使用缺氧敏感性纳米复合材料的葡萄糖响应性胰岛素递送系统

使用缺氧敏感性纳米复合材料的葡萄糖响应性胰岛素递送系统
1.本技术是申请日为2016年4月21日、发明名称为“使用缺氧敏感性纳米复合材料的葡萄糖响应性胰岛素递送系统”的中国专利申请号201680023377.6的分案申请。
2.相关申请
3.本技术要求享有2015年4月21日提交的美国临时专利申请no.62/150,622的优先权和权益，其公开通过引证以其全部内容结合于本文中。
技术领域
4.本公开的主题涉及用于糖尿病治疗剂如胰岛素和/或其生物活性衍生物的葡萄糖敏感性递送的系统和组合物，如囊泡，纳米颗粒，微针和微针阵列。本公开的主题进一步涉及制备该组合物的方法和将糖尿病治疗剂递送到对其需要的受试者的方法。
5.缩写
6.℃＝摄氏度
7.％＝百分比
8.μl＝微升
9.μm＝微米(micrometer)或微米(micron)
10.μs＝微秒
11.a.u.＝吸光度单位
12.boc＝叔丁氧基羰基
13.cd＝圆二色性
14.di＝去离子的
15.dl＝分升
16.dls＝动态光散射
17.dmf＝二甲基甲酰胺
18.edc＝n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐
19.elisa＝酶联免疫吸附剂
20.fesem＝场发射扫描电子显微镜
21.fitc＝荧光素异硫氰酸酯
22.gox＝葡萄糖氧化酶
23.grv＝葡萄糖响应性囊泡
24.h＝小时
25.ha＝透明质酸
26.hs＝缺氧敏感性
27.iu＝国际单位
28.kcl＝氯化钾
29.k2co3＝碳酸钾
30.kda＝千道尔顿
31.kg＝千克
32.kh2po4＝磷酸二氢钾
33.lc＝负载容量
34.mba＝n,n'
‑
亚甲基双丙烯酰胺
35.mg＝毫克
36.m
‑
ha＝丙烯酸酯改性的透明质酸
37.min＝分钟
38.ml＝毫升
39.mm＝毫米
40.mm＝毫摩尔
41.mn＝微针
42.mv＝毫伏
43.n＝牛顿
44.nacl＝氯化钠
45.nadph＝烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯
46.na2hpo4＝磷酸二钠
47.nhs＝n
‑
羟基琥珀酰亚胺
48.ni＝2
‑
硝基咪唑
49.nm＝纳米
50.nmr＝核磁共振
51.o2＝氧气
52.pbs＝磷酸盐缓冲盐水
53.pi＝等电点
54.rt＝室温
55.sem＝扫描电子显微镜
56.stz＝链脲霉素
57.tem＝透射电子显微镜
58.uv＝紫外线
59.zn＝锌


背景技术：

60.糖尿病是一类以血液中葡萄糖积累为特征的代谢疾病。参见pickupetal.,diabetes
‑
metabolismresearchandreviews,24,604
‑
610(2008)；和stumvolletal.,lancet,365,1333
‑
1346(2005)。截至2014年，全球有3.87亿人患有糖尿病，且到2035年，该数字估计为5.92亿。参见moetal.,chemicalsocietyreviews,43,3595
‑
3629(2014)；和tab
á
ketal.,lancet,379,2279
‑
2290(2012)。糖尿病患者的传统护理包括持续监测血糖水平和随后的胰岛素注射以维持血糖正常。参见owensetal.,lancet,358,739
‑
746(2001)。然而，这种自我给予可能会伴随疼痛和有限的葡萄糖控制。参见bratlieetal.,
advanced healthcare materials,1,267
‑
284(2012)；和ravaine et al.,journal of controlled release,132,2
‑
11(2008)。
61.在过去十年中，已经尝试开发用于胰岛素递送的具有微米级针头的经皮注射装置。参见martanto et al.,pharmaceutical research 21,947
‑
952(2004)；narayan,j.biomedical nanotechnology,10,2244
‑
2260(2014)；ling et al.,acta biomaterialia,9,8952
‑
8961(2013)；prausnitz et al.,nature biotechnology,26,1261
‑
1268(2008)；和yang et al.,nature communications,4,(2013),doi 10.1038/ncomms2715。然而，仍然存在对于另外的胰岛素递送系统和相关的组合物，特别是对于可以响应于血糖变化快速地将胰岛素递送于受试者而几乎没有疼痛的“闭环”递送系统的需要。


技术实现要素：

62.在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种组合物，包含：(a)两亲性聚合物材料，其中该两亲聚合物材料包含与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物，其中所述缺氧敏感性疏水基团包含可以在缺氧环境的存在下还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分；(b)糖尿病治疗剂，可选地其中糖尿病治疗剂是胰岛素或其生物活性衍生物；和(c)葡萄糖氧化剂。
63.在一些实施方式中，亲水聚合物是可生物降解的。在一些实施方式中，亲水性聚合物是聚氨基酸，如聚谷氨酸，合成嵌段共聚物，或多糖，可选地其中亲水性聚合物是多糖，进一步可选地其中多糖是葡糖胺聚糖。在一些实施方式中，亲水性聚合物是透明质酸。
64.在一些实施方式中，缺氧敏感性部分包含硝基咪唑。在一些实施方式中，疏水基团共价结合于亲水性聚合物。在一些实施方式中，两亲性聚合物材料包含与氨基取代的疏水基团前体的氨基基团结合的亲水性聚合物，从而在所述氨基基团和存在于亲水性聚合物上的羧酸基团之间形成酰胺。在一些实施方式中，两亲性聚合物材料包含与6
‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺结合的透明质酸。
65.在一些实施方式中，葡萄糖氧化剂是葡萄糖氧化酶(gox)。在一些实施方式中，糖尿病治疗剂是胰岛素或其生物活性衍生物，其中胰岛素或其生物活性衍生物选自人胰岛素，重组人胰岛素，来自非人动物的胰岛素，速效胰岛素，速效胰岛素类似物，中效胰岛素和/或长效胰岛素。在一些实施方式中，糖尿病治疗剂是重组人胰岛素。在一些实施方式中，两亲性聚合物材料形成包封所述糖尿病治疗剂和所述葡萄糖氧化剂的囊泡。
66.在一些实施方式中，本公开的主题提供了纳米颗粒，其包含：(a)两亲性聚合物材料，其中两亲性聚合物材料包含与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物，其中所述缺氧敏感性疏水基团包含可以在缺氧环境的存在下还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分；(b)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物；和(c)葡萄糖氧化剂。
67.在一些实施方式中，本公开的主题提供了囊泡，其包含含有与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物的两亲性聚合物材料，其中所述缺氧敏感性疏水基团包含可以在缺氧环境存在下还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分，并且进一步其中(i)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物，和(ii)葡萄糖氧化剂包含于所述囊泡内。在一些实施方式中，亲水性聚合物是聚氨基酸，如聚谷氨酸，合成嵌段共聚物或多糖，如葡糖胺聚糖，可选地其中亲水性聚合物是透明质酸。在一些实施方式中，缺氧敏感性部分包含硝基咪唑。在
一些实施方式中，糖尿病治疗剂是重组人胰岛素。在一些实施方式中，葡萄糖氧化剂是葡萄糖氧化酶(gox)。
68.在一些实施方式中，本公开的主题提供了微针阵列，其包含含有与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物的两亲性聚合物材料的囊泡，其中所述缺氧敏感疏水基团包含能够在缺氧环境下还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分，并且进一步其中(i)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物，和(ii)葡萄糖氧化剂包含于囊泡内。在一些实施方式中，微针阵列包括多个微针，其中所述多个微针中的每一个具有约20至约1000微米的长度。在一些实施方式中，多个微针中的每一个具有约600微米的长度。
69.在一些实施方式中，微针阵列作为皮肤贴片的一部分提供，可选地其中所述贴片包括一个或多个背衬层和/或皮肤相容性粘合剂。
70.在一些实施方式中，本公开的主题提供一种闭环胰岛素递送系统，其包括微针阵列，该微针阵列含有包含两亲性聚合物材料的囊泡，该两亲性聚合物材料包含与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物，其中所述缺氧敏感性疏水基团包括能够在缺氧环境中还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分，并且进一步其中(i)胰岛素或其生物活性衍生物和(ii)葡萄糖氧化剂包含于囊泡内。
71.在一些实施方式中，本公开的主题提供了将糖尿病治疗剂递送至对其需要的受试者的方法，该方法包括(a)提供微针阵列，其包含含有两亲性聚合物材料的囊泡，该两亲性聚合物包含与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物，其中所述缺氧敏感的疏水基团包含能够在缺氧环境中还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分，并且进一步其中(i)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或生物活性衍生物，和(ii)葡萄糖氧化剂包含于囊泡内，以及(b)将所述阵列施加于所述受试者的皮肤表面，其中当葡萄糖与微针阵列接触时，其被氧化，从而产生导致缺氧敏感性部分减少而形成亲水部分的缺氧环境，导致囊泡破裂且囊泡中包含的糖尿病治疗剂的释放。
72.在一些实施方式中，糖尿病治疗剂的递送处于对应于与微针阵列接触的葡萄糖的浓度的速率下。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是糖尿病患者。
73.在一些实施方式中，本公开的主题提供了制备用于葡萄糖敏感性递送糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物的微针阵列的方法，方法包括：(a)制备包含含有与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物的两亲性聚合物材料的囊泡的水溶液，其中所述缺氧敏感性疏水基团包含能够在缺氧环境中还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分，并且进一步其中(i)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物，和(ii)葡萄糖氧化剂包含于囊泡内；(b)将所述水溶液分散到包含多个微针腔的模具中，从而提供填充的模具；(c)干燥填充的模具而除去水分；和(d)移除模具而提供微针阵列。在一些实施方式中，方法进一步包括在微针阵列中交联聚合物材料。在一些实施方式中，交联通过暴露于紫外(uv)辐射而进行。
