一种用于定向诱导轴突再生的纺丝膜支架

1.本发明属于组织工程支架领域，具体涉及一种用于定向诱导轴突再生的纺丝膜支架。


背景技术：

2.视神经损伤后视网膜神经节细胞（rgcs）发生凋亡，轴突难以再生。目前还没有一种治疗方法可以有效刺激轴突再生，并功能性地修复视觉通路中的轴突连接。针对视神经生长内在动力不足、难以穿越损伤区域且再生的轴突逆向生长特点，具有定向诱导功能的生物支架材料的开发尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种用于定向诱导轴突再生的纺丝膜支架。
4.本发明所采取的技术方案如下：一种用于定向诱导轴突再生的纺丝膜支架，其制备方法包括以下步骤：（1）采用静电纺丝技术制备纺丝纤维膜；（2）将纺丝纤维膜进行热拉伸处理，获得高度取向的纤维支架。
5.步骤（1）中，用于静电纺丝的电纺液中包含热塑性生物材料。
6.所述热塑性生物材料为聚乳酸
‑
羟基乙酸和聚己内酯。
7.步骤（1）中，用于静电纺丝的电纺液中加入有胞磷胆碱。
8.步骤（1）中，用于静电纺丝的电纺液中加入有法舒地尔。
9.步骤（1）中，所述电纺液为聚乳酸
‑
羟基乙酸和聚己内酯加入六氟异丙醇及二氯甲烷中，然后加入胞磷胆碱及法舒地尔，磁力搅拌过夜后得到。
10.步骤（1）中，纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min，室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上；待纺丝结束后从铝箔纸上撕下纺丝纤维膜，放于真空干燥箱中室温干燥。
11.步骤（2）中，将干燥后的纺丝纤维膜固定在拉伸夹具上，将夹有纺丝膜的夹具放入鼓风干燥箱内，缓慢拉伸夹具至纺丝膜延长4倍。
12.本发明的有益效果：本发明通过对纺丝纤维膜进行热拉伸处理，使纺丝纤维膜具有高度取向的特性，发现具有诱导轴突定向生长的功能。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
14.图1为实施例1
‑
4所制备的纺丝膜的取向微观结构以及直径分布；图2为细胞在对比例1所制备的无规纺丝膜（左）和实施例1所制备的取向纺丝膜（右）上的生长状态；图3为实施例1
‑
4（b,d,f,h）、对比例1
‑
4（a,c,e,g）以及对照组（i）的轴突生长效果和轴突生长统计结果（j）；图4为实施例4所制备的取向纺丝膜植入大鼠视神经损伤处后的免疫荧光染色结果；图5为实施例4所制备的取向纺丝膜植入大鼠视神经损伤处的he切片结果。
具体实施方式
15.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
16.一种用于定向诱导轴突再生的纺丝膜支架，其制备方法包括以下步骤：（1）采用静电纺丝技术制备纺丝纤维膜；（2）将纺丝纤维膜进行热拉伸处理，获得高度取向的纤维支架。
17.在本发明的一些实施例中，发现单纯采用静电纺丝技术制备纺丝纤维膜用于细胞培养，细胞呈无序生长，轴突往各个方向随机生长；通过对纺丝纤维膜进行热拉伸处理，使纺丝纤维膜具有高度取向的特性，发现细胞沿着纺丝膜定向生长，因此热拉伸处理后得到的高度取向的纤维具有诱导轴突定向生长的功能。
18.优选的，步骤（1）中，所述电纺液中包含聚乳酸
‑
羟基乙酸和聚己内酯。聚乳酸
‑
羟基乙酸（plga）和聚己内酯（pcl）都是可降解的生物材料，并且是大多数国家批准的用于许多植入性产品的材料。在本发明的一些实施例中，采用聚乳酸
‑
羟基乙酸和聚己内酯作为静电纺丝的原料。
19.优选的，步骤（1）中，用于静电纺丝的电纺液中加入有胞磷胆碱。胞磷胆碱是由核糖、焦磷酸盐、胞嘧啶和胆碱组成的一种单核苷酸。磷脂酰胆碱是细胞膜上最重要的磷脂之一，也是中枢神经系统中神经递质乙酰胆碱的前体，胞磷胆碱被认为是磷脂酰胆碱生物合成的中间体。胞磷胆碱可增加酪氨酸羟化酶活性，抑制多巴胺再摄取，从而增加多巴胺、去甲肾上腺素和5
ꢀ‑
羟色胺等脑神经递质的表达。在啮齿类动物视网膜培养和动物模型中，胞磷胆碱诱导抗凋亡作用，增加视网膜中多巴胺水平，并减缓视网膜神经纤维层变薄。对青光眼或非动脉性缺血性神经病变等神经退行性视觉病变的人类研究显示胞磷胆碱可降低rgcs损伤。胞磷胆碱可通过减少rgcs功能障碍，最终观察到视网膜后视觉通路的神经传导更好，视野缺损得到改善。在本发明的一些实施例中，在电纺液中加入胞磷胆碱，在促进视网膜外植体轴突的生长的相关研究中，发现含有胞磷胆碱的纺丝纤维膜可促进轴突的生长，其中，采用热拉伸处理的定向纺丝纤维膜相比未热拉伸处理的无规纺丝纤维膜效果有明显的增强。
