂的提取，结果发现不同溶剂提取物具有不同程度的抗菌活性，且有机酸、酚类、和香豆素类化合物为其发挥抑菌作用的主要成分。有研究结果显示，荨麻科植物的不同膜分离成分对sa均具有一定的抑菌活性。salehzadeh等对16株从皮肤和伤口感染处分离的mrsa进行了抑菌活性的研究，结果显示异株荨麻的甲醇提取物对mrsa具有显著的抗菌活性，同时发现其能抑制mrsa主要是由于含有脂肪酸和酚类物质。异株荨麻含有多种活性成分，且酚类，有机酸及黄酮类化合物含量丰富，这表明其有望作为一种候选的抗菌药物被研究及开发，且目前国内研究刚刚起步，涉及到单体化合物的研究甚少，异株荨麻的抑菌活性值得研究与开发。因此，目前亟需提供一个简便适用、环保提取抗mrsa化合物的方法。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种抗mrsa的荨麻提取物及其提取方法和应用。

本发明提供所采用的技术方案是：

一种抗mrsa荨麻提取物，所述抗mrsa荨麻提取物为异株荨麻中采用醇类溶剂提取分离得到。

优选地，所述醇类溶剂为甲醇或乙醇或其组合。

一种抗mrsa荨麻提取物的提取方法，所述方法包括以下步骤：

1)用甲醇溶液分别三次索氏提取异株荨麻全草，合并得到甲醇提取液；

2)将甲醇提取液抽滤，去除残留物质，回收得到滤液；

3)将步骤2)所得滤液减压浓缩，冷冻干燥，得到样品；

4)将样品经d101型大孔树脂吸附、富集与分离得到30％乙醇层、60％乙醇层不同部位；

5)将30％乙醇层、60％乙醇层不同部位通过硅胶柱分离化合物，反复；

6)薄层色谱法(tlc)分析，合并馏分。

优选地，所述步骤4)中过柱用单蒸水溶解样品，胶头滴管将样品1-3bv/hr加入至交换柱中，吸附流速为1-4bv/hr，泄漏量达到进口浓度的10％，吸附完成。

优选地，所述步骤4)中解吸用1-2倍柱体积的单蒸水淋洗，置换出树脂层中的原液，30％乙醇、60％乙醇冲洗树脂层，1-2bv/hr，冲洗并收集洗脱液。

优选地，所述步骤5)中采用干法上样，梯度洗脱先用极性小的洗脱系统冲下极性小的目的物质，后加大极性。

优选地，所述步骤(6)中显色剂使用碘：①0.5％的氯仿溶液；②碘蒸气，首先放入少量碘结晶在带盖的玻璃缸内，使得玻璃缸内碘蒸气为饱和状态。

所述的抗mrsa荨麻提取物或所述的抗mrsa荨麻提取物的提取方法在制备抗mrsa药物的应用。

本发明有益效果：

1、异株荨麻甲醇提取物经d101型大孔树脂分离洗脱后，抗mrsa活性部位主要集中在30％乙醇层部位、60％乙醇层部位。

2、荨麻提取物抑菌组分能够抑制mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa对数生长期的菌体分裂生长。能破坏细菌的细胞结构，导致细胞质外流，从而抑制菌体的繁殖生长。能破坏细菌细胞结构的完整性，从而导致核酸、蛋白质外流至培养液中，抑制菌体的生长繁殖。荨麻提取物不仅可以破坏细菌的细胞结构，还可通过影响细胞代谢发挥抑菌作用。荨麻提取物能降低细胞膜电位，影响菌体细胞的代谢活性，从而发挥抑菌作用。

附图说明

图1示出了菌液平板划线结果；

图2示出了pcr扩增特异性基因结果；

图3示出了抗mrsa活性化合物提取分离流程图；

图4示出了抑菌组分对细菌生长抑制作用曲线图(a：抑菌组分对mrsa生长曲线的抑制作用；b：抑菌组分对st5-mrsa生长曲线的抑制作用；c：抑菌组分对st239-mrsa生长曲线的抑制作用；与正常组比较，*p＜0.05，**p＜0.01)；

图5示出了抑菌组分对菌液中总糖浓度的影响结果图(a：抑菌组分对mrsa菌体总糖浓度的影响；b：抑菌组分对st5-mrsa菌体总糖浓度的影响；c：抑菌组分对st239-mrsa菌体总糖浓度的影响；与正常组比较，*p＜0.05，**p＜0.01)；

