一种重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体注射液的制作方法

一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液
技术领域
1.本发明属于药物制剂的技术领域，具体涉及一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤是第二常见的血液系统恶性肿瘤，其骨髓中单克隆浆细胞不受控制的增殖，导致了单克隆免疫球蛋白和免疫抑制的过量产生，以及骨溶解和终末器官损伤。目前有两个单克隆抗体已批注临床使用，在过去十年，多发性骨髓瘤治疗方案已经显著提高了患者的存活率。尽管如此，现有的治疗方案仍未满足目前的治疗需求，特别是对于当前疗法具有抗性的复发/难治性患者。
3.b细胞成熟抗原(bcma)是一种高度浆细胞特异性抗原，在调节b细胞成熟和分化为浆细胞方面通过参与增殖诱导配体(april)发挥重要作用。bcma表达限于b细胞谱系并且主要存在于浆细胞和浆母细胞上，并且在一定程度上存在于记忆b细胞上，但在外周和幼稚b细胞上实质上不存在，也未见在其他正常组织细胞中表达。bcma也在多发性骨髓瘤细胞上表达并参与白血病和淋巴瘤。连同其家族成员taci(跨膜活化剂和亲环素受体配体相互作用物)和baff-r(b细胞活化因子受体)，bcma调节体液免疫、b细胞发育和体内稳态的不同方面。bcma的表达出现在b-细胞分化作用的较后期并有利于浆母细胞和浆细胞在骨髓中的长期存活。小鼠中bcma基因的靶向缺失导致骨髓中长寿浆细胞的数量显著减少，指示bcma对其存活具有重要性。bcma过表达或通过多发性骨髓瘤细胞中的bcma刺激april可以直接上调关键免疫检查点分子，这可能有助于免疫抑制骨髓微环境。
4.在细胞免疫过程中，t淋巴细胞扮演着重要的角色。t细胞所介导的细胞免疫主要是通过t细胞受体(t cell receptor，tcr)特异识别细胞表面由主要组织相容性复合物(mhc)所递呈的抗原肽，进而激活t细胞内信号，对该靶细胞进行特异杀伤。这对及时清除体内病变的细胞及预防肿瘤的发生起着至关重要的作用。由于多数癌细胞表面的mhc的表达下调甚至缺失，使得肿瘤细胞能够逃逸免疫杀伤，从而发生肿瘤。
5.t细胞结合双特异性抗体(t cell-engaging bispecific antibodies，tcbs)代表了一种非常有效的将激活的细胞毒性t细胞重定向到肿瘤的方式。cd3作为t细胞受体的一部分，表达于成熟t细胞，能够转导tcr识别抗原所产生的活化信号。tcbs能够同时结合表面肿瘤抗原和t细胞受体的cd3ε亚基，在t细胞和肿瘤细胞之间提供一个物理连接，从而有效的激活静止的t细胞杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的效果(smits n c,sentman c l,journal of clinical oncology,2016:jco649970.)。因为t细胞双特异性旁路tcr抗原识别和t细胞活化的共刺激要求，它们消除了对肿瘤特异性免疫的需要，并克服了肿瘤微环境中t细胞面临的许多障碍。
6.近年来，为了解决将两个不同的半抗体进行正确装配问题，科学家们设计开发了多种结构的双特异性抗体。总体归结起来有两大类，一类双特异性抗体不含fc区，包括bite、dart、trandabs、bi-nanobody等。这类结构双抗优点是分子量小，可以在原核细胞中
表达，不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体fc段，分子量较低，导致其半衰期较短，且这种形式的双抗极易聚合、稳定性差且表达量低，因而临床应用受到一定限制。另一类双特异性抗体保留fc结构域，例如triomabs、kih igg、cross-mab、orthofab igg、dvd igg、igg scfv、scfv2-fc等构型。此类双抗形成igg样结构，分子结构较大，并且由fcrn介导的细胞内吞和再循环过程，使其具有更长的半衰期；同时保留了fc介导的部分或全部效应子功能，如抗体依赖细胞介导细胞毒性(adcc)、补体依赖细胞毒性(cdc)和抗体依赖细胞吞噬(adcp)。然而这类双抗也不能完全杜绝错配产物的生成，而任何错配分子的残留级分都很难从产物中分离，并且这种方法需要针对两个抗体序列进行大量的突变等基因工程改造，无法达到简单、通用的目的。
7.因此，研究多集中在开发一种在产品半衰期、稳定性、安全性和可生产性方面具有改善性能的bcma双特异性分子，比如专利cn111138542a中报道了一种bcma双特异性抗体分子。但是目前关于bmca双特异性抗体分子的制剂研究报道较少，合适的制剂产品对于发挥新型的双特性抗体分子的临床应用价值具有重要的影响。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种稳定的重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液，所述注射液使用磺丁基倍他环糊精钠和桔酸丙酯，加入其它药学上接受的辅料制备获得，其具有理想的玻璃转化温度，磺丁基倍他环糊精钠和桔酸丙酯的加入可以有效的防止制剂中抗体成分的断裂或降解，保证产品在存储、运输或使用中的稳定性。
9.本发明的技术方案如下：
10.一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液，所述注射液中含有重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体、磺丁基倍他环糊精钠和桔酸丙酯及其它药学上可接受的辅料。
11.优选地，所述的重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体的浓度为30～70mg/ml。
12.优选地，所述注射液中磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯与重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体的质量比为30～100：1～10：30～70。
13.进一步优选地，所述注射液中磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯与重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体的质量比为50～100：5～10：30～70。
14.优选地，所述的其它药学上可接受的辅料包括赋形剂、增溶剂和缓冲剂。
15.进一步优选地，所述的赋形剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇或nacl中的一种或几种。
16.进一步优选地，所述的赋形剂在注射液中的含量为100～250mm；优选为180～250mm。
17.进一步优选地，所述的增溶剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80；更加优选为聚山梨酯80。
18.进一步优选地，所述的增溶剂在注射液中的含量为0.1～0.5mg/ml。
19.进一步优选地，所述的缓冲剂为枸橼酸钠/枸橼酸缓冲体系。
20.进一步优选地，所述的缓冲剂在注射液中的含量为10～50mm；优选为10～20mm；优选ph范围为5.5～6.5。
21.优选地，所述重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液包含如下组分：
[0022][0023]
优选地，所述重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液包含如下组分：
[0024][0025][0026]
一种所述重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液的制备方法，具体步骤包括：