20.步骤（1）中，用于静电纺丝的电纺液中加入有法舒地尔。法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药物，目前研究中认为其可促进神经功能的恢复。在本发明的一些实施例中，在电纺液中加入法舒地尔，在本发明的另外一些实施例中，在电纺液中同时加入胞磷胆碱和法舒地尔，在促进视网膜外植体轴突的生长的相关研究中，仅加入法舒地尔的纤维膜
相比空白的定向取向纤维膜，两者效果没有明显差异，因此可以判断在定向取向纤维膜中，单组份法舒地尔并不能起到促进视网膜外植体轴突再生的作用，而同时加入胞磷胆碱和法舒地尔的定向取向纤维膜相比仅加入胞磷胆碱的定向取向纤维膜，轴突生长平均长度明显变大，判断胞磷胆碱和法舒地尔在定向取向纤维膜上起到联合用药的协同效果。但是，同时加入胞磷胆碱和法舒地尔的未热拉伸处理的无规纺丝纤维膜对轴突生长无明显作用。
21.实施例1：
①
静电纺丝法制备纺丝纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2）。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥结束后将纺丝膜保存在干燥器中。
22.②
热拉伸纺丝膜获得高度取向的纺丝纤维膜：将干燥后的纺丝纤维膜裁剪成适当大小后固定在拉伸夹具上。控制拉伸夹具的初始距离为1cm。将夹有纺丝膜的夹具放入鼓风干燥箱内，设置温度为53℃。放置数分钟后，缓慢拉伸夹具至纺丝膜延长4倍。所有热拉伸处理的纺丝膜都在鼓风干燥箱内放置2h。将热拉伸处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
23.附图中以pp
‑
a指代本实施例制备的纺丝膜。
24.实施例2：
①
静电纺丝法制备纺丝纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2），加入54 mg胞磷胆碱。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥结束后将纺丝膜保存在干燥器中。
25.②
热拉伸纺丝膜获得高度取向的纺丝纤维膜：将干燥后的电纺膜裁剪成适当大小后固定在拉伸夹具上。控制拉伸夹具的初始距离为1cm。将夹有纺丝膜的夹具放入鼓风干燥箱内，设置温度为53℃。放置数分钟后，缓慢拉伸夹具至纺丝膜延长4倍。所有热拉伸处理的纺丝膜都在鼓风干燥箱内放置2h。 将热拉伸处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
26.附图中以cit
‑
a指代本实施例制备的纺丝膜。
27.实施例3：
①
静电纺丝法制备纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2），加入18 mg法舒地尔。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，
然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥结束后将纺丝膜保存在干燥器中。
28.②
热拉伸纺丝膜获得高度取向的纺丝纤维膜：将干燥后的电纺膜裁剪成适当大小后固定在拉伸夹具上。控制拉伸夹具的初始距离为1cm。将夹有纺丝膜的夹具放入鼓风干燥箱内，设置温度为53℃。放置数分钟后，缓慢拉伸夹具至纺丝膜延长4倍。所有热拉伸处理的纺丝膜都在鼓风干燥箱内放置2h。将热拉伸处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
29.附图中以fa
ꢀ‑
a指代本实施例制备的纺丝膜。
30.实施例4：
①
静电纺丝法制备纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2），加入54 mg胞磷胆碱和18 mg法舒地尔。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥结束后将纺丝膜保存在干燥器中。
31.②
热拉伸纺丝膜获得高度取向的纤维结构：将干燥后的电纺膜裁剪成适当大小后固定在拉伸夹具上。控制拉伸夹具的初始距离为1cm。将夹有纺丝膜的夹具放入鼓风干燥箱内，设置温度为53℃。放置数分钟后，缓慢拉伸夹具至纺丝膜延长4倍。所有热拉伸处理的纺丝膜都在鼓风干燥箱内放置2h。 将热拉伸处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
32.附图中以cf
‑
a指代本实施例制备的纺丝膜。
33.对比例1：
①
静电纺丝法制备纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2）。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。将干燥处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