74.在一些实施方式中，步骤(b)在真空下进行。在一些实施方式中，在步骤(b)之后，将模具离心以使胶束压实成微针空腔。
75.在一些实施方式中，在步骤(c)之前，将额外的亲水性聚合物和/或化学交联剂加入到模具中，可选地其中将模具在添加额外的亲水性聚合物和/或化学交联剂之后离心，进
一步可选地其中额外的亲水性聚合物是改性的透明质酸，如亚烷基改性和/或丙烯酸酯改性的透明质酸。在一些实施方式中，步骤(c)在真空干燥器中进行。在一些实施方式中，模具包括硅酮。
76.因此，本公开的主题的一个目的是提供用于糖尿病治疗剂如胰岛素和/或其衍生物的葡萄糖敏感递送的组合物，囊泡，纳米颗粒，微针，微针阵列，系统和方法，以及制备微针阵列的方法。这个和其它目的通过本公开的主题全部或部分地实现。
77.在研究了本公开的主题的以下描述和非限制性的附图和实施例之后，以上陈述的本公开主题的目的，本公开主题的其它目的和优点对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
78.图1a是显示葡萄糖响应性胰岛素递送系统的形成的示意图，葡萄糖响应性胰岛素递送系统包含缺氧敏感性囊泡，本文也称为葡萄糖响应性囊泡(grv)，使用缺氧敏感性(hs)透明质酸(ha)制备并加载有胰岛素和葡萄糖氧化酶(glucose oxidizing enzyme)，即葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)(gox)；疏水性缺氧敏感性部分，即2
‑
硝基咪唑(ni)在grv中还原以形成由葡萄糖的gox氧化引起的缺氧触发的亲水部分(2
‑
氨基咪唑)；以及随后的grv的解体和胰岛素从grv中的释放。
79.图1b显示了由高血糖状态触发的用于体内胰岛素递送的含葡萄糖响应性囊泡(grv)的微针阵列贴片的示意图。微针可以包括图1a描述的grv，而贴片可以应用于皮肤。在正常血糖状态下，几乎没有胰岛素释放；但在高血糖状态下，会触发胰岛素从微针中释放。
80.图2a是(i)在400毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液中温育之前，(ii)在400mg/dl葡萄糖溶液中温育二十分钟之后，(iii)在400mg/dl葡萄糖溶液中温育1小时之后，或(iv)在400mg/dl葡萄糖溶液中温育24小时之后，加载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的葡萄糖响应性囊泡(grv)的一系列的透射电子显微镜(tem)图像。
81.图2b是显示在400毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液中温育之前的葡萄糖响应性囊泡(grv)的尺寸分布的柱状图。
82.图2c是显示在400毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液中温育24小时后葡萄糖响应性囊泡(grv)的大小分布的柱状图。
83.图2d是在400毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液中温育之前，荧光素异硫氰酸酯(fitc)
‑
胰岛素加载的葡萄糖响应性囊泡(grv)的溶液的2.5维(2.5d)荧光图像。
84.图2e是在400毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液中37摄氏度(℃)温育1小时后，荧光素异硫氰酸酯(fitc)
‑
胰岛素加载的葡萄糖响应性囊泡(grv)的溶液的2.5维(2.5d)荧光图像。
85.图2f是显示在含有不同浓度的葡萄糖且含有氧浓度分子探针的葡萄糖溶液中温育的葡萄糖响应性囊泡(grv)的磷光寿命曲线的图表。提供了在100毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液(实心圆)和在400mg/dl葡萄糖溶液(实心三角形)中温育的grv的数据。为了比较，提供了在没有葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中温育的grv的数据。
86.图2g是显示在37摄氏度(℃)下各种葡萄糖溶液中的葡萄糖响应性囊泡(grv)的时间依赖性紫外线(uv)吸收(在330纳米(nm)处)的曲线图。提供了在100毫克/分升(mg/dl)葡
萄糖溶液(实心圆)和400mg/dl葡萄糖溶液(实心三角形)中温育的grv的数据。为了比较，提供了在没有葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水(pbs)(实心正方形)中温育的grv的数据。误差条表示三次重复的标准偏差(s.d.)。
87.图3a是显示在不同葡萄糖浓度(0毫克/分升(mg/dl)葡萄糖(即，pbs，实心正方形))；100mg/dl葡萄糖(实心圆)和400mg/dl葡萄糖(实心三角形)的不同葡萄糖溶液中在37摄氏度(℃)下温育的葡萄糖响应性囊泡(grv)的体外累积胰岛素释放的图表。
88.图3b是显示含有葡萄糖氧化酶(gox)和胰岛素的的葡萄糖响应性囊泡(grv)(grv(e+i)，空心圆圈)以及含有一半量的gox(grv(1)/2e+i)，实心圆)的类似的grv的自身调节曲线的图表。胰岛素释放速率显示为葡萄糖浓度(即，每分升100毫克(mg/dl)，200mg/dl或400mg/dl)的函数。
89.图3c是依次暴露于100毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液10分钟和随后400mg/dl葡萄糖溶液10分钟进行几次重复的葡萄糖响应性囊泡(grv)的脉冲式释放曲线。
90.图3d是天然胰岛素溶液(空心圆)和在400毫克/分升(mg/dl)葡萄糖溶液中温育的葡萄糖响应性囊泡(grv)释放的胰岛素的溶液(实心圆)的圆二色性(cd)色谱。误差条代表三次重复的标准偏差。
91.图4a是来自硅胶模具的本公开的主题的葡萄糖响应性囊泡(grv)加载的微针(mn)阵列贴片的示例性制作过程的示意图。
92.图4b是本公开主题的示例性微针(mn)阵列的照片。照片右下角的比例尺代表1厘米(cm)。
93.图4c是加载有含有荧光素异硫氰酸酯(fitc)标记的胰岛素的葡萄糖响应性囊泡(grv)的微针(mn)的荧光显微镜图像。插图是微针中的一个的更接近的图像。比例尺表示200微米(μm)。
94.图4d是本公开的主题的示例性微针(mn)阵列的扫描电子显微镜(sem)图像。比例尺表示200微米(μm)。
95.图4e是显示非交联的和交联的葡萄糖响应性囊泡(grv)加载的微针管(mn)的机械性能的图表。
96.图5a是以下的一组图像：(左上)用本公开的主题的微针(mn)阵列贴片经皮处理的小鼠背部和相关皮肤(圆全内的区域)；(右上)显示mn穿透小鼠皮肤的台盼蓝(trypan blue)染色；和(底部)由mn中的一个穿透的小鼠皮肤的苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)(h&e)染色的部分。在右上角的图像中，比例尺表示500微米(μm)。在底部的图像中，比例尺表示100微米(μm)；肌肉和脂肪组织分别由“m”和“f”表示；而发生mn插入的区域用虚线表示。
97.图5b是在链脲霉素(stz)诱导的糖尿病小鼠中用于i型糖尿病的葡萄糖响应性囊泡(grv)加载的微针(mn)阵列贴片治疗的体内研究期间血糖水平的图表。提供了用空白mn(不含胰岛素或酶的mn，空心三角形)；加载有仅含有人重组胰岛素的grv的mn(grv(i)，实心圆))；加载有含有胰岛素和葡萄糖氧化酶的grv的mn(grv(e+i)，实心正方形)；和加载有胰岛素和一半量的酶的mn(grv(1/2e+i)，空心正方形)治疗的小鼠的数据。作为对照，提供了经由胰岛素注射治疗的小鼠的数据(空心圆)。
98.图5c是在链脲霉素(stz)诱导的糖尿病小鼠中对i型糖尿病的葡萄糖响应性囊泡
微针(mn)阵列贴片治疗的体内研究期间血浆胰岛素浓度的图表。提供了加载有仅人重组胰岛素的mn阵列(grv(i)，实心三角形)；加载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的mn阵列(grv(e+i)，实心正方形)；和加载有胰岛素和半量酶的nm阵列(grv(1/2e+i)，实心圆))处理的小鼠的数据。
99.图5d是葡萄糖响应性囊泡(grv)加载的微针(mn)阵列贴片在小鼠背部插入4小时后的扫描电子显微镜(sem)图像。mn加载有含有胰岛素和葡萄糖氧化酶的grv(即，grv(e+i))。比例尺表示200微米(μm)。
100.图5e是在给予其中grv含有胰岛素和葡萄糖氧化酶(即，grv(e+i)，实心圆圈)的葡萄糖响应性囊泡(grv)加载的微针(mn)阵列贴片之后1小时的糖尿病小鼠的体内血糖耐量测试中获得的数据的图表。为了对比，还显示了健康小鼠(实心正方形)和糖尿病小鼠在给予其中mn仅加载胰岛素的mn阵列贴片之后1小时(实心三角形)的数据。
101.图5f是显示由图5e描述的测试对小鼠腹膜内注射葡萄糖的响应性的图表，其基于在120分钟内的曲线下面积(auc)计算，其中基线设定为零分钟葡萄糖读数。
102.图5g是显示在给予第一葡萄糖响应性囊泡加载(grv)的mn阵列贴片之后一小时额外给予微针(mn)阵列贴片治疗的小鼠中的血糖变化的图表，其中第一grv加载的mn阵列贴片含有加载有胰岛素和葡萄糖氧化酶的grv(即grv(e+i))。额外的mn阵列贴片包含加载有胰岛素和葡萄糖氧化酶两者的grv(grv(e+i)+grv(e+i)，空心正方形)；加载有胰岛素和半量的酶的grv(grv(e+i)+(grv(1/2e+1)，实心圆))或仅胰岛素(grv(e+i)+胰岛素，空心圆圈)。为了对照，还提供了不接收第二mn阵列贴片(grv(e+i)，实心正方形)的小鼠的数据。黑色箭头表示第一和第二mn阵列贴片的给予时间点。
103.图5h是用葡萄糖响应性囊泡加载(grv)的微针(mn)阵列贴片治疗的健康小鼠中的血糖变化随时间的图表。提供了用其中grv包含胰岛素和葡萄糖氧化酶两者(grv(e+i)，实心圆))和其中grv仅含有胰岛素(grv(i)，实心三角形)的grv加载的mn阵列贴片治疗的小鼠的数据。为了对照，提供了注射胰岛素的(胰岛素，实心正方形)小鼠的数据。黑色箭头表示给予时间点。
104.图5i是图5h描述的小鼠的低血糖指数(hypoglycemic index)的定量的图表。低血糖指数由初始血糖和最低血糖读数之差除以达到最低点的时间来计算。与胰岛素加载的mn阵列贴片(grv(i))相比，含有加载有酶和胰岛素的grv(grv(e+i))的葡萄糖响应性囊泡(grv)微针(mn)阵列贴片的*p<0.05。误差条表示s.d.(n＝5)。
具体实施方式
105.现在将参照附图和实施例更详细地描述本公开的主题，其中显示了代表性的实施方式。然而，本公开的主题可以以不同的形式实施，并且不应解释为限于本文所阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式，而使本公开将是彻底和完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达实施方式的范围。附图中的某些组件不一定按比例绘制，而是将重点放在示出本公开的主题(在某些情况下，示意性地)的原理。
106.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献以其全部内容通过引证结合于本文中。
107.在整个说明书和权利要求书中，给定的化学式或名称应该涵盖所有活性光学和立体异构体，以及外消旋混合物(在存在这些异构体和混合物的情况下)。
108.i.定义
