CX-5461在制备PHF6突变的急性髓系白血病的药物中的应用

cx
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5461在制备phf6突变的急性髓系白血病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及cx
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5461在制备phf6突变的急性髓系白血病 的药物中的应用。


背景技术：

2.phf6(plant homeodomain finger protein 6)位于x染色体上，被鉴定为负责遗传性神经 发育障碍、精神发育迟滞的遗传基因。其中phf6的突变是引起bfls疾病的原因。目前为 止，phf6的突变不仅表现在遗传疾病方面，也表现在许多癌症上，包括t细胞急性淋巴白 血病，急性髓系白血病，慢性髓系白血病，混合型急性白血病、肝癌等。与bfls患者中绝 大多数存在的错义突变不同，肿瘤性phf6突变由缺失，插入，移码，无义或错义突变组成。
3.phf6已被证明能在体外结合双链dna，并能与几个已知的转录调节因子相互作用，如 上游结合因子1(ubf1)和rna聚合酶ⅱ相关因子。此外，phf6被发现是一种染色质调节 蛋白，在调节神经发生、造血、淋巴细胞谱系转变的发育过程以及白血病发生中发挥重要作 用。在b细胞白血病中，phf6的缺失不仅导致了b细胞和t细胞特异性转录起始位点染色 质的显著改变，也导致了体内的b细胞向混合谱系淋巴癌的淋巴细胞谱系转变。这些结果说 明phf6具有修饰组蛋白和调控染色质的潜在能力，其作用类似于在典型phd区域内发现的 蛋白质。最近的研究证明，phf6能与核小体重塑和去乙酰化酶复合物发生物理作用，由于该 复合物既是一种染色质重塑复合物，也是一种转录调节因子，因此可以靶向到一些影响胚胎 发生、神经发生、造血和肿瘤的基因上。有研究发现，phf6主要定位于核仁的纤颤中心(fc) 和致密纤颤成分(dfc)边界，表明其在核糖体rna转录过程的早期调控中发挥关键的作用。
4.phf6可以作为组蛋白表观遗传修饰的解读器，与核仁中的h3k9me3和h3k27me1抑 制组蛋白标记结合。组蛋白甲基转移酶suv39h1通过免疫沉淀(ip)质谱、共聚焦显微镜和序 贯染色质免疫沉淀(chip)分析进一步鉴定为一种能与phf6相互作用的核蛋白。
5.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,aml)是一种高度异质性的血液系统恶性肿瘤， 表现为大量未成熟的髓系血细胞前体细胞大量增殖、浸润或扩散到其它组织。在我国，aml 的年发病率为1.62/10万，占成人急性白血病的60％～70％，是最常见的急性白血病。虽然联 合化疗、造血干细胞移植和小分子靶向药物在一定程度上改善了aml患者的生活质量，提 高了aml的治愈率，但aml极易复发，且一旦复发便对化疗药物丧失敏感性，五年生存率 仅为26％。此外，由于aml异质性强，呈多种基因突变和染色体异常，导致患者对化疗药 物敏感性差异大，生存期差异显著。因此，亟待探索新的抗aml靶向药物。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了cx
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5461在制备phf6突变的急性髓系白 血病的药物中的应用，经研究证实cx
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5461可用于phf6突变的急性髓系白血病的精准
治疗 或联合治疗，是一种很好的抗aml靶向药物。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
8.本发明提供一方面提供cx
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5461在制备精准治疗或联合治疗phf6突变型急性髓系白血 病的药物中的应用。
9.本发明经研究发现，cx
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5461有效抑制了phf6敲除的hela细胞和u937细胞的增殖， 并伴有rrna转录水平下降，phf6敲除的u937细胞对cx
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5461没有表现出明显的耐药性， 从而cx
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5461可用于phf6突变的aml的精准治疗或联合治疗。
10.优选地，所述phf6突变为phf6缺失。
11.优选地，所述精准治疗或联合治疗为抑制phf6突变型急性髓系白血病细胞的增殖。
12.本发明提供另一方面提供一种用于精准治疗phf6突变型急性髓系白血病的药物，所述 药物以cx
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5461作为主要活性成分。
13.优选地，还包括其他与cx
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5461起协同疗效的白血病药物。
14.优选地，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。即该药物可与药学上可接受的载体或 赋形剂混合制备成组合物。
15.上述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂 等以及一些药用基质。上述载体是药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、 助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(pla)、聚乙醇 酸聚乳酸共聚物(plga)、透明质酸等。
