一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

通常认为程序性死亡1配体(pd-l1)在肿瘤细胞表面上起作用，然而基于pd-l1阻断的免疫疗法临床病例中失败率仍然很高。当前增强基于pd-l1的疗法的反应效率的方法仅限于局部调节肿瘤部位，例如增加肿瘤的免疫原性和重塑肿瘤的免疫微环境，而忽视了系统性的免疫抑制因素。值得注意的是，pd-l1还在肿瘤细胞衍生的外泌体表面表达，它随外泌体循环至全身，从而结合并耗竭循环中的t细胞，产生全身性免疫抑制全身，因此，对于免疫检查点治疗，循环外泌体pd-l1的调节与肿瘤细胞pd-l1的调节一样重要。

但是目前的pd-l1阻断抗体对外泌体pd-l1无效，原因之一是外泌体上pd-l1的独特表达方式使其对抗体的反应性降低。另一个原因是，外泌体可以循环至一些能屏蔽抗体作用的部位。迄今为止，在临床实践中还没有一种可以直接靶向外泌体pd-l1的药物，因此对精确调控外泌体pd-l1提出了挑战。而直接抑制肿瘤细胞外泌体的产生为降低总外泌体pd-l1提供了另一种策略。但是，考虑到正常细胞分泌的外泌体对维持正常生理至关重要，如何选择性地抑制肿瘤特异性外泌体从而降低潜在的全身毒性是另外一个亟待解决的难题。

技术实现要素：

为了克服上述技术问题，本发明提供一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂及其制备方法与应用。本发明通过提取荷瘤小鼠的肿瘤组织，并处理加工形成肿瘤细胞膜囊泡，经化学修饰后形成可在肿瘤组织中原位形成凝胶的凝胶因子，在共载cdk5抑制剂和外泌体抑制剂后，可以有效的调控肿瘤细胞和肿瘤外泌体pd-l1，从而同时解除局部和系统性免疫抑制，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供cdk5抑制剂联合外泌体抑制药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述cdk5抑制剂可以选自sirna、shrna、抗体、小分子化合物和肽段；

优选地，所述cdk5抑制剂选自：roscovitine(rosco)，奥罗莫星(olomoucine)及其衍生物，dinaciclib(mk-7965，sch727965)，at7519，cip，p5和cpd1等；

更优选地，所述cdk5抑制剂为roscovitine；

所述外泌体抑制药物包括但不限于钙离子离子通道抑制剂类、质子泵抑制剂类、鞘磷脂-核糖核酸酶抑制剂类、内皮素受体a干扰类药物；

优选地，所述外泌体抑制药物可以选自：二甲基阿米洛利(dma)、奥美拉唑、磺胺异恶唑、鞘磷脂酶抑制剂gw4869等；

更优选地，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利；

进一步地，所述cdk5抑制剂为roscovitine，外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利，二者质量比为1～10：1；优选地，二者质量比为5：1。

所述抗肿瘤药物至少具有如下一种或多种用途：

1)缓解肿瘤外泌体带来的免疫抑制；

2)缓解肿瘤细胞表面pd-l1带来的免疫抑制；

3)提高抗肿瘤效力；

其中，用途1)和2)均与pd-l1相关。

本发明的第二个方面，提供一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂，所述的基于细胞膜的生物活性制剂的药物活性成分包含上述cdk5抑制剂和外泌体抑制药物。

进一步地，所述生物活性制剂为水凝胶。

本发明的第三个方面，提供上述基于肿瘤细胞膜的水凝胶的制备方法，包括：

海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡形成凝胶因子，将cdk5抑制剂和外泌体抑制药物分别溶解后混合均匀，加入凝胶因子的水溶液中搅拌处理，即得成胶溶液。

本发明的第四个方面，提供上述基于细胞膜的生物活性制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：

(1)本发明将cdk5抑制剂和外泌体抑制剂联合应用于抗肿瘤，同时缓解肿瘤外泌体和肿瘤细胞表面pd-l1带来的免疫抑制，具有更优异的抗肿瘤效果；

(2)本发明首次制备了一种海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡，该结构具有凝胶因子功能，能在钙离子存在下快速形成凝胶；