109.虽然认为以下术语本领域普通技术人员都可以充分理解，但为了便于本公开主题的阐述，陈述了以下定义。
110.根据长期的专利法惯例，术语“一个”，“一种”和“该”在本技术，包括权利要求书中使用时，都是指“一个或多个”。因此，例如，提及“组合物”或“聚合物”则包括多种这样的组合物或聚合物，等等。
111.除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示数量大小，反应条件等的所有数字都应该理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非相反指出，本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数都是可以根据本公开的主题寻求获得的所需性质而变化的近似值。
112.如本文所使用的术语“约”在涉及尺寸(即，直径)，重量，浓度或百分比的值或量时，意味着涵盖由指定的量在一个实例中
±
20％或
±
10％、在另一个实例中
±
5％、而在又一个实例中
±
1％、而在又一个实例中
±
0.1％的变化，这些变化适用于实施公开的方法。
113.如本文所用，当在实体的列表的上下文中使用时，术语“和/或”是指单独呈现或组合存在的实体。因此，例如，短语“a，b，c和/或d”分别包括a，b，c和d，还包括a，b，c和d的任何和所有组合和子组合。
114.术语“包含”与“包括”，“含有”或“特征在于”同义，是包容性的或开放式的，且不排除另外的未提及的要素或方法步骤。“包含”是指权利要求语言中使用的术语，意味着指出的元素是基本的，但可以添加其他元素并且形成仍然在权利要求范围内的概念。
115.如本文所用，短语“由
…
组成”不包括权利要求中未指出的任何元素，步骤或成分。当术语“由
…
组成”出现于权利要求书的本体的一个条款中，而不是紧接在序言之后时，它只限制该条款中阐述的要素；其他要素并不会排除于权利要求整体之外。
116.如本文所用，短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，加上实质上不影响所要求保护的主题的基本和新的特性的那些。
117.关于术语“包含”，“由...组成”和“基本上由...组成”，在本文中使用这三个术语之一的情况下，本公开和权利要求要求保护的主题可以包括其他两个术语中任一种的使用。
118.如本文所用，术语“烷基”是指c1‑
20
，包括线性(即“直链”)，、支链或环状的饱和，或至少部分且在一些情况下完全不饱和(即，烯基和炔基)的烃链，包括，例如、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和烯丙基。“支链的”是指其中低级烷基基团如甲基、乙基或丙基与直链烷基链连接的烷基。“低级烷基”是指具有1至约8个碳原子，例如，1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基基团(即c1‑8烷基)。“高级烷基”是指具有约10至约20个碳原子，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基基团。在某些实施方式中，“烷基”具体是指c1‑8直链烷基。在其它实施方式中，“烷基”具体是指c1‑8支链烷基。
119.烷基基团可以可选地被一个或多个可以是相同或不同的烷基取代基取代(“取代
的烷基”)。术语“烷基基团取代基”包括，但不限于、烷基、取代的烷基、卤素、硝基、氨基、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳烷氧基、芳烷硫基、羧基、烷氧基羰基、氧基和环烷基。可以可选地沿着烷基链插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是氢，低级烷基(本文中也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。
120.因此，如本文所用，术语“取代的烷基”包括如本文所定义的烷基基团，其中烷基基团的一个或多个原子或官能团被另一个原子或官能团替代，包括，例如，烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、磺基和巯基。
121.术语“芳基”在本文中用于指可以是单个芳族环或稠合在一起、共价连接或连接到共同的基团，例如，但不限于，亚甲基或亚乙基部分的多个芳族环的芳族取代基。共同的连接基团也可以是羰基，如二苯甲酮中、，或氧，如二苯醚中，或氮，如二苯胺中。术语“芳基”特别涵盖杂环芳族化合物。芳香族环可以包括苯基、萘基、联苯基、二苯基醚、二苯胺和二苯甲酮等。在具体的实施方式中，术语“芳基”是指包含约5至约10个碳原子，例如，5、6、7、8、9或10个碳原子的环状芳族化合物，并且包括5和6元烃和杂环芳环。
122.芳基可以可选地被一个或多个可以相同或不同的芳基取代基取代(“取代的芳基”)，其中“芳基基团取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、卤素、硝基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰氨基、芳酰氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和
‑
nr'r”，其中r'和r”可以各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。
123.因此，如本文所用，术语“取代的芳基”包括如本文所定义的芳基基团，其中芳基基团的一个或多个原子或官能团被另一个原子或官能团，包括，例如，烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、磺基和巯基取代。
124.芳基基团的具体实例包括，但不限于，环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
125.术语“芳烷基”是指烷基
‑
芳基基团，可选地其中烷基和/或芳基基团包含一个或多个烷基或芳基基团取代基。
126.在一些实施方式中，术语“二价”是指可以键合(例如，共价键合)或键合至另外两个基团，如其它的烷基、芳烷基、环烷基或芳基的基团。通常，二价基团上的两个不同位置(例如，两个不同的原子)可以键合到其他分子上的基团。例如，二价基团可以是亚烷基基团。
[0127]“亚烷基”可以是指具有1至约20个碳原子，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的直链或支链二价脂族烃基团。亚烷基可以是直链的，支链的或环状的。亚烷基也可以可选地是不饱和的和/或被一个或多个“烷基基团取代基”取代。沿着亚烷基可以可选地插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子(本文中也称为“烷基氨基烷基”)，其中氮取代基是如前所述的烷基。示例性的亚烷基包括亚甲基(
‑
ch2‑
)；亚乙基(
‑
ch2‑
ch2‑
)；亚丙基(
‑
(ch2)3‑
)；亚环己基(
‑
c6h
10
‑
)；
‑
ch＝ch
‑
ch＝ch
‑
；
‑
ch＝ch
‑
ch2‑
；
‑
(ch2)
q
‑
n(r)
‑
(ch2)
r
‑
，其中q和r各自独立地为0至约20，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的整数，r是氢或低级烷基；亚甲基二氧基(
‑
o
‑
ch2‑
o
‑
)；和亚乙基二氧基(
‑
o
‑
(ch2)2‑
o
‑
)。亚烷基可以具有约2至约3个碳原子并且可以进
一步具有6
‑
20个碳。
[0128]“亚芳基”是指二价芳基基团。
[0129]
术语“氨基”是指
‑
nr'r
″
基团，其中r'和r
″
各自独立地选自包括h和取代和未取代的烷基、环烷基、杂环、芳烷基、芳基和杂芳基的基团。在一些实施方式中，氨基基团是
‑
nh2。“氨基烷基”和“氨基芳基”是指
‑
nr'r
″
基团，其中分别地，r'是如上文对氨基的定义，而r
″
是取代或未取代的烷基或芳基。
[0130]
术语“羧酸酯”和“羧酸”可以分别是指基团
‑
c(＝o)o
‑
和
‑
c(＝o)oh。
[0131]
在一些实施方式中，“羧酸酯”可以是指
‑
c(＝o)o
‑
或
‑
c(＝o)oh基团。
[0132]
术语“酰胺”是指具有式
‑
c(＝o)
‑
nrr
″
的基团，其中r和r
″
各自独立地为h、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基或取代的芳基。
[0133]
术语“纳米尺度”、“纳米材料”、“纳米尺度聚合物”、“纳米簇”和“纳米颗粒”是指具有至少一个具有小于约1000nm的尺寸(例如，长度，宽度，直径等)的区域的结构(例如，囊泡)。在一些实施方式中，尺寸更小(例如，小于约500nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约125nm、小于约100nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm或甚至小于约20nm)。在一些实施方式中，尺寸小于约10nm。
[0134]
在一些实施方式中，纳米颗粒接近球形。当纳米颗粒接近球形时，特征尺寸可以对应于球体的直径。除了球形外，纳米颗粒或其他纳米尺度材料可以是盘形、长方形、多面体、棒状、立方体或不规则形状。纳米尺度材料也可以是不规则形状的或包括球体、棒、圆盘或立方体的簇。
[0135]
本文所用的术语“微”(例如，在“微针”中)是指具有至少一个具有小于约1,000微米(μm)的尺寸的区域的结构。在一些实施方式中，术语“微”是指具有约1微米至约1,000微米的尺寸的结构。
[0136]
术语“直径”是本领域公认的，并且在本文中用于指物理直径或流体动力学直径。基本上球形的颗粒的直径可以是指物理或流体动力学直径。如本文所用，非球形颗粒的直径可以指颗粒表面上两点之间的最大直线距离。当涉及多个颗粒时，颗粒的直径通常指颗粒的平均直径。粒径可以使用本领域中的各种技术测定，包括，但不限于，动态光散射。
[0137]
本文使用“单分散体”描述其中所有颗粒相同或几乎相同大小的颗粒群体。例如，“单分散体”可以是指其中90％的分布位于中值粒度的15％，10％或5％之内的颗粒分布。
[0138]
术语“聚合物”和“聚合物的”是指具有重复单元(即，给定化学亚结构的多个拷贝)的化学结构。如本文所用，聚合物可以是指具有多于10个重复单元的基团和/或其中重复单元不是亚甲基的的基团。聚合物可以由可聚合单体形成。可聚合单体是包含一个或多个可以与其他分子反应形成键的反应性部分{例如，甲硅烷氧基醚，羟基，胺，乙烯基团(即碳
‑
碳双键)，卤素(即cl，br，f和i)，酯，活化酯等}的分子。通常，每个可聚合单体分子可以键合到两个或多个其它分子。在一些情况下，可聚合单体将仅与另一个分子键合，形成聚合物材料的末端。一些聚合物含有可生物降解的连接，例如，酯或酰胺，使得它们在生物条件下可以随时间而降解。
[0139]“共聚物”是指衍生自多于一种单体的聚合物。
[0140]
如本文所用，“嵌段共聚物”是指以线性顺序包含嵌段(即，整个共聚物的聚合物子部分)的共聚物。“嵌段”是指具有至少一个不存在于大分子的相邻部分中的特征的共聚物
的一部分。因此，“嵌段共聚物”可以是指其中相邻嵌段在组成上不同的共聚物，即这些嵌段每个都包含衍生自不同特性的单体种类或具有不同的结构单元的组成或顺序分布的结构单元。
[0141]
本文所用的“生物相容性的”通常是指通常对接受者无毒且不对接受者造成任何明显不利影响的材料及其任何代谢物或降解产物。
[0142]