34.附图中以pp
‑
r指代本对比例制备的纺丝膜。
35.对比例2：
①
静电纺丝法制备纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻
璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2），加入54 mg的胞磷胆碱。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥结束后将纺丝膜保存在干燥器中。将干燥处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
36.附图中以cit
ꢀ‑
r指代本对比例制备的纺丝膜。
37.对比例3：
①
静电纺丝法制备纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2），加入18 mg法舒地尔。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥处理后的纺丝膜都在鼓风干燥箱内放置2h。将热拉伸处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
38.附图中以fa
ꢀ‑
r指代本对比例制备的纺丝膜。
39.对比例4：
①
静电纺丝法制备纤维膜：分别称取0.9g plga和0.9g pcl后放入20ml的棕色玻璃瓶中，加入8ml六氟异丙醇（hfip）及2ml二氯甲烷（ch2cl2），加入54 mg胞磷胆碱和18 mg法舒地尔。磁力搅拌过夜后在4℃保存。将配制好的电纺液加入到20ml注射器中，连接23g针头式静电纺丝喷头，然后将注射器固定在纺丝机内。无药组纺丝电压设定为+12kv，载药组纺丝电压设定为
‑
12kv/+20kv，接收距离为12cm，注射器推注速度为0.24mm/min（4ml/h），室温，纤维收集于包裹在滚筒表面的铝箔纸上。待纺丝结束后从铝箔纸上撕下电纺膜，放于真空干燥箱中室温干燥48h。干燥结束后将纺丝膜保存在干燥器中。干燥处理后的电纺膜裁剪成24孔板大小的圆片状用于细胞培养，剪成约1
×
0.5mm的长方形后沿长轴剪成柱状用于神经内植入。用于细胞及动物实验的纺丝膜则使用8 kgy co60射线照射3min灭菌。
40.附图中以cf
‑
r指代本对比例制备的纺丝膜。
41.如图1所示，采用sem观察实施例1
‑
4制备得到的各组取向纺丝膜纤维的表面形貌。可见各组纺丝膜纤维分步均匀，尺寸均一。经统计，pp组纤维直径主要分布在0.3μm。cit组纤维直径主要分布在0.2μm，fa组纤维直径主要分布在0.15μm，cf组纤维直径主要分布在0.15μm。
42.如图2所示，采用sem观察细胞在实施例1和对比例1制备得到的两组纺丝膜表面的生长状态。可见，在无规纺丝膜上面，pc12细胞呈无序生长，神经轴突呈各个方向随机生长状态；在取向纺丝膜上面，细胞沿着纺丝膜定向生长。可见，具有定向纤维的纺丝膜具有诱导pc12细胞神经轴突定向生长的功能。
43.将视网膜平铺在纺丝膜表面培养7d后固定、特异性染色、拍照观察视网膜外植体轴突的生长情况。如图3所示，pp
‑
r组外植体轴突生长较短，但是密度较大。pp
‑
a组、cit
‑
a组、fa
‑
a组、cf
‑
a组外植体轴突沿纤维方向向远处延伸，其中cf
‑
a组轴突生长平均长度最长，达到231.5
±
21.46μm；cit
‑
a组轴突生长平均长度为166.6
±
21.13μm；fa
‑
a组轴突生长平均长度为115.4
±
13.94μm；pp组轴突生长平均长度较短，为109.8
±
9.103为μm。有序载药纤维对轴突生长的促进作用，cf组明显强于cit组，cit组明显强于fa组，fa组与pp组之间无统计学差异。cit
‑
r组、fa
‑
r组轴突沿着呈无规则向远处延伸，cit
‑
r组轴突生长平均长度为119.2
±
13.91μm；fa
‑
r组轴突生长平均长度为112.5
±
23.49μm。这两组对轴突生长的促进作用无明显差异。control组与cf
‑
r组未见轴突向外延伸（control组指未采用纺丝膜培养处理的视网膜）。
44.如图4所示，将载药取向纺丝膜植入大鼠视神经夹伤处，可见其促进轴突再生。损伤处的视神经轴突生长杂乱，新生的轴突长至支架表面后沿着表面向远端生长。
45.如图5所示，支架周围聚集大量核深染的巨噬细胞吞噬支架纤维，支架内部无明显炎细胞浸润。支架表面的瘢痕周围分布大量空泡结构。支架未填充的视神经内有红色的胶原纤维分布。新生的轴突可以沿着胶原纤维向远端延伸。
46.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。