reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物及其诱导表皮再生修复创面的应用
技术领域：
：1.本发明涉及生物化学、分子生物学、免疫学、材料生物学和皮肤病学领域，涉及一种促进创面快速愈合的光敏水凝胶组合物及其应用、以及制备方法。
背景技术：
：：2.皮肤是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和承受压力的功能。人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织三层组成。皮肤具有屏障作用：一方面防止体内水分、电解质等丢失；另一方面阻止外界有害物质的侵入，为机体抵挡外界的紫外线、化学物质、过敏原、微生物，形成一道天然的屏障来保护宿主。同时，皮肤中的体毛可以维持体温，而汗液可以排毒，维持体液内环境平衡。皮下脂肪组织可以保持体温，并分泌生长因子和细胞因子【1】。3.由于受伤或疾病而使大部分皮肤失去完整性可能导致严重残疾。大面积皮肤损伤如若无法及时修复将引起多种并发症，严重时可能会危及生命。例如，皮肤大面积损伤后会导致大量的体液流失，从而导致人体的内环境失衡，引发器官衰竭。另外，皮肤屏障丢失后导致机体更容易受到外界微生物的感染，从而引发脓毒症【2】。并且，皮肤创伤处的炎症反应过强还会导致皮肤伤口修复速率降低，同时更容易出现疤痕【3】。除了急性伤口外，慢性皮肤伤口如压力溃疡和糖尿病足溃疡也在稳步上升。根据统计，美国在2013年皮肤治疗的花费达到了750亿美元，而其中由于烧伤或其他原因使大面积皮肤屏障受损导致病人死亡的比例达到15％【4】。因此，寻找在大型皮肤创面出现后及时封闭伤口来控制体液流失和防止伤口感染和发炎至关重要。4.创伤愈合是一个有序的变化过程。但在大面积感染性皮肤缺损愈合中往往需二次再处理,即植皮或缝合才能治愈【5】。目前有许多的新型材料被用于伤口的治疗过程当中，水凝胶也是其中之一【6】。光致亚胺交联水凝胶体系是一种新型的光敏感水凝胶体系，该体系中接枝有邻硝基苄醇(nb)光响应基团的透明质酸ha-nb在395nm光照下产生醛基，随即同含有氨基的材料(例如壳聚糖、明胶、聚赖氨酸、蛋白质、富含血小板血浆prp等)和生物组织表面的氨基反应形成亚胺键，在原位构建水凝胶的同时实现水凝胶与作用处生物组织的化学键固定【7】。该方法具备光致交联水凝胶优异的可操作性和成胶可控性。在创伤修复过程中，新生细胞和组织可以充分的向水凝胶内部迁移和渗透，更好地发挥水凝胶支架材料的作用，加速创伤的愈合进程，因此该光致亚胺交联水凝胶具有重要的临床转化价值【8】。5.另外，伤口感染是大型创面护理的一大挑战，也是造成创伤后死亡的最常见原因。在抗感染过程中，目前主要使用抗生素抑制微生物感染。但是，抗生素的使用会导致耐药细菌和真菌的产生，从而使皮肤损伤的治疗面临一个重大挑战【7】。而本发明课题组发现抗菌蛋白胰岛再生源蛋白(regeneratingislet-derivedprotein3a，reg3a)不仅具有抑制细菌生长的功能【10】，还能促进细胞增殖【11】和抑制伤口发炎【12】。但是将reg3a(人)/regⅲγ(鼠)与水凝胶混合是否能起到快速封闭伤口、促进伤口愈合、防止伤口感染以及控制伤口炎症的多重作用仍未知。6.目前大面积的皮肤烧创伤除了进行基本的止血、封闭伤口、控制炎症以及防止感染等早期处理以外，还需要进行二期的处理，即植皮以恢复完整的皮肤屏障。植皮的来源主要是自体其他部位的皮肤或其他动物的皮肤，如猪皮等，将它移植到人身上容易造成与其他类型的器官移植同样的问题即免疫排斥反应。由于大面积烧创伤患者通常有一定程度的免疫功能障碍，因此感染的风险增加，免疫抑制治疗不可取。在2018年，日本的kurita报道了他们的一项研究成果：通过将四种转录因子dgtm(dnp63α、grhl2、tfap-2α、c-myc)转入到小鼠的间充质干细胞后能成功诱导间充质干细胞分化成上皮样的细胞。经过鉴定，该细胞具有与小鼠的角质形成细胞类似的形态和特征，并能在体外形成3d皮肤【13】。