[0027]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液加入枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、赋形剂和增溶剂，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0028]
与现有技术相比，本发明取得的技术效果是：
[0029]
本发明提供了一种稳定的重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液，其具有稳定性好，安全性高的特点，进一步降低了临床用药的安全隐患。本发明提供的注射液的制备工艺简单，适于放大，且质量稳定可控，方便储存和运输。环糊精及桔酸丙酯的使用，可以减少赋形剂、增溶剂的用量，既可以降低生产成本，又可以降低用药的安全隐患。
具体实施方式
[0030]
下面通过实施例来进一步说明本发明，应该正确理解的是：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。
[0031]
实施例1
[0032]
(1)处方
[0033][0034]
(2)制备方法
[0035]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0036]
实施例2
[0037]
(1)处方
[0038][0039]
(2)制备方法
[0040]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异
性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、nacl和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0041]
实施例3
[0042]
(1)处方
[0043][0044]
(2)制备方法
[0045]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至50mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0046]
实施例4
[0047]
(1)处方
[0048][0049]
(2)制备方法
[0050]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异
性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、海藻糖和聚山梨酯20，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0051]
实施例5
[0052]
(1)处方
[0053][0054][0055]
(2)制备方法
[0056]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至70mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、甘露醇和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0057]
实施例6
[0058]
(1)处方
[0059][0060]
(2)制备方法
[0061]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异
性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0062]
实施例7
[0063]
(1)处方
[0064][0065][0066]
(2)制备方法
[0067]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0068]
实施例8
[0069]
(1)处方
[0070][0071]
(2)制备方法
[0072]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异
性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0073]
对比实施例1
[0074]
(1)处方
[0075][0076][0077]
(2)制备方法
[0078]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0079]
对比实施例2
[0080]
(1)处方
[0081][0082]
(2)制备方法
[0083]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0084]
对比实施例3
[0085]
(1)处方
[0086][0087][0088]
(2)制备方法
[0089]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0090]
对比实施例4
[0091]
(1)处方
[0092][0093]
(2)制备方法
[0094]
配制处方浓度和ph的枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液，将重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体超滤换液至枸橼酸钠/枸橼酸缓冲液中，调节蛋白浓度至30mg/ml；准确称取处方量的磺丁基倍他环糊精钠、桔酸丙酯、蔗糖和聚山梨酯80，溶解并混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，灌装入西林瓶即得。
[0095]
验证实施例
[0096]
1.差示量热扫描(dsc)
[0097]
将实施例1～8和对比实施例1～4的重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体溶液通
过逐渐升温测定其熔化温度tm值。结果见表1。
[0098]
方法：采用microcaltm vp-capillary dsc仪器，在仪器程序控制温度下，测定溶液中蛋白质的tm值。样品用对应的缓冲溶液稀释至1mg/ml。取350μl样品加入到96孔板的样品孔，相应的缓冲液取350μl加入到buffer孔，扫描温度设置为20～90℃，扫描速率为60℃/hr。数据分析采用microcal vp-capillary dsc自动分析软件。
[0099]
表1 dsc检测结果
[0100]
样品tmonset/℃tm1/℃tm2/℃实施例148.7463.4680.20实施例247.5362.7578.34实施例347.3462.3377.69实施例448.6963.1279.66实施例545.1860.8676.34实施例645.5361.3977.55实施例743.7456.3876.43实施例842.3659.7577.14对比实施例142.1253.3875.04对比实施例242.9355.3675.09对比实施例342.3654.6978.69对比实施例444.3257.6376.05
[0101]
结果表明，本发明加入磺丁基倍他环糊精和桔酸丙酯的制剂产品的tmonset和tm1明显提高，所获得的药物具有较好的热稳定性。
[0102]
2.稳定性试验
[0103]
分别按照实施例1～8及对比实施例1～4制备样品，采用加速稳定性试验和长期试验考察贮存稳定性。
[0104]
加速试验在25℃
±
2℃的条件下进行，时间为6个月。所用设备能控制温度
±
2℃，并对实际温度进行监测。在试验期间第0个月、3个月、6个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。长期试验在2～8℃的条件下进行，分别于0个月、6个月、12个月、24个月末按稳定性重点考察项目进行检测；纯度检查按照通则0514分子排组色谱法和通则0542毛细管电泳法测定，活性按照基于生物发光的报告基因法确定，实验细胞：chok1-bcma-luc细胞，结果见表2、表3。
[0105]
表2 2～8℃长期稳定性试验结果
[0106]
[0107]
[0108][0109]
表3 25℃加速稳定性试验结果
[0110]
[0111]