一种抗感染的抗菌肽散剂及其制备方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种用于抗感染的抗菌肽散剂及其制备方法。


背景技术：

2.随着生物医药技术的发展，抗菌肽用于抗菌研究的报道日渐增多。抗菌肽以细胞膜为主要靶点，通过其独特的特点致使细胞膜丧失其屏障功能，现已成为了生物医药领域的焦点。
3.医学上的感染，是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。局部组织的感染如皮肤的划伤，破损，烫伤，脓疮等等都会引起感染。cn111643559a专利中公开了目前用于治疗上述感染的药物剂型繁多，如颗粒或膏剂，但均存在一定的缺点。其研究者开发了一种解毒生肌的中药散剂，特别适用于暴露疗法。散剂是固体剂型中的分散程度最大的制剂，药物粒径小，易于分散，制备工艺简单，易于控制剂量。cn1795871a公开了一种治疗口腔溃疡的中西药散剂，具有制备工艺简便，疗效好等优点。cn10797262a公开了一种治疗小儿口腔溃疡的西药散剂。cn106727621a公开了一种治疗牙痛的西药散剂，具有毒副作用小，见效快等优点。上述散剂的活性成分均为中药成分，或者西药活性成分的混合物，且上述散剂的制备多在室温条件下进行，原料在制剂过程中稳定性良好。
4.抗菌肽在湿、热条件下容易产生降解，制备过程中产生局部过高温度会导致抗菌肽产生降解杂质，导致产品质量变差。针对热不稳定的多肽产品，将抗菌肽通过冻干工艺制得抗菌肽冻干组合物可改善抗菌肽的稳定性。cn104043098a公开了一种用于治疗妇女阴道炎的抗菌肽冻干制剂及其制备方法，该产品是将抗菌肽原料溶液冻干制得抗菌肽原料冻干粉，但临床上常需辅以专溶。产品工艺复杂，且给临用应用带来一定的不便性等。如能够通过冻干制备稳定的抗菌肽组合物散剂，那将会改善临床用药便利性。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种抗菌肽散剂，通过冷冻干燥工艺制备而得。抗菌肽散剂用于抗感染治疗，以期望解决细菌等日益严重的抗药性问题，为广大患者减轻痛苦。
6.针对热不稳定多肽产品，将抗菌肽通过冻干工艺制得抗菌肽冻干组合物可改善抗菌肽的稳定性。
7.本发明公开了一种用于抗感染的抗菌肽散剂，包括下述质量份的组分：抗菌肽0.05～0.5份、乳糖2～5份、甘露醇5～10份、柠檬酸钠0.1～1份。
8.其中，所述抗菌肽为如下通式的多肽：
9.区段甲
‑ⅰ‑
a
‑ⅱ‑
区段乙；
[0010]ⅰ选自下述任意氨基酸残基：l
‑
亮氨酸、d
‑
亮氨酸、l
‑
缬氨酸、d
‑
缬氨酸、l
‑
丙氨酸、d
‑
丙氨酸、甘氨酸、l
‑
丝氨酸、d
‑
丝氨酸、l
‑
赖氨酸及d
‑
赖氨酸(l
‑
和d
‑
光学异构形式的l、a、
s、v和k，以及g)；
[0011]ⅱ选自下述任意氨基酸残基：选自下述任意氨基酸残基：l
‑
亮氨酸、d
‑
亮氨酸、l
‑
缬氨酸、d
‑
缬氨酸、l
‑
丙氨酸、d
‑
丙氨酸、甘氨酸、l
‑
丝氨酸、d
‑
丝氨酸、l
‑
赖氨酸及d
‑
赖氨酸(l
‑
和d
‑
光学异构形式的l、a、s、v和k，以及g)；
[0012]
区段甲如seq id no：1所示，其序列为：kwksflktfk；
[0013]
区段乙如seq id no：2所示，其序列为：ktvlhtalkaiss；
[0014]
a代表丙氨酸残基；
[0015]
所述通式中，方向为自n端至c端。
[0016]
优选的，所述抗菌肽为na
l
以及d
‑
na
l
。
[0017]
所述na
l
具有seq id no：3的序列，其氨基酸序列为：kwksflktfksaaktvlhtalkaiss；
[0018]
所述d
‑
na
l
具有seq id no：4的序列，其氨基酸序列为：kwksflktfksaaktvlhtalkaiss(除了第13位的a为l构型外，所有氨基酸都是d
‑
构型)。
[0019]
所述抗感染的抗菌肽散剂的ph值为4.0～6.0。
[0020]