本文使用的“可生物降解的”通常是指在生理条件下将降解或腐蚀成能够被受试者代谢、消除或排泄的更小单元或化学物质的材料。在一些实施方式中，降解时间是聚合物组成和形态的函数。合适的降解时间为数天至数周。例如，在一些实施方式中，聚合物可以在7天至24周、可选地7天至12周、可选地7天至6周、或进一步可选地7天至3周的时间段内降解。
[0143]
术语“亲水性”可以是指溶解或优选溶解于水和/或水溶液中的基团。
[0144]
术语“疏水性”是指不显著溶于水和/或水溶液和/或优选溶解于脂肪和/或非水溶液中的基团。
[0145]
术语“两亲性”是指含有亲水基团和疏水基团两者的分子或聚合物。
[0146]
术语“结合物”和“结合的”可以是指包含至少两个彼此通过如通过离子键、配位键或共价键键合的不同化学部分或分子(例如，小分子，聚合物，蛋白质等)的组合物。在一些实施方式中，术语“结合物”是指彼此共价键合的部分或分子。在一些实施方式中，结合物可以包含通过分子间力如氢键，伦敦色散力，范德华相互作用等彼此相关联的两个不同化学部分。
[0147]
本文所用的术语“胰岛素”是指来自人或其他哺乳动物的胰岛素。在一些实施方式中，术语“胰岛素”是指人胰岛素。在一些实施方式中，术语“胰岛素”是指重组人胰岛素。
[0148]
本文所用的“生物活性衍生物”是指其中一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代或缺失的人胰岛素或另一种哺乳动物胰岛素，其中a链和/或b链已经通过在n
‑
端或c
‑
端添加一个或多个氨基酸残基而延伸，和/或其中胰岛素已经通过加入一个或多个化学取代基而修饰。衍生物可以作用为代替内源性胰岛素并保留内源胰岛素至少一些生物活性。胰岛素衍生物可以具有与内源性胰岛素不同的药代动力学。基于本领域技术人员已知的药代动力学，可以基于胰岛素衍生物与人胰岛素相关的药代动力学优化剂量。
[0149]
本文所用的术语“糖尿病治疗剂”可以是指治疗糖尿病或其并发症(例如，但不限于，糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、青光眼和糖尿病性酮症酸中毒)或导致高血糖的另一种葡萄糖代谢紊乱的治疗性药剂。在一些实施方式中，糖尿病治疗剂是本领域已知的用于治疗糖尿病的胰岛素或其生物活性衍生物或非胰岛素类治疗剂。用于治疗糖尿病的合适的非胰岛素类治疗剂包括，但不限于，胰岛素敏化剂、dpp iv抑制剂、胰高血糖素样肽1(glp
‑
1)及其类似物、胰岛素促分泌素、如但不限于、磺酰脲、美各里替尼(meglitinide)、胃抑制性多肽(gip)、胰岛素受体活化剂、双胍、噻唑烷二酮、α
‑
葡糖苷酶抑制剂等。在一些实施方式中，糖尿病治疗剂是胰岛素或生物活性衍生物。
[0150]
术语“交联试剂”或“交联剂”是指包含至少两个可以相同或不同的反应性官能团(或可以去阻断或去保护而提供反应性官能团的基团)的化合物。在一些实施方式中，两个反应性官能团可以具有不同的化学反应性(例如，两个反应性官能团与其它分子上的不同类型的官能团是反应性的(例如，形成键，如共价键)，或两个反应性官能团之一倾向于与另
一个分子上特定的官能团比其它反应性官能团更快地反应)。因此，交联试剂可以用于连接(例如，共价键合)两个其他实体(例如，分子、聚合物、蛋白质、核酸、囊泡、脂质体、纳米颗粒、微粒等)而形成交联组合物。
[0151]
术语“囊泡”可以是指包含被一个或多个同心层的分子或聚合物(例如，两亲性聚合物)包封的流体的人造颗粒，(在一些实施方式中，纳米颗粒)。溶解或悬浮于流体中的可以是一种或多种治疗剂(例如，小分子、蛋白质、核酸等)。根据本公开的主题的一些实施方式，流体可以包含溶解于水溶液中的糖尿病治疗剂，如胰岛素或其生物活性衍生物和葡萄糖氧化剂，如葡萄糖氧化酶。流体可以包含多于只一种治疗剂，如有胰岛素或其生物活性衍生物及另一种治疗性药剂，如用于治疗糖尿病或其并发症的非胰岛素类药物。在一些实施方式中，每种治疗性药剂可以是水溶的治疗性药剂。
[0152]
本文所用的术语“高血糖症”可以是指其中相对于健康个体，受试者的血浆中循环的升高的葡萄糖含量的病状。使用本领域已知的方法，包括测量空腹血糖水平，可以诊断高血糖症。
[0153]
如本文所用的术语“高胰岛素血症”可以是指其中当血糖水平升高或正常时伴有循环胰岛素水平升高的病状。高胰岛素血症可以由血脂异常，如高甘油三酯、高胆固醇、高的低密度脂蛋白(ldl)和低的高密度脂蛋白(hdl)；高尿酸水平；多囊卵巢综合征；ii型糖尿病和肥胖相关的胰岛素耐受性引起。
[0154]
本文所用的术语“胰岛素耐受”可以是其中指正常量的胰岛素不能产生正常的生理或分子响应的病症。在一些情况下，内源生产或外源给予的超生理量的胰岛素能够全部或部分地克服胰岛素耐受性，并产生生物响应。
[0155]
本文所用的术语“代谢综合征”可以是指相关的特性的群，包括但不限于，高胰岛素血症、葡萄糖耐量异常、肥胖、脂肪向腹部或身体上部区间再分布、高血压、异常纤维蛋白溶解(dysfibrinolysis)和以高甘油三酯、低的高密度脂蛋白(hdl)
‑
胆固醇和高的小致密低密度脂蛋白(ldl)颗粒为特征的血脂异常。具有代谢综合征的受试者处于发展为2型糖尿病和/或其他病症(例如，动脉粥样硬化)的风险。
[0156]
本文所用的术语“葡萄糖耐量”可以是指当受试者在葡萄糖摄入波动时控制血浆葡萄糖和/或血浆胰岛素水平的能力。例如，葡萄糖耐量包括在约120分钟左右时间内将血浆葡萄糖水平降低至摄入葡萄糖之前的水平的能力。
[0157]
ii.一般考虑
[0158]
能够响应于升高的血糖而“分泌”胰岛素的人工胰腺样闭环葡萄糖响应性胰岛素递送系统可以以最小的患者努力以及血糖和生活质量的潜在改善提供调节血糖的期望方式。参见bratlie et al.,advanced healthcare materials,1(3):267
‑
284(2012)；ravaine et al.,j.controlled release,132(1):2
‑
11(2008)；和wu et al.,chem.rev.,111(12):7855
‑
7875(2011)。目前的闭环系统结合了葡萄糖监测模块和传感器触发的胰岛素释放模块。参见bratlie et al.,advanced healthcare materials,1(3):267
‑
284(2012)；and ravaine et al.,j.controlled release,132(1):2
‑
11(2008)。例如，存在采用由患者和外部胰岛素输液泵校准的连续葡萄糖监测传感器的闭环电子/机械器件。参见veiseh et al.,nature reviews drug discovery,14(1):45
‑
57(2015)。然而，各种挑战如保证准确的信号反馈和防止生物污损可能与这些装置相关。
[0159]
避免这些挑战中的一些的一种方法涉及利用具有葡萄糖感应元件的胰岛素加载的基质的化学方法。基质可以设计为响应于葡萄糖浓度变化而经受结构变形，例如，收缩、溶胀或解离，导致葡萄糖刺激的胰岛素释放。参见gordijo et al.,adv.funct.mater.,21(1):73
‑
82(2011)；gu et al.,acs nano,7(8):6758
‑
6766(2013)；katoaka et al.,j.am.chem.soc.,120(48):12694
‑
12695(1998)；和gu et al.,acs nano,7(5):4194
‑
4201(2013)。用于合成的闭环装置的可能葡萄糖感应部分包括苯基硼酸(pba)、葡萄糖结合蛋白(gbp)和葡萄糖氧化酶(gox)。不幸的是，大部分现有的合成闭环系统由于与每种葡萄糖感应策略相关的特定问题而限于体外研究，其中相对较少示出体内的适用性。例如，pba及其衍生物已知与多元醇分子如葡萄糖的可逆相互作用(参见aronoff et al.,carbohydr.res.,40(2):299
‑
309(1975))；但是葡萄糖和pba之间的有效相互作用和基质随后的结构变化通常需要比生理环境高的碱性ph。pba结合物的安全性和毒性仍有待确定。伴刀豆球蛋白(concanavalin)a(con a)是通常基于其多重结合位点和与葡萄糖和葡聚糖(用作基质材料)的竞争性相互作用的胰岛素递送最常用的gbp。参见kim et al.,j.controlled release,11(1):193
‑
201(1990)。然而，con a的体内毒性和不稳定性限制了其临床应用。参见tiegs et al.,j.clin.invest.,90(1):196(1992)。
[0160]
gox是可以在氧气存在下将葡萄糖转化为葡萄糖酸的酶：
[0161][0162]
参见wu et al.,chem.rev.,111(12):7855
‑
7875(2011)。采用gox的葡萄糖响应性系统先前已经与ph敏感性材料整合，ph敏感性材料可以随着通过增加葡萄糖浓度而促进的ph的局部降低而质子化或降解。然而，这种依赖于ph降低的方法，特别是在缓冲的生理环境中，可能受较慢的响应性的损害。参见veiseh et al.,nature reviews drug discovery,14(1):45
‑
57(2015)。
[0163]
本公开的主题提供了递送胰岛素的方法，其结合：(1)快速响应性，以更好地将药代动力学模拟为正常胰腺活动；(2)易于给予；和(3)生物相容性而无长期副作用。更具体地，本公开的主题提供了基于含有(例如，溶解于包封在囊泡中的流体在)胰岛素(和/或另一种糖尿病治疗剂)和葡萄糖氧化剂(例如gox)的缺氧敏感性囊泡的用于胰岛素(和/或其他糖尿病治疗剂)的递送装置。本公开的装置不利用酶促诱导的ph变化，而是利用由在葡萄糖氧化期间消氧的消耗导致的局部产生的缺氧，作为响应于高血糖而快速促进胰岛素(和/或另一种糖尿病治疗剂)释放的触发。已经证明，氧的传输系数比体内氢离子的扩散系数要慢(参见fletcher,biophys.j.,29(3):437
‑
458(1980)；michaels et al.aiche j.,21(5):985
‑
996(1975)；和dowd et al.,journal of bone and joint surgery,british volume,65(1):79
‑
83(1983))，这表明如果缺氧敏感性材料并入基于葡萄糖氧化剂的葡萄糖响应性制剂中，可以获得更快速的响应。
[0164]
在本公开的主题的一个实施方式中，为了实现缺氧响应性转导，使用2
‑
硝基咪唑(ni)改性的材料作为缺氧敏感性材料。ni是由于其对肿瘤部位缺氧状态的高敏感性而因此常常用于癌症成像的疏水性成分。参见nunn et al.,eur.j.nucl.med.,22(3):265
‑
280(1995)；and krohn et al.,j.nucl.med.,49(suppl.2):129s
‑
148s(2008)。通过由一系列连接到生物还原剂，如生物组织中富含的辅酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)的硝基
还原酶催化的单电子还原，可以将ni转化为亲水性的2
‑
氨基咪唑。参见nunn et al.,eur.j.nucl.med.,22(3):265
‑
280(1995)；krohn et al.,j.nucl.med.,49(suppl.2):129s
‑
148s(2008)；edwards,j.antimicrob.chemother.,31(1):9
‑
20(1993)；和takasawa et al.,stroke,39(5):1629
‑
1637(2008).(25
‑
28)。
[0165]
如图1a所示，胺官能化的ni与生物相容的可生物降解的聚合物透明质酸(ha；分子量：300kda)结合。通过自组装，两亲性缺氧敏感性ha(hs
‑
ha)可以很容易地形成纳米级葡萄糖响应性囊泡(grv)，其可以包封水溶液中的重组人胰岛素(和/或另一种糖尿病治疗剂)和葡萄糖氧化剂如gox。在高血糖存在下，由于由葡萄糖氧化剂催化的葡萄糖氧化，可以迅速消耗溶解的氧，其导致局部缺氧环境。然后在nadph和还原酶存在下，hs
