抗EGFR融合蛋白或其抗原结合片段的组合物及其用途的制作方法

抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段的组合物及其用途
技术领域
1.本发明涉及一种抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段的药物组合物及其制剂和用途。


背景技术：

2.根据抗egfr抗体的各种体外和体内研究结果，抗egfr抗体可抑制癌细胞增殖、减少介导肿瘤的血管生成、诱导癌细胞凋亡、增强放射治疗和传统化疗的毒性作用。因此，抗egfr抗体可以抑制各种水平的肿瘤。
3.然而，用于治疗目的的包含抗egfr抗体或融合蛋白或抗原结合片段的液体制剂可能会存在由于抗体或融合蛋白或抗原结合片段的聚集性质导致蛋白质多聚体形成的问题，并且也可能会由于蛋白水解反应而发生脱氨基反应。这种变性反应可以由例如在运输过程中在高温下储藏或由切应力引起。如果包含抗egfr 抗体或融合蛋白或抗原结合片段的液体制剂由于变性反应而出现聚集，则可能出现沉淀并形成颗粒，从而引起栓塞。
4.在这方面，可以在将液体制剂施用于患者之前对液体制剂进行过滤(例如通过注射器注射)以防止聚集。然而，这种附加步骤可能使得给药方法复杂并且不适合于临床试验。此外，在过滤之后，颗粒可以继续形成，导致稳定性降低。
5.因此，仍然需要开发一种稳定的包含抗egfr抗体或融合蛋白或抗原结合片段的药物制剂，该药物制剂具有低浊度且在应力条件下也无聚集或无颗粒形成。
6.为了实现抗体或融合蛋白或抗原结合片段的临床潜力，必需在保存和施用期间维持所述抗体或融合蛋白或抗原结合片段的生物学活性。化学和物理的不稳定性能够促进生物学活性的降低。由于水和温度的变化，抗体或融合蛋白或抗原结合片段可能发生凝聚、氧化、脱酰胺或水解。保持抗体或融合蛋白或抗原结合片段的生物学活性的一种方法是通过冻干来稳定抗体制剂。一旦重新配制，特别有用的冻干制剂可提供高的抗体浓度，因此，需要抗egfr抗体或融合蛋白或抗原结合片段的稳定的冻干制剂。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段为可特异性结合 egfr的融合蛋白或其抗原结合片段；以及缓冲剂，所述缓冲剂为磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲剂；所述缓冲剂的ph为5.5至6.5，优选为6.0。
9.在可选的实施方案中，缓冲剂浓度为5mm至30mm，优选为5mm至25mm，最优选为10mm。
10.在可选的实施方案中，特异性结合egfr的融合蛋白或其抗原结合片段浓度为1mg/ml至20mg/ml，优选为5mg/ml。
11.在可选的实施方案中，药物组合物，其还包括糖，所述糖优选为海藻糖或蔗糖或甘
露醇，最优选为海藻糖。
12.在可选的实施方案中，糖浓度为50mm至250mm，优选为50mm至150mm，最优选为135mm。
13.在可选的实施方案中，药物组合物，其还包括表面活性剂，所述表面活性剂优选为聚山梨酯，更优选为聚山梨酯80。
14.在可选的实施方案中，其中表面活性剂的浓度为0.1mg/ml至0.4mg/ml，优选为0.2mg/ml。
15.在可选的实施方案中，一种药物组合物，其中包含：
16.(a)1mg/ml至20mg/ml的特异性结合egfr的融合蛋白或其抗原结合片段，
17.(b)5mm至30mm的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲剂，ph为5.5至6.5，
18.(c)50mm至200mm的海藻糖，和
19.(d)0.1mg/ml至0.4mg/ml的聚山梨酯80。
20.在可选的实施方案中，一种药物组合物，其中包含：
21.(a)5mg/ml的特异性结合egfr的融合蛋白或其抗原结合片段，
22.(b)10mm的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲剂，ph为6.0，
23.(c)135mm的海藻糖，和
24.(d)0.2mg/ml的聚山梨酯80。
25.在可选的实施方案中，一种药物组合物，其中所述抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段包含如seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列所示的重链hcdr1、hcdr2和hcdr3；和包含如seq id no:6、seq id no:7 和seq id no:8的氨基酸序列所示的轻链lcdr1、lcdr2和lcdr3，和/或包含如seq id no:9的氨基酸序列所示的重链。
26.在可选的实施方案中，一种药物组合物，其中所述抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段包括鼠源、嵌合、人源化或全人源的抗体或其抗原结合片段。
27.在可选的实施方案中，一种含抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段的冻干制剂，其中所述制剂通过将前述药物组合物经冷冻干燥获得。