优选的，所述用于抗感染的抗菌肽散剂，包括下述质量份的组分：抗菌肽0.05～0.5份、乳糖3～3.5份、甘露醇6～6.5份、柠檬酸钠0.4～0.5份。
[0021]
本发明的还提供了上述抗菌肽散剂的制备方法。
[0022]
本发明所提供的抗菌肽散剂的制备方法，其原料包括下述质量体积百分比(g/100ml)的物质：抗菌肽0.5
‰
～5
‰
、乳糖2％～5％，甘露醇5％～10％，柠檬酸钠0.1％～1％、余量为注射用水。
[0023]
本发明所提供的抗菌肽散剂的制备方法，包括下述步骤：将所述抗菌肽、乳糖和甘露醇加入注射用水中，搅拌溶解，加入柠檬酸钠调节ph值至4.0～6.0，注射用水补加至全量；经0.22μm滤膜除菌过滤后分装于西林瓶中，半加塞置于真空冷冻干燥机中冻干；待冻干结束后，所述真空冷冻干燥机箱体充入氮气，箱体压力至
‑
0.015mpa～0mpa，维持10～15分钟后，压塞，出箱，轧盖。
[0024]
其中，所述冻干的具体冻干曲线如下：
[0025]
预冻阶段：冷阱降温至
‑
50℃以下，维持3～4小时，使样品冻实。
[0026]
主升华阶段：控制导热油温度在1～2小时内升温至
‑
10℃，维持8～12小时；控制导热油温度在1～2小时内升温至0℃，维持15～25小时。
[0027]
解析干燥阶段：控制导热油温度在1～2小时内升温至30℃，维持5～10小时。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0029]
由于抗菌肽在湿、热条件下容易产生降解，本技术将抗菌肽溶解后，加入稳定剂，制备抗菌肽冻干散剂，固体状态下储存可改善抗菌肽的稳定性。此外，本品旨在开发一种局部外用抗感染药物，制备抗菌肽散剂具有携带便捷，可直接用药，增加了患者的顺应性。
具体实施方式
[0030]
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0031]
下述实施例中使用的抗菌肽的序列(具有seq id no：3的序列)能够通过人工合
成。
[0032]
实施例1：抗菌肽冻干保护剂的筛选
[0033]
抗菌肽冻干保护剂可以选自蔗糖、海藻糖、葡聚糖、乳糖、甘露醇、甘氨酸、肌醇、葡甲胺、山梨醇、精氨酸、组氨酸、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、环糊精、羟丙基甲基纤维素等，本发明重点考察了乳糖，甘露醇，环糊精以及羟丙基甲基纤维素作为冻干保护剂对抗菌肽散剂(抗菌肽散剂的制备方法参见实施例3)质量的影响，具体处方见表1，结果见表2。
[0034]
表1含不同冻干保护剂的抗菌肽散剂处方组成
[0035]
处方抗菌肽乳糖甘露醇环糊精羟丙甲纤维素柠檬酸钠注射用水处方10.1g3.3g6.28g//0.4g100ml处方20.1g/9.38g/0.2g0.4g100ml处方30.1g/8.58g1g/0.4g100ml
[0036]
表2抗菌肽散剂(25℃条件下)稳定性考察结果
[0037][0038][0039]
由表1和表2结果分析可知，处方1在25℃条件下放置3个月，抗菌肽含量仍高于98％，而处方2和处方3在相同条件下，抗菌肽含量均低于95％，故而选择甘露醇和乳糖作为抗菌肽冻干保护剂。
[0040]
实施例2：冻干充氮工艺的考察
[0041]
抗菌肽散剂处方组成表：
[0042][0043]
采用上述处方，冻干过程考察了充氮(箱体压力至
‑
0.01mpa)对抗菌肽散剂质量的影响，结果见表3。
[0044]
表3充氮对抗菌肽散剂(25℃条件下)质量的影响
[0045][0046]
由表3结果分析可知，在25℃条件下放置3个月，未充氮组抗菌肽含量低于95％，而充氮组抗菌肽含量高于98％，顶空充氮能够提高抗菌肽散剂的产品质量。
[0047]
实施例3：抗菌肽散剂
[0048]
抗菌肽散剂(一)：
[0049][0050]
抗菌肽散剂(二)：
[0051][0052][0053]
抗菌肽散剂(三)：
[0054][0055]
抗菌肽散剂(四)：
[0056][0057]