同时，将带有dgtm四种转录因子的慢病毒上清加入小鼠的伤口【14】，就可以使小鼠皮肤溃疡表面快速有效的上皮化。但是对于dgtm和reg3a/regⅲγ、水凝胶组合使用是否能通过快速封闭伤口来防止体液流失、伤口感染以及控制伤口炎症来促进dgtm在伤口中诱导间充质干细胞重编程为角质形成细胞，从而原位再生表皮来使大面积烧创伤创面无需手术植皮就能原位修复完全未知。因此，本专利即利用dgtm、reg3a和光敏水凝胶的组合来达到大面积烧创伤创面无需清创、植皮即能快速修复的目的。技术实现要素：7.本发明涉及生物化学、分子生物学、免疫学、材料生物学和皮肤病学领域，涉及通过将光敏水凝胶、具有杀菌消炎作用的reg3a蛋白以及dnp63a(d)、grhl2(g)、tfap2a(t)和myc(m)(也称dnp63α、grhl2、tfap2α、c-myc)四种因子组合起来从而达到促进大型皮肤创面表皮原位再生和快速愈合效果。8.本发明针对大面积以及溃疡创面难以原位再生修复从而危及患者生命这一亟待解决的问题，计划利用生物相容性优异且易于控制的光敏水凝胶快速封闭伤口，并将具有消炎、杀菌、促进伤口修复功能的胰再生源蛋白reg3a和能够诱导创面皮肤再生的四种转录因子dgtm(dnp63α、grhl2、tfap2α、c-myc)的组合使用，诱导表皮原位再生，实现大面积创面无需清创和手术植皮即能快速修复的目的。9.本发明提出了一种reg3a-光敏水凝胶，所述reg3a-光敏水凝胶包含光敏水凝胶和reg3a蛋白。10.本发明涉及一种新型光致亚胺交联水凝胶体系，该水凝胶体系中，接枝有邻硝基苄醇(nb)光响应基团的透明质酸ha-nb在395nm光照下产生醛基，随即同含有氨基的材料(例如壳聚糖、明胶、聚赖氨酸、蛋白质、富含血小板血浆prp等)和生物组织表面的氨基反应形成亚胺键，在原位构建水凝胶的同时实现水凝胶与作用处生物组织的化学键固定。11.本发明还提出了一种reg3a-光敏水凝胶的制备方法，所述reg3a-光敏水凝胶的制备方法为reg3a蛋白与光敏水凝胶混合后孵育于创面，使用紫外灯照射10-30s后凝固。12.本发明中，所述reg3a蛋白是一类具有抑制细菌生长和伤口发炎以及促角质形成细胞增殖的生物活性的蛋白质，其在鼠中的同源蛋白为regiiiγ，氨基酸序列如seqidno.1和2所示，核苷酸序列如seqidno.3和4所示。13.具体地，小鼠的regiiiγ氨基酸序列如(seqidno.1)所示；人的reg3a氨基酸序列如(seqidno.2)所示；小鼠的regiiiγ核苷酸序列如(seqidno.3)所示；人的reg3a核苷酸序列如(seqidno.4)所示。14.本发明提出一种将伤口处的间充质干细胞重编程为角质形成细胞的方法，即通过使用慢病毒感染将四种转录因子dgtm转入到小鼠的间充质干细胞当中，然后使用f-medium诱导得到上皮样的细胞。经过鉴定，该细胞具有与小鼠的角质形成细胞类似的形态和特征，并能在体外分化为分层的表皮。15.本发明还提出一种reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物，包括如上所述的reg3a-光敏水凝胶和诱导创面表皮再生的dgtm因子。其中，所述dgtm因子指的是dnp63α、grhl2、tfap-2α、c-myc四种转录因子，dgtm因子氨基酸序列如seqidno.5、6、7、8所示，其核苷酸序列如seqidno.9、10、11、12所示。16.具体地，dnp63α的氨基酸序列如(seqidno.5)所示；17.dnp63α的核苷酸序列如(seqidno.9)所示；18.grhl2的氨基酸序列如(seqidno.6)所示；19.grhl2的核苷酸序列如(seqidno.10)所示；20.tfap2a的氨基酸序列如(seqidno.7)所示；21.tfap2a的核苷酸序列如(seqidno.11)所示；22.c-myc的氨基酸序列如(seqidno.8)所示；23.c-myc的核苷酸序列如(seqidno.12)所示。24.所述dgtm因子(dnp63α、grhl2、tfap-2α、c-myc)诱导间充质细胞重编程为角质形成细胞。25.