一种抗心肌缺血中药组合物的制备方法

1.本发明涉及中药领域，具体涉及一种用于治疗心肌缺血的新药组方的制备方法。


背景技术：

2.心肌缺血是因为机体对心脏血流量的供应减少，导致对心脏的供氧减少，心肌代谢紊乱，心脏不能正常发挥生理功能的病理状态。缺血性心脏病包括心绞痛、心肌梗死、冠心病等，因为其高患病率和高死亡率，引起全世界广泛关注。全球疾病负担(gbd)研究结果显示，2017年世界范围内的缺血性心脏病新发病例1000多万，现患病例1.2亿，并导致800多万人死亡，是全球人口死亡的首位原因。随着我国居民经济水平的改善及生活方式的变化，我国缺血性心脏病患病率和死亡率不断上升，2015年全国共有接近150万人死于缺血性心脏病，是我国居民仅次于脑血管病的第二位死亡原因。
3.现有针对缺血性心脏病的治疗多采用化学药物，如硝酸酯类、他汀类降血脂药、抗血小板制剂等，目前尚未有确切疗效的中药用于临床治疗。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，寻求一种对心肌缺血具有确切疗效的中药组方的制备方法，拓宽缺血性心脏病的用药资源。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种抗心肌缺血中药组合物的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)称取原料
7.按由以下重量份称取原料：广枣15份、丹参10份、檀香10份、诃子10份、木棉花10份；
8.(2)水提
9.将原料加入水，热回流提取；过滤，取水提液备用；
10.(3)醇沉
11.将水提液浓缩后，加入乙醇溶液，沉淀，过滤，取滤液，浓缩去除溶剂中乙醇或去除溶剂，即得抗心肌缺血中药组合物的水溶液或所述抗心肌缺血中药组合物。
12.进一步的，步骤(2)中热回流提取次数为3次，每次水的加入量为原料总重量的12倍，每次热回流提取时间为1.5h。
13.步骤(3)中醇沉具体步骤为：将水提液浓缩至相对密度为1.1
‑
1.2，加入乙醇至溶液中乙醇含量为85％，沉淀，取滤液；干燥即得所述抗心肌缺血中药组合物。
14.本发明相比现有技术具有以下优点：
15.1、本发明药物组合物来源天然药物成分，对急性心肌缺血大鼠血液和心肌组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶含量和丙二醛含量等生化指标和心肌坏死面积均有改善作用，具有抗iso致大鼠急性心肌缺血、治疗冠心病的作用。
16.2、本发明中药组合物制备方法简单，原料来源广泛、成本低。
附图说明
17.图1为标准曲线制备用hplc色谱图；
18.图中，a
‑
对照品，b
‑
供试品溶液，c
‑
阴性对照溶液；
19.图2为不同处理下大鼠心肌组织病理切片对比图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
21.实施例1
22.中药组合物制备工艺筛选实施例：
23.一、提取工艺
24.1)称取原料
25.按处方量称取以下重量份的原料：广枣15份、丹参10份、檀香10份、诃子10份、木棉花10份；
26.(2)水提
27.将原料加入水，热回流提取；过滤，取水提液备用；
28.(3)醇沉
29.浓缩提取液至相对密度为1.1
‑
1.2，加入乙醇至一定浓度，沉淀，取滤液，浓缩去除溶剂中乙醇，即得抗心肌缺血中药组合物的sxk水溶液。
30.二、提取工艺的优选
31.1仪器和材料
32.1.1仪器高效液相色谱仪(dinex ultiate 3000，美国戴安仪器有限公司)，电热鼓风干燥箱(gzx
‑
9070mbe，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，超声波清洗机(sb
‑
5200dt，宁波新艺超声波设备有限公司)，旋转蒸发仪(re
‑
52aa，上海亚荣生化仪器厂)，数显式电热恒温水浴锅(xmtd
‑