制备工艺如下：将抗菌肽，乳糖和甘露醇加入注射用水中，搅拌溶解，加入柠檬酸钠调节ph值至5.0，注射用水补加至全量。经0.22μm滤膜除菌过滤后分装于西林瓶中，半加塞置于真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，具体的冻干曲线如下：
[0058]
预冻阶段：冷阱降温至
‑
50℃以下，维持3～4小时，使样品冻实。
[0059]
主升华阶段：控制导热油温度在1～2小时内升温至
‑
10℃，维持8～12小时；控制导热油温度在1～2小时内升温至0℃，维持15～25小时。
[0060]
解析干燥阶段：控制导热油温度在1～2小时内升温至30℃，维持5～10小时。
[0061]
充氮：待解析干燥完成后，冻干机箱体充入氮气，箱体压力至
‑
0.015mpa～0mpa，维持10～15分钟后，压塞，出箱，轧盖。
[0062]
抗菌肽散剂质量评价方法：
[0063]
1)有关物质：照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录v d)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，取溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。有关物质及限度：面积归一化法总杂质不得超过3.0％。
[0064]
2)含量：照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，精密量取本品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.25mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取抗菌肽对照品(抗菌肽原料药)适量，同法测定。
[0065]
抗菌肽散剂(一)及抗菌肽散剂(二)稳定性考察结果见表4。
[0066]
表4抗菌肽散剂(4℃条件下)稳定性考察结果
[0067][0068]
由表4可见，抗菌肽散剂(一)和抗菌肽散剂(二)处方在4℃条件下，在12个月内抗菌肽的含量均能够维持在98％以上。
[0069]
实施例4：抗菌肽散剂抗皮肤感染试验
[0070]
icr小鼠，20
±
2g，雄性。按体重随机分组。每组10只，共5组，分为模型组，散剂基质对照组，左氧氟沙星凝胶阳性对照组，抗菌肽散剂(一)组，抗菌肽散剂(二)组。普通级动物房饲养，喂以普通饲料，自由摄水，光照12小时明暗交替。
[0071]
试验菌株：金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003。
[0072]
制剂：抗菌肽散剂(一)，抗菌肽散剂(二)，散剂基质(抗菌肽散剂(一)对应的空白)，左氧氟沙星凝胶(0.5％制剂，山东方明药业集团股份有限公司)。
[0073]
方案：(1)取保存于液氮的金黄色葡萄球菌菌株接种于血液平板，37℃过夜培养。
[0074]
(2)次日将生长于血平板的单个菌落接种于mh液体培养基中，于控温摇床中37℃震荡培养1h。
[0075]
(3)将被测定菌液与0.5麦氏比浊标准液比色，稀释至5
×
106cfu/ml备用。
[0076]
(4)皮肤造模：将小鼠背部剪毛，脱毛膏脱毛，待毛全部褪去后，用600目砂纸打磨至渗血。渗血皮肤皮下注射浓度为5
×
106cfu/ml的菌液，0.05ml。
[0077]
(5)给药：左氧氟沙星凝胶(0.5％制剂，山东方明药业集团股份有限公司)给药0.1ml，抗菌肽散剂及散剂基质给药剂量均为50mg，每天早晚各外用1次，连续3天一疗程。
[0078]
(6)3天后，无菌取感染部位皮肤，按体积1:10稀释并研磨匀浆，取20μl涂皿，检测活菌并计数统计。
[0079]
结果：感染皮肤检测结果见表5。
[0080]
表5抗菌肽散剂对金葡菌皮肤感染影响
[0081][0082][0083]
由表5可知，抗菌肽散剂与基质对照组以及模型组相比较效果明显，对抗金黄色葡萄球菌皮肤感染效果较好。
[0084]
抗菌肽散剂为局部外用抗感染药物，适用于致病菌尤其是耐药菌引起的各种感染，以及湿疹合并感染、溃疡合并感染等继发性皮肤感染，具有广泛的应用前景。