16.优选地，所述药物的剂型包括但不限于口服液、冲剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、 膏剂和注射剂。此外，该药物还可制备成临床上可接受的其他剂型。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.cx
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5461是一种靶向rna聚合酶ⅰ并特异性抑制rdna转录的小分子药物。本发明经研 究发现，cx5461可有效抑制phf6敲除的hela和u937细胞的增殖，与阿糖胞苷相比phf6 敲除的u937 aml细胞对cx5461没有表现出显著的耐药性，表明cx
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5461与阿糖胞苷相比 用于治疗phf6突变的aml可能是一个更好的选择，可用于phf6突变的急性髓系白血病的 精准治疗或联合治疗，是一种很好的抗aml靶向药物。
附图说明
19.图1为感染了慢病毒的hela细胞集落的结晶紫染色图；
20.图2为掺入furd后新生rrna的共聚焦显微镜图；
21.图3(a)为使用cck
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8测定法检测u937细胞的增殖情况；图3(b)为不同细胞(shnc、 shphf6、shsuv39h1、over
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phf6、over
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suv39h1、over
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pphf6+shsuv39h1、 over
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suv39h1+shphf6)的47s pre
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rrna的qpcr分析(*p<0.5；***p<0.001)；
22.图4为过表达phf6和suv39h1的hela细胞的异种移植肿瘤的生长情况(a为肿瘤组 织的实体图；b为肿瘤重量统计图；c为肿瘤体积统计图；*p<0.5；***p<0.001)；
23.图5为过表达phf6和suv39h1的u937细胞的异种移植肿瘤的生长情况(a为肿瘤组 织的实体图；b为肿瘤重量统计图；c为肿瘤体积统计图；**p<0.01；***p<0.001)；
24.图6a为u937异种移植组织的h&e和ki67染色(比例尺为100μm)；图6b为u937 异种
移植组织47s pre
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rrna的qpcr分析；图6c为来自aml患者的bmncs 47s pre
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rrna 的qpcr分析(*p<0.5；**p<0.01；***p<0.001)；
25.图7a为经cx5461处理后的hela细胞集落的结晶紫染色图；图7b为经不同浓度的 cx5461处理(0、25、50、75、100和500nm)后phf6沉默(shphf6)或未沉默(shnc)的hela 细胞的pre
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rrna的qpcr分析(***p<0.001)；
26.图8a为经不同浓度cx5461(0、16、32、64、128和256nm)处理后的phf6沉默(shphf6) 和非phf6沉默的(shnc)u937 aml细胞的细胞存活率；图8b为经不同浓度cx5461处理 后的phf6沉默(shphf6)和非phf6沉默的(shnc)u937 aml细胞的47s pre
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rrna的qpcr 分析；图8c为经不同浓度阿糖胞苷(0、16、32、64、128、256nm)处理后的phf6沉默(shphf6) 和非phf6沉默的(shnc)u937 aml细胞的细胞存活率(**p<0.01；***p<0.001)；
27.图9为经盐水、cx5461(1mg/kg)和阿糖胞苷(1mg/kg)处理后的phf6沉默的u937 aml 细胞的异种移植瘤生长情况(a为肿瘤组织的实体图；b为肿瘤重量统计图；c为肿瘤体积 统计图；**p<0.01；***p<0.001)；
28.图10的左图为经盐水、cx5461(1mg/kg)和阿糖胞苷(1mg/kg)处理后的phf6沉默 的u937 aml细胞的47s pre
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rrna的qpcr分析；右图为经盐水、cx5461(1mg/kg)和阿 糖胞苷(1mg/kg)处理后的phf6沉默的u937 aml细胞的h&e染色以及肿瘤组织的ki67 表达情况(比例尺为100μm；**p<0.01)。
具体实施方式
29.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的 说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实 施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材 料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
31.实施例1cx