图6示出了抑菌组分对菌体磷代谢的影响结果图(a：抑菌组分对mrsa菌体磷代谢的影响；b：抑菌组分对st5-mrsa菌体磷代谢的影响；c：抑菌组分对st239-mrsa菌体磷代谢的影响；与正常组比较，*p＜0.05，**p＜0.01))；

图7示出了抑菌组分对菌体膜电位的影响结果图。

具体实施方式

实施例1

第一部分受体菌的活化及菌悬液的制备

在进行抑菌药效和机制研究之前，首先要确保受试菌株处于活化状态，并按菌体的生长习性制备浓度适宜的菌悬液以便于后期的实验研究。

1实验材料

1.1实验所用菌株：金黄色葡萄球菌sa(资源编号：bncc186053，其他编号：atcc25923)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa(资源编号：bncc337371，其他编号：atcc43300)，上述两种菌株均购自于北京北纳创联生物技术研究院，st5-mrsa，st239-mrsa由三峡大学医学实验中心保藏，为三峡大学医学院王德成老师惠赠，实验过程中，也可以不仅仅限定采用上述两株菌株，还可以采用市售其他的mrsa菌株。

1.2实验仪器：24孔、96培养板：greinerbioone科技公司、lab-line恒温摇床：lab公司、hws-50电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂、ellogic200凝胶成像分析系统：美国kodak(柯达)公司、pcr仪：美国biorad公司、mikro220r台式高速冷冻离心机：德国hettich公司。

1.3实验试剂：sds，sigma公司，货号：l3771，规格：25g，正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、无水乙醇、冰乙酸、石油醚、甲醇，天津市恒兴化学试剂制造公司，分析级，规格：500ml/瓶；苯酚，sigma公司，货号：p1037，规格：25g；氯仿，sigma公司，货号：151858，规格：10×0.25ml/瓶；异戊醇，sigma公司，货号：59090，规格：250ml/瓶；琼脂糖，sigma公司，货号：a2576，规格：5g；胰蛋白胨，英国oxoid公司，批号：lp0042，规格：500g；酵母提取物，英国oxoid公司，批号：lp0021，规格：500g；琼脂糖，麦克林公司，货号：a801450，规格：5g；氯化钠，天津市科密欧化学试剂有限公司，分析级，规格：500g；营养琼脂平板培养基，青岛海博生物技术有限公司，货号：hbpm003-6，规格：9cm×10个/包。

2实验方法

2.1细菌的活化：将3ml的lb培养基注入冻干管中，轻轻吹打，充分溶解成菌悬液。37℃摇床培养12h，吸取菌悬液200μl，加入营养琼脂平板上，涂布，37℃培养过夜，应用平板划线法分离出单菌落，再传代1-2次恢复活力。

2.2pcr扩增特异性基因

2.2.1sds法提取细菌基因组dna

1)挑取单菌落接种于3ml的lb培养基，放置于恒温摇床培养，37℃、120rpm。备用。

2)取0.5ml菌液离心，10000rpm、5min；弃上清，先后加入ddh2o150μl、10％sds15μl、5mol/lnacl50μl，放置于65℃恒温烘箱温育10min。

3)加入酚/氯仿/异戊醇(23:24:1)混合溶液215μl混匀，离心，10000rpm，5min。

4)加入与离心后上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合溶液混匀，离心，10000rpm，5min。

5)将上清液转移至新ep管中，加入0.6倍体积异丙醇轻轻混匀，混合静置10min，离心，10000rpm，5min。

6)弃上清，加入体积分数70％的乙醇洗涤，离心，12000rpm，2min，弃上清。

7)重复上一步，洗涤数次后取ddh2o100μl重悬dna，-20℃保存。

2.2.2特异性基因扩增引物的设计

选择金黄色葡萄球菌特异性基因(16srdna、nuc基因、nuca基因)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的持异性基因(meca基因)进行pcr检测，其引物的设计参考见下表1。

表1金黄色葡萄球菌的16srdna基因、nuc基因、nuca基因、meca基因的引物序列

2.2.3pcr扩增的反应体系和反应条件

表2检测特异性基因的pcr反应体系

pcr扩增的反应条件：

预变性：94℃，2min；

变性：94℃，30s；

退火：58℃，30s35个循环；

延伸：72℃，30s；

终延伸：72℃，2min。

2.2.4琼脂糖凝胶电泳

1)稀释缓冲液：取5×tbe缓冲液20ml加水至200ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液。