204，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。电子分析天平(cpa225d，赛多利斯科学仪器有限公司)。
33.1.2材料丹参药材(批号1601002，河北全泰药业有限公司)，丹参酮ⅱa 对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110766
‑
201721)，甲醇(分析纯，南京化学试剂厂)；乙腈(色谱醇，dikmapure)。
34.2方法与结果
35.2.1丹参酮ⅱa的含量测定
36.2.1.1色谱条件与系统适应性试验：采用diamonsil c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；以乙腈(a)
‑
磷酸水(b)为流动相，按表1的设置条件进行梯度洗脱；柱温为20℃；检测波长为270nm；理论板数按丹参酮ⅱa峰计算应不低于60000。
37.表1流动相设置条件
38.39.2.1.2对照品溶液的制备精密称定丹参酮ⅱa5.0012mg，置5ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取上述配制的对照品溶液1ml，置50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为丹参酮ⅱa对照品溶液，浓度为20.0048μg
·
ml
‑
1。
40.2.1.3供试品溶液的制备取制备得到的sxk水溶液，定容于100ml，摇匀，即得。
41.2.1.4阴性对照溶液的制备:称取缺少丹参的全方药材，按同样的工艺制备不含丹参的样品一份，定容于100ml，摇匀，即得。
42.2.1.5专属性试验将上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，各进样10μl。结果见图1：供试品色谱图中，在与丹参酮ⅱa对照品色谱图相同的保留时间处有色谱峰，与其它组分能达到分离；阴性对照溶液色谱图中，在与丹参酮ⅱa对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰，表明在上述色谱条件下丹参酮ⅱa具有专属性:。
43.2.1.6测定方法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
44.2.1.7标准曲线的制备:将对照品溶液用甲醇按照2、4、6、8、10倍稀释，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定。以色谱峰面积为纵坐标，以丹参酮ⅱa的含量为横坐标，用excel软件绘制标准曲线，得回归方程为:y＝69.66x+0.2946，(r2＝0.9998)。
45.2.1.8精密度试验：连续取“2.1.2”项下对照品溶液10μl，分别进样6针，记录每针的峰面积，结果丹参酮ⅱa的峰面积rsd为1.86％，表明仪器精密度良好。
46.2.1.9稳定性试验：取制备得到的sxk水溶液，按“2.1.2”项下方法制备，分别于2、4、6、8、10h进样，按“2.1.1”项下色谱条件测定丹参酮ⅱa含量，计算rsd为1.13％，表明:sxk水溶液中丹参酮ⅱa至少放置10h稳定性良好。
47.2.2正交试验设计：以提取液中丹参酮ⅱa的得率和收膏率为考察指标，选择步骤(3)中的醇沉浓度、步骤(1)中的提取次数、加水量、提取时间按4因素3水平进行l9(34)正交试验设计，因素水平表(见表2)。
48.表2本发明中药组合物正交试验提取因素水平表
[0049][0050][0051]
2.2.1提取方法：按处方量称取全方药材，共55g，分别取9份。采用正交设计试验l9(34)，选取四个因素水平a醇沉浓度、b提取次数、c加水量、d提取时间，见表2，按照正交试验方案，水煎煮过滤，向滤液中加入75～85％乙醇溶液，静置析出沉淀后，过滤，将滤液浓缩至100ml，得9个正交试验的样品溶液。
[0052]