‑
ha上的ni基团还原成亲水性2
‑
氨基咪唑，其导致grv的解离和随后的胰岛素(和/或其他糖尿病治疗剂)释放。
[0166]
为了增加给予的便利性，本公开的grv可以加载到用于无痛递送糖尿病治疗剂(例如，胰岛素)的基于微针(mn)阵列的贴片中。参见图1b和4a。例如，如图4a中所示，可以由交联的ha制成微针的矩阵，其中交联可以改善微针的刚度并且限制针的grv的损失。如图1b所示，一旦皮下给予，当暴露于血管和淋巴管网络中的高间质液体葡萄糖水平时，加载于微针中的grv解体，从而促进糖尿病治疗剂(例如，胰岛素)的释放，其可以迅速通过区域的淋巴和毛细血管吸收。如下文所述，具有缺氧敏感性葡萄糖响应机制的示例性“智能胰岛素贴片”可以在1型糖尿病的小鼠模型中显示出快速的葡萄糖调节响应性并可靠地避免低血糖。
[0167]
iii.葡萄糖响应性囊泡，相关的组合物和系统
[0168]
响应血糖而分泌胰岛素的闭环胰岛素递送系统对于治疗1型糖尿病和2型糖尿病并提高糖尿病患者的生活质量具有广泛的应用前景。在一些实施方式中，本公开的主题提供了使用含有缺氧敏感囊泡的无痛微针阵列贴片的用于递送胰岛素和/或另一种糖尿病治疗剂的葡萄糖响应性递送装置，缺氧敏感囊泡可以在暴露于由高血糖状态下葡萄糖的酶氧化而产生的局部缺氧环境时快速解体并释放封装的治疗剂或药剂(例如，胰岛素)。这种“智能胰岛素贴片”可以以快速响应性调节血糖并避免低血糖。
[0169]
在一些实施方式中，本公开的主题涉及用于将糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)递送至对其需要的受试者，例如，用于控制导致高血糖的糖尿病或另一种葡萄糖代谢障碍的组合物。在一些实施方式中，本公开的组合物可以向对其需要的受试者提供葡萄糖敏感性的闭环糖尿病治疗剂递送，从而提供对糖尿病的更成本有效和更容易的控制，以及对糖尿病治疗的低血糖并发症的预防。
[0170]
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种组合物，其包含：
[0171]
(a)两亲性聚合物材料，其中两亲聚合物材料包含与缺氧敏感性疏水基团结合的亲水性聚合物，其中缺氧敏感性疏水基团包含可以在缺氧环境存在下还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分；
[0172]
(b)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物；和
[0173]
(c)葡萄糖氧化剂。
[0174]
亲水性聚合物可以是合成的或天然存在的生物相容性聚合物。合适的亲水性聚合物可以包括极性或带电的侧链部分。在一些实施方式中，亲水聚合物可以是可生物降解的。合适的亲水性聚合物包括但不限于聚氨基酸(例如，聚谷氨酸，聚天冬氨酸等)，合成嵌段共聚物(例如，其中至少一个嵌段包含亲水性聚合物链)，和多糖如葡糖胺聚糖(gag)。在一些
实施方式中，亲水性聚合物是gag，如透明质酸(hyaluronan)或透明质酸(hyaluronic acid)；肝素，硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。在一些实施方式中，亲水性聚合物是透明质酸。
[0175]
如上所示，疏水基团包含缺氧敏感性部分，例如，可以(例如，在与两亲性聚合物材料接触的溶剂或生理环境中)经受化学反应或响应于氧减少的其它结构变化的部分。例如，缺氧敏感性基团可以经受还原反应或响应于氧减少的反应。一种或多种还原反应可以由酶催化。在一些实施方式中，氧的减少可以是由与两亲性聚合物材料接触的氧化葡萄糖的葡萄糖氧化剂的活性引起的氧局部耗尽的结果。因此，在一些实施方式中，缺氧是在两亲聚合物材料及其相关联的葡萄糖氧化剂附近葡萄糖浓度增加的副作用。
[0176]
代表性的缺氧敏感性部分包括硝基取代的芳基基团。在一些实施方式中，缺氧敏感性部分是硝基咪唑(例如，2
‑
硝基咪唑)。硝基咪唑可以包括，即，除了在咪唑环上取代的硝基基团之外，在咪唑环的碳和/或氮原子上取代的一个或多个芳基基团取代基(例如，烷基，卤素等)。在一些实施方式中，缺氧敏感性部分可以包含多于一个硝基基团。
[0177]
在一些实施方式中，疏水基团与亲水性聚合物共价结合。例如，疏水基团可以基于包含氨基基团的前体分子。前体分子的氨基基团可以与存在于亲水性聚合物上的羧酸基团形成酰胺键。在一些实施方式中，两亲性聚合物材料可以包含与2
‑
硝基咪唑取代的烷基胺，如但不限于6
‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺，5
‑
(2
‑
硝基咪唑)戊胺，4
‑
(2
‑
硝基咪唑)丁胺，7
‑
(2
‑
硝基咪唑)庚胺，8
‑
(2
‑
硝基咪唑)辛胺等结合的透明质酸(或包含羧酸侧链基团的另一种亲水性聚合物)。
[0178]
可以使用任何合适的葡萄糖氧化剂。在一些实施方式中，葡萄糖氧化剂是酶如葡萄糖氧化酶(gox)(ec1.1.3.4)，其氧化葡萄糖而产生过氧化氢和葡萄糖酸的环状形式的d
‑
葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯。在一些实施方式中，葡萄糖氧化剂可以是gox的生物活性变体。
[0179]
在一些实施方式中，糖尿病治疗剂是胰岛素或其生物活性衍生物，如人胰岛素、重组人胰岛素、来自非人动物源(例如，牛、猪)的胰岛素或任何其它胰岛素，包括胰岛素衍生物。在一些实施方式中，胰岛素是与预期的接受者相同的物种的胰岛素，即用于治疗人的人胰岛素。胰岛素或其生物活性衍生物可以包含不同胰岛素和/或衍生物的混合物。胰岛素或其生物活性衍生物可以包括速效胰岛素，速效胰岛素类似物、中效胰岛素和/或长效胰岛素。在一些实施方式中，胰岛素或其生物活性衍生物是快速作用或速效胰岛素。
[0180]
速效胰岛素在1到20分钟内开始起效，高峰期约一小时后，并持续三至五小时。速效胰岛素需要约2小时才能完全吸收到体循环中。速效胰岛素包括常规的重组人胰岛素(如lilly销售的humulin
tm
和由novonordisk销售的novolin
tm
)。在几种氨基酸上与人胰岛素不同，但在人体中是生物活性的牛和猪胰岛素也是速效胰岛素。
[0181]
速效胰岛素包括已被改性或已经改变了氨基酸位置以提高其吸收速率的胰岛素。有三种类型的可用的速效市售胰岛素类似物：赖脯胰岛素(赖氨酸
‑
脯氨酸胰岛素，由eli lilly以humalog
tm
出售)，谷维素胰岛素(由sanofi
‑
aventis作为apidra
tm
出售)和门冬胰岛素(由novo nordisk作为novolog
tm
出售)。
[0182]
中效胰岛素具有比短效胰岛素更长的使用寿命，但开始起效速度较慢，达到其最大强度需要更长时间。中效胰岛素通常在注射后2
‑
4小时内开始起效，峰值为在注射后约4
‑
14小时，且在注射后24小时保持有效。中效胰岛素的类型包括nph(中性精蛋白锌胰岛素
(neutral protamine hagedorn))和lente
tm
胰岛素。nph胰岛素含有精胺，其减慢吸收速度而使胰岛素需要更长时间才能达到血流，但具有较长的峰值和寿命。
[0183]
长效胰岛素包括eli lilly的humulin
tm u(ultralente
tm
人胰岛素(重组dna来源)延长的锌悬液)；和甘精胰岛素(lantus
tm aventis)。甘精胰岛素是重组人类胰岛素类似物，其可以具有长达24小时的持续时间。其与人胰岛素的不同之处在于在21位上具有甘氨酸而不是天冬酰胺，并且在β链的羧基端加入了两个精氨酸。lantus
tm
由溶解于透明水性流体中的甘精胰岛素组成(100iu，3.6378mg甘精胰岛素，30μm锌，2.7mg间甲酚，20mg甘油85％，水至1ml)。
[0184]
另外，或作为胰岛素或其生物活性衍生物的替代，本公开的组合物可以包含本领域已知的用于治疗糖尿病或其并发症，或另一种葡萄糖代谢紊乱的非胰岛素类活性药物。因此，在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含非胰岛素类糖尿病药物，例如，但不限于下文列出的非胰岛素类糖尿病治疗剂，例如，胰高血糖素样肽1(glp1)或其类似物、α
‑
葡糖苷酶抑制剂、磺酰脲、噻唑烷二酮、或双胍。
[0185]
在一些实施方式中，两亲性聚合物材料形成含有包封或包埋于纳米颗粒内部(例如，在纳米颗粒内的孔隙或其它内部空间中)或另外非共价地与聚合物材料相关联的糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物和/或其他糖尿病治疗剂)和葡萄糖氧化剂的纳米颗粒。在一些实施方式中，缺氧敏感性部分的还原会破坏纳米颗粒结构(例如，当两亲性聚合物变得更亲水时)，使得糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)从纳米颗粒(例如，通过扩散)分散。在一些实施方式中，两亲性聚合物材料形成包封糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)和葡萄糖氧化剂的囊泡。缺氧敏感性部分的还原(例如，响应于由葡萄糖氧化剂由于葡萄糖增加的活性增加而导致的缺氧)可以导致囊泡的解体和糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其衍生物)的释放。
[0186]
在一些实施方式中，纳米颗粒和/或囊泡具有约50至约500nm的平均直径。在一些实施方式中，平均直径为约50至约250nm。在一些实施方式中，平均直径为约80至约160nm(例如，约80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、或160nm)。在一些实施方式中，纳米颗粒和/或囊泡具有约118nm的平均直径(例如，通过动态光散射法测量的)。在一些实施方式中，纳米颗粒和/或囊泡可以是单分散的或接近单分散的(例如，其中至少约80％的分布位于中值粒径的15％，10％或5％内)。
[0187]
在一些实施方式中，本公开的主题的组合物，例如，纳米颗粒和/或囊泡，可以用于制备用于递送糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)的微针或微针阵列。
[0188]
在一些实施方式中，本公开的主题提供了包含多个包含囊泡和/或纳米颗粒的微针的微针阵列，其中囊泡和/或纳米颗粒包含含有与缺氧敏感性疏水基团结合(例如，共价结合)的亲水性聚合物的两亲性聚合物材料，其中所述缺氧敏感性疏水基团包含能够在缺氧环境中还原而形成亲水部分的缺氧敏感性部分，并且进一步其中(i)糖尿病治疗剂，可选地胰岛素或其生物活性衍生物，和(ii)葡萄糖氧化剂包含于囊泡内。在一些实施方式中，微针阵列可以包括多个微针，其中所述多个微针中的每个微针具有约20至约1000微米(例如，约20、50、100、150、200、250、3300、350、400、450、500、450、600、650、700、750、800、650、900、950或约1000微米)的长度。在一些实施方式中，多个微针中的每一个具有约500至约700微米的长度。在一些实施方式中，每个微针可以具有近似圆锥形或金字塔形的形状。在一些实
施方式中，微针的尖端可以小于约100微米、小于约75微米、小于约50微米、小于约40微米、小于约30微米、或小于约20微米。在一些实施方式中，每个微针的尖端可以为约10微米。
[0189]
微针阵列可以包括多个微针，其中微针的基部以任何合适的二维图案排列。微针可以以规则的阵列(例如，正方形、矩形、圆形、椭圆形或其他形状的图案)排布，其中各个微针之间的距离保持相同或以重复的方式变化，或以不规则阵列(例如，其中各个微针之间的距离以不可识别的重复方式变化)排布。