2)制备胶液：称取0.8g琼脂糖，加入200ml锥形瓶内，随后加入0.5×tbe稀释缓冲液40ml，用封口膜盖上锥形瓶口后，放置于微波炉中大火加热2min，直到琼脂糖完全熔化，即配成2％琼脂糖凝胶液。

3)制备胶板：将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，在水龙头下用冷水冲淋锥形瓶，直到琼脂糖胶液冷却至50-60℃，迅速向其中加入4μleb。之后将混合液倒入胶槽内，胶板完全凝固后拨出梳子，向槽内加入0.5×tbe稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

4)点样：用移液枪每孔各加入pcr扩增产物和缓冲液混合液10μl，dnamarker10μl。

5)电泳：电泳槽盖好，立即接通电源，120v，40min。

6)成像：通过bio-rad凝胶扫描成像系统成像，观察并保存实验结果。

2.2.5菌悬液的制备

用无菌接种环刮取单菌落，向灭菌试管中加入3ml的lb培养基并混匀以制备菌悬液，37℃摇床培养12h，1:50转接至15ml离心管中，37℃摇床培养24h，通过麦氏比浊仪调整菌液浓度为1.5×10⁸cfu/ml(麦氏单位0.5)。

3.实验结果

3.1菌液的活化

菌液平板划线结果如图所示，菌液的平板划线分离法是指在平板培养基表面用接种环通过分区划线稀释，将混合微生物进行分离，进一步得到多个独立分布的单个细胞，通过一定条件培养后生长繁殖成为单菌落，通常情况下，这个单菌落可被认为是微生物的纯种。本课题中，菌种分别划线于营养琼脂平板上，可见明显单菌落。结果表明，菌种的平板划线成功，实验结果见图1。

3.2pcr扩增特异性基因

16srdna基因可作为鉴定金黄色葡萄球菌的参考基因，nuc、nuca基因是鉴定金黄色葡萄球菌的特异基因，此金黄色葡萄球菌扩增出的nuc片段(126bp)、nuca片段(239bp)长度与目的片段一致。meca基因是鉴定耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的特异基因，此耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa)扩增出的meca片段(533bp)长度与目的片段一致。结果表明，sa、mrsa、st5-mrsa和st239-mrsa均活化成功。实验结果见图2。

第二部分：异株荨麻抗mrsa抑菌活性部位的筛选

受试细菌活化后，接着以异株荨麻为研究对象，对异株荨麻的抗菌活性以及发挥抗菌的有效成分进行研究，目的是明确异株荨麻发挥抗菌作用的活性成分，为抗菌机制研究奠定基础。

1.实验材料

1.1异株荨麻，购自湖北宜昌，经三峡大学生生药学专家曾建红教授鉴定为实验所用材料为荨麻科荨麻属植物异株荨麻。

1.2实验试剂:甲醇、无水乙醇、双蒸水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇、4％naoh溶液、氯仿、二甲基亚砜(dmso)、ttc(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)

1.3实验仪器:索氏提取器、真空泵、旋转蒸发仪、冷冻干燥器、中药粉碎机、d101大孔吸附树脂、ph试纸、硅胶、展开缸、紫外灯、超声清洗仪、恒温培养箱。

2.实验方法

2.1异株荨麻提取物的制备

异株荨麻全草用中药粉碎机粉碎成粉末，干燥保存。分别用水、甲醇、乙醇在索氏提取装置中提取200g植物药材，每次2h，三次。提取液用滤纸抽滤两次，去除残留物质。提取物用旋转蒸发器浓缩，在-80℃冷冻干燥器中冻干，保存于烧杯中，-20℃，直至使用。

2.2不同分离方法用于分离异株荨麻粗提物中的活性成分

2.2.1大孔树脂法

(1)树脂预处理：根据使用要求在树脂使用前，为了将大孔树脂内孔残存的惰性溶剂等除掉，我们要对树脂进行不同程度的预处理，以方便后续实验进行。采用分析级的无水乙醇浸泡新树脂数分钟，务必保证无水乙醇液面超过树脂层。之后将混有无水乙醇的树脂缓慢加入交换柱中，此过程如有气泡产生，应立即赶出气泡。树脂层面上应保持一定体积液体，以免干柱，待树脂沉降平稳以后，静置12h。然后加入单蒸水反复淋洗，2bv/hr，直至流出液体在烧杯中与水不产生分层或无明显乙醇气味时为止。树脂表面上保持一定体积液体，以免干柱，产生气泡，备用。