本发明还提供了所述reg3a-dgtm光敏水凝胶在制备抑制伤口中细胞因子产生的药物中的应用。26.其中，所述细胞因子包括tnfα和il-6。27.本发明还提出一种药物组合物或试剂或试剂盒，其含有如上所述的reg3a-光敏水凝胶，和/或dgtm因子，和/或如上所述的reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物。28.本发明提出所述reg3a-光敏水凝胶、所述reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物、所述药物组合物或试剂或试剂盒在制备治疗大面积皮肤创面的药物中、在用于抑制创面细胞因子产生的药物中、用于促进角质形成细胞增殖的药物中的应用。29.本发明还提出所述reg3a-光敏水凝胶、所述reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物、所述药物组合物或试剂或试剂盒的制备方法。30.本发明还提供了如上所述的reg3a-光敏水凝胶、如上所述的reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物、如上所述的药物组合物或试剂或试剂盒在用于促进大面积皮肤创面愈合的方法，向受试者个体施用reg3a-光敏水凝胶和/或reg3a-dgtm光敏水凝胶组合物。31.本发明有益效果包括：本发明提出将能够快速封闭伤口的光敏水凝胶以及同时具有促进角质形成细胞增殖、抑制细菌生长以及控制伤口发炎的reg3a蛋白和dgtm诱导技术结合起来，为大面积皮肤烧创伤创面的原位修复提供新的治疗方法。32.具体地，所述方法包括以下步骤：33.(1)载体构建：以能够用于真核细胞基因超表达的慢病毒载体plvx-ires-zsgreen载体为构建载体，将从角质形成细胞克隆出的dnp63α、grhl2、tfap2α、c-myc的基因片段连入载体中，将构建的质粒进行测序确定无误后备用。34.(2)慢病毒包装：将构建好的慢病毒载体与慢病毒组装载体pspax2、pmd2.g用pei共转入hek293t细胞中。转染48小时后收集细胞培养上清。得到的慢病毒上清过0.45um滤膜后备用。35.(3)慢病毒浓缩：向包装好的慢病毒上清中加入5xpeg8000浓缩液，摇晃均匀后在4度冰箱中静置过夜。第二天，使用冷冻离心机4度4500rpm离心30分钟后弃掉上清，使用原液体积的1/100重悬病毒颗粒，得到浓缩100倍的病毒悬液。36.(4)dgtm慢病毒诱导间充质干细胞分化为角质形成细胞：37.取怀孕13.5天的孕鼠，分离胎鼠的胚胎成纤维细胞，培养至p3代后种24孔板。弃去细胞原有的培养基，按d:g:t:m＝1:1:0.5:1的比例向24孔板的每个孔加入四个因子的慢病毒上清，同时再补加dmem完全培养基以及终浓度为10ug/ml的polybrene，感染过夜。第二天将含病毒的培养液弃去，换成新鲜的dmem培养基。连续换液至病毒感染后第3天。在d3天将培养液换为诱导角质形成细胞的培养基f-medium(3:1[v/v]f-12[ham]-dmem,5％fbs,0.4μg/mlhydrocortisone,5μg/mlinsulin,8.4ng/mlcholeratoxin,10ng/mlegf,24μg/mladenine,100u/mlpenicillin,100μg/mlstreptomycin)，每天换液，观察细胞的形态变化，收集细胞rna检测角质形成细胞的marker表达。[0038](5)dgtm诱导的角质形成细胞体外分化成表皮：首先构建真皮等效物：取一块2cmx2cm大小的人的包皮，彻底的清洗后，使用1m的nacl溶液在37℃培养箱里浸泡过夜，第二天将包皮上的表皮去除，剩下的真皮部分用含400u/mlp/s的dmem浸泡分钟，之后用含400u/mlp/s的dmem浸泡30分钟，最后将真皮浸泡在50u/mlp/s的dmem中6天。将真皮等效物加载到铝座上后，在顶部设置一个塑料环(直径1cm)，并用含有y27632的f-培养基重悬诱导得到的表皮祖细胞，接种在环内的细胞密度为4×105个/cm2。