2.2.2收膏率的测定:精密量取“2.2.1”项中各条件的样品溶液各50ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，80℃减压干燥至恒重，精密称定质量，计算收膏率。
[0053]
2.2.3评价指标及结果分析正交试验结果采用直观分析和方差分析相结合，结果见表3和表4。
[0054]
表3本发明中药组合物水提醇沉正交试验直观分析图
[0055][0056]
表4综合评分方差分析结果
[0057][0058][0059]
根据直观分析和方差分析结果，综合评分的极差大小显示各因素作用主次为b>d>c>a，即提取次数对丹参酮iia含量影响最大，其次为提取时间、加水量、醇沉浓度，最优水提醇沉工艺组合为a3b3c3d2。即用12倍的水，热回流提取3次，每次1.5小时，用85％乙醇沉淀后，取滤液。
[0060]
2.2.4验证性实验:按处方比例称取药材3份，每份55g，按最佳的水提醇沉工艺进行3次验证试验，测定丹参酮ⅱa的含量和收膏率。结果说明优选的工艺丹参酮ⅱa的含量干浸膏收率的综合评分最高，rsd为2.21％。结果表明该优选工艺稳定可行。
[0061]
实施例2
[0062]
产品制备实施例
[0063]
1)称取原料
[0064]
按处方量称取以下重量份的原料：广枣15份、丹参10份、檀香10份、诃子10份、木棉花10份；
[0065]
(2)水提
[0066]
将原料加入12倍重量份水，热回流提取3次，每次1.5h；过滤，合并提取液，备用；
[0067]
(3)醇沉
[0068]
合并提取液后，浓缩提取液至相对密度为1.1
‑
1.2，加入乙醇至溶液中乙醇含量为85％，沉淀，取滤液，即得本发明中药组合物水提物。
[0069]
实施例3
[0070]
应用实施例
[0071]
1材料
[0072]
1.1动物健康sd大鼠50只，雌雄各半，体重200～250g。由黑龙江中医药大学glp中心提供，许可证号scxk
‑
(京)2009
‑
0001。
[0073]
1.2仪器ky2000半自动生化分析仪(日本岛津公司)；756pc spectrum紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；bl
‑
420f生物机能实验系统。
[0074]
1.3试剂gsh
‑
px测试盒(批号20180626)，sod试剂盒(批号20181105)，mda试剂盒(批号20171214)，均购自南京建成生物工程研究所。
[0075]
1.4药物盐酸异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司)；地奥心血康胶囊(成都地奥集团有限公司)；实施例2制备所得本发明中药组合物sxk的水溶液。
[0076]
2方法
[0077]
2.1异丙肾上腺素(iso)诱导的急性心肌缺血模型的建立：将大鼠随机分成空白组、模型组、sxk高、中、低3个剂量组和阳性对照药(地奥心血康胶囊)组，将sxk的水溶液，依照正常给药剂量按体表面积折算，给药剂量分别为高、中、低剂量组：4ml(l(将上述实例1中制备中药组合物干燥后，用水配制成浓度为0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml的高、中、低三种浓度作为高、中、低剂量组，以1ml/100g进行灌胃给药)。阳性对照组:4ml(相当于地奥心血康30mg
·
kg
‑1)。空白组和模型组给予相应体积的蒸馏水，所有大鼠连续灌胃15天，1次/天。依据文献报道(二氢槲皮素对心肌缺血模型大鼠的保护作用及氧化应激水平的影响，顾媛媛、于莹、周忠光等，时珍国医国药，2019,30(10)：2370
‑
2372)和预试，从第12天开始，除空白组外，其余各组均按照5mg
·
kg
‑1的剂量腹腔注射异丙肾上腺素，1次/天，连续3天。
[0078]
2.2检测指标及方法
[0079]
2.2.1心电图检测：大鼠末次灌胃后，用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml
·
kg