(2)过柱：尽量用单蒸水溶解要处理的药物(溶液乙醇浓度不能过高)，随后利用胶头滴管将药物缓慢加入至交换柱中，1-3bv/hr，此过程中树脂层中不能产生气泡。吸附流速为1-4bv/hr。之后检测流出液体中药物的泄漏量，泄漏量达到进口浓度的10％，吸附完成。

(3)解吸：用1-2倍柱体积的单蒸水淋洗，置换出树脂层中的原液，根据本实验目的要求，我们依次用水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇冲洗树脂层，1-2bv/hr，以冲洗出目的药物，过程中收集洗脱液，即可。

(4)再生：整个冲洗过程结束后，树脂需要重生以满足下一次实验需要。此时用单蒸水冲洗树脂层，直至流出液体在烧杯中与水不产生分层或无明显乙醇气味时为止。然后用2-3倍柱体积的4％naoh溶液冲洗树脂层，1-2bv/hr，随后用单蒸水冲洗至流出液体在ph试纸上显示中性，即可。

2.2.2薄层色谱法(tlc)

(1)制板：选择合适的玻璃板(经常使用显微镜上的载玻片)，依次用水和乙醇洗净，晾干。取适量薄层色谱用的硅胶，加适量蒸馏水调成糊。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。将糊倒在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115℃左右烘干40-50分钟。冷却后备用。

(2)点样：用最少量溶剂溶解样品，随后使用3-5mm毛细管迅速少量蘸取样品溶液，轻轻在板上进行点样。点样量务必不要过多，浪费样品同时影响实验结果。

(3)展开：吹干样点，用镊子夹着薄层板竖直放入展开缸中。薄层板下沿要浸入展开剂中，但样点切勿浸入其中。盖上展开缸盖，展开。等待展开剂上行到一定的展开高度，用镊子夹出薄层板，用吹风机吹干，挥发干展开剂，此时可在紫外灯下观察结果。

(4)显色：用吹风机吹干，挥发干展开剂，选择合适的显色方法显色。显色剂的配制：碘：①0.5％的氯仿溶液；②碘蒸气，首先放入少量碘结晶在带盖的玻璃缸内，使得玻璃缸内碘蒸气为饱和状态。用镊子将薄层板夹着放入缸内，等待数分钟，即可显色。

2.2.3硅胶柱色谱法

(1)装柱：首先用少量的洗脱溶剂浸泡脱脂棉数分钟，随后将脱脂棉塞入柱内以防吸附剂漏出。将准备好的d101型硅胶用极性小的洗脱剂溶解，并超声数分钟，去除气泡。随后打开下端活塞，将溶解好的硅胶混悬液缓慢加入柱内(注意：不要将脱脂棉冲起来)。硅胶在柱内自由沉降，此时，硅胶柱上层仍需加入洗脱剂以保持一定的液面高度。硅胶表面上保持一定体积液体，以免干柱，产生气泡。备用。

(2)上样：本实验采用干法上样。用少量用于装柱时极性偏小的洗脱剂溶解要处理的样品，之后将其倒入旋蒸瓶内，根据样品量加入一定量的d101型硅胶，拌匀混合。随后利用旋转蒸发仪和循环水系统将其旋干，除尽溶剂，用药勺刮下样品。将拌有样品的硅胶沿着硅胶柱壁，缓慢且均匀的加入柱内，此时硅胶柱内洗脱剂仍有一定的液面高度。等待硅胶柱沉降直至高度不变，然后向硅胶柱内加入少量的一层未溶解的d101型硅胶，应保持硅胶上层表面平整无坑洼。硅胶表面上保持一定体积液体，以免干柱，产生气泡。

(3)洗脱：预先通过薄层色谱法筛选最佳的洗脱剂系统及比例，通常来讲，薄层色谱展开时rf值为0.3左右的溶剂系统为最佳。首先打开硅胶柱下端活塞，加入配置好的洗脱系统溶剂，洗脱剂流速不宜过快，过程中少量多次收集洗脱液，并进行tlc比对，以考虑是否更换洗脱系统极性。采用梯度洗脱法洗脱，先用极性小的洗脱系统冲下极性小的目的物质，后加大极性。情况允许条件下，可使用加压装置使得洗脱更快。