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5461对phf6敲除的人髓系白血病u937细胞增殖的影响
32.1、实验方法
33.(1)细胞培养：培养人宫颈癌细胞系hela细胞、人胚肾细胞系hek 293和人胚肾细胞 系hek 293t(均购自中国科学院细胞库)的培养基为含有10％胎牛血清的dmem培养基， 培养基中还需加入100u/m l青霉素、100mg/m l链霉素，置于含有5％co2的37℃细胞培 养箱中培养；培养人外周血白血病细胞系jurkat细胞(购自中国科学院细胞库)的培养基为 含有10％胎牛血清的1640培养基，培养基中还需加入100u/m l青霉素、100mg/ml链霉素， 置于含有5％co2的37℃细胞培养箱中培养。
34.(2)质粒的制备：为了获得用于人phf6的质粒，从hek293t使用trizol法提取rna， 具体操作为：向细胞中加入trizol，将细胞的trizol裂解液转入ep管中，在15～30℃的室温 下放置5分钟；然后按照每1ml trizol加0.2ml氯仿的量往ep管中加入氯仿(即为1/5 体积)，盖上ep管盖子，在手中用力震荡15秒(10次)，在15℃～30℃的室温下放置2～ 3分钟后，14000rpm(4℃)离心15分钟，上层水相置于新ep管中(～500ul，用200ul的 黄色枪头小心吸取，约吸取3次，杜绝取到中间层/下层)，并按照每1ml trizol加0.5ml异 丙醇的量加入异丙醇(即为1/2体积)，4℃下静置20分钟,，沉淀rna，14000rpm(4℃) 离心15分钟。
35.接着按照每1ml trizol加1ml75％乙醇的量进行洗涤，14000rpm(4℃)离心20分钟， 弃上清；让沉淀的rna在室温下自然干燥；用45ul rnase
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free water溶解rna沉淀，即可 得到rna。
36.以rna为模板，利用北京全式金公司的逆转录试剂盒(目录号：ae341)进行逆转录得 到cdna模板，并利用引物flag
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phf6
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f和flag
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phf6
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r从cdna上扩增出野生phf6基因， 然后通过bamhi和ecori对扩增出的野生phf6基因和flag
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cmv2载体(购自擎科生物) 实行双酶切后进行连接，制备得到flag
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phf6质粒。
37.以flag
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phf6为模板，扩增得到截短的基因，然后通过bamhi和ecori对扩增出的截断 基因和flag
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cmv2载体实行双酶切后进行连接，制备得到质粒flag
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phf6
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r274x和 flag
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phf6
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r116x。
38.以上述得到的cdna作为模板，利用引物v5
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suv39h1
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f和v5
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suv39h1
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r从cdna 上扩增出野生型的suv39h1基因，该基因一直可以调节phf6的表达。利用bamhi和ecori 对野生型的suv39h1基因和pcdna3.1/v5
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his的载体(购自擎科生物)实行双酶切处理后 进行连接，制备得到v5
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suv39h1的质粒。
39.以v5
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suv39h1的质粒为模板，利用引物v5
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suv39h1(r235h)
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f和v5
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suv39h1 (r235h)
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r进行全质粒pcr的操作，制备得到v5