28.在可选的实施方案中，一种含抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段的液体制剂，其中所述液体制剂通过将前述的药物组合物无菌灌装获得。
29.在可选的实施方案中，上述药物组合物冻干制剂或液体制剂可用于在制备治疗、抑制肿瘤细胞增殖或转移的疾病或病症的药物，优选地，所述疾病或病症为癌症，更优选地，所述癌症选自：肾肿瘤、胰腺肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤和卵巢肿瘤、肺肿瘤和皮肤肿瘤。
30.本发明的抗体的两条重链氨基酸序列如seq id no:1和seq id no:9所示，轻链氨基酸序列如seq id no:5所示。
31.本发明提供一种更利于生产和给药，性能更稳定的包含抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段的药物组合物，本发明的制剂稳定，生物相容性好，杂质少，储存数月之后展现了很高的抗体稳定性。解决了抗体类药物的分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定的技术问题，使药物适合给药，发挥更好的治疗效果。
32.术语的详细说明
33.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另
有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
[0034]“缓冲剂”是指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受ph变化的缓冲剂。
[0035]“药物组合物”是指含有一种或多种本文所述抗egfr融合蛋白或其抗原结合片段与其他化学组分的混合物，所述其他组分为例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持融合蛋白或抗原结合片段活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0036]
本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。
[0037]
本发明中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
[0038]“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
[0039]
本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本技术和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
[0040]
本发明所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
[0041]
稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过sec-hplc测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，抗体药物制剂是淡黄色近无色澄明液体或者无色，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、ph和重量克分子渗透压浓度具有不超过
±
10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的减少。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。
[0042]
抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(fv 区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区 (hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(cdr)。每条轻链可变区(lcvr或vl)和重链可变区(hcvr或 vh)由3个cdr区4个fr区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fr1、 cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。轻链的3个cdr区指lcdr1、lcdr2、和lcdr3；重链的3个cdr区指hcdr1、hcdr2和hcdr3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的lcvr区和hcvr区的cdr氨基酸残基在数量和位置符合已知的kabat编号规则(lcdr1-3，hcdr1-3)。
[0043]
本发明中所述的“融合蛋白”是指包括一种、两种或更多种源自不同天然存在的蛋