(4)收集处理：洗脱过程中少量多次收集洗脱液，且每份洗脱液通过tlc定性检查，将相同成分的洗脱液合并，浓缩，以备用。经浓缩，重结晶等处理通常可以得到某一较为纯的物质。若tlc检查发现仍含有多种成分，未洗脱完全，可再次上硅胶柱，以分离化合物。

2.3异株荨麻中有效成分的抑菌效果研究

2.3.1最低抑菌浓度(mic)的测定

采用ttc染色法测定最低抑菌浓度。取对数期生长良好的菌悬液，用mha培养基稀释，调整菌液浓度至106cfu/ml左右后，分别加入菌悬液、不同浓度药物各100μl于细菌孔板中，调整其终浓度达到0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2mg/ml。然后放置于恒温培养箱中培养，37℃、24h。培养后向各实验孔中加入20μl的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，ttc)，混匀。然后放置于恒温培养箱避光培养，37℃、4h，观察实验孔中颜色变化。同时以5％dmso为对照组(具体实验操作中摸索得到对菌体细胞生长无影响的dmso的最大浓度为5％)，平行实验3次。

2.3.2抑菌圈(diz)的测定

采用纸片扩散法测定diz。将药物样品20.0mg超声溶解于10ml5％dmso水溶液中，若水溶性不好可将样品先溶于dmso，再进行稀释。准备若干个直径为6mm的圆形空白滤纸片，装入带塞试管，高压灭菌，121℃、20min，干燥后待用。用无菌移液枪在无菌条件下吸取30μl药液，打在事先制备好的空白滤纸片上，烘干，备用。在超净工作台内用移液枪吸取菌液浓度为0.5麦氏单位的菌液200μl，涂布在制备好的mhb培养基中，使菌液均匀铺满培养基，将含待测药物的滤纸片均匀地帖在培养平皿表面(每片间隔约3cm左右)，放置于恒温培养箱中培养，37℃、24h，观察结果有效药物可在纸片周围出现一圈不长菌的区域称抑菌圈，抑菌圈越大表示药物抑菌作用越强。同时以5％dmso为对照组，平行实验3次。

最低抑菌浓度(mic)是用来定量描述药物抗菌效果的指标之一，它表示能显现出抑菌效果的最小药物浓度，经过最低抑菌浓度的测定后，对从异株荨麻中所分离出的化合物的抗菌活性有了基本的评判，可利用该指标筛选出抗菌效果明显的化合物，为后续机制研究奠定基础。抑菌圈的测定也是直观检测药物的抑菌能力，给药后，根据每类化合物与菌体作用后，所形成的抑菌圈的大小来评价化合物的抑菌能力。结合最低抑菌浓度值与抑菌圈的大小，评价所分离出的化合物的抗菌能力，找出抗菌能力显著的成分用于后续机制研究。

3.实验结果

3.1异株荨麻不同溶剂提取物抗mrsa体外抑菌活性

在荨麻粗提取物的基础上，运用不同的溶剂(水、甲醇、乙醇)进行了继续分离，共得到三种提取物，分别是水提取物、甲醇提取物和乙醇提取物，对三种不同溶剂的提取物进行最低抑菌浓度(mic)的测定，实验测定原理是2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，ttc)广泛应用于细菌染色中，在氧化状态下，ttc呈现出无色。ttc染色法能将活细胞与死细胞区分开来，通常情况下，ttc进入细胞后，可以与细菌的活细胞中的琥珀酸脱氢酶发生反应，形成还原产物甲臜，此时甲臜呈现出红色并在细胞内累积，但死细胞不存在上述实验现象，由所观察到的颜色变化情况，确定三种不同溶剂的提取物的最低抑菌浓度(mic)。