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suv39h1(r235h)的质粒。
40.表1实验中所用的克隆引物的序列详情表
[0041][0042]
根据phf6的sirna干扰序列，分别设计合成了针对人的phf6、suv39h1的shphf6、 shsuv39h1引物，shrna的引物序列详见表2。
[0043]
设计合成的引物需要在pcr仪中95℃加热处理5min，之后置于室温中使其缓慢退火， 获得的产物连接到经过hindiii、bamhi两种限制性内切酶进行双酶切处理的 psilencer2.1
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u6
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hygro(ambion，usa)质粒中，挑选克隆进行测序。根据测序结果从中挑 选测序正确的质粒，利用ecori和hindiii两种酶进行双酶切，获得重组质粒的rnai序列后， 接着连接到处理成线性的慢病毒载体fg12载体(购自擎科基因)中。挑选克隆进行测序，分别 获得针对人的phf6和suv39h1的慢病毒包装质粒。
[0044]
表2用于包装病毒的shrna序列
[0045][0046][0047]
(3)慢病毒的制作和感染：利用人胚肾细胞系hek 293t细胞进行慢病毒的包装实验。 将293t细胞在10cm细胞培养皿中培养，当293t细胞的生长密度达到80％时开始进行转染 病毒包装质粒的实验。在转染前1h换新鲜的含有10％胎牛血清的dmem培养基，在换培养 基时需要轻柔，因为293t细胞贴壁能力不是很好。
[0048]
然后利用磷酸钙的方法进行慢病毒质粒的转染：首先往每个培养皿中加入包装病毒和目 标质粒(两个包装病毒fg12分别为5μg，目标质粒10μg)，转染12h后将细胞上清液收 集置于4℃中存放，并在细胞中再加入含30％胎牛血清的dmem培养基继续培养24h，之后 再次收集细胞上清液，并且与第一次收集的上清液混合，分装到细胞冻存管中置于
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80℃中保 存备用。
[0049]
将收集到的病毒液加入目标细胞中，感染24小时而后更换培养基，即可得到suv39h1 和phf6敲低或过表达的细胞系。
[0050]
(4)实时rt
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pcr分析：使用trizol法从hek293，hela和jurkat中提取rna，具体 操作为：向细胞中加入trizol，将细胞的trizol裂解液转入ep管中，在15～30℃的室温下放 置5分钟；然后按照每1ml trizol加0.2ml氯仿的量往ep管中加入氯仿(即为1/5体积)， 盖上ep管盖子，在手中用力震荡15秒(10次)，并在15～30℃的室温下放置2～3分钟， 接着14000rpm(4℃)离心15分钟，将得到的上层水相置于新ep管中(～500ul，用200ul 的黄色枪头小心吸取，约吸取3次，杜绝取到中间层/下层)，按照每1ml trizol加0.5ml异 丙醇的量加入异丙醇(即为1/2体积)，4℃下静置20分钟，沉淀rna，14000rpm(4℃) 离心15分钟。按照每1ml trizol加1ml75％乙醇的量进行洗涤，14000rpm(4℃)离心20 分钟，弃上清；让沉淀的rna在室温下自然干燥，用45ul rnase
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free water溶解rna沉淀， 即可得到rna。
[0051]
以rna为模板，利用北京全式金公司的逆转录试剂盒(目录号：ae341)进行逆转录得 到cdna模板，并利用该cdna为模板，使用qpcr试剂盒(北京全式金，目录号：aq601) 按说明书进行定量pcr分析。
[0052]
利用六孔板进行平板细胞克隆实验。首先将不同分组的hela细胞进行消化操作，注意消 化的时间需要控制好，要确保细胞消化成为单个细胞，之后进行细胞计数，每组取10,000个 加入六孔板中，在超净台中摇匀，确保细胞均匀分散在培养基中，放入培养箱中培养(培养 条件:37℃，5％co2)。然后分析cx
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5461对细胞克隆的影响，同样按照上述实验
落数量反应hela细胞增殖情况。
[0064]
图8将phf6沉默的u937细胞加以不同浓度的cx5461，根据细胞集落数量反应u937 细胞增殖情况。
[0065]
由图9可以看出，相比阿糖胞苷，cx5461可以更明显抑制肿瘤的生长。
[0066]
由图10可以看出，相比阿糖胞苷，cx5461可以更明显抑制肿瘤47s pre
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rrna的表达， 更明显抑制肿瘤的生长。
[0067]
综上所述可见，cx
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5461有效抑制了phf6敲除的hela细胞和u937细胞的增殖，并伴 有rrna转录水平下降，phf6敲除的u937细胞对cx
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5461没有表现出明显的耐药性，从而 cx
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5461可用于phf6突变的aml的精准治疗或联合治疗。
[0068]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领 域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、 修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。