在培养的前6天，培养基的ca2+浓度逐渐增加到1.8mm。第7天，环内培养基的体积缩小到上皮细胞片的水平面，使上皮细胞在气液界面生长。于第14天观察，进行组织学观察表皮形成。[0039](6)reg3a/regiiiγ蛋白纯化：将-80℃保存的含有超表达reg3a质粒的大肠杆菌bl21在tsb培养平板上划线，第二天挑单菌落接种于tsb液体培养基中过夜培养，将过夜培养物转接于新鲜的tsb培养基中继续培养；当od600为0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导表达，收集诱导后的菌体，进行破菌和洗涤；分别取诱导前后、破菌上清和沉淀以及洗涤后的上清沉淀的样品进行sds-page检测目的蛋白表达情况。溶解包涵体后，进行蛋白的复性和透析，滤膜过滤除菌后上阳离子柱(captospimpres阳离子柱)，用不同浓度的nacl溶液作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液进行sds-page检测目的蛋白洗脱情况。根据显示结果收集洗脱样品进行透析、超滤和浓缩，收集超滤前后样品进行sds-page检测目的蛋白表达情况，其余样品分装后冻存于-80℃备用。[0040](7)dgtm-reg3a光敏水凝胶促进小鼠大面积伤口愈合：计算每种病毒颗粒数达到109所需要的病毒悬液体积，将病毒悬液液滴加在小鼠伤口部位，再将100ugregⅲγ与100ul水凝胶混合后涂抹在伤口部位封闭伤口。处理完毕后对小鼠背部伤口每天拍照直至伤口完全愈合。使用imagej分析小鼠背部伤口大小后用excel处理统计伤口愈合比例，分析结果在graphpadprism8.3内进行作图分析。附图说明[0041]图1表示dnp63a、grhl2、tfap2a、c-myc四个基因慢病毒病毒感染mef的最佳moi分别为1:100、1:200、1:200、1:200。[0042]图2表示dgtm慢病毒诱导mef分化成角质形成细胞的最适组合比例为1:1:0.5:1。[0043]图3表示使用慢病毒转染dgtm因子到mef细胞后诱导不同天数会出现与角质形成细胞形态相似的细胞。[0044]图4表示使用慢病毒转染dgtm因子到mef细胞后dgtm转录因子超表达成功。[0045]图5表示使用慢病毒转染dgtm因子到mef细胞后外胚层细胞的标志k8\k18以及角质形成细胞的标志蛋白k14\cdh1的表达随着诱导时间增加而表达增加。[0046]图6表示dgtm诱导得到的角质形成细胞能在小鼠的真皮上分化形成表皮层。[0047]图7表示纯化得到regⅲγ的过程。[0048]图8表示regⅲγ抑制了dgtm诱导得到的角质形成细胞中poly(i:c)诱导的炎症因子il-6、tnf-α的表达。[0049]图9表示regⅲγ促进dgtm诱导得到的角质形成细胞的增殖相关基因pcna表达增加。[0050]图10表示用光敏水凝胶+regⅲγ+dgtm不同组合治疗小鼠大面积伤口后伤口面积大小以及统计的小鼠伤口愈合速率，结果显示光敏水凝胶+regⅲγ+dgtm组合显著促进大面积伤口愈合。[0051]图11表示使用光敏水凝胶+regⅲγ+dgtm不同组合使小鼠伤口处的炎症因子il-6、tnf-α表达下降。具体实施方式：[0052]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。[0053]实施例1：病毒转染的最佳moi检测[0054]取怀孕13.5天的孕鼠，分离胎鼠的胚胎成纤维细胞，培养至p3代后种24孔板，细胞密度为4000-5000个/cm2。第二天，取出24孔板，弃去细胞原有的培养基，按1：10、1：100、1：200的细胞与病毒比例感染细胞，细胞感染过夜以后第二天将含病毒的培养液弃去，换成新鲜的dmem培养基。继续培养至48h时，在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达变化。[0055]实验结果表明，如图1所示，dnp63a、grhl2、tfap2a、c-myc四个基因慢病毒病毒感染mef的最佳moi分别为1:100、1:200、1:200、1:200。