实验结果见表3-1至表3-4。从表中可以看出，在ttc染色后，培养基的颜色与药物浓度之间存在关联，药物浓度越高，培养基颜色呈现出不同程度的变浅，甚至无色。如培养sa时，当甲醇提取物浓度大于5mg/ml时，培养液呈现无色，说明甲醇提取物在此浓度下可抑制sa的生长。水提取物能够抑制sa、st5-mrsa、st239-mrsa的生长，且对其最低抑菌浓度依次为10、15、15mg/ml，但水提取物对mrsa无抑制作用；甲醇提取物能够抑制sa、mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa的生长，且对其最低抑菌浓度依次为5、10、10、15mg/ml；乙醇提取物能够抑制sa、st5-mrsa的生长，且对其最低抑菌浓度依次为10、15mg/ml，但乙醇提取物对mrsa、st239-mrsa无抑制作用。

表3-1异株荨麻不同溶剂提取物对sa的mic结果(mg.ml-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

表3-2异株荨麻不同溶剂提取物对mrsa的mic结果(mg.ml-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

表3-3异株荨麻不同溶剂提取物对st5-mrsa的mic结果(mg.ml-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

表3-4异株荨麻不同溶剂提取物对st239-mrsa的mic结果(mg.ml-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

不同溶剂提取物作用于细菌后，抑菌圈的大小可同来评价不同提取物的抑菌效果，抑菌圈越大，说明药物的抑菌效果更显著，实验结果表明，不同溶剂的提取物(水提取物、甲醇提取物、乙醇提取物)对sa、mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa显示了不同程度的抑制作用，实验结果见表4，与异株荨麻的甲醇提取物比较，异株荨麻的水提取物和乙醇提取物对sa、mrsa、st239-mrsa的diz变小，且差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)；异株荨麻水提取物对st5-mrsa的diz也显示出同样的结果，差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，异株荨麻乙醇提取物对st5-mrsa的diz变小，差异不具有统计学意义(p＞0.05)。因此筛选出抑菌活性更强的甲醇提取物进行下一步研究。

表4异株荨麻不同溶剂提取物对实验菌株的diz结果(mm)

注：“n”表示无抑菌作用；与甲醇提取物比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

3.2d101型大孔吸附树脂分离异株荨麻甲醇提取物各洗脱组分抗mrsa体外抑菌活性

取上述筛选出的异株荨麻抗mrsa活性较强的甲醇提取物部位，经d101型大孔树脂分离洗脱后得到水层、30％乙醇层、60％乙醇层、90％乙醇层不同部位。

实验结果见表5-1、5-2、5-3、5-4。从表中可以看出水层部位能够抑制sa、st5-mrsa的生长，且对其最低抑菌浓度依次为10、15mg/ml，但对mrsa、st239-mrsa无抑制作用；30％乙醇层部位能够抑制sa、mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa的生长，且对其最低抑菌浓度依次为10、15、15、15mg/ml；60％乙醇层部位能够抑制sa、mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa的生长，且对其最低抑菌浓度依次为10、10、20、15mg/ml；90％乙醇层部位能够抑制sa的生长，且对其最低抑菌浓度为10mg/ml，但对mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa无抑制作用。

表5-1d101型大孔吸附树脂分离各洗脱组分对sa的mic结果(mg.ml^-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

表5-2d101型大孔吸附树脂分离各洗脱组分对mrsa的mic结果(mg.ml^-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

表5-3d101型大孔吸附树脂分离各洗脱组分对st5-mrsa的mic结果(mg.ml^-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

表5-4d101型大孔吸附树脂分离各洗脱组分对st239-mrsa的mic结果(mg.ml^-1)

注：“+++”为红色；“++”为粉色；“+”为淡粉色；“—”为无色

异株荨麻的甲醇提取物经d101型大孔树脂分离洗脱后得到不同部位，利用抑菌圈对其抑菌效果进行评价。抑制作用越强的药物，其diz越大。实验结果表明，水层、30％乙醇层、60％乙醇层、90％乙醇层对sa、st5-mrsa、st239-mrsa显示了不同程度的抑制作用，结果见表6。与30％乙醇层部位比较，水层部位和90％乙醇层部位对sa、mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa的diz变小，差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)；60％乙醇层部位对sa、st5-mrsa、st239-mrsa的diz变小，对mrsa的diz变大、差异不具有统计学意义(p＞0.05)。与60％乙醇层部位比较，水层部位和90％乙醇层部位对sa、mrsa、st239-mrsa的diz变小，差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)；90％乙醇层部位对st5-mrsa也具有同样的结果，差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)；水层对st5-mrsa的diz变小，但差异不具有统计学意义(p＞0.05)。结果表明异株荨麻甲醇提取物经d101型大孔树脂分离洗脱后，抗mrsa活性部位主要集中在30％乙醇层部位、60％乙醇层部位，因此筛选出抑菌活性更强的30％乙醇层部位、60％乙醇层部位进行下一步研究。