(3)本发明首次合成了一种基于细胞膜的凝胶因子，其结构区别于目前已有的凝胶因子，具有较高的生物活性；

(4)本发明制备得到的基于细胞膜的水凝胶对正常细胞显示较好的生物相容性，毒副作用小，为设计更加安全的局部给药载体提供可能；

(5)本发明基于细胞膜的生物活性制剂利用免疫治疗，抑制了肿瘤外泌体的产生，下调了肿瘤细胞pd-l1基因表达，提高了体内抗肿瘤效果，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例2海藻酸钠氧化物修饰前后肿瘤细胞膜囊泡纳米结构的透射电镜图片；

图2为本发明实施例4的o-tmv凝胶的成胶照片；

图3为本发明实施例4的o-tmv和o-tmv@dr凝胶的扫描电镜图片；

图4为本发明实施例5的o-tmv@水凝胶的体外细胞毒性实验表征图；

图5为本发明实施例6的o-tmv@dr水凝胶体内抗肿瘤活性实验表征图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，同时调控肿瘤细胞及其外泌体pd-l1数量对于提高基于pd-l1的免疫治疗十分重要。

有鉴于此，发明人研究发现，cdk5在多种肿瘤细胞中高度活跃，研究表明，通过抑制cdk5，可以有效下调pd-l1。与标准的pd-l1阻断抗体相比，cdk5抑制剂可以发挥更彻底的作用。同时，dma作为一种外泌体抑制剂可以有效抑制肿瘤细胞分泌外泌体的数量。因此，本发明通过联用外泌体抑制剂(dma)和cdk5抑制剂roscovitine(rosco)，一方面，通过dma抑制肿瘤细胞产生外泌体，从而减少外泌体pd-l1的数量；另一方面，通过rosco下调pd-l1，缓解ifn-γ相关的免疫耐药，二者结合，同时调控了肿瘤和外泌体的pd-l1表达。同时，利用基于肿瘤细胞膜的可注射水凝胶作为载体，一方面，可以有效减少全身性副作用；另一方面，肿瘤细胞膜提供了大量的内源性抗原，有助于增强肿瘤的免疫原性，使其更有利于pd-l1阻断治疗发挥疗效。

因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供cdk5抑制剂联合外泌体抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述cdk5抑制剂可以选自sirna、shrna、抗体、小分子化合物和肽段；

优选地，所述cdkk5抑制剂选自：roscovitine(rosco)，奥罗莫星(olomoucine)及其衍生物，dinaciclib(mk-7965，sch727965)，at7519，cip，p5和cpd1等；

更优选地，所述cdk5抑制剂为roscovitine；

所述外泌体抑制药物包括但不限于钙离子离子通道抑制剂类、质子泵抑制剂类、鞘磷脂-核糖核酸酶抑制剂类、内皮素受体a干扰类药物；

优选地，所述外泌体抑制药物可以选自：二甲基阿米洛利(dma)、奥美拉唑、磺胺异恶唑、鞘磷脂酶抑制剂gw4869等；

更优选地，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利；

当所述cdk5抑制剂为roscovitine，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利时，二者质量比为1～10：1；当roscovitine与二甲基阿米洛利的质量比为5：1为时，抗肿瘤效果最佳；

所述抗肿瘤药物至少具有如下任一种或多种用途：

1)缓解肿瘤外泌体带来的免疫抑制；

2)缓解肿瘤细胞表面pd-l1带来的免疫抑制；

3)提高抗肿瘤效力；

其中，用途1)和2)均与pd-l1相关。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种基于肿瘤细胞膜的生物活性制剂，所述制剂的药物活性成分包含上述cdk5抑制剂和外泌体抑制药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述基于细胞膜的生物活性制剂为水凝胶。