白质或者工程化改造后的蛋白质的多肽被人为地组合以形成一种蛋白质的蛋白质。包括但不限于一下例举的形式，1、对于一条多肽链组成的融合蛋白，其由相同或不同的多肽彼此融合，以形成包含所述不同的多肽的一条多肽链；2、对于两条或以上多肽链组成的融合蛋白，其中任选的一条或多条多肽链由相同或不同的多肽彼此融合，以形成包含所述相同或不同的多肽的多肽链，这些多肽链以共价或非共价的形式彼此组合形成蛋白。
[0044]
本发明中所述的“抗体或其抗原结合”或“功能片段”，指具有抗原结合活性的fab片段，fab’片段，f(ab’)2片段，以及与抗体结合的fv片段scfv片段。fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，fv抗体还包含在vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(singlechainantibody)或单链fv(scfv)。
具体实施方式
[0045]
本发明的融合蛋白制剂处方开发过程包括缓冲体系筛选、添加物筛选、表面活性剂筛选及初步原辅料相容性，稳定性研究。以下sec-hplc(sizeexclusion-highperformanceliquidchromatography)表示体积排阻-高效液相色谱，其中hmw，lmw分别表示高分子量、低分子量。cex-hplc(cationexchange-highperformanceliquidchromatography)表示高效液相离子交换色谱。以下不溶性微粒和可见异物的参照标准符合药典的相关规定。
[0046]
实施例1：核苷酸序列
[0047]
将目标氨基酸序列转化为核苷酸序列，获得核苷酸序列分别为：seqidno:10(egfr重链)、seqidno:11(egfr轻链)、seqidno:12((il10)2-fc)。
[0048]
实施例2：基因合成与表达载体的构建
[0049]
分别采用pcdna3.4-g418和pcdna3.1-g418载体作为表达所述多功能抗体的轻链和重链的专用载体。pcdna3.4-g418含有轻链所使用的启动子cmvpromoter、真核筛选标记g418标签和原核筛选标签ampicilline。pcdna3.1-g418载体含有重链所使用的启动子cmvpromoter、真核筛选标记g418标签和原核筛选标签ampicilline。基因合成得到抗体表达轻链和重链的核苷酸序列，用hindiii和xhoi对载体和目的片段进行双酶切，回收后通过dna连接酶进行酶连，并转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述抗体第一重链、第二重链、第一轻链重组质粒，分别为pcdna3.1-g418-1、pcdna3.1-g418-2和pcdna3.4-g418-3。
[0050]
实施例3：质粒抽提
[0051]
根据《分子克隆实验指南》(2002年，科学出版社)所述方法将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α中，将转化细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上培养，挑选质粒克隆至液体lb培养基中培养，260rpm摇菌14小时，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。
[0052]
实施例4：质粒转染、瞬转表达与抗体纯化
[0053]
在37℃、8％co2、100rpm下培养expicho至细胞密度6
×
106cells/ml。使用脂质体分别将构建的载体pcdna3.1-g418-6-1、pcdna3.1-g418-6-2、pcdna3.4-g418-6-3转染到上
述细胞中，转染质粒浓度为1μg/ml，脂质体浓度参照expicho
tm
expression system试剂盒确定，在32℃、5％co2，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和5-8天之间分别补料一次。4000rpm离心上述培养产物，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用proteina、离子柱纯化所得的抗体蛋白并收集洗脱液。
[0054]
proteina、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用ge的proteina层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1
×
pbs (ph7.4)，细胞上清上样结合后利用pbs洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1m甘氨酸(ph3.0)洗脱目的蛋白，利用tris调节ph至中性保存。将亲和层析所得产物调节ph至低于或者高于pi1-2个ph单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应ph缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应ph条件下nacl梯度洗脱，根据sds-page及sec-hplc选择目的蛋白所在的收集管合并保存。