[0190]
在一些实施方式中，微针阵列可以作为皮肤贴片的一部分提供。在一些实施方式中，微针阵列可以包括一个或多个背衬层(例如，以保护微针阵列免受湿气或物理损伤(例如，划伤))。在一些实施方式中，微针阵列可以包括从阵列向外延伸(例如，与阵列的基底共面)的层，其包括用于辅助阵列附着于皮肤的皮肤相容性粘合剂。
[0191]
本公开的微针阵列可以以葡萄糖响应性或依赖性的方式释放糖尿病治疗剂或药剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物和/或其他糖尿病治疗剂)。在一些实施方式中，糖尿病治疗剂或药剂(例如，胰岛素或生物活性衍生物)的释放速率取决于与阵列接触的葡萄糖的浓度(例如，当阵列接触更高浓度的葡萄糖时释放速率更快)。在一些实施方式中，微针阵列是闭环胰岛素递送系统。
[0192]
iv.治疗方法
[0193]
在一些实施方式中，本公开的主题提供了将糖尿病治疗剂，如胰岛素或生物活性胰岛素衍生物递送至对其需要的受试者的方法，方法包括向受试者给予本公开的主题的组合物(例如，纳米颗粒和/或囊泡)。给予可以通过任何合适的途径(例如，口腔、静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、皮下、肌肉内、经皮或通过吸入)。本公开的组合物可以以治疗有效量提供于任何合适的药用载体(例如，水)，媒介或稀释剂中。
[0194]“治疗有效量”是指以单次给药，或作为一系列给药的一部分向个体给予的该量对受试者有效地产生可测量的效果。例如，治疗有效量可以是降低或减少受试者的血糖浓度或引起葡萄糖耐量测试中的改善所需的量。因此，治疗有效量可以是足以降低或减少空腹血浆葡萄糖(fpg)的任何水平(例如，基线水平)的量，其中，例如，该量足以降低大于200mg/dl的fpg水平至小于200mg/dl，或其中该量足以将约175mg/dl至约200mg/dl的fpg水平降低至小于起始水平。在一些实施方式中，治疗有效量是足以将fpg水平降低至小于约150mg/dl、小于约125mg/dl、小于约120mg/dl、小于约115mg/dl、或小于约110mg/dl的量。治疗有效量可以结合给药方案和受试者的病状的诊断分析(例如，监测血浆中葡萄糖和/或胰岛素的水平)而调节。治疗有效量可以根据受试者的健康和身体状况、受试者体重、期望的疾病消退程度、胰岛素或胰岛素衍生物(或其他糖尿病治疗剂)的活性、葡萄糖氧化剂的活性、制剂等而变化。
[0195]
在一些实施方式中，方法包括提供本公开主题的微针阵列，以及将阵列应用于受试者的皮肤表面。当葡萄糖与微针阵列接触时，其被氧化，从而产生缺氧环境，导致两亲性聚合物材料的疏水基团的缺氧敏感性部分还原，由此形成亲水部分。亲水部分的形成可以导致包含两亲性聚合物材料的囊泡和/或纳米颗粒解体和包含于囊泡和/或纳米颗粒中的糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或生物活性胰岛素衍生物)的释放。在一些实施方式中，糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或生物活性胰岛素衍生物)的递送速率对应于与微针阵列接触的葡萄糖浓度。
[0196]
在一些实施方式中，可以将多于一个微针阵列，例如同时或依次地施加于受试者的皮肤表面。例如，可以依次每几个小时施加微针阵列。在一些实施方式中，可以在受试者进食几分钟(例如，约5至约120分钟)之前，期间或之内施加一个或多个阵列。在一些实施方式中，在受试者进食之前施加阵列，而在受试者进食后几分钟内施加第二阵列。
[0197]
微针阵列可以包括适合于治疗的受试者(例如，基于受试者体重)和/或基于治疗的受试者的实际或预期的血糖浓度(例如，基于受试者的实际或预期的食物摄取量(特别是碳水化合物摄入量))的适合的单位剂量的糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)。术语“单位剂量”可以是指包含足以产生期望的或可测量的效果的预定量的胰岛素、葡萄糖氧化剂和/或其它治疗剂的离散单位。
[0198]
在一些实施方式中，一种或多种另外的治疗剂包含于囊泡内并可以与糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)一起释放。在一些实施方式中，另外的治疗剂是水溶性的。在一些实施方式中，另外的治疗剂是蛋白质或蛋白质衍生物。
[0199]
在一些实施方式中，囊泡可以包含胰岛素(或其生物活性衍生物)和另外的治疗剂两者，其中另外的治疗剂是用于治疗糖尿病或其并发症(例如，糖尿病性神经病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、青光眼、糖尿病性酮酸中毒、细菌或真菌感染)的另一种药物。例如，在一些实施方式中，另外的治疗剂可以包括本领域已知的并用于治疗糖尿病(例如，2型糖尿病)的一种或多种非胰岛素活性药剂。非胰岛素类糖尿病药剂可以属于多种广泛类型的药物，包括，但不限于，胰岛素敏化剂、dpp iv抑制剂和glp1类似物、胰岛素促分泌剂，包括但不限于磺酰脲如醋磺己脲(dymelor)、氯磺丙脲(chlorpropamide)(diabinese)、妥拉磺脲(tolazamide)(tolinase)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)(orinase)、格列美脲(glimepiride)(amaryl)、格列吡嗪(glipizide)(glucotrol)、格列吡嗪缓释剂(glucotrol xl)、格列本脲(glyburide)(diabeta、micronase)、微粉化格列本脲(glynase、prestab)、美格列脲如那格列奈(nateglinide)(starlix)和瑞格列奈(repaglinide)(prandin)的、胃抑制性多肽(gip)、胰高血糖素样肽(glp)
‑
1、吗啉胍bts 67582、磷酸二酯酶抑制剂和琥珀酸酯衍生物、胰岛素受体激活剂；胰岛素敏化双胍如二甲双胍(glucophage)、噻唑烷二酮(tzd)如曲格列酮(troglitazone)(rezulin)、吡格列酮(pioglitazone)(actos)、罗格列酮(roziglitazone)(avandia)、mcc
‑
555、利格列酮(rivoglitazone)、环格列酮(ciglitazone)；非tzd过氧化物酶体增殖物活化受体
‑
γ(ppar
‑
γ)激动剂gl262570、α
‑
葡糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(precose)和米格列醇(glyset)、组合药剂如格列本脲二甲双胍(glucovance)(glucophage和glyburide)、酪氨酸磷酸酶抑制剂如钒、ptp
‑
1b抑制剂和ampk活化剂，包括5
‑
氨基咪唑
‑4‑
甲酰胺核糖核苷(aicar)、以及其它药剂如艾塞那肽(exendin)(exenatide(合成艾塞那肽
‑
4))和胰淀素(amylin)(symlin
tm
(普兰林肽醋酸酯(pramlintide acetate)))、d
‑
手性
‑
肌醇、变构肽配体(nbi
‑
6024)、anergix db复合物、gaba抑制黑皮质素(melanocortin)、葡萄糖降低剂(alt
‑
4037)、aerodose(aerogen)、胰岛素模拟物、单独的胰岛素样生长因子
‑
1或与bp3的复合物(somatokline)、甲氧氯普胺(metoclopramide)hcl(emitasol/spd 425)、motillde/红霉素类似物、和gag模拟物。在某些实施方式中，非胰岛素类糖尿病治疗剂可以是胰岛素敏化剂，例如，但不限于，噻唑烷二酮，如罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、mcc
‑
555、利格列酮、环格列酮等，及其组合。
[0200]
在一些实施方式中，根据本公开的主题治疗的受试者是人类受试者，但是应当理
解的是，本文的方法对于所有脊椎动物物种都是有效的，这旨在涵盖于术语“受试者”中。
[0201]
更具体地，本文提供了哺乳动物如人以及由于濒危而对于人类重要(例如，西伯利亚虎)、经济上重要(农场上饲养供人消费的动物)和/或社会上重要(作为宠物或在动物园中饲养的动物)的哺乳动物，例如，除了人之外的食肉动物(如猫和狗)、猪(家猪、肉猪、和野猪)、反刍动物(如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马的治疗。因此，本文描述的方法的实施方式包括家畜的治疗，包括，但不限于，驯养的猪(家猪和肉猪)、反刍动物、马、家禽等。
[0202]
通常，本公开的方法可以用于治疗患有导致血糖浓度升高(即，高血糖症)的糖尿病或另一种葡萄糖代谢紊乱的受试者。短语“葡萄糖代谢紊乱”可以包括特征为与受试者相对于健康个体的葡萄糖水平升高和/或胰岛素水平升高相关的临床症状或临床症状的组合的任何病症。葡萄糖和/或胰岛素水平升高可能表现于以下疾病，病症和病状中：高血糖、ii型糖尿病、妊娠糖尿病、i型糖尿病、胰岛素耐受、葡萄糖耐量受损、高胰岛素血症、糖代谢受损、前期糖尿病、其他代谢紊乱(如代谢综合征，也称为综合征x)、以及肥胖等。
[0203]
一般而言，术语“糖尿病”和“糖尿病的”是指碳水化合物代谢的进行性疾病，涉及胰岛素的生产或利用不足，常常以高血糖和糖尿症为特征。在本文中使用的术语“前期糖尿病”和“前期糖尿病的”可以是指其中受试者不具有通常在糖尿病中观察到的特性，症状等，但确实具有如果不治疗，可能会进展为糖尿病的特性，症状等的状态。这些病状的存在可以使用例如空腹血浆葡萄糖(fpg)测试或口服葡萄糖耐量测试(ogtt)确定。两者通常要求受试者在开始测试前至少8小时禁食。
[0204]
在fpg测试中，禁食结束后要测量受试者的血糖；通常，受试者禁食过夜，并且在受试者早晨进食前测量血糖。健康受试者通常具有约90至约100mg/dl的fpg浓度，具有“前期糖尿病”的受试者通常具有约100至约125mg/dl的fpg浓度，并且患有“糖尿病”的受试者通常基于高于约126mg/dl的fpg水平。
[0205]
在ogtt中，在禁食后以及饮用富含葡萄糖的饮料两小时后测量受试者的血糖。摄取富含葡萄糖的饮料两小时后，健康受试者通常具有低于约140mg/dl的血糖浓度，前期糖尿病受试者通常具有约140至约199mg/dl的血糖浓度，糖尿病受试者通常具有约200mg/dl或更高的血糖浓度。
[0206]
虽然上述血糖值与人类受试者相关，但是在鼠科受试者中，正常血糖，中度高血糖症和明显的高血糖在衡量不同。在4小时禁食之后，健康的鼠科受试者通常具有约100至约150mg/dl的fpg浓度，具有“前期糖尿病”的鼠受试者通常具有约175至约250mg/dl的fpg浓度而具有“糖尿病”的鼠受试者通常具有高于约250mg/dl的fpg浓度。
[0207]
在一些实施方式中，受试者是糖尿病患者。受试者可以患有1型或2型糖尿病。在一些实施方式中，受试者可以具有妊娠糖尿病或前期糖尿病。在一些实施方式中，受试者可以患有除糖尿病之外的葡萄糖代谢紊乱(例如，代谢综合征、葡萄糖代谢受损、高胰岛素血症等)。可以使用本领域已知的诊断方法，例如通过测定血浆葡萄糖和/或胰岛素水平确定使用本公开方法的合适的用于治疗的候选物。例如，合适的受试者可以包括具有高于约100mg/dl、高于约110mg/dl、高于约120mg/dl、高于约150mg/dl、或高于约200mg/dl的空腹血糖浓度(例如，8至10小时禁食之后)的人。合适的受试者还可以包括餐后血糖浓度大于约140mg/dl、大于约150mg/dl或大于约200mg/dl的人。葡萄糖浓度也可以以毫摩尔/升(mmol/