[0056]实施例2：dgtm慢病毒诱导mef分化成角质形成细胞的最适组合比例为1:1:0.5:1.[0057]取怀孕13.5天的孕鼠，分离胎鼠的胚胎成纤维细胞，培养至p3代后种24孔板。弃去细胞原有的培养基，按1:1:1:1、2:1:1:1、1:2:1:1、1:1:2:1、1:1:1:2、2:2:1:1、1:1:2:2以及1:1:0.5:1这8种不同的dgtm组合对mef进行感染，感染过夜。第二天将含病毒的培养液弃去，换成新鲜的dmem培养基。连续换液至病毒感染后第3天。在第4天收集rna样品，用rt-pcr检测角质形成细胞的标志基因keratin14以及成纤维细胞的标志基因fsp1表达(图2)。实验结果显示不同比例的dgtm诱导第4天，细胞中fsp1表达没有太大差异，但k14的表达显著升高。其中，dgtm比例在1:1:1:1、2:2:1:1、1:1:0.5:1能显著诱导细胞中k14表达升高，而k14表达最低的两组均是增加了tfap2a的量。这说明tfap2a可能会抑制角质形成细胞的增殖，因此我们最后认为dgtm在2:2:1:1、1:1:0.5:1是诱导mef分化为角质形成细胞的最适组合。[0058]实施例3：dgtm诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化成角质形成细胞[0059]取怀孕13.5天的孕鼠，分离胎鼠的胚胎成纤维细胞，培养至p3代后种24孔板。弃去细胞原有的培养基，按d:g:t:m＝1:1:0.5:1的比例向24孔板的每个孔加入四个因子的慢病毒上清，同时再补加dmem完全培养基以及终浓度为10ug/ml的polybrene，感染过夜。第二天将含病毒的培养液弃去，换成新鲜的dmem培养基。连续换液至病毒感染后第3天。在d3天将培养液换为诱导角质形成细胞的培养基f-medium(3:1[v/v]f-12[ham]-dmem,5％fbs,0.4μg/mlhydrocortisone,5μg/mlinsulin,8.4ng/mlcholeratoxin,10ng/mlegf,24μg/mladenine,100u/mlpenicillin,100μg/mlstreptomycin)，每天换液，观察细胞的形态变化，收集细胞rna检测角质形成细胞的marker表达。[0060]实验结果表明，诱导5天后，本发明观察到与角质形成细胞形态类似的细胞(图3)，并且能检测到这些细胞发出荧光，说明dgtm在细胞中成功表达。通过rt-pcr本发明也检测到dnp63a、grhl2、tfap2a、c-myc四个基因的表达均在d3天明显上升(图4)。[0061]同时取诱导过程中d0、d3和d7天的细胞的rna检测外胚层细胞标记基因(k8、k18)的表达以及角质形成细胞标记基因(k14、cdh1)表达(图5)。实时定量pcr检测到在d7天k14表达升高了4倍，而cdh1的表达升高了20倍(图5)。其次本发明发现d3天的细胞表达k8升高了2倍、k18升高了1.5倍。但是在d7天细胞的k8和k18的表达又下降到了与d0天一样的水平。这些实验结果显示mef细胞在dgtm的作用下最终能分化为角质形成细胞。[0062]实施例4：dgtm诱导所得的角质形成细胞在体外形成上皮组织[0063]将使用dgtm感染成纤维细胞诱导得到的角质形成细胞以细胞密度为4×105个/cm2的数量接种至去除表皮的小鼠真皮上的塑料环中。待细胞贴壁，吸去塑料环中培养基后，在塑料环外使用含1.8mmca2+的培养基在气液界面诱导培养14天，14天后取组织样品使用4％pfa固定后脱水透明制作石蜡切片后进行he染色.实验结果表明，如图6所示，接种了诱导角质形成细胞的皮肤能够分化形成分层的表皮。[0064]实施例5：regⅲγ蛋白的纯化：[0065]将-80℃保存的细菌在平板培养基上划线，第二天挑单菌落接种于液体培养基中过夜培养，将过夜培养物转接于新鲜培养基中继续培养；当od600为0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导表达，收集诱导后的菌体，进行破菌和洗涤；分别取诱导前后、破菌上清和沉淀以及洗涤后的上清沉淀的样品进行sds-page检测目的蛋白表达情况(图7a、b)。