[0055]
实施例5：缓冲体系筛选
[0056]
用抗体制剂常用的缓冲盐设计2组不同ph值的缓冲溶液。将抗体原液经过超滤换液至不同ph值的缓冲溶液、进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行40℃加速稳定性实验，定期取样，进行性状、分子排阻高效液相色谱(sec
‑ꢀ
hplc)等检测。比较稳定性所获得的数据，总结数据之间的关联性，选择有利于抗体稳定性的ph值的缓冲溶液。
[0057]
表1缓冲体系筛选研究方案
[0058][0059]
对7组缓冲体系在两个不同考察条件下不同取样点进行取样检测分析，结果见表2。
[0060]
表2缓冲体系筛选检测结果
[0061][0062]
注:40为考察条件为40
±
2℃；w为考察周期，1w＝1周。
[0063]
纯度考察项中sec-hplc的评价结果显示，磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲体系对应的f1～f4的样品在40℃放置3周后，主峰比例仍能保持在97％以上，稳定性要优于f5～f7的样品。表明该缓冲体系下抗体样品能在宽泛的ph范围内保持稳定的状态。考虑到抗体样品的ph不宜距等电点太近，选择ph值为6.0的 10mm磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲体系作为抗体制剂处方的缓冲体系。
[0064]
实施例6：辅料(糖)筛选
[0065]
用20mm组氨酸/盐酸组氨酸，ph值为6.0的缓冲溶液，添加不同辅料，如海藻糖、精氨酸、氯化钠等制成不同处方的样品，将抗体蛋白换液至相应处方中，进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行40℃高温稳定性实验，在1周、3 周、4周取样进行外观、蛋白质含量、ph值、分子排阻高效液相色谱(sec—hplc) 等检测。比较稳定性检测数据，选择有利于抗体稳定性且经济成本最佳的处方。
[0066]
制剂处方筛选方案及7组制剂处方评价数据统计表见表3和表4。
[0067]
表3制剂处方筛选方案
[0068][0069]
表4处方筛选检测结果汇总表
[0070]
[0071][0072]
注：25、40为考察条件为25℃、40℃；w为考察周期，1w＝1周。
[0073]
纯度考察项中sec-hplc的评价结果显示，样品在40℃条件下放置4周，随着时间的增加，f10和f11的样品的聚体和小分子片段的含量呈现逐渐增加的趋势，主峰比例明显下降，表明样品在添加了精氨酸的缓冲液中不稳定；f12、 f13和f14的样品的氯化钠添加量不同，聚体和小分子片段的含量均未发生明显的变化，结果表明氯化钠对样品无影响；样品在40℃条件下放置3周，f8和f9 的样品稳定性接近，从经济的角度，海藻糖含量更低的方案更佳。
[0074]
实施例7：表面活性剂筛选
[0075]
用10mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、135mm海藻糖、ph值为6.0的缓冲溶液，不同种类的表面活性剂(聚山梨酯80、聚山梨酯20)制成不同处方的样品，将抗体蛋白换液至相应处方中，进行除菌过滤、无菌分装。用分装的样品进行反复冻融(循环温度：-80～4℃)和振荡7天(250rpm，25℃)取样进行外观、分子排阻高效液相色谱(sec—hplc)等检测。比较稳定性检测数据，选择有利于抗体稳定性的活性剂及其含量。
[0076]
表面活性剂筛选方案及6组表面活性剂评价数据统计表见下表5和6。
[0077]
表5表面活性剂筛选方案
[0078][0079]
注：抗体浓度为5mg/ml。
[0080]
表6表面活性剂筛选结果
[0081][0082]
[0083]
纯度考察项中sec-hplc的评价结果显示，冻融2次和5次后，f1、f5和 f6中样品的聚体含量增加较为缓慢。因此，综合考虑优选0.2g/l聚山梨酯80作为项目制剂处方的表面活性剂。
[0084]
通过以上的研究结果可确定抗体的最佳制剂处方为ph值6.0，10mm磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲体系，135mm海藻糖，0.2g/l聚山梨酯80。
[0085]
实施例8：原液稳定性实验之光破坏试验
[0086]
通过长期稳定性试验及加速稳定性试验来评估候选制剂处方的原辅料相容性，在不同环境条件下是否能维持原液的稳定性。
[0087]
将纯化后的抗体超滤换液至10mm磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲剂+135mm 海藻糖+0.02％聚山梨酯80(ph6.0)的制剂缓冲液中，抗体溶度5mg/ml，进行除菌过滤、无菌分装，用分装的样品在5天日光+紫外的照射下的稳定性研究，进行sec-hplc检测。
[0088]