本发明的又一具体实施方式中，所述水凝胶制剂由cdk5抑制剂、外泌体抑制药物和肿瘤细胞膜囊泡制成。

本发明的又一具体实施方式中，所述肿瘤细胞膜囊泡为海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡。

本发明的又一具体实施方式中，所述cdk5抑制剂为roscovitine，所述外泌体抑制药物为二甲基阿米洛利，二者质量比为1～10：1；当roscovitine与二甲基阿米洛利的质量比为5：1为时，抗肿瘤效果最佳。

本发明的又一具体实施方式中，所述肿瘤细胞膜囊泡尺寸为150～220nm。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述基于细胞膜的生物活性制剂的制备方法，包括：

海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜形成凝胶因子，将cdk5抑制剂和外泌体抑制药物分别溶解后混合均匀形成药物溶液，加入凝胶因子的水溶液中搅拌处理，即得成胶溶液。

本发明的又一具体实施方式中，cdk5抑制剂和外泌体抑制剂溶解的溶剂为去离子水，其溶解效果更佳，加入药物溶液的方法为滴加，使得抗肿瘤药物成分分散更为均匀；

本发明的又一具体实施方式中，所述细胞膜囊泡由以下方法制备得到：

(1)收集小鼠肿瘤组织，采用匀浆法得到肿瘤单细胞悬液；

(2)探头超声得到破碎的肿瘤细胞，采用超滤离心方式进行除杂，采用梯度离心法提取肿瘤细胞膜；

(3)采用超声的方式获得肿瘤细胞膜囊泡。

本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(1)中，肿瘤单细胞悬液通过加入匀浆缓冲液然后研磨获得，所述匀浆缓冲液是含有蔗糖、edta、hepes-naoh和蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液；

进一步地，蔗糖的浓度为0.1～1mm，优选为0.25mm；edta的浓度为0.5～5mm，优选为1mm；hepes-naoh的浓度为5～30mm，优选为20mm；蛋白酶抑制剂的浓度为6.5～8.5mm，ph为7.4。

本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(2)中，具体步骤包括：

将收集的肿瘤单细胞悬液在低温下进行探头超声，破碎肿瘤细胞，得到破碎的肿瘤细胞；

随后将破碎的肿瘤细胞在低温下进行中速离心，除去黑色素进行纯化；

向纯化后的破碎细胞悬液在低温下进行高速离心，得到肿瘤细胞膜沉淀；

将肿瘤细胞膜沉淀重新分散后，冷冻保存；

进一步地，所述低温为0～6℃，探头超声的功率幅度为20～60％，优选为40％，探头超声时间为5～15min，优选为10min，探头超声的时间间隔为开：2～6s；关：1～4s，优选为开：3s；关：7s；所述中速离心的转速为2000～4000g，优选为3000g，离心时间为5～20min，优选为10min；所述高速离心的转速为10000～20000g，优选为15000g，离心时间为30～90min，优选为60min；将细胞膜沉淀重新分散的溶剂为pbs；

本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(3)中，将肿瘤细胞膜在低温下采头超声的方式进行膜融合，得到肿瘤细胞膜囊泡，优选地，所述低温为0～6℃，超声时间为30～120s，优选为60s。

本发明的又一具体实施方式中，海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡由以下方法制备得到：

将海藻酸钠氧化物溶解后，和肿瘤细胞膜囊泡混合均匀，室温下反应一段时间后，除杂得到海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡；

优选地，所述室温为18～30℃；

优选地，所述海藻酸钠氧化物溶解选用溶剂为去离子水，其溶解效果更佳；

优选地，采用搅拌的方式混合，提高海藻酸钠氧化物和肿瘤细胞膜囊泡二者混合均匀度和反应速度；

优选地，所述反应时间为4～12h，更优选为6h。

本发明的又一具体实施方式中，海藻酸钠氧化物为海藻酸钠经高碘酸钠氧化后产物；

本发明的又一具体实施方式中，海藻酸钠氧化物具体由以下方法制备得到：

将海藻酸钠溶于去离子水中，加入高碘酸钠，室温搅拌下反应，再加入乙二醇继续搅拌反应，加入nacl后用乙醇提取，重新溶解后在水中透析，后冷冻干燥得到海藻酸钠氧化物。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述基于细胞膜的生物活性制剂在制备抗肿瘤药物中的应用；