表6d101型大孔吸附树脂分离各洗脱组分对实验菌株的diz结果(mm)

注：“n”表示无抑菌作用；与30％乙醇层比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01；与60％乙醇层比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

3.3抗mrsa活性化合物的提取分离流程

如图3所示，为筛选得到的抗mrsa活性化合物的提取分离流程图。

第三部分荨麻提取物抗mrsa的机制研究

1材料

1.1实验菌株：金黄色葡萄球菌sa(资源编号：bncc186053，其他编号：atcc25923)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa(资源编号：bncc337371，其他编号：atcc43300)购自北京北纳创联生物技术研究院，北纳生物(bncc)是中国微生物菌种保藏联合会员之一，与国内外著名微生物菌种保藏中心建立了长期的交流与合作；st5-mrsa，st239-mrsa为三峡大学医学院王德成老师惠赠。

1.2试剂：

mha，青岛海博生物技术有限公司，货号：hbpm6232，规格：9cm×10个/包；mhb，青岛海博生物技术有限公司，货号：hb6231，规格：250g；dmso，sigma公司，细胞级，货号：d2650，规格：5×10ml/瓶；蒽酮，麦克林公司，分析级，货号：a800666，规格：5g；葡萄糖，天津科密欧化学试剂有限公司，分析级，规格：500g；考马斯亮蓝g250，国药集团化学试剂有限公司，分析级，规格：5g；硫酸亚铁，阿拉丁公司，分析级，货号：f116340，规格：500g；钼酸铵，麦克林公司，分析级，货号：a854572，规格：100g；罗丹明123，sigma公司，货号：rb004，规格：5mg。

1.3主要仪器：lab-line恒温摇床：lab公司；mutiskanspectrum型全波长酶标仪：thermo公司；hva-85型高压灭菌锅：日本hirayama公司；99234densimat型比浊仪：上海艾研生物科技有限公司；hws-50电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；mikro220r台式高速冷冻离心机：德国hettich公司；r540型荧光分光光度计：日本青岛公司。

2方法

2.1菌种生长曲线的测定

采用比浊法探究药物对细菌生长的影响。将细菌培养至对数生长期后，按1：100的比例将细菌转接到含有药物的mha培养基中，放置于恒温摇床培养，37℃、120rpm。培养后每3h取一次样，每次200μl。通过酶标仪测定od600，通过graphpad描绘菌种受药物影响不同时间后的生长曲线。同时以5％dmso为对照组，平行实验3次。

2.2菌液可溶性多糖的测定

取对数生长期的菌悬液，与5ml浓度为mic的药物等体积混合，混合均匀后，放置于恒温摇床培养，37℃、120rpm。随后每2h取一次样，每次1ml，离心，11000rpm、2min。然后吸取上清液，用pbs稀释5倍后，用移液枪精确量取50μl加入ep管中，随后向其中加入蒽酮试剂200μl，放置于冰水中，5min、0℃。再放置于沸水中煮沸10min、100℃，室温放置10min以冷却。以标准葡萄糖溶液的浓度与吸光度值为标准，绘制标准曲线，利用酶标仪测定样品在620nm下的吸光度值。同时以5％dmso为对照组，平行实验3次。

2.3核酸及蛋白质含量的测定

菌悬液离心，4000rpm、15min，收集菌体，用pbs冲洗3次后重悬于pbs中。取100μl重悬液分别加入450μl不同浓度的药物，放置于恒温培养箱培养，37℃、3h。然后菌悬液离心，8000rpm、3min。取上清液200μl，通过酶标仪测定其在260nm处的吸光度，细菌悬液中核酸的含量即为测定得到的吸光度值。另外采取考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量。同时以5％dmso为对照组，平行实验3次。

2.4菌液磷代谢的测定

将活化后的菌液按1：60的比例转接到mha培养基中，放置于恒温摇床培养，120rpm、37℃、12h。然后离心，5000rpm、10min，吸取上清，弃去，用pbs稀释菌悬液，调整菌液浓度至1×106cfu/ml左右。用移液枪精确量取0.5ml的菌液和葡萄糖溶液等体积混合，混合均匀后加于离心管中，随后向其中各加入磷标准溶液和浓度为mic的药物200μl。每2h取一次样，每次0.1ml，加入三氯乙酸-硫酸亚铁和钼酸铵进行处理，之后酶标仪测定样品在630nm下的吸光度值。同时以5％dmso为对照组，平行实验3次。