试验方案及结果见表7、表8，结果显示：抗体在5天日光+紫外的照射下，样品纯度有所下降，聚体增加，抗体出现一定程度的聚集；光照试验结果表明日光光照对抗体影响较大，会导致抗体破碎，稳定性下降。
[0089]
表7光破坏试验设计
[0090]
时间(天)5条件5(日光+紫外)
[0091]
注：1、日光光照强度为4500lx
±
500lx，紫外照度为250μw/cm2。
[0092]
表8光破坏试验结果
[0093][0094][0095]
实施例9：原液稳定性实验之抗体冻融稳定性研究
[0096]
反复冻融所产生的机械剪切力将对抗体蛋白分子产生破坏作用，而生产或其他后续保存又不可避免的或多或少的会出现反复冻融现象，故设置此次实验判断本发明抗体是否能够反复冻融。结果如表9，表明抗体浓度为5mg/ml左右时，
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80℃与-20℃冷冻2到5次、室温下融化，不会影响抗体的sec-hplc结果，抗体能较稳定的进行反复冻融。
[0097]
表9抗体反复冻融试验
[0098]
[0099]
注：dr0、dr2、dr5分别为-80℃冷冻，25℃融化0次、2次、5次。
[0100]
实施例10：液体制剂稳定性实验
[0101]
将样品配制成制剂处方：5mg/ml样品，10mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，135mm海藻糖，0.02％聚山梨酯80，ph6.0；进行除菌过滤、无菌分装；用分装的样品进行-80℃稳定性、4℃稳定性和25℃稳定性实验，放样1m、3m、 6m，进行外观、分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)等检测。
[0102]
结果如表10、11、12所示，抗体在-80℃(3个月)条件下，聚体及小分子片段未产生明显变化；在4℃(3个月)条件下，聚体及小分子片段未产生明显变化；在25℃(1个月)条件下，聚体无明显变化，在25℃(3个月)条件下，聚体轻微增加。
[0103]
长期稳定性实验数据可以看出，抗体在10mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，135mm海藻糖，0.02％聚山梨酯80，ph6.0的处方中低温保存效果较好。也可以看出，本发明组合物长期稳定性要优于专利202110141918.8。
[0104]
表10抗体-80℃稳定性试验结果
[0105][0106]
表11抗体4℃稳定性试验结果
[0107][0108]
表12抗体25℃稳定性试验结果
[0109][0110]
注：na为样品未检出。
[0111]
实施例11：冻干制剂的制备
[0112]
配制如表13所示浓度的冻干前溶液，并冻干成成品。
[0113]
表13冻干前溶液组分
[0114]
成分浓度抗体5mg/ml十二水合磷酸氢二钠0.44g/l二水合磷酸二氢钠1.37g/l
海藻糖51.35g/l聚山梨酯-800.2g/l
[0115]
将纯化后的抗体用超滤膜包进行超滤置换浓缩，超滤至磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，再与含一定比例的海藻糖、聚山梨酯-80，ph6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液混合，使得混合后各组分的浓度如表13所示。充分混匀后，分装至冻干用注射剂瓶中，按2ml/瓶分装，进行冷冻干燥。冷冻干燥程序如下：
[0116]
(1)预冻阶段∶0℃保持60min；-45℃预冻保持2h；
[0117]
(2)升华阶段∶设置真空度在10pa，程序升温，30min升温至-10℃，保持 1h；60min升温至-5℃，保持26h；30min升温至0℃，保持5h；30min升温至 5℃，保持2h；
[0118]
(3)解析干燥∶30min升温至25℃，10pa压力下保持4h，5pa压力下再保持2h；
[0119]
(4)冻干结束，压塞出箱，再手动轧盖，4℃保存。
[0120]
实施例12：冻干制剂稳定性实验
[0121]
冻干制剂稳定性实验结果如表14-18所示，抗体在4℃(2个月)条件下保持稳定，聚体增加约0.5％；在25℃(2个月)条件下，聚体增加约0.5％；在40℃ (1个月)条件下，聚体增加约0.6％。均在质量标准范围内(sec主峰含量大于 95％)。
[0122]
综上所述，抗体的冻干成品在10mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，135mm 海藻糖，0.02％聚山梨酯80，ph6.0处方中较稳定。
[0123]
表14光破坏试验设计
[0124][0125]
注：1、日光光照强度为4500lx
±
500lx，紫外照度为250μw/cm2。
[0126]
表15光破坏试验结果
[0127][0128]
表16冻干成品4℃稳定性结果
[0129][0130][0131]
表17冻干成品25℃稳定性结果
[0132][0133]
注：na为样品未检出。
[0134]
表18冻干成品40℃稳定性结果
[0135]