所述肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤；所述恶性瘤包括实体瘤和血液瘤，其中，实体瘤包括黑色素瘤；

上述基于细胞膜的生物活性制剂至少具有如下一种或多种用途：

1)缓解肿瘤外泌体带来的免疫抑制；

2)缓解肿瘤细胞表面pd-l1带来的免疫抑制；

3)提高抗肿瘤效力。

其中，用途1)和2)均与pd-l1相关。

同时，需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。实体瘤可以是例如乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肾、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(wilmstumor)。此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。血液瘤可以是例如侵略性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓样白血病(cml/aml)、急性淋巴细胞性白血病(all)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和t-细胞型淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及aids相关的恶性瘤。

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得，所用的设备均为现有设备。

实施例1：海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡的制备

1)肿瘤单细胞悬液的制备：收集小鼠黑色素瘤组织后，通过加入匀浆缓冲液然后研磨获得，所述匀浆缓冲液是含有0.25mm蔗糖、1mmedta、20mmhepes-naoh和蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液。

2)提取肿瘤细胞膜：将收集的肿瘤单细胞悬液在4℃下进行探头超声破碎肿瘤细胞，得到破碎的肿瘤细胞，探头超声的功率幅度为40％，时间为10min，间隔为开：4s，关：2s；将破碎的肿瘤细胞在4℃下进行3000g离心10min，除去黑色素进行纯化；向纯化后的破碎细胞悬液在4℃下进行15000g离心60min，得到肿瘤细胞膜沉淀；将细胞膜沉淀重新分散在pbs中，冷冻保存。

3)制备肿瘤细胞膜囊泡：将肿瘤细胞膜在4℃下超声处理1min，最终得到肿瘤细胞膜囊泡。

4)制备海藻酸钠氧化物：将海藻算啊溶于去离子水中，然后加入高碘酸钠，在室温黑暗中搅拌4h后加入乙二醇搅拌1h，再加入nacl，用乙醇提取。然后，将上述提取物重新溶解，并对水透析3天。冷冻干燥后获得氧化海藻酸钠。

5)制备海藻酸钠氧化物修饰的肿瘤细胞膜囊泡：将过量的氧化海藻酸钠溶液在去离子水中，与肿瘤细胞膜囊泡混合后充分搅拌，室温反应6h后，通过超滤离心除去多余的海藻酸钠氧化物，得到修饰后的肿瘤细胞膜囊泡。

实施例2：透射电镜(tem)鉴定修饰前后肿瘤细胞膜囊泡的纳米结构

用移液枪分别吸取10μl修饰前后肿瘤细胞膜囊泡溶液，碳膜铜网上，滤纸吸去多余液体，室温下干燥后置于透射电镜下观察。结果如图1所示，透射电镜图片可以证实，修饰前后的肿瘤细胞膜囊泡形态有明显差异，尺寸分别为～160和～200nm，且大小均一，分散性良好。

实施例3：载药o-tmv胶液的制备

本实施例提供基于该细胞膜囊泡的水凝胶制剂，包括上述修饰后的肿瘤细胞膜囊泡、cdk5抑制剂roscovitine和外泌体抑制剂二甲基阿米洛利。

具体制备方法包括：分别精密称取cdk5抑制剂roscovitine和外泌体抑制剂二甲基阿米洛利，使用去离子水分别溶解至7.82和1.18mg·ml^-1。各取100μl后在超声条件下混合均匀，缓慢滴加至搅拌中的800ml修饰后的肿瘤细胞膜囊泡水溶液中，搅拌20min即为o-tmv@dr胶液。

实施例4：o-tmv和o-tmv@dr水凝胶的成胶特性及微观形态

为更直观的观察与比较，对实施例3制备得到的o-tmv凝胶因子的成胶性进行拍照观察。在图2中，o-tmv凝胶因子可以在钙离子存在的条件下，快速形成凝胶，对形成的凝胶的微观结构进行观察，可见o-tmv和载药后形成的o-tmv@dr水凝胶均为多孔结构，具有巨大的载药潜力。