溶解包涵体后，进行蛋白的复性和透析，滤膜过滤除菌后上柱(captospimpres阳离子柱)，用成分为20、50、100、200、300、500mm、1mnacl(溶于20mmph6.5的pb中)的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液进行sds-page检测目的蛋白洗脱情况(图7c)。根据显示结果收集洗脱样品进行透析、超滤和浓缩，收集超滤前后样品进行sds-page检测目的蛋白表达情况，其余样品分装后冻存于-80℃备用。[0066]实施例6：regⅲγ抑制dgtm诱导所得的角质形成细胞中poly(i:c)诱导的炎症因alliancebetweenstemcellsandtheirniche.developmentalcell,2017,43(4):387-401.[0078]【2】hsuyc,lil,fuchse.emerginginteractionsbetweenskinstemcellsandtheirniches.naturemedicine,2014,20(8):847-856.[0079]【3】smithrm.immunity,traumaandtheelderly.injury,2007,38(12):1401-1404.[0080]【4】arwerten,hostee,wattfm.epithelialstemcells,woundhealingandcancer.naturereviewscancer,2012,12(3):170-180.[0081]【5】gurtnergc,werners,barrandony,etal.woundrepairandregeneration.nature.nature,2008,453(7193):314-321.[0082]【6】钟永富,刘华,徐支南,etal.纳米人造皮肤及其材料在烧伤创面的应用applicationofnanoartificialskinanditsmaterialsinburnwounds.中国组织工程研究,2010,014(029):5411-5414.[0083]【7】yang,y.,etal.tissue-integratableandbiocompatiblephotogelationbytheiminecrosslinkingreaction.advancedmaterials28,2724-2730(2016).[0084]【8】yang,y.,etal.tissue-integratableandbiocompatiblephotogelationbytheiminecrosslinkingreaction.advancedmaterials28,2724-2730(2016).[0085]【9】branski,l.k.,etal.emerginginfectionsinburns.surgicalinfections10,389-397(2009).[0086]【10】jiangz,liuy,lic,etal.interleukin-36γinducedbythetlr3-slug-vdraxispromoteswoundhealingviareg3a.journalofinvestigativedermatology,2017:s0022202x17327379.[0087]【11】theantimicrobialproteinreg3aregulateskeratinocyteproliferationanddifferentiationafterskininjury.immunity,2012,37(1):74-84.[0088]【12】wuy,quany,liuy,etal.hyperglycaem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