技术特征：
1.一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法其特征在于具体步骤如下：(1)脱细胞脂肪的制备：a.取新鲜来源的脂肪在
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80℃至37℃的条件环境下冷冻复融3～5次，每次1～2h，然后取冻融后的脂肪剪碎或采用均质、离心处理后保留脂肪层；b.将步骤a中至直接剪碎的脂肪或收集的脂肪层置于trypsin
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edta消化液中振荡消化16h～24h后，然后用pbs缓冲液洗涤3～5次，每次30～60min，然后置于异丙醇中振荡浸泡处理48h～72h，每24h换液一次，并用pbs缓冲液洗涤后再次用体积浓度为1％～3％的triton x
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100去污剂振荡消化1h～2h，pbs缓冲液洗涤3～5次后，再次在trypsin
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edta消化液中振荡消化4h～6h。c.将步骤b中振荡消化后的脂肪采用pbs缓冲液洗涤，并使用benzonase浓度大于≥100u/ml的pbs溶液振荡处理16h～24h，再次使用异丙醇振荡浸泡处理8h～12h后，采用pbs缓冲液洗涤，最后使用乙醇消毒液浸泡3～5次得到灭菌后的脱细胞脂肪，每次浸泡时间为30min～60min；(2)肝素化脱细胞脂肪的制备：a.在浓度为0.1mol/l的mes缓冲液中加入1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、n
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羟基琥珀酰亚胺和肝素钠配制成mes缓冲液混合溶液，并在室温下反应孵育15min～30min；其mes缓冲液混合溶液中，1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
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羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为3:5，肝素钠的质量分数为0.5％～1.5％；b.取步骤(1)中制备的脱细胞脂肪按照质量百分比1％～2％加入步骤a中反应后的mes缓冲液混合溶液中，并在温度为25℃～37℃、振荡频率为60rpm～120rpm的条件下振荡反应16h～24h得到肝素化脱细胞脂肪；将反应后得到肝素化脱细胞脂肪使用na2hpo4溶液洗涤30min～60min后，再使用nacl溶液洗涤3～5次，每次30min～60min，最后用无菌pbs缓冲液洗涤3～5次，每次10min～30min，并将洗涤后的肝素化脱细胞脂肪保存于无菌离心管中；(3)负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪的制备：取步骤(2)中制备的肝素化脱细胞脂肪切碎直至形成均匀的凝胶状匀浆，按照每ml无菌bfgf溶液加入2000mg肝素化脱细胞脂肪的比例浸泡于浓度为1μg/ml～5μg/ml的无菌bfgf溶液中，并在4℃条件下孵育16h～24h；然后，取出反应后的肝素化脱细胞脂肪，并用无菌pbs溶液清洗3～5次，每次3～5min，洗脱未交联的bfgf后即得到负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料，并将其置于4℃无菌保存。2.根据权利要求1所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的a步骤中所述的新鲜脂肪为鼠来源、兔来源、人来源或其他动物来源；将新鲜脂肪冻融后直接切碎成0.5x0.5cm的小块；或者将新鲜脂肪冻融后加入等体积的去离子水，采用均质器在转速12000～15000rpm的转速下均质5～10min；并将均质处理后的组织悬浮液在离心转速为1500～3000rpm的条件下离心5～10min，去除最上层黄色油脂及最下层水分，保留中间的脂肪层。3.根据权利要求1所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的b步骤中的trypsin
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edta消化液的质量浓度为0.05％～0.25％。4.根据权利要求1所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的c步骤中的乙醇消毒液为体积浓度75％的乙醇或含有过氧乙酸的乙醇水溶液，其中，含有过氧乙酸的乙醇水溶液中过氧乙酸的体积百分比为0.1％，乙醇的体积
百分比为4％。5.根据权利要求1所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的异丙醇的质量浓度为99.9％；所述步骤(1)中的去离子水和pbs缓冲液中均按照质量体积比加入100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b；所述步骤(1)得到的脱细胞脂肪储存在无菌pbs缓冲液中。6.根据权利要求1所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的b步骤中na2hpo4溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，所述nacl溶液的摩尔浓度为1～4mol/l。7.根据权利要求1所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的含edc/nhs的mes缓冲液、na2hpo4溶液、nacl溶液在配置后均用0.22μm除菌过滤器过滤后并保存于无菌容器中。8.一种权利要求1至6中任意一项方法制备的负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的的应用，其特征在于：将所述负载bfgf的脱细胞脂肪材料作为脂肪填充物用于脂肪组织的再生或重建。9.根据权利要求8所述的一种负载bfgf的肝素化脱细胞脂肪材料的的应用，其特征在于：将所述负载bfgf的脱细胞脂肪材料在24h内注射至由高分子聚合物制备的3d打印支架中，并连同3d打印支架一起作为脂肪填充物用于脂肪组织的再生或重建。10.根据权利要求9所述的一种bfgf的肝素化dat材料的制备方法，其特征在于：所述3d打印支架材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚
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β
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羟基丁酸、透明质酸等中任意一种或多种高分子聚合物制成。
技术总结
本发明提供了一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法及应用。所述负载bFGF的肝素化DAT是由新鲜来源的脂肪在
技术研发人员：张郭 汪振星 孙家明 慈海 周牧冉 陈佳龙 刘绍恺 陈雳风 赵阳 罗超 曾宇阳 方慧敏 侯金飞 谢昕芳 孙谛 刘剑 王冰倩 倪若飘 王斌 李志鹏 姜文彬 揭君津 周莹芊 郭亚琪 锁丽涛
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属协和医院
技术研发日：2021.06.28
技术公布日：2021/11/14