l)为单位表示，这可以通过将mg/dl除以18倍数而获得。
[0208]
v.制备微针阵列的方法
[0209]
在一些实施方式中，本公开的主题提供了制备用于糖尿病治疗剂(例如，胰岛素或其生物活性衍生物)的葡萄糖敏感性递送的微针阵列的方法。在一些实施方式中，方法可以包括：
[0210]
(a)制备本公开的主题的囊泡和/或纳米颗粒的水溶液；
[0211]
(b)将所述水溶液分散于包含多个微针空腔的模具中，从而提供填充的模具；
[0212]
(c)干燥填充的模具而除去水分；和
[0213]
(d)去除模具以提供微针阵列。
[0214]
在一些实施方式中，方法可以进一步包括在微针阵列中交联聚合物材料。例如，在一些实施方式中，在干燥之前可以将化学交联剂(例如，n,n
‑
亚甲基双丙烯酰胺)和/或光引发剂加入到模具中。在一些实施方式中，交联可以在去除模具后通过暴露于uv照射来进行。
[0215]
在一些实施方式中，在干燥之前可以将另外的聚合物加入到模具中。另外的聚合物可以与两亲性聚合物材料的亲水性聚合物相同或不同。在一些实施方式中，另外的聚合物是经改性的透明质酸，例如，亚烷基改性的和/或丙烯酸酯改性的透明质酸。
[0216]
在一些实施方式中，步骤(b)中的模具的填充可以在真空下进行和/或可以包括离心模具(例如，以有助于有效的和/或增加的微针空腔中囊泡的填充)。
[0217]
在一些实施方式中，模具可以在干燥器或真空干燥器中进行干燥。
[0218]
在一些实施方式中，模具可以包含聚合物，如硅酮(例如，聚二甲基硅氧烷(pdms))。模具可以包含约10、50、100、250、500、1000或更多个的微腔。微腔尖端之间的尖端到尖端的间隔可以为约100至约1000微米(例如，700、750、800、850、900、950或约1000微米)。
[0219]
在一些实施方式中，制备的微阵列可以进行包装，例如，用于储存或运输。例如，包装可以包括聚合物膜，如水分和/或气体不透过的聚合物膜。阵列可以单个包装，或以多阵列组包装。
[0220]
实施例
[0221]
包括以下实施例以向本领域普通技术人员提供用于实践本公开的主题的代表性实施方式的指导。鉴于本公开和本领域的一般技术水平，本领域技术人员可以理解的是，以下实施例仅旨在是示例性的，并且可以采用许多改变，修改和更改而不脱离本公开的主题的范围。
[0222]
通常，呈现的体外和体内结果是平均值
±
平均值的标准误差。使用学生t检验或anova检验进行统计学分析。对于p值<0.05，认为实验组与对照组之间的差异具有统计学显著性。
[0223]
实施例1
[0224]
缺氧敏感性透明质酸的代表性合成
[0225]
通过经由酰胺形成将ha与6
‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺化学结合而合成缺氧敏感性透明质酸(hs
‑
ha)。所有化学品均购自sigma
‑
aldrich(美国，密苏里州，圣路易斯)，除非另有说明，按原样使用。透明质酸钠(分子量300千道尔顿(kda))购自freda biochem co.，ltd。(中国，山东)。
[0226]
首先，合成6
‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺，用于与ha的羧酸反应。简言之，将硝基咪唑(ni，0.15g，1.3mmol)溶于dmf中，向其中加入k2co3(0.28g，2.0mmol)。然后，将6
‑
(叔丁氧基羰基氨基)己基溴(即6
‑
(boc
‑
氨基)己基溴，0.39g，1.4mmol)逐滴加入到溶液中并在80
°
0下搅拌4小时。通过过滤从反应混合物中除去固体杂质，并用甲醇洗涤。然后蒸发残余溶剂，得到固体产物，将其悬浮于去离子水(di)中，并用乙酸乙酯萃取。收集有机层，在硫酸钠上干燥，然后浓缩。将产物重新溶解于在冰上的甲醇中。将五(5)ml的1.25m hcl的甲醇溶液加入到溶液中并在室温(rt)下搅拌24小时，之后用旋转蒸发器除去溶剂而得到胺官能化的ni。接着，在n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二酰亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)的存在下，将6
‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺结合至ha。简言之，将0.24g ha(分子量：～300kda)溶解于水中，向其中加入edc(0.56g，3.4mmol)和nhs(0.39g，3.4mmol)，并在rt下搅拌15分钟。然后在rt下将6
‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺(0.18g，0.85mmol)加入混合物中24小时。将反应溶液对di水和甲醇的1:1混合物充分透析1天，并对去离子水透析2天。然后，通过冻干获得hs
‑
ha并通过1h nmr(varian gemini 2300；varian inc.，palo alto，california，united states of america)表征。
[0227]6‑
(2
‑
硝基咪唑)己胺：1h nmr(dmso
‑
d6，300mhz，δppm)：1.30
‑
1.78(m，8h，nh2ch2(ch2)4)，2.73(s，2h，nh2ch2)，4.38(s，2h，nch2)，7.19(s，1h)，7.87(s，1h)。
[0228]
hs
‑
ha：1h nmr(d2o，300mhz，δppm)：1.88
‑
2.40(m，8h，nh2ch2(ch2)4)，2.87
‑
3.19(m，4h，nh2ch2，nch2)，7.19(s，1h)，7.48(s，1h)。
[0229]
实施例2
[0230]
葡萄糖响应性囊泡(grv)的合成与表征
[0231]
通过在水溶液中的自组装制备grv。简言之，将20mg两亲性hs
‑
ha溶于水/甲醇(2/1，v/v)中，然后加入10mg人胰岛素和1.0mg gox。人重组胰岛素(锌(zn)盐，27.5国际单位/毫克(iu/mg))购自life technology(carlsbad，california，united states of america)。将乳液在4
°
。下搅拌2小时。然后通过对去离子水透析1天除去甲醇。将所得的grv溶液的ph值调节至5.3(胰岛素的等电点(pi))，以通过以8,000rpm下的离心10分钟除去未加载的胰岛素，并通过离心过滤器(100,000da分子量截止值，millipore，billerica，massachusetts，united states of america)在ph 7.4下进一步过滤。将最终的grv溶液储存于4
°
液下用于后续研究。通过使用coomassie plus蛋白分析(thermo fisher scientific inc.，waltham，massachusetts，united states of america)测量加载的胰岛素含量而测定grv的胰岛素负载容量(lc)。在zetasizer(nano zs，malvern instruments ltd.，malvern，united kingdom)上测量grv的ζ电位和尺寸分布。grv的透射电子显微镜(tem)图像在jeol 2000fx tem仪器(jeol usa，inc.，peabody，massachusetts，united states of america)上获得。
[0232]
因此，通过缺氧敏感性透明质酸的自组装，将重组人胰岛素和gox包封于核内而形成grv。参见图1a。如实施例1所述，通过在三个步骤中用胺官能化的ni形成酰胺键而获得hs
‑
ha。疏水性ni基团的引入赋予衍生的ha两亲性，使得可以在水溶液中形成grv。此外，ni提供了缺氧敏感性元件，其预期在缺氧条件下生物降解。参见nunn et al.,eur.j.nucl.med,22(3):265
‑
280(1995)；和takasawa et al.,stroke,39(5):1629
‑
1637(2008)。具有胺基团的还原产物是水溶性的，导致grv解体。参见图1a。
[0233]
grv具有单分散尺寸的球形形状。参见图2a，左侧tem图像。通过动态光散射(dls)测定grv的平均直径为118nm(参见图2b)，这与tem的观察一致。由于ha的残留羧基，grv的ζ电位测量为
‑
34.7
±
0.4mv。具有荧光素异硫氰酸酯(fitc)标记的胰岛素的grv的荧光图像进一步证实了胰岛素成功包封。参见图2d。grv的胰岛素负载容量测定为8.7％。如果不暴露于缺氧条件下，获得的grv是高度稳定的，在4
°
高下长达1个月没有观察到显著沉淀。
[0234]
实施例3
[0235]
grv的体外葡萄糖响应性胰岛素释放
[0236]
为了评估grv的葡萄糖响应能力，将grv在具有100μm nadph和5μg/ml细胞色素c还原酶的600μl pbs缓冲液(nacl，137mm；kcl，2.7mm；na2hpo4，10mm；kh2po4，2mm；ph 7.4)中温育。加入不同量的葡萄糖以提供0mg/dl、100mg/dl或400mg/dl的最终葡萄糖浓度的溶液。400mg/dl葡萄糖浓度溶液代表典型的高血糖葡萄糖水平，100mg/dl葡萄糖浓度溶液代表正常血糖葡萄糖水平，0mg/dl葡萄糖浓度溶液用作对照。通过用质量流量计调节，将混合物在37
°
7下温育于具有21％的氧浓度的容器中。在预定的时间，使用ph计(ab15，thermo fisher scientific inc.，waltham，massachusetts，united states of america)记录每种混合物的ph值，并随后将ph值调节至胰岛素的pi以通过8,000rpm下的离心10分钟分离释放的胰岛素。使用coomassie plus蛋白分析(thermo fisher scientific inc.，waltham，massachusetts，united states of america)检测包封于grv中的残留胰岛素的浓度。在200pro多模式孔板读数器(tecan group ltd.，zurich，switzerland)上在595nm下检测吸光度，并将胰岛素含量用胰岛素标准曲线校准。为了绘制grv溶液的uv
‑
vis吸收，在设定的时间在330nm下测量吸光度强度。为了评估不同ph条件下grv的胰岛素释放曲线，将grv在100μm nadph和5μg/ml细胞色素c还原酶存在下温育于ph 4.0或ph 7.4下的pbs缓冲液中。使用与上述相同的方法测量释放的胰岛素。使用cd光谱仪(aviv biomedical inc.，lakewood，new jersey，united states of america)分析天然胰岛素溶液和从grv释放的胰岛素的溶液(0.1mg/ml)的远uv圆二色(cd)光谱。
[0237]
使用氧敏感性磷光分子探针测量由gox催化的葡萄糖氧化所引起的氧消耗。参见will et al.,nat.protoc.,1(6):2563
‑
2572(2006)；和fercher et al.,acs nano,5(7):5499
‑
5508(2011)。暴露于高血糖溶液的样品与其他两种样品相比具有较低的氧浓度。参见图2f。其在10分钟内迅速达到平衡，表明氧气消耗速率与溶解速率达到平衡。在400mg/dl葡萄糖溶液中的grv溶液的记录的ph值随时间稳定下降，进一步证实了gox催化葡萄糖至葡萄糖酸的转化。
[0238]
在这种缺氧环境中，来自由还原酶催化的nadph的电子有效地还原了hs
‑
ha的硝基基团。根据grv的uv
‑
vis吸收光谱，在330nm处的ni的特征峰的降低和对应于2
‑