‑1)，待麻醉好之后，使其仰卧固定于手术台上，将针头电极一侧插入大鼠四肢皮下，另一侧连接于bl
‑
420f生物机能实验系统，记录标准ⅱ导联心电图，观察造模前后心电图变化，比较造模前后心电图j点电压值及t波变化，t波高度测量以p
‑
r段为基线，测定5个连续波形，取其平均值，进行统计学分析。
[0080]
2.2.2血清中gsh
‑
px、sod、mda的测定：大鼠腹主动脉插管取血，取一部分血浆分离血清，按试剂盒说明书操作测定血清中gsh
‑
px、sod、mda的含量。
[0081]
2.2.3心肌组织病理切片的制作：取出心尖组织，放于10％甲醛中固定，he染色，光镜下观察各组标本的病理形态学的变化情况。
[0082]
2.3统计学处理：用spss 13.0软件，数据用x
±
s表示，两组间比较采用t检验，p<0.05有统计学意义。
[0083]
3结果
[0084]
3.1对急性心肌缺血大鼠心电图的影响：注射iso后，如表5所示，与对照组比较，模型组的t波增大，j点下移，显示心肌缺血造成；与模型组比较，sxk高剂量能显著改善j点和t波变化幅度(p<0.05)。
[0085]
表5注射异丙肾上腺素后t波高度及j点高度的影响(x
±
s，n＝10)
[0086][0087]
与空白组比较
▲
p<0.05，
▲▲
p<0.01；与模型组比较
■
p<0.05，
■■
p<0.01。
[0088]
3.2对血清中gsh
‑
px、sod、mda的影响：注射iso后，大鼠血清中gsh
‑
px、sod活性显著降低，mda含量明显升高。与模型组相比，sxk三个剂量组大鼠血清中gsh
‑
px、sod活力均有一定程度升高，mda含量降低，其中，sxk高剂量能显著升高大鼠血清中gsh
‑
px活力(p<0.05)，能显著降低大鼠血清中mda含量(p<0.05)。见表6。
[0089]
表6对心肌缺血大鼠血清gsh
‑
px、mda、sod活性的影响(x
±
s，n＝10)
[0090][0091]
与空白组比较
▲
p<0.05，
▲▲
p<0.01；与模型组比较
■
p<0.05，
■■
p<0.01。
[0092]
3.3心肌组织病理切片空白组大鼠的心肌细胞排列整齐，无明显变性坏死，细胞间质无炎细胞浸润。与空白对照组比较，模型组心肌组织具有明显的缺血损伤，主要呈现心肌纤维紊乱、间质水肿变性，心肌细胞呈空泡变性、胞质着色不均、胞核固缩等明显的病理性形态结构改变表明腹腔注射异丙肾上腺素可引起心肌急性缺血损伤；与模型组相比，各给药组心肌坏死面积明显减小；随给药剂量的增加，心肌组织坏死面积明显减小，表明sxk可减轻心肌细胞的变性坏死，结果见图2。
[0093]
缺血性心脏病(冠心病)的病因与心脏氧自由基的产生密切相关，心肌缺氧缺血诱发氧化应激反应，大量的中性粒细胞聚集在缺血区域，加快氧自由基的生成，氧自由基大量堆积使膜脂质过氧化，引起细胞膜的结构异常和功能损伤，从而加剧了心肌组织损伤。谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)及超氧化物歧化酶(sod)是一种内源性酶清除剂，可以抵消自由基的氧化破坏，丙二醛(mda)是一种稳定的脂质过氧化的醛酸类产物，被广泛用于反映氧化应激的水平。本发明制备得到的中药组合物sxk高剂量组有较强的抗氧化能力，能提高心肌组织中gsh
‑
px和sod的活性，并能够抑制脂质过氧化过程，降低脂质过氧化物mda活性，减轻氧自由基对心肌的损伤，保护缺血性心肌，治疗缺血性心脏病。
[0094]
本发明在研究过程中观察到大鼠口服sxk后能有效抑制iso所致心肌组织缺血，明
显改变t波及j点的高度，血清中gsh
‑
px及sod活力升高，mda含量显著降低，提示sxk可以保护心肌细胞，提高细胞膜的稳定性。从病理切片上可以看出服用sxk后大鼠心肌变性坏死区域的大量炎性细胞浸润、心肌纤维排列紊乱、断裂，肌丝融解得到较明显改善，病变范围缩小。实验证明本发明制备得到的中药组合物sxk能有效抑制异丙肾上腺素(iso)所致心肌组织缺血，保护心肌细胞免受损伤，从而起到治疗冠心病的作用。