2.5菌体膜电位的测定

采用罗丹明123(rhodamine123，rh123)染色法测定菌体膜电位。取对数期生长良好的菌液，用mha培养基稀释，调整菌液浓度至1×107cfu/ml左右。加入浓度为mic的药物后，放置于摇床培养，220rpm、3h，随后用pbs冲洗3次。分别向菌液中加入配置好的rh123溶液，调整其终浓度至mic，然后放置于恒温培养箱中避光培养，37℃、30min。之后，菌液用pbs冲洗3次后重悬于pbs中。将要测定的样品加入石英比色皿中，通过荧光分光光度计测定荧光强度。测定时，480nm为激发波长，530nm为发射波长。同时以5％dmso为对照组，平行实验3次。

2.6统计学方法

统计学分析采用专业统计软件spss20.0进行，结果以均数±标准差的方式表示。两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(one-wayanova)检验。p＜0.05表明有统计学差异，p＜0.01表明有显著性统计学差异。

3结果

3.1抑菌组分对细菌生长曲线的抑制作用

30％乙醇层部位、60％乙醇层部位合并成抑菌组分(antimicrobialcomponent，ac)，抑菌组分对mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa生长的影响实验结果见下图。从图4中可知，没有加入药物处理的组，细菌在经过一定时间的滞后期后，仍会马上进入细菌生长的对数期。而实验组中细菌的指数生长期明显被抑制(p＜0.05或p＜0.01)，菌体的生长一直处于较低的水平，结果表明荨麻提取物抑菌组分能够抑制mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa对数生长期的菌体分裂生长。

3.2抑菌组分对菌液中总糖浓度的影响

抑菌组分对mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa菌液中总糖浓度的影响实验结果如图5。通常情况下，正常的细菌会吸取一部分培养基中的糖类物质以促进繁殖生长，此时培养液中糖类物质浓度会出现下降趋势。然而，当细菌与药物作用后，培养液中总糖的浓度随着作用时间的延长而升高，其差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，此结果表明细菌细胞内的糖类物质逐渐泄漏到细胞外，此时细菌的细胞膜结构可能已被破坏。因此可知，荨麻提取物能破坏细菌的细胞结构，导致细胞质外流，从而抑制菌体的繁殖生长。

3.3抑菌组分对菌体核酸、蛋白质含量的影响

抑菌组分对mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa菌液中核酸、蛋白质含量的影响实验结果如下。如表所示，当细菌与药物作用后，分别与正常组比较，细菌悬液在260nm下的吸光度值变大，其差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，核酸含量增加。与正常组比较，细菌与药物作用后，细菌悬液中蛋白质含量也出现同样的结果，其差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。由此可见，荨麻提取物能破坏细菌细胞结构的完整性，从而导致核酸、蛋白质外流至培养液中，抑制菌体的生长繁殖。

表7抑菌组分对菌体核酸释放的影响

注：与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

表8抑菌组分对菌体蛋白质释放的影响

注：与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

3.4抑菌组分对菌体磷代谢的影响

抑菌组分对mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa菌体磷代谢的影响实验结果如下。如图6所示,与正常组相比,当细菌与药物作用不同时间后,菌体的磷消耗量降低，其差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01),这表明了菌体的磷代谢失调。由此可见，荨麻提取物不仅可以破坏细菌的细胞结构，还可通过影响细胞代谢发挥抑菌作用。

3.5抑菌组分对菌体膜电位的影响

抑菌组分对mrsa、st5-mrsa、st239-mrsa菌体膜电位的影响实验结果如下。膜电位是正常细胞膜两侧形成的不同浓度的离子电位，正常情况下，rh123将通过细胞膜进入菌体细胞，选择性的对活细胞中的线粒体进行染色。然而当药物与细菌作用后，如图7所示，与正常组比较，rh123释放，菌液中平均荧光强度降低，其差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，这表明药物引起了细胞膜电位去极化，破坏了菌体细胞的膜电位。由此可见，荨麻提取物能降低细胞膜电位，影响菌体细胞的代谢活性，从而发挥抑菌作用。