实施例5：o-tmv水凝胶的生物相容性

1.细胞的培养

选取人脐带静脉上皮细胞huvec作为研究对象。取冻存细胞，用培养基于37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。

2.细胞毒性实验

huvec细胞用于评估不同浓度o-tmv的生物相容性。用收集对数生长期huvec细胞，细胞以2×10⁴个/孔的浓度加入48孔板中，孵育过夜后，加入不同浓度的o-tmv水凝胶(膜蛋白浓度：50μg·ml^-1-500μg·ml^-1)，设3个复孔。将细胞在37℃下培养24h，然后洗涤，换新鲜培养基，每孔加入0.5％的mtt溶液，继续孵育4h，然后弃去孔内液体，每孔加dmso溶解，用酶标仪测定490nm处吸光度，用下式计算细胞抑制率：

几种样品在不同浓度下的细胞抑制率实验结果如图4。由图4可以看出，o-tmv水凝胶对huvec细胞的生存率影响较小，即使是高浓度的o-tmv水凝胶也不影响huvec的细胞形态和生存状态。

由此，得出结论，o-tmv水凝胶对人脐带静脉上皮细胞huvec细胞的生物相容性很高，生物安全性较好。

实施例6o-tmv@dr水凝胶体内抑瘤研究

1.动物模型建立

6至8周雌性c57bl/6小鼠用于建立体内抗肿瘤双边模型。将b16f10细胞悬液(每只小鼠8×10⁵个细胞)皮下接种到小鼠的右前肢处来建立原位肿瘤，3天后，将b16f10细胞悬液(每只小鼠8×10⁵个细胞)皮下接种到小鼠的左前肢处来建立远位肿瘤。

2.动物体内抑瘤实验

原位肿瘤达到～60mm³后，称重小鼠，随机分成6组：生理盐水作为对照，rosco，dma，o-tmv，rosco+dma，o-tm@dr，后5组作为实验组，各实验组以dma或rosco计，给药剂量为：dma：295μg·kg^-1，rosco：1.96mg·kg^-1。原位瘤内注射给药一次后，每两天测量肿瘤体积，并根据以下等式计算肿瘤体积：

l表示最大直径(mm)，而w表示最小直径(mm)。

在各种治疗结束后，处死小鼠以取出肿瘤称重。并根据以下公式计算每组小鼠肿瘤的抑制率：

wc表示生理盐水组的平均肿瘤重量，而wt表示其他组的最终肿瘤重量。

体内抑瘤实验结果如图5所示。

修饰后的肿瘤细胞膜囊泡、rosoco和dma混合后形成o-tmv@dr胶液，可在肿瘤生理环境下快速形成凝胶，发挥长效抗肿瘤作用。

从图5可以看出，在原位瘤和远位瘤中，相对于dma或roscovitine单独给药组，两药联合给药组d+r的抑瘤率，都分别高于单独给药组，原因在于两药联合可以同时下调肿瘤细胞表面及其分泌的外泌体上的pd-l1表达量，抑肿瘤局部微环境和全身系统性免疫抑制，从而达到更好的抗肿瘤效果。特别地，对于远位瘤，单独使用dma或者rosco的抑瘤率分别为27.77％和24.97％，而联用两药后的抑瘤率可以达到68.23％，明显高于单独使用两种药物的抑瘤率之和，证明dma和rosco对转移肿瘤起协同抑制作用，表明cdk5抑制剂和外泌体抑制剂的联合应用在抗肿瘤转移治疗方面极具潜力。

单独给予o-tmv的实验组也表现出优异的肿瘤抑制效果，原因在于，肿瘤细胞膜提供了大量的内源性抗原，有助于增强肿瘤的免疫原性。o-tmv@dr实验组表现出最优的抑制肿瘤生长和转移的效果，表明基于肿瘤细胞膜的载药生物活性制剂更有利于pd-l1阻断治疗发挥疗效。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。