氨基咪唑的特征峰的280nm处新峰的产生也证实了在用400mg/dl葡萄糖溶液温育2小时后，通过在缺氧条件下的还原反应将ni的硝基基团转化为胺基基团。通过测量330nm处的uv
‑
vis吸光度，实时监测ni的残留浓度。随着时间的推移，用400mg/dl葡萄糖溶液温育的grv的相应强度逐渐降低(参见图2g)，表明在核中疏水性ni基团被胺基团取代。
[0239]
相反，与100mg/dl葡萄糖溶液相关的样品中观察到吸收强度的下降慢得多，而没有葡萄糖的对照样品中没有观察到降低。此外，通过tem成像和dls观察到grv构象和尺寸的相应演化。参见图2a和图2c。
[0240]
为了进一步验证胰岛素从解体的grv释放，将与fitc结合的胰岛素被封装于grv中。1小时后荧光信号在整个溶液中更均匀分布，而原始grv溶液显示出大量的成簇信号，表明fitc
‑
胰岛素随时间的释放。参见图2e。
[0241]
由于grv的解离，从400mg/dl葡萄糖溶液中温育的grv获得了快速的胰岛素释放曲线，而在具有0或100mg/dl葡萄糖的pbs溶液中温育的grv仅释放出少量胰岛素。参见图3a。为了验证胰岛素释放速度是否直接对应于由氧水平而不是降低的ph水平导致的ni基团的减少，研究了ph＝4.0的溶液中的胰岛素释放动力学。结果表明，在ph＝4.0溶液中温育的样品的胰岛素释放并不显著，证实了grv在酸性条件下是稳定的。此外，通过改变葡萄糖浓度观察到胰岛素的可变动力学释放曲线。参见图3b。当葡萄糖浓度从100mg/dl变化至400mg/dl时，达到最大6.6倍差异的胰岛素释放速率。相反，含有半量的gox的grv由于相对较慢的氧消耗速率而显示出较慢的释放速率，表明可以通过改变酶的包封剂量调节胰岛素的释放速率。此外，当交替暴露于正常和高血糖状态时，grv的胰岛素释放曲线呈现脉冲模式，每20分钟改变状态几个周期。参见图3c。与现有的合成闭环系统相比，grv对葡萄糖浓度变化反应迅速。参见mo et al.,chsrv,43(10):3595
‑
3629(2014)；and veiseh et al.,nature reviews drug discovery,14(1):45
‑
57(2015)。例如，在与以前报道的ph敏感性触发的葡萄糖响应性纳米颗粒(参见gu et al.,acs nano；7(5):4194
‑
4201(2013))相比时，采用相同量的酶，缺氧敏感性grv显示出对高血糖水平显著更快的响应速率。不受任何一种理论的束缚，据信本公开的grv的更快的响应速度可以归因于由局部缺氧微环境触发相比通过局部酸性环境触发的制剂解离的“结构转变点”的更快速实现。总之，结果表明，grv的解体和胰岛素的释放是葡萄糖介导的缺氧依赖性过程。另外，如圆二色(cd)光谱所示，由grv(0.1mg/ml)释放的胰岛素的二级构象结构保持了天然胰岛素的二级构象结构。参见图3d。
[0242]
实施例4
[0243]
grv加载的微针(mn)阵列贴片的制造与表征
[0244]
为了实现方便的给予，制备了含有grv的微针(mn)阵列贴片。微针阵列贴片可以是无痛的和一次性的。
[0245]
简而言之，首先通过离心将grv加载到用于mn的硅酮模具的尖端中，然后逐滴添加含有交联剂n,n'
‑
亚甲基双丙烯酰胺(mba)和光引发剂的丙烯酸酯改性的ha(m
‑
ha)溶液。参见图4a。在uv照射下，基于ha的针基质光交联，这可以有助于增强mn的刚度并避免grv由针不期望的损失。获得的mn具有圆锥形状，并且针排列为具有6
×
6mm的面积的10
×
10阵列(参见图4b)，随后用医用胶带将其固定。每根针具有150μm的基部半径，600μm的高度，和约10μm的尖端半径。参见图4c。图4d显示了含有fitc
‑
胰岛素加载的grv的代表性mn的荧光图像，表明grv均匀分布于内部。此外，通过使用拉伸压缩机测量机械强度，交联的mn的失效力测定为0.06n/针，而未交联的mn的失效力仅为0.02n/针。参见图4e。因此，看起来mn的刚度随着交联而改进，这可以提供足够的强度而有助于插入皮肤而不断裂。
[0246]
为了研究在mn制造之后mn中包封的grv是否保持葡萄糖响应能力，将含有grv的针尖端重新溶解到pbs缓冲液中，并用不同的葡萄糖浓度溶液处理。与原始grv的胰岛素释放曲线相比，释放曲线的差异可以忽略不计。
[0247]
实施例5
[0248]
用于1型糖尿病治疗的微针的体内研究
[0249]
为了评估mn阵列贴片用于糖尿病治疗的体内功效，将链脲霉素(stz)诱导的1型糖尿病小鼠(雄性c57b6，jackson lab，bar harbor，maine，united states of america)分组(每组5只小鼠)并在背部经皮给予不同的贴片样品(参见图5a，左上)，包括：仅含有m
‑
ha的空白mn贴片；加载有人重组胰岛素的mn贴片；加载有含胰岛素和酶的grv(grv(e+i))的mn贴片；加载有含胰岛素和半剂量的酶的grv(grv(1/2e+i))的mn贴片和加载有仅含胰岛素(的grvgrv(i))的mn贴片。每只小鼠施加的胰岛素剂量为10mg/kg。使用clarity gl2plus血糖仪(clarity diagnostics，boca raton，florida，united states of america)从尾静脉样品(约3微升)测量血浆当量葡萄糖。在给予前监测小鼠葡萄糖水平两天，并在给予不同的贴片之前将所有小鼠禁食过夜。(在5、15、30、60分钟时和之后每小时一次)监测每只小鼠的葡萄糖水平，直到恢复到稳定的高血糖。
[0250]
为了测量体内血浆胰岛素浓度，在指定的时间点从小鼠的尾静脉抽取25微升血液样品。分离血清并保存于
‑
20
°
2直至分析。根据制造商的方案，使用人胰岛素elisa试剂盒(calbiotech，spring valley，california，united states of america)测定血浆胰岛素浓度。
[0251]
本公开的mn阵列贴片可以有效地穿透小鼠的背部皮肤，如由台盼蓝染色(参见图5a，右上)以及苏木精和伊红(h&e)染色证明。参见图5a，底部。随时间监测每组治疗的小鼠的血糖。用grv(e+i)加载的mn贴片治疗的小鼠的血糖在0.5小时内快速下降到接近200mg/dl，并逐渐维持于正常血糖状态(<200mg/dl)长达4小时，之后逐渐升高。参见图5b。不受任何一种理论的束缚，这种快速响应速率看上去是由于快速产生快速激活grv解离的局部缺氧微环境而引起的；而与氢离子相比，氧在体内相对低的扩散速率可以进一步促进该过程。当每只小鼠的mn中的酶剂量减少(从1mg/kg降至0.5mg/kg)时，用grv(1/2e+i)加载的mn贴片治疗的小鼠的血糖在0.5小时内降至约350mg/dl，随后稳定升高。在不存在酶的情况下，给予grv(i)加载的mn贴片的小鼠的葡萄糖没有显示出明显下降，表明grv在体内是稳定的。因此，与给予grv(1/2e+i)或grv(i)加载的mn贴片的那些相比，给予grv(e+i)加载的mn贴片的小鼠呈现持续更高的血浆胰岛素浓度长达至少24小时，如通过酶联免疫吸附分析(elisa)定量的。参见图5c。插入到皮肤中的grv(e+i)加载的mn贴片的sem图像显示出治疗后瓦解的尖端(参见图5d)，进一步表明加载的grv解体并溶解至皮下组织中。
[0252]
进行葡萄糖耐量测试而确认在给予grv(e+i)加载的mn贴片和胰岛素加载的mn贴片后1小时mn的体内葡萄糖响应性。简言之，将小鼠禁食过夜，并对每只小鼠给予各自具有10mg/kg的胰岛素剂量的grv(e+i)加载的mn贴片或胰岛素加载的mn贴片，并随后对所有小鼠以1.5g/kg的剂量腹膜内注射pbs中的葡萄糖溶液。在注射后在5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、120分钟时监测葡萄糖水平。将健康小鼠的葡萄糖耐量测试用作对照。类似地，用于评估低血糖的健康小鼠给予胰岛素加载的mn贴片，grv(i)加载的mn贴片或grv(e+i)加载的mn贴片，但不经受葡萄糖挑战。
[0253]
在给予mn贴片后1小时之时进行的葡萄糖耐量测试中，对照的健康小鼠在腹膜内注射葡萄糖后表现出血糖的快速增加，随后逐渐降低至正常血糖。参见图5e。用grv(e+i)加载的mn贴片治疗的糖尿病小鼠在葡萄糖注射后显示出延迟的血糖增加，然后在30分钟内迅速下降至正常状态。然而，给予胰岛素加载的mn贴片的小鼠的葡萄糖在120分钟内没有下降。在0至120分钟计算曲线下的面积以测量mn响应性。如图5f所示，grv(e+i)加载的mn贴片
对葡萄糖挑战具有显著快速的响应。
[0254]
为了进一步评估mn的体内葡萄糖控制能力，进行了mn贴片的系列给予。用第一grv(e+i)加载的mn贴片(每只小鼠的胰岛素剂量：5mg/kg)治疗的小鼠的葡萄糖水平在1小时内迅速降低至约200mg/dl。参见图5g。然而，在施加另一种(即第二种)grv(e+i)加载的mn贴片(每只小鼠的胰岛素剂量：5mg/kg)时，葡萄糖没有进一步降低至低血糖水平，并且葡萄糖浓度维持于约200mg/dl长达另外3小时。相反，给予第二grv(i)加载的mn贴片(每只小鼠的胰岛素剂量：5mg/kg)或没有接受另外的贴片的小鼠在3小时内显示出葡萄糖快速增加至高血糖状态。随后给另一组小鼠给予胰岛素加载的mn贴片，而其血糖继续下降，导致潜在的低血糖风险。关于健康小鼠的研究进一步表明，载有grv的mn贴片中胰岛素几乎没有泄漏，并且与载有胰岛素的mn相比，降低了低血糖风险。参见图5h。计算相应的低血糖指数(定义为从初始读数到最低点的葡萄糖下降值除以达到此下降的时间)，以定量测定胰岛素引起低血糖的程度。与正常血糖状态下给予载有胰岛素的mn相比，载有grv的mn显示出降低的降血糖指数。参见图5i。此外，在整个人体中发现了ha，而裸grv在所研究的各种浓度下都没有显示出显著的毒性。
[0255]
实施例6
[0256]
实施例1
‑
5的讨论
[0257]
目前的基于gox的葡萄糖响应性胰岛素递送系统主要利用由ph敏感性材料组成的基质，其通过由于酶促产生的葡萄糖酸而质子化或降解来释放胰岛素。然而，它们的效能可能由于对血糖变化的反应缓慢，特别是在缓冲的生理环境下而受到限制。本公开的grv据信是基于缺氧敏感性制剂而非ph敏感性制剂的葡萄糖响应性胰岛素递送策略的第一次展示。由于氧的酶促消耗，在pbs缓冲溶液中迅速产生局部缺氧微环境，这由氧敏感性磷光探针所证明。随后，hs
‑
ha的疏水侧链还原成亲水链，导致grv的解体，随后增加胰岛素的释放速率。在具有400mg/dl葡萄糖的pbs缓冲液中温育20分钟后通过tem观察到grv的形态变化，表明grv解体。grv的体外胰岛素释放曲线表明比以前报道的基于ph敏感性的葡萄糖响应性纳米颗粒更快的释放速率。此外，胰岛素释放动力学可以通过在体外和体内改变酶剂量而调节，进一步表明胰岛素从grv的释放经历了葡萄糖介导的缺氧依赖性过程。
[0258]
grv整合到基于ha的mn阵列贴片中，用于方便、无痛且持续地给予胰岛素递送。交联的ha基质不仅有助于改善机械强度和皮肤穿透能力，而且看上去也防止grv中胰岛素的损失而避免爆发性释放。另外，针贴片和囊泡的框架均由高生物相容性的ha制成。
[0259]
grv(e+i)加载的mn在正常范围内表现出优异的葡萄糖调节，具有更快的响应速度。此外，除了高度敏感性囊泡外，通过经皮给予的淋巴管的快速吸收也可以有助于快速的优点。体内葡萄糖耐量测试证实，grv加载的mn对葡萄糖挑战更具响应性，并可以有效避免低血糖的潜在风险。此外，采用mn的连续给予的结果表明，它们可以在更长的时间内将葡萄糖精确控制于正常范围内。考虑到这些实施例中使用的人胰岛素在小鼠中相对不敏感性，潜在的人类使用的实际剂量可能会显著降低。据信，本公开的“智能胰岛素贴片”提供了以快速葡萄糖响应、无痛、安全的方式闭环递送胰岛素的临床机会。
[0260]
应当理解的是，在不脱离本公开主题的范围的情况下，可以改变本公开的主题的各种细节。此外，前述描述仅仅是为了举例说明的目的，而不是为了限制的目的。